CN118388666A - 一种促进皮肤胶原蛋白和弹性蛋白再生的多肽及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种促进皮肤胶原蛋白和弹性蛋白再生的多肽及制备方法，本发明创新性地设计了一种融合蛋白，通过将弹性蛋白多肽与胶原蛋白多肽结合，利用富含VAPGXG基序的弹性蛋白片段以及I型胶原蛋白α2链的核心片段设计的氨基酸序列，在促进成纤维细胞增殖、抑制金属蛋白酶活性、以及增强胶原蛋白和弹性蛋白表达方面发挥重要作用；本发明利用基因工程技术，在大肠杆菌表达系统中实现了融合蛋白的高效表达与纯化，显著提高了生产效率并降低了成本且可扩展性强；本发明生产的融合蛋白N端添加的透皮肽TAT序列增强了其在皮肤中的穿透能力，从而提升了本发明在皮肤深层的生物利用度和疗效。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种促进皮肤胶原蛋白和弹性蛋白再生的多肽及制备方法。
背景技术
皮肤中的胶原蛋白和弹性蛋白是两种极其重要的结构蛋白，它们共同构成了皮肤的细胞外基质（ECM），为皮肤提供了必要的结构支持和功能特性。
胶原蛋白是人体中最丰富的蛋白质之一，占全身蛋白质总量的约30%。在皮肤中，胶原蛋白特别丰富，主要存在于真皮层，其含量可高达70%至80%，它由三条多肽链以螺旋形式缠绕而成，形成三股螺旋结构，这种结构赋予了胶原蛋白极高的稳定性和韧性。胶原蛋白的主要功能是为皮肤提供结构支撑，维持皮肤的紧致和弹性。随着年龄的增长，胶原蛋白的合成会逐渐减少，同时，由于基质金属蛋白酶（MMPs）的作用，胶原蛋白也会逐渐被降解。这些因素共同导致了皮肤老化过程中的皱纹形成、弹性下降和皮肤松弛等现象。
弹性蛋白是另一种重要的皮肤结构蛋白，与胶原蛋白一起，共同维持皮肤的弹性和柔韧性，如同房屋中的钢筋。弹性蛋白由弹性纤维组成，这些纤维在真皮层中交织成网状结构，允许皮肤在受到外力拉伸后能够恢复原状。与胶原蛋白相比，弹性蛋白的更新速度较慢，但其具有更强的伸缩性。弹性蛋白的降解主要受到弹性蛋白酶的影响，同样，长期的紫外线暴露和其他环境因素也会加速弹性蛋白的降解，导致皮肤失去弹性和紧致度。
胶原蛋白和弹性蛋白在皮肤中相互作用，共同构成了一个复杂的网络，支撑着皮肤的结构。胶原蛋白提供了皮肤的强度和韧性，而弹性蛋白则赋予了皮肤弹性。两者的平衡对于保持皮肤的健康和年轻状态至关重要。
研究表明，外源蛋白质的刺激作用能够促使皮肤自身产生新的胶原蛋白或弹性蛋白，促进皮肤的年轻化和健康化。现有抗衰产品为了延缓皮肤老化过程，往往通过人为外源补充胶原蛋白和弹性蛋白来实现，但是单一的胶原蛋白或弹性蛋白补充往往难以达到理想的抗衰老效果。
发明内容
本发明针对上述的单一的胶原蛋白或弹性蛋白补充往往难以达到理想的抗衰老效果的问题，提供了一种促进皮肤胶原蛋白和弹性蛋白再生的多肽及制备方法。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种促进皮肤胶原蛋白和弹性蛋白再生的多肽，所述多肽的氨基酸序列(序列名称Seq_1)为：MYGRKKRRQRRRVAPGVGVAPGVGVAPGVGSVAPGVGVAPGVGVAPGVGSVAPGVGVAPGVGVAPGVGSVAPGVGVAPGVGVAPGVGSVAPGVGVAPGVGVAPGVGSVAPGVGVAPGVGVAPGVGSVAPGVGVAPGVGVAPGVGSVAPGVGVAPGVGVAPGVGSGLMGPRGLPGSPGNIGPAGKEGPVGLPGIDGRPGPIGPAGARGEPGNIGFPGPKGPTGDPGKNGDKGHAGLAGARGAPGPDGNNGAQGPPGPQGVQGGKGEQGPPGPPGFQGLPGPSGPAGEVGKPGERGLHGEFRHHHHHH。
作为优选，促进皮肤胶原蛋白和弹性蛋白再生的多肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将设计好的氨基酸序列进行大肠杆菌密码子优化后基因合成，插入到表达质粒的NcoI和XhoI之间，末端添加His标签；
步骤二、将合成的表达质粒转化到大肠杆菌中，涂布到Kan抗性的LB固体培养基中进行筛选；
步骤三、将筛选出的阳性转化子转接到TB液体培养基中诱导蛋白表达；
步骤四、收集菌体，超声破碎，纯化重组蛋白；
步骤五、功效验证试验。
作为优选，所述步骤二中的表达质粒为pET20b、pET24A-D、pET28A-C、pQE-T7、pQE-30、pQE-60或pBR322。
作为优选，所述步骤二中的表达质粒为pET28A-C，所述大肠杆菌为BL21菌株。
作为优选，所述步骤三中的诱导表达条件为：0.2mM IPTG、0.2M NaCl、TB培养基，18摄氏度诱导时间为18小时。
作为优选，所述步骤五的功效验证试验包括促进细胞增殖试验、人成纤维细胞验证试验和促进胶原蛋白和弹性蛋白表达验证试验。
作为优选，所述步骤四中的纯化重组蛋白的方法为镍柱柱纯化。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
相比现有技术，本发明的促进皮肤胶原蛋白和弹性蛋白再生的多肽，
（1）本发明创新性地设计了一种融合蛋白，通过将弹性蛋白多肽与胶原蛋白多肽结合，利用富含VAPGXG基序的弹性蛋白片段以及I型胶原蛋白α2链的核心片段设计的氨基酸序列，在促进成纤维细胞增殖、抑制金属蛋白酶活性、以及增强胶原蛋白和弹性蛋白表达方面发挥重要作用。
（2）本发明利用基因工程技术，在大肠杆菌表达系统中实现了融合蛋白的高效表达与纯化，显著提高了生产效率并降低了成本，相比于传统的蛋白质提取和纯化方法，本发明更为经济且可扩展性强。
（3）本发明生产的融合蛋白N端添加的透皮肽TAT序列增强了其在皮肤中的穿透能力，从而提升了本发明在皮肤深层的生物利用度和疗效。
（4）本发明通过融合弹性蛋白多肽和胶原蛋白多肽，结合了两者在皮肤抗衰老方面的优势，提供了一种更为全面和有效的解决方案，这种双重作用机制同时针对皮肤的弹性和结构支撑进行了优化，优于现有单一成分的抗衰老产品。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍：
图1为不同浓度重组蛋白EEC对成纤维细胞的增殖的影响图，
图2为不同浓度重组蛋白EEC对金属蛋白酶的表达的影响图，
图3为不同重组蛋白对细胞胶原蛋白和弹性蛋白表达的影响图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。
实施例1
下面结合附图1-图3对本发明作进一步的描述，一种促进皮肤胶原蛋白和弹性蛋白再生的多肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将氨基酸序列(序列名称Seq_1)为：MYGRKKRRQRRRVAPGVGVAPGVGVAPGVGSVAPGVGVAPGVGVAPGVGSVAPGVGVAPGVGVAPGVGSVAPGVGVAPGVGVAPGVGSVAPGVGVAPGVGVAPGVGSVAPGVGVAPGVGVAPGVGSVAPGVGVAPGVGVAPGVGSVAPGVGVAPGVGVAPGVGSGLMGPRGLPGSPGNIGPAGKEGPVGLPGIDGRPGPIGPAGARGEPGNIGFPGPKGPTGDPGKNGDKGHAGLAGARGAPGPDGNNGAQGPPGPQGVQGGKGEQGPPGPPGFQGLPGPSGPAGEVGKPGERGLHGEFRHHHHHH的组合多肽EEC进行大肠杆菌密码子优化后基因合成，插入到表达质粒的NcoI和XhoI之间，末端添加His标签；
步骤二、将合成的表达质粒转化到大肠杆菌BL21菌株中，涂布到Kan抗性的LB固体培养基中进行筛选；
步骤三、将阳性转化子转接到TB液体培养基中诱导蛋白表达，诱导表达条件：0.2mM IPTG、0.2M NaCl、TB培养基，18摄氏度诱导时间为18小时；
步骤四、收集菌体，超声破碎，采用镍柱柱纯化的方法对其纯化,得到了重组蛋白；
步骤五、功效验证试验；
促进细胞增殖试验：人皮肤成纤维细胞在DMEM培养基（含10% FBS、1%青链霉素）中于37摄氏度、5% CO2培养箱中培养。先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5-1cm一道，横穿过孔，每孔穿过4条线；设置空白对照组（BC，无血清培养基）与样品组（EEC）。样品组设置5个质量浓度梯度：1 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL、7.5 mg/mL、10 mg/mL，每个质量浓度梯度下设置3个重复孔。将人成纤维细胞分别接种至6孔板中，每孔2 mL，放置37摄氏度、5% CO2培养箱中孵育24 h，至达到95%-100%汇合状态。孵育完成后用200μLPBS清洗3次，样品组加入2 mL无血清培养基配制的供试品，对照组只加入无血清培养基，放置于培养箱（37摄氏度、5% CO2）中培养。分别于0小时和24小时后取样拍照，擦去6孔板背后的marker横线划痕。4倍镜下进行拍照，保证划痕居中且垂直，注意背景一致，拍照。用Image J软件测量划痕面积并计算细胞迁移速率。
细胞迁移率(伤口愈合率)=(初始细胞间距离均值-t时刻细胞间距离均值)/初始细胞间距离均值，如图1所示，相比于空白组，重组蛋白EEC对成纤维细胞有明显的增殖能力，随着加入的重组蛋白EEC的浓度的提高，不同实验组相对应的细胞增殖率均随之升高。以上结果表明，重组蛋白EEC对于人成纤维细胞的增殖有明显的促进作用，具有作为医用材料的原料应用潜力。
成纤维细胞实验：
将人皮肤成纤维细胞在DMEM培养基（含10% FBS、1%青链霉素）中于37摄氏度、5%CO2培养箱中培养。当细胞生长至培养瓶的80%～90%时消化细胞，消化后转移至离心管，1000 r/min离心5 min，弃上清，加入1 mL培养基重悬，人成纤维细胞以4×103个/孔进行细胞接种。均匀接种于6孔培养板；胶原合成相关基因检测设置空白对照组（BC）、与样品组1mg/mL，2.5mg/mL，5mg/mL融合蛋白EEC。胶原降解相关基因检测设置空白对照组（BC）与样品组（1-5mg/mL 融合蛋白EEC），除BC组外均进行UVA辐照，辐照剂量为25 J/cm2。辐照结束后，放置于培养箱（37摄氏度、5% CO2）中继续培养24小时。每孔用2 mL的PBS清洗两次，加入1mL的RNAiso Plus，吹打裂解细胞后收样。依据试剂盒说明书，开展RNA提取、反转录及荧光定量PCR，检测胶原降解相关基因（MMP-1，MMP-3）的表达量，采用2-△△CT方法进行计算。
如图2所示，根据荧光定量PCR结果可知，相比于空白组，重组蛋白EEC对金属蛋白酶的表达有明显的抑制效果，随着加入的重组蛋白EEC的浓度的提高，各实验组的金属蛋白酶的表达量均随之降低。以上结果表明，我们设计的重组蛋白EEC对于人成纤维细胞的金属蛋白酶表达有明显的抑制效果。
促进胶原蛋白和弹性蛋白表达试验：
将人皮肤成纤维细胞在DMEM培养基（含10% FBS、1%青链霉素）中于37摄氏度、5%CO2培养箱中培养。当细胞生长至培养瓶的80%～90%时消化细胞，消化后转移至离心管，1000 r/min离心5 min，弃上清，加入1 mL培养基重悬，人成纤维细胞以4×103个/孔进行细胞接种。均匀接种于6孔培养板；胶原合成相关基因检测设置空白对照组（BC）、实验组1添加市场售卖的弹性蛋白肽ELP16 5 mg/mL，实验组2添加市场售卖的胶原蛋白肽COL 5 mg/mL，实验组3 添加融合蛋白EEC 5 mg/mL。胶原降解相关基因检测设置空白对照组（BC）与样品组（5 mg/mL 各类型胶原蛋白），均进行UVA辐照，辐照剂量为25 J/cm2。辐照结束后，放置于培养箱（37摄氏度、5% CO2）中继续培养24小时。每孔用2 mL的PBS清洗两次，加入1 mLRNAiso Plus，吹打裂解细胞后收样。依据试剂盒说明书，开展RNA提取、反转录及荧光定量PCR，检测胶原表达相关基因（因Collagen Ⅰ，Collagen Ⅲ，TGF β1）和弹性蛋白表达相关基因（Elastin，β-Actin）的表达量，采用2-△△CT方法进行计算。
如图3所示，根据荧光定量PCR结果可知，相比于空白对照组（BC）、实验组1添加弹性蛋白肽ELP16 5mg/mL、实验组2添加胶原蛋白肽COL 5mg/mL，实验组3添加融合蛋白EEC5mg/mL，结果显示，重组蛋白EEC对胶原表达相关基因（因Collagen Ⅰ，Collagen Ⅲ，TGF β1）和弹性蛋白表达相关基因（Elastin，β-Actin）表达量的促进效果最为显著，优于弹性蛋白肽ELP16和胶原蛋白肽COL，表明融合蛋白对ECM蛋白的相互促进效果明显，更有效促进胶原纤维和弹性纤维的再生。
需要说明的是，弹性蛋白的一级结构中，富含特殊的VPGXG和VAPGXG基序，其中X代表除脯氨酸外的任意氨基酸。特别的，由人弹性蛋白第24个外显子编码的VGVAPG寡肽已经广泛用做美容护肤品添加剂，其能够通过与高亲和性弹性蛋白受体结合，发挥其显著的生物学活性。大量研究证实VGVAPG六肽不但能够趋化成纤维细胞，还能刺激人皮肤成纤维细胞增殖，而VPGVG及其多聚体则不具备此功能。此外，VGVAPG寡肽能促进角质形成细胞迁移和分化。更进一步研究表明，VGVAPG寡肽能促进人血管内皮细胞迁移和成管，这表明其具有促进血管生成。最新的研究还发现，VGVAPG寡肽能通过激活IGF-1受体，上调弹性蛋白表达，进而促进弹性组织生成。有研究指出含(VGVAPG)3基序的多肽能增加人皮肤成纤维细胞和人皮肤组织体外培养物中弹性蛋白和胶原蛋白在的表达。研究表明在弹性因子中鉴定xGxxPG序列作为负责弹性蛋白衍生肽生物活性的基序，研究表明弹性基序（VGVAPG）3是通过刺激弹性蛋白结合蛋白受体、占据基质金属蛋白酶-1亚位点的GIL三肽和充当尿激酶竞争底物的RVRL连接结构域来增加基质成分表达，从而有效地促进了真皮成纤维细胞I型、III型胶原和弹性蛋白表达并对MMP-1、纤溶酶和尿激酶有抑制效果。这些作用诱导了组织产生新的纤维网络，在皮肤重塑和再生中起到促进效果。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其他领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (7)
1.一种促进皮肤胶原蛋白和弹性蛋白再生的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为：MYGRKKRRQRRRVAPGVGVAPGVGVAPGVGSVAPGVGVAPGVGVAPGVGSVAPGVGVAPGVGVAPGVGSVAPGVGVAPGVGVAPGVGSVAPGVGVAPGVGVAPGVGSVAPGVGVAPGVGVAPGVGSVAPGVGVAPGVGVAPGVGSVAPGVGVAPGVGVAPGVGSGLMGPRGLPGSPGNIGPAGKEGPVGLPGIDGRPGPIGPAGARGEPGNIGFPGPKGPTGDPGKNGDKGHAGLAGARGAPGPDGNNGAQGPPGPQGVQGGKGEQGPPGPPGFQGLPGPSGPAGEVGKPGERGLHGEFRHHHHHH。
2.一种制备权利要求1所述的促进皮肤胶原蛋白和弹性蛋白再生的多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将设计好的氨基酸序列进行大肠杆菌密码子优化后基因合成，插入到表达质粒的NcoI和XhoI之间，末端添加His标签；
步骤二、将合成的表达质粒转化到大肠杆菌中，涂布到Kan抗性的LB固体培养基中进行筛选；
步骤三、将筛选出的阳性转化子转接到TB液体培养基中诱导蛋白表达；
步骤四、收集菌体，超声破碎，纯化重组蛋白；
步骤五、功效验证试验。
3.根据权利要求2所述的促进皮肤胶原蛋白和弹性蛋白再生的多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤二中的表达质粒为pET20b、pET24A-D、pET28A-C、pQE-T7、pQE-30、pQE-60或pBR322。
4.根据权利要求3所述的促进皮肤胶原蛋白和弹性蛋白再生的多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤二中的表达质粒为pET28A-C，所述大肠杆菌为BL21菌株。
5.根据权利要求2所述的促进皮肤胶原蛋白和弹性蛋白再生的多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤三中的诱导表达条件为：0.2mM IPTG、0.2M NaCl和TB培养基，18摄氏度诱导时间为18小时。
6.根据权利要求2所述的促进皮肤胶原蛋白和弹性蛋白再生的多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤五的功效验证试验包括促进细胞增殖试验、人成纤维细胞验证试验和促进胶原蛋白和弹性蛋白表达验证试验。
7.根据权利要求2所述的促进皮肤胶原蛋白和弹性蛋白再生的多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤四中的纯化重组蛋白的方法为镍柱柱纯化。
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