CN118369147A - 从生物质中提取和纯化天然阿魏酸并转化为香兰素 - Google Patents
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Abstract
从生物质中反应性提取和纯化有机分子的过程包括使用提取溶剂从生物质中提取一种或多种产物来溶解产物,在提取过程中将生物质与反应物接触,并将液体产物与固体产物分离。液体产品包括阿魏酸盐或阿魏酸,将其纯化到不同的纯度并通过生物方法将其转化为香兰素。
Description
交叉引用相关专利
本申请要求优先于2021年10月1日提交的美国临时专利申请第63/251,365号,标题为“从生物质中提取和纯化天然阿魏酸并转化为香兰素”,该申请以引用方式并入本文。
关于政府资助的研究或开发的声明
不适用。
背景
消费者对天然产品和成分的需求促使该行业寻求天然香兰素的新来源,而来自石化产品和丁香酚等合成非天然来源的香兰素的需求有所下降。从香草豆中获得的香草提取物无法跟上不断增长的需求和人口增长的步伐;它仅限于某些地理位置,并导致有害的森林砍伐。获得天然香兰素的最可行解决方案是通过天然阿魏酸的发酵,这种酸可以从合适的天然/生物质原料中获取。香兰素(香草调味品中的活性分子)的碳13NMR用于通过香兰素分子的八个碳的13C和12C的比例确定香兰素的来源,其中醛和甲氧基的碳被确定为最重要的。愈创木酚等合成来源可以与来自香草豆和阿魏酸的天然香兰素区分开来,其阈值取决于实验设置。
天然阿魏酸的大部分供应是在米糠油的加工过程中提取的。阿魏酸也包含在农业生物质中,如芒草、玉米副产品(纤维、麸皮、秸秆、细粉、麸质饲料等)、大米、小麦、甜菜、甜菜纤维、甜菜浆和其他作物。提取阿魏酸的典型方法包括碱提取和酶法。或者,阿魏酸被提取为几种阿魏酸植物甾醇酯,如γ-谷维素。过量的酒精提取已被用于从生物质中去除木质素,类似的提取已被用于提取阿魏酸酯。例如,在甲醇存在下,提取物含有阿魏酸甲酯(3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酸甲酯),而在乙醇存在下,提取物含有阿魏酸乙酯(3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酸乙酯)。从生物质中回收阿魏酸的其他工艺在Abu-Omar等的WO2018/195422和Stair等的WO2021/011810专利中进行了描述了并通过引用完整地并入本文。
总结
在某些方面,从生物质中反应性提取和随后纯化有机分子的过程包括使用提取溶剂从生物质中提取一种或多种产物,在提取过程中将生物质与反应物接触,用溶剂稀释反应产物,用有机溶剂稀释反应产物以沉淀一种或多种杂质,将液体产品与固体产品分离,回收一种或多种产品,对液体产品进行水解反应以将阿魏酸酯转化为阿魏酸,对液体产品进行水解以水解一种或多种杂质,选择性地将一种或多种产品溶解到一种或多种有机溶剂中以除去一种或多种杂质,进行液-液萃取以选择性地将一种或多种产品转移到有机溶剂中,进行超滤或纳滤以去除一种或多种产品中的杂质以产生过滤提取物,使用吸附提取过滤提取物中的油以产生脱油提取物,使用与有机溶剂接触提取过滤提取物中的油以去除其他产品中的油,调节提取液的pH值以选择性地沉淀一种或多种产物,然后可以通过过滤除去,对脱油的提取物进行酯交换或水解,并进行液相色谱以进一步纯化阿魏酸,香豆酸,阿魏酸盐,香豆酸或其组合。进行吸附纯化以进一步纯化阿魏酸、香豆酸、阿魏酸酯、香豆酸酯或它们的组合。溶解和重结晶产物以进一步纯化阿魏酸、香豆酸、阿魏酸酯、香豆酸酯或其组合。所述一种或多种产物包括提取的有机分子,包括阿魏酸酯或阿魏酸或香豆酸酯或香豆酸,并且该一种或多种产物作为液体提取物从生物质中分离出来。阿魏酸酯或香豆酸酯可在酯交换或水解中反应生成阿魏酸、香豆酸、阿魏酸酯、香豆酸酯或其组合。经阿魏酸、香豆酸、阿魏酸酯、香豆酸酯或其组合纯化以产生一种或多种纯化产物。在通过生物方法将阿魏酸转化为香兰素之前,产品包括不同纯度的阿魏酸盐或阿魏酸。
附图简述
为了更全面地理解本公开内容,参考以下附图和详细说明:
图1显示出了从溶解在水性或有机溶剂中的提取混合物或阿魏酸或阿魏酸盐中纯化阿魏酸或阿魏酸盐的过程示意图。
图2显示出了从溶解在水性或有机溶剂中的提取混合物(9A)或阿魏酸或阿魏酸盐中纯化阿魏酸或阿魏酸盐,并转化为香兰素的过程的流程示意图。
图3显示出了通过浓缩、选择性溶解、硅胶柱和热水过滤纯化阿魏酸(FA)的过程示意图。
图4显示出了通过浓缩、选择性溶解、己烷提取和热水过滤来纯化阿魏酸的过程的流程示意图。
图5显示出了通过浓缩、选择性溶解、己烷提取/沉淀和热水过滤纯化阿魏酸的过程示意图。
图6显示出了通过浓缩、选择性溶解、己烷提取/沉淀、硅胶柱和热水过滤纯化阿魏酸的过程示意图。
图7显示出了通过浓缩、硅胶柱和热水过滤纯化阿魏酸的过程示意图。
图8显示出了通过浓缩、冷研磨、热水过滤、乙酸乙酯提取、己烷提取和热水过滤纯化阿魏酸的工艺流程示意图。
图9显示出了通过浓缩、选择性溶解、热水过滤、己烷提取和热水过滤来纯化阿魏酸的过程示意图。
图10显示出了提取示例#1.c之后的工艺流程示意图,然后是纯化示例#5。
详细说明
首先可以理解的是,尽管下面提供了一个或多个实施例,但所公开的系统和方法可以使用任意数量的技术来实现,无论是目前已知的还是现有的。本专利绝不应局限于下面的说明性实现、附图和技术,包括本文所示和描述的示例性和实施,但可以在所附权利要求的范围内及其全部等效物范围内进行修改。因此,在公开多个实施例的同时,对于本领域技术人员来说,从以下详细描述中,仍然可以看到其他实施例。显而易见,本文公开的某些实施例能够在各个方面进行修改,而不会偏离本文所提出的权利要求的精神和范围。因此,以下详细描述应被视为说明性描述,而不是限制性描述。
阿魏酸(3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙-2-烯酸,3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酸)是一种强大的抗氧化剂,用于消费品和药品。阿魏酸还用于生产天然香兰素,是香草调味料中的活性分子/成分。香精香料行业使用酶法将阿魏酸转化为天然香兰素。由于天然香草豆提取物的挥发性、高成本和稀缺性,天然阿魏酸生产的天然香兰素尤为重要。
提取的阿魏酸盐和香豆酸盐可以被视为天然的,例如欧洲1334/2008和美国食品和药物管理局(FDA)21CFR101.22关于天然标签的规定。提取的阿魏酸酯可以水解为阿魏酸,并提纯为纯结晶固体或水溶液。提取的阿魏酸可以提纯为纯结晶固体或水溶液。在此过程中还会提取额外的肉桂酸、糖、油和脂肪酸,并可以作为副产品进行分离。本申请描述了一种从生物质中生产阿魏酸的方法,该过程可以包括本文总结的任意数量的步骤,其中这些步骤可以包括农业生物质的预处理、阿魏酸和香豆酸的反应性提取以及阿魏酸酯(各种甲基-、乙基-、丙基-、丁基-或其任何变体的阿魏酸酯)和香豆酸酯。使用过滤方法和色谱法纯化所得的阿魏酸酯、香豆酸酯、阿魏酸和香豆酸,任选地将阿魏酸盐和香豆酸酯转化为阿魏酸和香豆酸。通过离子交换纯化阿魏酸,吸附纯化,选择性溶解到有机溶剂中,用水性和有机溶剂进行液-液分离,用有机溶剂洗涤固体或半固体产品,调节pH值以沉淀杂质或改变提取化合物的溶解度,色谱法,结晶和固体阿魏酸和香豆酸的回收。
本文所述的阿魏酸和阿魏酸盐纯化方法除了提纯从生物质中提取的阿魏酸和阿魏酸盐外,还可以应用于任何含有阿魏酸或阿魏酸盐的工艺流程。例如,本文所述的阿魏酸和阿魏酸盐纯化方法可用于纯化阿魏酸或阿魏酸盐,其已使用本文所述的替代提取方法从生物质中提取。本文所述的阿魏酸和阿魏酸盐纯化方法还可用于纯化各种生物质工艺流中所含的阿魏酸或阿魏酸盐,包括但不限于从玉米加工的废物中提纯阿魏酸或阿魏酸盐,例如来自玉米饼加工的含有阿魏酸的水性nejayote工艺流,橄榄磨坊工艺流和废水,小麦加工工艺流和废水,或小麦蒸馏器穀物加工流和废水。
图1显示出了用于纯化阿魏酸或阿魏酸盐的工艺步骤100的流程示意图。该工艺步骤100可以包括从提取混合物中提取步骤102,或将阿魏酸或阿魏酸盐溶解在水溶剂或有机溶剂中的提取。纯化步骤104可用于混合物,并且可以包括以任何顺序纯化阿魏酸或含阿魏酸盐溶液的任意数量的方法,包括浓缩、选择性溶解、硅胶吸附、热水过滤、溶剂型油提取、溶剂型沉淀、选择性吸附、超滤和纳滤。最后一步106可以包括生产纯化的阿魏酸产品。根据纯化步骤104中使用的纯化方法,步骤106中阿魏酸产物的纯度范围为约15至100重量百分比。
图2显示出了纯化过程200的另一示意图。过程200可以与过程100相似。工艺200可以在步骤102处从提取混合物开始。纯化步骤104用于从溶解在水溶剂或有机溶剂中的阿魏酸或阿魏酸盐的提取混合物中纯化阿魏酸或阿魏酸盐。纯化步骤104可以包括任意数量/顺序的工艺,用于纯化含有阿魏酸或阿魏酸盐的溶液,包括浓缩、选择性溶解、硅胶吸附、热水过滤、溶剂型油提取、溶剂型沉淀、选择性吸附、超滤和纳滤。根据纯化步骤106所采用的纯化方法,阿魏酸产物的纯度范围介于15%到100%重量百分比。根据一些实施方案,来自纯化步骤106的阿魏酸随后可以在步骤108中转化为香兰素。
在某些方面,生产提取混合物或水溶液的加工步骤可以包括阿魏酸酯的提取,其中可以包括阿魏酸酯的反应性提取。在一些实施方案中,用于反应性提取阿魏酸盐和香豆酸酯的过程可以包括用于从生物质中提取阿魏酸盐和香豆酸酯的反应步骤和/或提取步骤。反应步骤和提取步骤可以作为反应提取步骤同时发生。任何合适的生物质都可以用作反应和提取步骤的起始原料。各种示例性生物质原料包括但不限于芒草、玉米麸皮、玉米纤维、玉米麸质饲料、乾酒糟(DDG)、含溶质的乾酒糟(DDGS)、酒糟、玉米秸秆、玉米麸质粉、甜菜纤维、稻壳、米糠、麦麸或其他小麦衍生原料,和/或含有阿魏酸盐键的其他农业残留物。虽然反应性提取过程中使用的玉米纤维或其他类型的生物质可以在反应性提取步骤之前干燥,但不需要干燥步骤。有利的是,湿玉米纤维或其它类型的湿生物质中水的存在不会对本文所介绍的反应性提取产生负面影响。值得注意的是,使用湿玉米纤维或其他湿生物质可以降低与干燥生物质相关的加工成本和能源使用。
在一些实施方案中,可以在反应和提取之前使用预处理步骤或反应提取步骤来除去生物质原料的某些组分。
反应步骤可以在提取步骤之前或同时进行,可以与碱一起进行。提取步骤可以在溶剂存在下进行。产品可以包含以下至少一种:阿魏酸、阿魏酸酯(ferulic acid ester)、香豆酸和香豆酸酯(coumaric acid ester)。示例性的阿魏酸酯可以包括但不限于:阿魏酸甲酯、阿魏酸乙酯、阿魏酸丙酯和阿魏酸丁酯。示例性香豆酸酯可以包括但不限于香豆酸甲酯、香豆酸乙酯、香豆酸丙酯和香豆酸丁酯。副产品也可以被提取出来,包括油,通常由油酸、油酸酯(油酸酯)、亚油酸和亚油酸酯(亚油酸酯)组成。其他副产品可以包括但不限于蛋白质、氨基酸、碳水化合物、碳水化合物衍生材料、糖、盐和纤维。
该过程的提取和反应步骤可以在提取溶剂的帮助下进行。在一些实施方案中,提取溶剂可以包括醇(例如,有机醇)、水或醇和水的混合物。当存在水时,至少一部分水可以由生物质提供或作为生物质的一部分。如本文公开的实施例所述,当使用水作为反应提取溶剂时,阿魏酸和香豆酸被视为反应产物。当使用酒精和水的混合物作为反应提取溶剂时,反应产物可以包括阿魏酸和香豆酸。在某些情况下,反应产物可以包括阿魏酸、阿魏酸酯、香豆酸和香豆酸酯的混合物。虽然不希望受到理论的限制,但已经注意到阿魏酸酯的种类与溶剂中所选的醇直接相关。例如,使用甲醇产生阿魏酸甲酯,使用乙醇产生阿魏酸乙酯。香豆酸的酯也被同时制得。
在一些实施方案中,反应步骤也可以使用碱进行。该反应步骤可以与提取同时进行。例如,可以将碱添加到溶剂中,以提高溶解度以及较低反应温度下的反应和提取速率。碱包括浓度约为0至6N(每升溶剂的碱摩尔当量)的任何第一或第二基氢氧化物,例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸氢盐和铵。
可以使用各种工艺设计来执行提取和/或反应步骤。可以使用任何能够将生物质原料与溶剂和/或碱接触的合适反应器配置。例如,阿魏酸和阿魏酸酯的反应提取可以发生在搅拌或未搅拌的间歇式反应器、连续搅拌罐式反应器(CSTR)、填充床反应器(PBR)或本领域技术人员已知的其它反应器类型中。
为了提高或优化阿魏酸或阿魏酸酯的产率,可以改变几个变量,包括提取助剂或碱的浓度、提取溶剂与生物质的比例、反应性提取温度、反应性提取时间、生物质种类、提取溶剂组成和/或反应器设备。下面列举了几组操作条件,但其他操作条件是可能的,并作为本公开的一部分包含在内。
在一些实施方案中,反应提取在5℃-200℃之间进行,溶剂与生物质的体积比为1-30,氢氧化钠或碱浓度为0.01M-6M,反应时间为0.1-24小时。
在一些实施方案中,残留的生物质如玉米纤维可以通过过滤、离心、双辊压榨、螺旋压榨、压滤和真空过滤从反应提取产物中去除。有利的是,去除残留的固体生物质可以生产出适合动物饲料的固体材料,同时提高反应提取产物中阿魏酸或阿魏酸酯的纯度。
在一些实施方案中,反应性提取可以提取阿魏酸和阿魏酸酯的副产物,包括但不限于蛋白质、阿拉伯木聚糖、杂氧聚糖、半纤维素、纤维素、碳水化合物、木糖、葡聚糖、脂肪酸、脂肪酸酯及其衍生物。在反应提取溶剂含有一定量水的实施方案中,可以在反应提取过程中或反应提取完成后向反应混合物中加入有机溶剂,以从反应混合物中沉淀出固体、半固体或油的副产物。在一些实施方案中,用于沉淀副产物的有机溶剂可以是己烷、乙酸酯(例如乙酸乙酯)、乙醇、脂肪醇或其它有机溶剂。然后,通过过滤、离心、双辊压榨、螺旋压榨机、压滤机和真空过滤,可以从反应混合物中除去通过添加有机溶剂沉淀的副产物以及玉米纤维或生物质的残留固体。有利的是,副产物的沉淀和除去所述副产物与残留的玉米纤维或生物质固体可以增加残留玉米纤维或生物质的营养价值,同时提高反应混合物中阿魏酸或阿魏酸酯的纯度。有利的是,副产物的沉淀和除去所述副产物与残留的玉米纤维固体或生物质固体可以降低反应产物的粘度。在一些实施方案中,富含阿魏酸或阿魏酸酯的溶液随后可以浓缩以产生富水混合物,该混合物可以进行液-液萃取以选择性地将阿魏酸或阿魏酸酯从富水溶液中提取到有机溶剂中,产生溶解在有机溶剂中的阿魏酸或阿魏酸酯。其中阿魏酸或阿魏酸酯在有机溶剂中的纯度高于水相。糖、蛋白质、碳水化合物和盐等杂质仍保留在富含水的液相中。液-液萃取中使用的有机溶剂可以包括但不限于己烷、甲苯、乙醚、乙酸乙酯或任何与水不混溶的有机溶剂。作为液-液萃取的替代方法,可以浓缩富含阿魏酸或阿魏酸酯的液相以产生固体、半固体或油性产物,从中可以选择性地将阿魏酸或阿魏酸酯提取入有机溶剂,从而提高阿魏酸或阿魏酸酯的纯度。用于选择性溶解的有机溶剂可以包括但不限于己烷、甲苯、乙醚、乙酸乙酯或其他常见的有机溶剂。
在一些实施方案中,阿魏酸和阿魏酸酯的副产物包括但不限于蛋白质、阿拉伯木聚糖、杂氧聚糖、半纤维素、纤维素、木糖、葡聚糖和衍生物。在从反应性提取的液体产物中除去固体残留的玉米纤维或生物质后,与阿魏酸或阿魏酸酯一起保留在液体反应性提取产物中。在某些情况下,副产物可以分解或部分分解成副产物,包括但不限于葡萄糖、木糖、氨基酸、其衍生物,或通过对液体反应性提取产物进行水解反应使其具有水溶性。这种水解可以通过向液体反应性提取产物中加入酸或碱来催化,并且可以选择加热。适合水解的碱包括但不限于浓度约为0至6N(每升溶剂的摩尔当量碱)的任何第一或第二基氢氧化物,如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸盐、碳酸氢盐和铵,或足以将pH值提高到13的碱。适合水解的酸包括但不限于盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、乙酸及其组合,其浓度约为0至6N(每升溶剂的摩尔酸当量),或足以将pH降低至1的酸。水解混合物可以加热到20℃-120℃的温度,持续0-12小时以完成水解。有利的是,水解后的反应产物可以具有降低的粘度。在一些实施方案中,水解后的液体反应产物可以用有机溶剂在液-液萃取中萃取,以产生富含阿魏酸或阿魏酸酯的有机相,从而提高阿魏酸或阿魏酸酯的纯度。糖、蛋白质、碳水化合物和盐等杂质仍保留在水相中。液-液萃取中使用的有机溶剂可以包括但不限于己烷、甲苯、乙醚、乙酸乙酯或任何与水不混溶的有机溶剂。在其他实施方案中,水解后的液体反应产物可以浓缩以产生固体、半固体或油性产物,从中可以选择性地将阿魏酸或阿魏酸酯溶解到有机溶剂中,从而增加阿魏酸或阿魏酸酯的纯度。选择性提取中使用的有机溶剂可以包括但不限于己烷、甲苯、乙醚、乙酸乙酯或其他常见的有机溶剂。
在一些实施方案中,反应性提取中产生的阿魏酸可以通过升华进行纯化。在其它实施方案中,阿魏酸可以在反应提取之后的任何处理步骤之前或之后通过升华进行纯化。在一些实施方案中,通过加热有或没有施加真空的粗阿魏酸溶液并冷凝气态阿魏酸来升华阿魏酸,以产生纯化的固体阿魏酸产品。
本文公开的工艺和方法围绕包括阿魏酸和相关化合物在内的产物的回收提供了许多新的改进。例如,在去除纤维后用碱水解阿拉伯木聚糖。它允许通过使用有机溶剂(如乙酸乙酯)进行液-液萃取进行相分离。这种选择性溶解是一种从包含碳水化合物和水溶性副产物的混合物中回收阿魏酸的新方法。否则,提取物中阿拉伯木聚糖(玉米胶)的高粘度会阻碍加工和进一步纯化。
同样,用乙醇等酒精洗涤水提取物以沉淀阿拉伯木聚糖和其他碳水化合物也是新的方法。这允许在工艺中使用营养丰富且适合作为饲料的纤维,然后进行液-液萃取,以获得阿魏酸有机层以进一步纯化。如果没有此步骤,提取物可以形成乳液,并且可能无法进一步加工。其他新元素包括热水过滤,以从其他酚类中回收阿魏酸。此外,本文所述的分离步骤也是新的。在使用获得的阿魏酸生产香兰素的背景下,这些元素中的每一个都是新的。
在一些实施方案中,含有阿魏酸或阿魏酸盐的生物质提取物或含有阿魏酸或阿魏酸盐的水性或有机工艺流程可以由图1和图2中概述的一系列纯化步骤,以生产阿魏酸产品,其中阿魏酸产品的纯度范围可以从15到100阿魏酸质量百分比。当阿魏酸产品的纯度低于100wt.%纯度时,污染物可分为第1类、第2类、第3类和第4类污染物,如下所示。第1类污染物可以包括木质素或木质素衍生材料,并且可以包括以下部分或其中一种的任意组合:木质素、多酚、香豆酸、取代酚或木质素衍生材料。虽然不希望受到理论的限制,但需要注意的是,第1类污染物通常可以通过紫外-可见光谱法进行表征,并且通常具有约200纳米(nm)的Lamda最大值和约240nm或约320nm处的局部最大吸光度,或者可以使用多种方法将第1类污染物测定为总酚类物质含量。第2类污染物可以包括碳水化合物或碳水化合物衍生材料,并且可以包括以下部分或其中一种的任意组合:碳水化合物、半纤维素、纤维素、阿拉伯木聚糖、杂木聚糖、木聚糖、葡聚糖、糖和碳水化合物衍生材料。第3类污染物可以是水溶性的,可以包括以下任何组合、某些或其中一种:蛋白质、氨基酸、含氮化合物和盐。第4类污染物通常被描述为油,可以包括以下部分或其中一种的任意组合:脂肪酸、油酸、亚油酸、脂肪酸酯、甾醇和植物甾醇。
如本文所述从生物质中提取的阿魏酸可以使用多种生物转化技术转化为香兰素(如图2的步骤108),以生产可被视为天然的香兰素产品,例如遵循欧洲1334/2008和美国食品和药物管理局(FDA)21CFR101.22关于天然标签的规定。有利地,本文所述的阿魏酸反应性提取方法产生阿魏酸产物,其可直接转化为香兰素,而不需要在从生物质中反应性萃取后对阿魏酸进行进一步纯化。此外,本文所述的任何纯化步骤的阿魏酸产物都可以转化为香兰素。当希望将纯度更高的阿魏酸转化为香兰素时,其反应活性高于初始反应性提取步骤中产生的阿魏酸。在从生物质中反应性提取阿魏酸或按照本文所述的任何纯化步骤将阿魏酸转化为香兰素时,可以通过与许多已知将阿魏酸转化为香兰素的生物制剂反应来实现,包括但不限于:假单胞菌属,包括萤光假单胞菌、萤光假单胞菌BF13-1p4、恶臭假单胞菌、恶臭假单胞菌KT2440、支链淀粉属,包括ATCC 39116支链淀粉菌属(也称为Streptomyces setonii)、支链淀粉菌属HR 167、链霉菌属、包括链霉菌属V-1、酸性片球菌、肠杆菌属Px6-4、大肠杆菌、大肠杆菌JM109/pBB1、黄孢子菌、金孢子菌NCIM 1197、朱砂杆菌和/或黑曲霉。这份将阿魏酸转化为香兰素的生物制剂清单并非详尽无遗,其他微生物和生物制剂也可用于完成阿魏酸向香兰素的转化。微生物可以使用常规培养基方法在摇瓶或生物反应器中培养,使用间歇或连续进料底物和其他营养物质。培养装置可以包括由琼脂、琼脂糖、海藻酸盐、聚氨酯泡沫或其他类似的合适的凝胶状或固体材料组成的固相,以支持微生物生长。培养装置还可以包括用于吸附基质和/或产品的树脂,以促进产品的进料和收获,并增加通过系统的通量。
在一些实施方案中,阿魏酸产物的纯度范围为15至100阿魏酸质量百分比,可以进一步转化为香兰素产品,如图2的步骤108所示。阿魏酸转化为香兰素可以通过与许多已知将阿魏酸转化为香兰素的生物制剂反应而发生,包括但不限于:假单胞菌属,包括萤光假单胞菌、萤光假单胞菌BF13-1p4、恶臭假单胞菌、恶臭假单胞菌KT2440、支链淀粉属,包括Amycolatopsis sp.ATCC 39116(也称为Streptomyces setonii)、Amycolatopsis sp.HR167、链霉菌属,包括链霉菌属V-1菌株、酸性片球菌、肠杆菌Px6-4、大肠杆菌、大肠杆菌JM109/pBB1、黄孢子菌、黄孢子菌NCIM 1197、朱砂霉菌和/或黑曲霉菌。这份将阿魏酸转化为香兰素的生物制剂清单并非详尽无遗,其他微生物和生物制剂也可用于完成阿魏酸向香兰素的转化。当阿魏酸产品的纯度低于100wt.%纯度时,污染物可分为第1类、第2类、第3类和第4类污染物,如前所述。当含有1-4类污染物任意组合的阿魏酸纯度低于100%时,香兰素产品可以作为独特的混合物生产,其中香兰素产品是作为1-4类污染物的任意组合以及任何未反应的阿魏酸或生物制品(包括但不限于愈创木酚)的混合物生产的,香草酸、香草醇、4-乙烯基愈创木酚、原儿茶酸、儿茶酚或其任何组合。
如本文所述,许多纯化步骤(例如,图1和/或2中的纯化步骤104)可以在一些实施方案中使用,这些步骤可以在反应性提取步骤之后从含阿魏酸的产物中除去特定的杂质。可应用于反应提取液产品的纯化步骤包括但不限于:浓缩、选择性溶解、吸附、热水过滤、有机溶剂提取/沉淀、升华、阳离子交换、阴离子交换和树脂吸附。这些纯化步骤和本领域技术人员已知的其它纯化步骤可以以不同的顺序或组合使用,这些顺序或组合对于本领域技术人员来说是显而易见的,以生产具有高纯度(>95%)的阿魏酸。
在一些实施方案中,浓缩可以单独或与其它纯化工艺组合来应用于反应性提取液产品。浓缩是一种通过蒸发除去液体产品混合物的溶剂或挥发性馏分的工艺方法。浓缩方法包括但不限于蒸馏和旋转蒸发。在一些实施方案中,固体材料包括但不限于活性炭、硅矿、二氧化硅、氧化铝、硅藻土或这些材料中的一种或多种的混合物,可以在粗提取物混合物的浓缩过程中加入。在一些实施方案中,喷雾干燥可用于进一步浓缩提取液,形成粉末状固体,然后加入到用于选择性溶解的有机溶剂或乙酸乙酯溶液中。
在一些实施方案中,选择性溶解可以单独或与其它纯化工艺组合应用于反应提取液工艺。溶解是一种工艺方法,其中含有阿魏酸或阿魏酸酯的混合物在任选浓度之前或之后溶解在最少量的溶剂中。适合于本步骤的溶剂包括但不限于乙醇、水、丙酮、己烷、乙酸乙酯、乙醚或上述至少两种溶剂的混合物。在一些实施方案中,液体产品混合物的pH值被调节到pH 2-5之间,酸包括但不限于硫酸、盐酸、硝酸、乳酸、乙酸或其它酸。酸化的混合物可以倒入包括但不限于乙醇、丙酮、己烷、乙酸乙酯、乙醚或上述至少两种溶剂的混合物中。混合物可在0-100℃下搅拌10-1000分钟,选择性地溶解有机溶剂馏分中的阿魏酸或阿魏酸酯组分,而水溶性杂质沉淀或保持可溶于水相。可以收集阿魏酸或富含阿魏酸酯的有机层并浓缩,以便进行后续纯化。选择性溶解的相关工艺替代方案包括但不限于阳离子交换、阴离子交换、模拟移动床色谱、液相色谱、逆流色谱、超滤、纳滤、转盘超滤或纳米过滤或升华。
在一些实施方案中,硅胶吸附可以单独或与其它纯化工艺组合应用于反应提取液工艺。硅胶吸附是一种通过极性或分子量差异将阿魏酸或阿魏酸酯与杂质分离的纯化方法。本步骤可用于除去大部分玉米油、脂肪酸、脂肪酸酯、甾醇、无机化合物、木质素衍生酚类化合物、糖类、木聚糖、氨基酸等高极性杂质。硅胶柱填充后,可以在色谱柱顶部施加已溶解在极少量溶剂中的阿魏酸或含阿魏酸盐的混合物,并使用流动相冲洗色谱柱,其中流动相可以是丙酮和己烷、乙酸乙酯和己烷的混合物,乙醇和己烷,或本领域技术人员已知的类似溶剂组合。流动相中两种组分的体积比范围为100:0.1至0.1:100。当流动相通过色谱柱时,可以从色谱柱中收集产品馏分。含有阿魏酸或阿魏酸酯的馏分可以合并和浓缩,以便进一步纯化。或者,氧化铝、硅藻土、活性炭或类似材料可以使用类似的方法直接替代二氧化硅。硅胶吸附的相关工艺替代方案包括但不限于阳离子交换、阴离子交换、模拟移动床色谱、液相色谱、逆流色谱、超滤、纳滤、转盘超滤或纳米过滤或升华。
在一些实施方案中,热水过滤可以单独或与其他净化过程组合应用于反应提取液过程。热水过滤是一种净化方法,其中可以根据阿魏酸或阿魏酸酯的溶解度差异与水中的杂质进行分离。代表性杂质可包括但不限于玉米油、脂肪酸、脂肪酸酯、甾醇、无机化合物、木质素衍生酚类化合物、糖类、木聚糖类、氨基酸类。将含阿魏酸或阿魏酸酯的混合物加入到一定量的水中。在一些实施方案中,水的pH值在2-7的范围内,而含有阿魏酸或阿魏酸的混合物与水的重量比范围为1:1至1:100。将含有阿魏酸或阿魏酸酯的溶液和水的混合物加热至沸腾,以获得透明或黄色的液体部分和少量沉淀。液体部分可以在热时过滤,然后冷却至室温。过滤后的溶液可在0-30℃下静置1-100小时,使阿魏酸或阿魏酸酯从溶液中沉淀出来。当阿魏酸或阿魏酸酯沉淀完成后,可对混合物进行过滤,收集含阿魏酸的固体。热水过滤的相关工艺替代方案包括但不限于阳离子交换、阴离子交换、模拟移动床色谱法、液相色谱法、逆流色谱法、超滤法、纳滤法、转盘超滤或纳米过滤或升华法。
在一些实施方案中,溶剂型油提取可以单独或与其它提纯工艺组合应用于反应提取液工艺。溶剂型油提取是一种从含有阿魏酸或阿魏酸酯的混合物中除去玉米油、脂肪酸、脂肪酸酯、甾醇、植物甾醇、脂质或其他非极性杂质的纯化方法。将阿魏酸或阿魏酸酯与玉米油、脂肪酸、脂肪酸酯、甾醇、植物甾醇、脂质或其它含非极性杂质的混合物溶解在溶剂中。合适的溶剂可以包括但不限于乙醇、丙酮、乙酸乙酯或上述至少两种溶剂的混合物。该溶液可以以1:1至1:100的体积比加入到庚烷、甲苯、石油醚、己烷或类似溶剂的搅拌另一种溶剂中。混合物可在0-100℃搅拌0.1-24小时。富含其他溶剂的液体部分可以作为半固体、固体或油状残留物的单独相收集,该残留物含有大部分阿魏酸或阿魏酸酯。富含其他溶剂的液体部分可含有玉米油、脂肪酸、脂肪酸酯、甾醇、植物甾醇、脂质或其他非极性杂质。阿魏酸或富阿魏酸酯样品可用于进一步纯化。在一些实施方案中,溶剂提取可以再重复2-3次,以从阿魏酸或阿魏酸酯中除去额外的玉米油、脂肪酸、脂肪酸酯、甾醇、植物甾醇、脂质或其它非极性杂质。溶剂型除油的相关工艺替代方案包括但不限于阳离子交换、阴离子交换、模拟移动床色谱法、液相色谱法、逆流色谱法、超滤、纳滤、转盘超滤或纳米过滤、升华或树脂吸附到树脂上,包括但不限于聚苯乙烯二乙烯基苯树脂的衍生物。
在一定条件下,溶剂型油提取工艺还可以析出一定量的阿魏酸固体(收率为10-50重量%)。这些固体具有相对较高的阿魏酸纯度(高达90重量%)。可以使用三种方法从溶剂型萃取/沉淀混合物中析出额外的高纯度阿魏酸固体,包括超声处理或搅拌混合物,提高混合物的温度以及向溶液中加入一定量的溶剂,如丙酮、乙醇或乙酸乙酯。
在一些实施方案中,溶剂型沉淀可以单独或与其它纯化工艺组合应用于反应提取液工艺。溶剂型沉淀可用作纯化步骤,其中向富含阿魏酸或阿魏酸酯的溶液中加入溶剂可用于从半固体、固体或油状残留物中沉淀木质素衍生物或其他高极性杂质。这些残留物可以是任何先前描述的溶剂型油提取步骤的产物。在一些实施方案中,可以将包括但不限于乙酸乙酯、甲苯或丙酮在内的有机溶剂(溶剂a)加入到富含阿魏酸或阿魏酸酯的半固体、固体或油状残留物(重量比为1:1至50:1)中,以沉淀一定量的细粉。然后加入第二有机溶剂(溶剂b),包括但不限于庚烷、甲苯、石油醚、己烷或类似溶剂,其中溶剂b与溶剂a在混合物中的体积比范围为1:100至1:1,以降低极性并进一步沉淀杂质。阿魏酸在溶剂a和溶剂b的混合物中保持高溶解度,>85重量%的阿魏酸可以从富含阿魏酸/阿魏酸酯的半固体、固体或油状残留物中提取到溶液中。沉淀的固体可以通过过滤方法从液体溶液中除去。然后将过滤后的液体溶液浓缩至干燥,浓缩液中阿魏酸的纯度可以在35-65重量%的范围内。溶剂型沉淀的相关工艺替代方案包括但不限于阳离子交换、阴离子交换、模拟移动床色谱法、液相色谱法、逆流色谱法、超滤法、纳滤法、转盘超滤或纳滤法或升华法。
选择性吸附:在一些实施方案中,选择性吸附是一种纯化过程,其中杂质可以通过与吸附剂的不同亲和力从阿魏酸中去除。例如,含有阿魏酸或阿魏酸酯的混合物可以溶解在溶剂中,其中溶剂可以包括但不限于乙醇、丙酮、乙酸乙酯或上述至少两种溶剂的混合物,质量比为1:1至1:100。在这种混合物中可以添加选择性吸附剂,其可以包括但不限于硅胶、活性炭、粘土矿物、聚苯乙烯-二乙烯基苯基树脂、具有胺或叔胺官能团化的聚苯乙烯-二乙烯基苯基树脂、丙烯酸基树脂、类似材料,溶剂与吸附剂的品质比范围为1000:1至1:1。混合物可在0-60℃搅拌0.1-24小时,吸附剂可通过过滤或沉降除去。然后可以将液体溶液浓缩至干燥,以获得比初始溶液的阿魏酸或阿魏酸酯纯度更高的产品。选择性吸附的相关工艺替代方案包括但不限于阳离子交换、阴离子交换、模拟移动床色谱、液相色谱、逆流色谱、超滤、纳滤、转盘超滤或纳米滤或升华。在一些实施方案中,选择性吸附除去抑制阿魏酸向香兰素的生物转化的化合物。
在一些实施方案中,含有阿魏酸或阿魏酸盐的粗提物溶液,或含有阿魏酸或阿魏酸盐的任何水性或有机工艺流,可以通过使用超滤进一步纯化。超滤可用于从阿魏酸和阿魏酸盐产品中选择性地去除生物质提取物馏分,如木质素、碳水化合物、阿拉伯木聚糖、半纤维素及其衍生物。
在一些实施方案中,絮凝剂可以加入到粗提物溶液或中间工艺流中,以沉淀杂质,包括但不限于木质素、碳水化合物、半纤维素、阿拉伯木聚糖及其衍生物,这些衍生物来自阿魏酸和含阿魏酸盐的产物。絮凝剂可以包括但不限于阳离子或阴离子絮凝剂。
下面的图3-10给出了整个纯化过程的示例。在这些范例中,可以使用本文中描述的任何纯化过程和参数,并且关于附图的描述无意成为限制。
在一些实施方案中,用于纯化阿魏酸的工艺300可以包括在步骤304处浓缩从步骤302中浓缩提取混合物,然后进行选择性溶解步骤306、二氧化硅吸附步骤308和热水过滤步骤310以在步骤312处生产阿魏酸产品。在一些实施方案中,粗提取混合物可以包含约1-10重量%的阿魏酸。如图3所示,该过程300可以从粗提取混合物302(例如,反应提取的富含阿魏酸的液体产物)开始,该混合物可以在浓缩步骤304中处理以形成浓缩混合物。例如,粗提取混合物可以通过真空蒸发进行浓缩。在一些实施方案中,浓缩混合物可以包含约1-10重量%的阿魏酸,其中阿魏酸的浓度可以高于粗提取混合物中的浓度。通过添加酸(例如盐酸等),可以将浓缩混合物的pH值调节到约3-4之间。酸化混合物可以与有机溶剂结合,包括本文所述的任何溶剂,如乙酸乙酯,并在本文所述的条件下。或者,在对粗提取混合物进行部分浓缩和酸化之后,可以将剩余的液体喷雾干燥以形成粉末状固体,并加入到用于选择性溶解的溶剂溶液中,如步骤306所示。混合后,可以让两相液体(有机和水)分离。有机层可以分离和浓缩,以获得中间产品。在一些实施方案中,阿魏酸的收率可以在约90-98%之间,阿魏酸纯度可以在约10-30重量%之间,或在约15-25%重量之间。在有机溶剂(如乙酸乙酯)中进行选择性溶解可以去除水溶性杂质。
在下一步308中,低极性(例如,玉米油)和高极性(例如,木质素衍生的低聚物)杂质可以使用硅胶柱除去。在该步骤中,中间产物可以施加在硅胶柱的顶部。收集富含阿魏酸的馏分并浓缩以获得浓缩产物。硅胶吸附步骤可有80-90%的阿魏酸收率,所得阿魏酸纯度可在约60-90重量%之间,在约70-85重量%之间。
在热水过滤步骤310中,浓缩产物可以加入到水中,并且可以将混合物加热至沸腾,以获得淡黄色液体部分和部分沉淀。液体部分在热时过滤,然后冷却至室温。然后将溶液冷却并静置以使阿魏酸沉淀。当沉淀完成时,在步骤312中过滤混合物以收集阿魏酸产物。热水过滤步骤可有50-90%的阿魏酸收率,所得阿魏酸产品可具有大于或等于95重量%的阿魏酸纯度。可以重复热水过滤步骤,以进一步将纯度提高到所需的水准。
图4描述了纯化过程400的另一个实施例。如图4所示,在步骤402处的粗提取混合物(例如,包含反应提取的富含阿魏酸的液体产物)可以在步骤404处浓缩,例如通过真空蒸发形成浓缩混合物。然后可以使用步骤406的选择性溶解过程处理浓缩混合物。通过添加酸,可以将浓缩混合物的pH值调节至3-4。酸化后的混合物可以加入到有机溶剂中。或者,在对粗提取混合物进行部分浓缩和酸化之后,可以将剩余的液体喷雾干燥以形成粉末状固体,并加入到用于步骤406选择性溶解的有机溶剂中。结合和搅拌后,可以形成两相液体(有机和水)。有机层可以分离和浓缩,以获得中间产品。在一些实施方案中,阿魏酸的收率可以在约90-98%之间,阿魏酸纯度可以在约10-30重量%之间,或在约15-25重量之间。步骤406中的选择性溶解在有机溶剂(包括本文公开的任何溶剂)中可以除去水溶性杂质,包括但不限于盐、糖、碳水化合物等。
在有机提取步骤408中,低极性杂质如玉米油可以通过用有机溶剂提取除去。从溶出步骤406中加入的产物可以以约1:20至1:1或约1:10的体积比加入到有机溶剂中。可以收集富含有机溶剂的液体部分。如果需要,有机提取步骤可以再重复2-3次以达到所需的分离。用有机溶剂提取后,所得产品可以变成高粘度的半固体。在一些实施方案中,阿魏酸的阶梯收率可以在约75-95%之间或在80-90%之间,并且阿魏酸的纯度可以在约20-40重量%之间,或在约25-35重量之间。
然后可以在步骤410中使用热水过滤,以进一步纯化从步骤408中提取的有机物的产物。该产品可以加入水中,将混合物加热至沸腾,以达到淡黄色的液体层和少量的深色油性层。淡黄色的液体部分可以在热时过滤,然后冷却至室温。然后将溶液留给阿魏酸沉淀。当沉淀完成后,可以在步骤412中过滤混合物以收集产物。在一些实施方案中,阿魏酸的收率可以在约40-90%之间,并且阿魏酸纯度可以大于90重量%。热水过滤步骤410可以重复,使阿魏酸纯度提高到>95%。
图5示出了纯化过程500的另一个实施例。如图5所示,来自步骤502的粗提取混合物(例如,反应提取的富含阿魏酸的液体产物)可以在步骤504中浓缩。在某些方面,混合物可以通过真空蒸发进行浓缩。来自步骤504的浓缩混合物的pH值可以通过加入酸来调节至3-4。酸化后的溶液可以加入到乙酸乙酯等有机溶剂中。或者,在对粗提取混合物进行部分浓缩和酸化后,可以将剩余的液体喷雾干燥以形成粉末状固体,并加入到用于步骤506选择性溶解的有机溶液中。搅拌后,可以形成两相液体(有机和水)。有机层可以使用分离漏斗分离并浓缩以获得中间产品。在一些实施方案中,选择性溶出步骤506可以具有阿魏酸的收率在约90-98%之间,而阿魏酸的纯度可以在约10-30重量%之间,或在约15-25重量之间。在乙酸乙酯中的选择性溶解可以去除水溶性杂质。
在下一步508中,低极性杂质如玉米油可以通过用有机溶剂如己烷提取除去。步骤506中的中间产物,其中挥发物含量可低于15重量%,可以以约1:20至约1:1或约1:10的体积比加入搅拌后的有机溶剂中。与有机溶剂接触可产生三种馏分:淡黄色液体(富含己烷层)、浅棕色细粉末和深棕色粘稠半固体。浅棕色细粉可以自由移动,经过滤干燥成可在步骤510中使用的细粉。步骤508中的阿魏酸回收率可在约15-25%之间,阿魏酸纯度可在约75-90重量%之间或约80-85重量%。在除去淡黄色液体(富含有机溶剂层)和细粉后,深棕色粘稠的半固体可以与极性溶剂(例如丙酮)接触并在步骤512中搅拌。可以形成一层细小的沉淀物。在这种混合物中加入另一种有机溶剂,如己烷,以沉淀更多的固体。沉淀物可以通过过滤除去,并且溶剂溶液可以浓缩以获得步骤512中的附加产物。阿魏酸的收率可以在约60-80%之间或约70-75%之间,阿魏酸纯度可以在约40-60重量%之间或约45-55重量之间。两种产物均可利用热水过滤工艺510进一步纯化以生产最终的阿魏酸产品516,如本文所述514达到40-90%的收率和>90%的阿魏酸纯度。可重复热水过滤步骤,将阿魏酸纯度提高到>95%。
图6显示了另一种纯化过程。如图6所示,首先在步骤502中提取混合物,在步骤504中浓缩混合物,进行选择性溶解,并在步骤508和512中使用有机提取过程产生三个馏分,可以与图5中描述的这些步骤相同或相似。在工艺600中,来自步骤512的有机提取工艺的产物可以施加在硅胶柱的顶部,并且该柱可以用一种或多种有机溶剂冲洗。富含阿魏酸的馏分可以被收集和浓缩,以获得用于热水过滤过程的产品。来自步骤508和604的两种产物都可以在步骤602、606中使用热水过滤进行纯化,以产生阿魏酸产物608,其可以与步骤510、514中描述的关于图5的相同或相似。热水过滤步骤可以根据需要重复,将阿魏酸纯度提高到>95%。
图7中描绘了另一种纯化过程700。如图7所示,在步骤502中使用提取混合物并在步骤504中浓缩混合物的第一步可以与图5中描述的这些步骤相同或相似。从浓缩步骤504得到的产物混合物可以在步骤702中传递到硅胶柱中。该混合物可以施加在硅胶柱的顶部,并且可以用一种或多种有机溶剂冲洗该柱。有机溶剂可以包括极性或非极性有机溶剂。可以收集和浓缩色谱柱中富含阿魏酸的馏分,以获得中间产物。凝胶柱纯化步骤702的步骤收率可为约75-95%之间,或约80-90%之间,而阿魏酸的纯度可为约50-70重量%,或约55-65重量%。所得产物可以使用步骤704中的热水过滤进行纯化,其可以与步骤510中描述的关于图5的相同或相似。热水过滤步骤可以根据需要重复,以将阿魏酸产品706中的阿魏酸纯度提高到>95%。
另一个纯化过程800如图8所示。如图7所示,在步骤502中使用提取混合物并在步骤504中浓缩混合物的第一步可以与图5中描述的这些步骤相同或相似。来自浓缩步骤504的浓缩溶液可以与液氮或干冰混合,使其在步骤802中的冷却研磨过程中变成固态。固体可在低于10℃的温度下研磨成粉末。或者,在将粗提取混合物浓缩到浓缩溶液后,可以将液体喷雾干燥以形成粉末状固体。来自冷研磨或喷雾干燥的粉末可以传递到热水过滤步骤,该步骤可以与本文描述的相同或相似(例如,相对于图5所描述的步骤510)。在该过程804中,可以将固体加入到水中,并且可以将混合物加热至沸腾,以获得淡黄色液体部分,深油状部分和部分沉淀物。液体部分可以在热时过滤,然后冷却至室温。然后可以将溶液留给阿魏酸沉淀。沉淀完成后,可以过滤混合物以收集产品。从热水过滤步骤804中得到的阿魏酸的步骤收率可在约50-95%之间,并且产品的阿魏酸纯度可在约20-40重量%之间,或在约25-35重量之间。
所得产物可传递至一个或多个有机提取工艺806、808。在一些实施方案中,第一有机提取步骤806可以包括将产物与有机溶剂如乙酸乙酯混合,以在水溶性杂质沉淀的同时提取阿魏酸产物。有机馏分可以浓缩成中间产物。从有机提取步骤806中得到的阿魏酸的步骤收率可在约50-95%之间,所得的阿魏酸纯度可在约20-40重量之间。中间产品可以与第二有机溶剂结合,该有机溶剂可以不同于步骤806中使用的有机溶剂,以除去玉米油并获得步骤808中的产品。步骤808中阿魏酸的收率可在约50-95%之间,阿魏酸纯度可在约30-40重量%之间,其中纯度可高于从步骤806提取的产物。从步骤808得到的产品可以传递到热水过滤步骤810,其可以与本文所述的热水过滤步骤相同或相似。热水过滤步骤可以根据需要重复,以将阿魏酸产品812中的阿魏酸纯度提高到>95%。
纯化过程900的另一个实施方案如图9所示。如图9所示,在步骤502中使用提取混合物的第一步骤,在步骤504中浓缩混合物,并在步骤506中使用选择性溶出过程,可以与图5中描述的这些步骤相同或相似。该产品从选择性溶出步骤506中可以传递到热水过滤过程902。在此步骤中,可以将产品加入水中,并将混合物加热至沸腾,以获得淡黄色液体部分、深油状部分和部分沉淀物。液体部分可以在热时过滤,然后冷却至室温。然后可以将溶液留给阿魏酸沉淀。沉淀完成后,可过滤混合物以收集中间产物。热水过滤工艺可使阿魏酸的步骤收率为50-95%,步骤902中产品的阿魏酸纯度可大于约30重量%。然后,产物可以传递到有机提取步骤904。在这个过程中,中间产物可以用有机溶剂提取,以除去玉米油并得到产品。有机提取工艺904的步骤中可以有50-95%的阿魏酸收率,并且从步骤902中得到的产品的阿魏酸纯度可以大于约35重量%。然后将产物5传递到热水过滤步骤906中,以进一步纯化阿魏酸。热水过滤步骤906可以与本文所述的任何热水过滤步骤相同或相似。热水过滤步骤可以根据需要重复,以将阿魏酸产品908中的阿魏酸纯度提高到>95%。
示例
在对主题进行了一般描述之后,以下实施例作为公开的特定方面给出,并被包括在内以证明其实践性和优点,以及发明的优选方面和特征。本领域技术人员应当理解,以下实施例中公开的技术代表了发明人发现的在发明实践中发挥良好作用的技术,因此可以认为构成其实践的优选模式。然而,本领域技术人员应当认识到,根据本公开,可以在公开的特定方面进行许多更改,并且仍然获得类似或相似的结果,而不会偏离即时公开的发明范围。不言而喻,这些例子只是为了举例说明,无意以任何方式限制权利要求的说明。
例1.A-F
阿魏酸和阿魏酸乙酯在乙醇/水中的反应提取。在本例中,使用350克干重玉米。在本例中,将玉米纤维湿品质、玉米含水量、溶剂中乙醇重量百分比(wt.%)、加水量、乙醇添加量、氢氧化钠浓度和添加氢氧化钠的差异制成表格。通过这些表格化变数,跟踪的产物的预期百分比产量也被制成表格。首先,根据所述纤维的干品质量称量玉米纤维的湿品质,并将其载入到4L搅拌玻璃间歇反应器中。通过确定溶剂与干生物质比6.3:1并确定水中乙醇的重量来计算要添加到系统中的水和乙醇的量。部分水分已经存在于玉米纤维中的水分含量。测量剩余的水量。氢氧化钠(NaOH)浓度以摩尔/升总溶剂为基础测定。将计算出的NaOH量称量并溶解在水中。将这些水以及所需量的乙醇一起添加到反应器中,以在溶剂系统中制造必要的重量%乙醇。反应器关闭,保持在80℃的热水浴中,配备回流冷凝器以防止压力积聚和/或溶剂损失,搅拌时叶轮电机设置为400rpm。反应器温度在1小时内上升到80℃。反应器继续加热和搅拌一小时(反应器总时间2小时)。然后将固体放入75μm滤袋中过滤。过滤后的固体用2.0升wt.%乙醇冲洗两次(总共4升)。通过11μm滤纸过滤,从组合提取物中去除细小固体。采用HPLC法测定阿魏酸和阿魏酸乙酯的收率。阿魏酸和阿魏酸乙酯的收率是根据色谱图计算的,相对于350g乾玉米纤维为基准(403g湿玉米纤维,13%水分)。
此时,粗提取物中溶解的固体约为5%的阿魏酸。为了提高粗提取物的纯度,进行选择性溶解。这是通过将提取物浓缩成粘性料浆并将料浆溶解在乙酸乙酯中来实现的。阿魏酸在乙酸乙酯相中的回收率为88%,其纯度约为20%。其余80%的溶解固体主要由玉米油和酚类木质素衍生物组成的混合物。
表1
表1续
示例2
阿魏酸在水中的反应提取。在本例中,将375g玉米纤维(按重量计为60%的水)装入4L搅拌玻璃间歇反应器中。在2.78L水中溶解36g氢氧化钠,并将溶液加入反应器中。种液体与玉米纤维中的水分含量一起产生20:1的水干生物质比,总氢氧化钠浓度为0.3M。将反应器封闭,设置在保持在30℃的热水浴中,配备回流冷凝器以防止压力积聚和/或溶剂损失,搅拌时叶轮电机设置为200rpm。反应器温度在1小时内上升到30℃。反应器继续加热和搅拌2小时(反应器总时间为3小时)。然后将固体放入75μm滤袋中过滤。过滤后的固体用1.5升水冲洗两次(总共3升)。阿魏酸的收率由HPLC测定。相对于150克干玉米纤维(375克湿玉米纤维,水分含量为60%),阿魏酸产量为2.1%。
使用这种提取方法,不提取酚类木质素衍生物;然而,阿拉伯木聚糖将从半纤维素中提取。在本例中不使用乙醇的目的是避免在实施例1中选择性溶解之前的浓缩步骤,直接转向用乙酸乙酯进行液-液提取以纯化阿魏酸。然而,阿拉伯木聚糖,也称为玉米纤维胶,是一种已知的乳化剂,当提取物与乙酸乙酯混合时,形成单一乳化相。通过在0.5M下碱性水解3小时从系统中除去阿拉伯木聚糖。通过将阿拉伯木聚糖水解为阿拉伯糖和木糖,可以过滤提取物。然后将所得提取物与乙酸乙酯进行两相液-液萃取。98%的阿魏酸在该提取中被回收,乙酸乙酯提取物中的溶解固体为纯度33%的阿魏酸。
示例3
在水中反应性提取阿魏酸并用乙醇冲洗。在本例中,将403g玉米纤维(按含水量13%计)装入4L搅拌玻璃间歇反应器中。在2.75L水中溶解33g氢氧化钠,并将溶液加入反应器中。这种液体与玉米纤维中的水分含量一起产生8:1的水/干生物质比,总氢氧化钠浓度为0.3M。将反应器封闭,保持在30℃的热水浴中,配备回流冷凝器以防止压力积聚和/或溶剂损失,搅拌时叶轮电机设置为400rpm。反应器温度在1小时内上升到30℃。反应器继续加热和搅拌2小时(反应器总时间为3小时)。然后用90wt.%乙醇稀释反应器浆料,直到乙醇的总溶剂浓度为40wt.%(2L)。然后将固体放入75μm滤袋中过滤。过滤后的固体用1L 90wt.%乙醇冲洗两次(总共2L)。通过11μm滤纸过滤,从组合提取物中去除细小固体。阿魏酸的收率由HPLC测定。相对于350克干玉米纤维(403克湿玉米纤维,水分为13%),阿魏酸产量为2.1%。
使用这种提取方法,不提取酚类木质素衍生物。虽然阿拉伯木聚糖将从半纤维素中提取,但阿拉伯木聚糖不溶于乙醇含量高于40wt.%的乙醇/水混合物,因此在过滤固体之前将乙醇添加到粗提取物中。由于乙醇已被引入系统,因此进行选择性溶解。这是通过将提取物浓缩成粘性料浆并将料浆溶解在乙酸乙酯中来实现的。提取的阿魏酸的88%得到回收,当溶剂被去除时,该固体的纯度约为40%的阿魏酸。与乙醇/水提取相比,纯度提高了两倍。
示例4
按照图3所示的方案:将2L粗提取混合物1(反应提取的富含阿魏酸液体产物)在55℃下通过真空蒸发浓缩至2(180mL)。通过加入盐酸将浓缩混合物2的pH调节至3-4。搅拌后,将酸化的2缓慢加入540mL乙酸乙酯中,并将混合物在25℃下搅拌3小时。或者,在将粗提取混合物1部分浓缩至约180mL并酸化后,可以将剩余的液体喷雾干燥以形成粉末状固体,并加入到用于选择性溶解的乙酸乙酯溶液3中。混合后,观察到液体的两相(有机和水)。使用分离漏斗分离有机层并浓缩,以达到产品3(阿魏酸的阶梯收率为96%,阿魏酸纯度为20%)。在乙酸乙酯中的选择性溶解可以去除水溶性杂质。在下一步中,使用硅胶柱除去低极性(例如,玉米油)和高极性(例如,木质素衍生的低聚物)杂质。将产物3涂在硅胶柱的顶部(硅胶重量为~40g),并用丙酮/己烷的混合物(v/v范围为0:1至1:1)冲洗色谱柱。收集富含阿魏酸的馏分并浓缩,得到产物4(阿魏酸阶梯收率为86%,阿魏酸纯度为74%)。将产物4加入15mL水(pH=6)中,并将混合物加热至沸腾,以获得淡黄色液体部分和部分沉淀。液体部分在热时过滤,然后冷却至室温。然后将溶液在4℃下静置6小时,使阿魏酸沉淀。沉淀完成后,过滤混合物以收集产物5(阿魏酸的步长收率为50-90%,>阿魏酸纯度为95%)。如果需要,可以重复热水过滤步骤以进一步提高纯度。
示例5
如图4所示,将2L粗提取混合物1(反应提取的富阿魏酸液体产物)在55℃下通过真空蒸发浓缩至2(180mL)。通过加入盐酸将浓缩混合物2的pH调节至3-4。搅拌后,将酸化的2缓慢加入540mL乙酸乙酯中,并将混合物在25℃下搅拌3小时。或者,在将粗提取混合物1部分浓缩至约180mL并酸化后,可以将剩余的液体喷雾干燥以形成粉末状固体,并加入到用于选择性溶解的乙酸乙酯溶液3中。搅拌后,观察到液体的两相(有机和水)。使用分液漏斗分离有机层并浓缩,以达到产品3(阿魏酸的阶梯收率为96%,阿魏酸纯度为20%)。选择性溶解在乙酸乙酯中可以去除水溶性杂质,包括但不限于盐、糖、碳水化合物等。在下一步中,通过用己烷提取去除玉米油等低极性杂质。将产物3以1:10的体积比缓慢加入搅拌后的己烷溶剂中。将混合物在25℃下快速搅拌0.5小时。收集富含己烷的液体部分。如果需要,重复己烷提取步骤2-3次。己烷提取后,产物3(原来深色油状液体)变成高粘度半固体(产物4,阿魏酸工艺收率86%,阿魏酸纯度31%,未观察到玉米油)。将产物4加入15mL水(pH=6)中,将混合物加热至沸腾,以获得淡黄色液体层和少量深色油状层。淡黄色液体部分在热时过滤,冷却至室温。然后将溶液在4℃下静置6小时,使阿魏酸沉淀。沉淀完成后,将混合物过滤以收集产物5(阿魏酸的阶梯收率为40-90%,>阿魏酸纯度为90%)。热水过滤步骤重复一次,将阿魏酸纯度提高到>95%。图10提供了本例中描述的提取过程后纯化的示例。
示例6
如图5所示,将2L粗提取混合物1(反应提取的富含阿魏酸的液体产物)在55℃下通过真空蒸发浓缩至2(180mL)。通过加入盐酸将浓缩混合物2的pH调节至3-4。搅拌后,将酸化的2缓慢加入540mL乙酸乙酯中,并将混合物在25℃下搅拌3小时。或者,在将粗提取混合物1部分浓缩至约180mL并酸化后,可以将剩余的液体喷雾干燥以形成粉末状固体,并加入到用于选择性溶解的乙酸乙酯溶液3中。搅拌后,观察到液体的两相(有机和水)。使用分液漏斗分离有机层并浓缩,以达到产品3(阿魏酸的阶梯收率为96%,阿魏酸纯度为20%)。在乙酸乙酯中的选择性溶解可以去除水溶性杂质。在下一步中,通过用己烷提取去除玉米油等低极性杂质。将挥发物含量低于15重量%的产品3缓慢加入到搅拌的己烷溶剂中,体积比为1:10。将混合物在25℃下快速搅拌0.5小时。获得三种馏分:淡黄色液体(富含己烷层)、浅棕色细粉和深棕色粘稠半固体。浅褐色细粉可自由移动,经过滤干燥成回收率为21%,纯度为85%的阿魏酸细粉(产物4)。除去淡黄色液体(富含己烷层)和细粉后,将深棕色粘稠的半固体与10mL丙酮接触,并将混合物在25℃下搅拌10分钟。观察到一层细小的沉淀物。向该混合物中再加入5mL己烷以沉淀更多固体。通过过滤除去沉淀物,浓缩己烷/丙酮溶液,得到产物5。(阿魏酸阶梯收率为73%,阿魏酸纯度为50%)。产品4和产品5均采用实施例2所述的热水过滤工艺进行纯化,以达到40-90%的阶梯收率和>90%的阿魏酸纯度。重复热水过滤步骤,将阿魏酸纯度提高到>95%。
示例7
如图6所示,在55℃下通过真空蒸发将2L粗提取混合物1浓缩至2(180mL)。通过加入盐酸将浓缩混合物2的pH调节至3-4。搅拌后,将酸化的2缓慢加入540mL乙酸乙酯中,并将混合物在25℃下搅拌3小时。或者,在将粗提取混合物1部分浓缩至约180mL并酸化后,可以将剩余的液体喷雾干燥以形成粉末状固体,并加入到用于选择性溶解的乙酸乙酯溶液3中。搅拌后,观察到液体的两相(有机和水)。使用分液漏斗分离有机层并浓缩,以达到产品3(96%阶梯收率,20%阿魏酸纯度)。在乙酸乙酯中的选择性溶解可以去除水溶性杂质。在下一步中,通过用己烷提取去除玉米油等低极性杂质。将挥发物含量低于15重量%的产品3缓慢加入到搅拌的己烷溶剂中,体积比为1:10。将混合物在25℃下快速搅拌0.5小时。获得三种馏分:淡黄色液体(富含己烷层)、浅棕色细粉和深棕色粘稠半固体。浅褐色细粉可自由移动,经过滤干燥成阿魏酸回收率为21%,阿魏酸纯度为85%的细粉(产物4)。除去淡黄色液体(富含己烷层)和细粉后,将深棕色粘稠的半固体与10mL丙酮接触,并将混合物在25℃下搅拌10分钟。观察到一层细小的沉淀物。向该混合物中再加入5mL己烷以沉淀更多固体。通过过滤除去沉淀物,浓缩己烷/丙酮溶液,得到产物5。(阶梯收率为73%,阿魏酸纯度为50%)。将产物5施加在短硅胶柱(硅胶重量为~20g)的顶部,并用丙酮/己烷的混合物(v/v=1:1)冲洗该柱。收集并浓缩富含阿魏酸的馏分,以达到产品6(86%的阶梯收率,>50%的阿魏酸纯度)。产品4和产品6均使用实施例2所述的热水过滤进行纯化,以达到40-90%的阶梯收率和>90%的阿魏酸纯度。重复热水过滤步骤,将阿魏酸纯度提高到>95%。
示例8
如图7所示,将2L粗提取混合物1(反应提取的富含阿魏酸的液体产物)在55℃下通过真空蒸发浓缩至2(30mL)。或者,在粗提取混合物1的部分浓缩之后,可以将剩余的液体喷雾干燥以形成粉末状固体(产物2)并施加到硅胶柱上。将产品2施加在硅胶柱的顶部(硅胶重量为>100g),并用丙酮/己烷的混合物冲洗色谱柱(v/v范围为0:1至1:1)。收集富阿魏酸馏分并浓缩,得到产物3(阿魏酸阶梯收率86%,阿魏酸纯度60%)。将产物3加入15mL水(pH=6)中,将混合物加热至沸腾,以获得淡黄色液体部分和部分沉淀。液体部分在热时过滤,然后冷却至室温。然后将溶液在4℃下静置6小时,使阿魏酸沉淀。沉淀完成后,将混合物过滤以收集产物4(阿魏酸的步进收率为50-90%,>阿魏酸纯度为90%)。重复热水过滤步骤,将阿魏酸纯度提高到>95%。
示例9
如图8所示,2L粗提取混合物1(反应提取的富阿魏酸液体产物)在55℃下通过真空蒸发浓缩至2(接近干燥)。产品2与液氮或乾冰混合,变成固态。将固体在低于10℃的温度下研磨成粉末(产物3)。或者,在将粗提取混合物浓缩至2(接近干燥)后,可以将液体喷雾干燥以形成粉末状固体。将冷研磨或喷雾干燥的粉末加入50mL水(pH=6)中,并将混合物快速加热至沸腾,以获得淡黄色液体部分、深色油状部分和部分沉淀物。液体部分在热时过滤,然后冷却至室温。然后将溶液在4℃下静置6小时,使阿魏酸沉淀。沉淀完成后,过滤混合物以收集产物4(阿魏酸的收率为50-95%,>阿魏酸纯度为30%)。向产物4中加入20mL乙酸乙酯,以提取阿魏酸产物,同时析出水溶性杂质。将乙酸乙酯馏分浓缩至产物5(阿魏酸的阶梯收率为50-95%,>30%的阿魏酸纯度),用10mL己烷提取,除去玉米油,得到产物6(阿魏酸阶梯收率为50-95%,>阿魏酸纯度为35%)。将产物6加入15mL水(pH=6)中,将混合物加热至沸腾,以获得淡黄色液体部分和部分沉淀。液体部分在加热时过滤,然后冷却至室温。然后将溶液在4℃下静置6小时,使阿魏酸沉淀。沉淀完成后,将混合物过滤以收集产物7(阿魏酸的收率为50-90%,>80%的阿魏酸纯度)。重复热水过滤步骤,将阿魏酸纯度提高到>95%。
实施例10
如图9所示,将2L粗提取混合物1(反应提取的富含阿魏酸液体产物)在55℃下通过真空蒸发浓缩至2(180mL)。通过加入盐酸将浓缩混合物2的pH调节至3-4。搅拌后,将酸化的2缓慢加入540mL乙酸乙酯中,并将混合物在25℃下搅拌3小时。搅拌后,观察到液体的两相(有机和水)。使用分液漏斗分离有机层并浓缩,以达到产品3(96%阶梯收率,20%阿魏酸纯度)。或者,在对粗提取混合物1进行部分浓缩之后,可以将剩余的液体喷雾干燥以形成粉末状固体,并加入到步骤3的选择性溶解中。在乙酸乙酯中的选择性溶解可以去除含有阿魏酸产物的有机相中的水溶性杂质。将产物3加入30mL水(pH=6)中,将混合物快速加热至沸腾,以获得淡黄色液体部分、深油状部分和部分沉淀物。液体部分在热时过滤,然后冷却至室温。然后将溶液在4℃下静置6小时,使阿魏酸沉淀。沉淀完成后,将混合物过滤以收集产物4(50-95%的阶梯收率,>30%的阿魏酸纯度)。用10mL己烷提取产品4以除去玉米油并获得产品5(50-95%的阶梯收率,>35%的阿魏酸纯度)。将产物5加入15mL水(pH=6)中,将混合物加热至沸腾,以获得淡黄色液体部分和部分沉淀。液体部分在加热时过滤,然后冷却至室温。然后将溶液在4℃下静置6小时,使阿魏酸沉淀。沉淀完成后,将混合物过滤以收集产物6(50-90%的阶梯收率,>80%的阿魏酸纯度)。重复热水过滤步骤,将阿魏酸纯度提高到>95%。
实施例11
使用实施例10中纯化的阿魏酸将90%纯度的阿魏酸转化为香兰素。在本例中,通过将来自琼脂平板或冻存细胞样品的支链淀粉属ATCC39116细胞加入含有30mL无菌发酵液的250mL挡板锥形瓶中来制备种子培养液,该培养液由4g/L酵母提取物组成;0.2g/L氯化钠;0.05g/L二水氯化钙;0.2g/L七水硫酸镁;4g/L磷酸二氢钠、1g/L磷酸二氢钾、10g/L葡萄糖。将培养液置于振荡培养箱中18小时(28℃,180rpm)。随后使用种子培养液以4%v/v接种30mL生产培养液。将生产培养液置于振荡培养箱中约48小时或直到培养液达到15-20的OD600(600纳米下光密度),此时通过添加浓度为6g/L的阿魏酸开始生物转化。在添加之前,将阿魏酸溶解在1M NaOH中,并通过0.22微米过滤器过滤。将培养液在28℃下以180rpm进一步培养,并在16-36小时后取样进行分析。采用HPLC分析阿魏酸的转化和代谢物的形成。HPLC分析显示,使用纯度为90%的样品反应20小时后,香兰素的摩尔产率最高可达58%。
实施例12
将99%纯度的市售阿魏酸转化为香兰素。在本例中,通过添加Amycolatopsissp.来制备种子培养液。将琼脂平板或冻存细胞样品中的细胞ATCC39116放入含有30mL无菌发酵液的250mL挡板锥形瓶中,该培养瓶由4g/L酵母提取物组成;0.2g/L氯化钠;0.05g/L二水氯化钙;0.2g/L七水硫酸镁;4g/L磷酸二氢钠、1g/L磷酸二氢钾、10g/L葡萄糖。将培养液置于振荡培养箱中18小时(28℃,180rpm)。随后使用种子培养液以4%v/v接种30mL生产培养液。将生产培养液置于振荡培养箱中约48小时或直到培养液达到15-20的OD600,此时通过添加最终浓度为6g/L(CAS:1135-24-6)的市售纯阿魏酸开始生物转化,在添加之前,将阿魏酸溶解在1M NaOH中并通过0.22um过滤器过滤。将培养液在28℃下以180rpm进一步培养,并在16-36小时后取样进行分析。采用HPLC分析阿魏酸的转化和代谢物的形成。HPLC分析显示,使用纯度为90%的市售阿魏酸反应20小时后,香兰素的摩尔产率最高可达58%。
实施例13
在一个假设的例子中,实施例1-10的阿魏酸产物通过生物手段转化,产生香兰素终产物。阿魏酸转化为香兰素是通过已知将阿魏酸转化为香兰素的生物制剂实现的,包括但不限于:假单胞菌属,包括萤光假单胞菌、萤光假单胞菌BF13-1p4、恶臭假单胞菌、恶臭假单胞菌KT2440、Amycolatopsis sp.,包括Amycolatopsis sp.ATCC 39116(也称为Streptomyces setonii)、Amycolatopsis sp.HR 167、Streptomyces sp.,包括,链霉菌菌株V-1、酸性片球菌、肠杆菌Px6-4、大肠杆菌、大肠杆菌JM109/pBB1、金孢子菌、金孢子菌NCIM 1197、朱砂霉菌和/或黑曲霉菌。该用于将阿魏酸转化为香兰素的生物制剂清单并非详尽无遗,并且需要注意的是,本领域技术人员将了解可用于完成阿魏酸向香兰素转化的其它微生物和生物制剂。微生物可以使用常规培养液和方法在摇瓶或生物反应器中培养,使用间歇或连续进料底物和其他营养物质。培养装置可以包括由琼脂、琼脂糖、海藻酸盐、聚氨酯泡沫或其他类似的合适的凝胶状或固体材料组成的固相,以支持微生物生长。培养装置还可以包括用于吸附基质和/或产品的树脂,以促进产品的进料和收获,并增加通过系统的通量。
实施例14
在一个假设的例子中,实施例1-10中纯度低于95%的阿魏酸通过生物手段转化,以生产香兰素终产物。阿魏酸转化为香兰素是通过已知将阿魏酸转化为香兰素的生物制剂实现的,包括但不限于:假单胞菌属,包括萤光假单胞菌、萤光假单胞菌BF13-1p4、恶臭假单胞菌、恶臭假单胞菌KT2440、Amycolatopsis sp.,包括Amycolatopsis sp.ATCC 39116(也称为Streptomyces setonii)、Amycolatopsis sp.HR 167、Streptomyces sp.,包括,链霉菌菌株V-1、酸性片球菌、肠杆菌Px6-4、大肠杆菌、大肠杆菌JM109/pBB1、金孢子菌、金孢子菌NCIM 1197、朱砂霉菌和/或黑曲霉菌。该用于将阿魏酸转化为香兰素的生物制剂清单并非详尽无遗,并且需要注意的是,本领域技术人员将了解可用于完成阿魏酸向香兰素转化的其它微生物和生物制剂。微生物可以使用常规培养基和方法在摇瓶或生物反应器中培养,使用间歇或连续进料底物和其他营养物质。培养装置可以包括由琼脂、琼脂糖、海藻酸盐、聚氨酯泡沫或其他类似的合适的凝胶状或固体材料组成的固相,以促进微生物生长。培养装置还可以包括用于吸附基质和/或产品的树脂,以促进产品的进料和收获,并增加通过系统的通量。
实施例15
在一个假设的例中,将乙酸乙酯溶剂从实施例1a-f的阿魏酸产物中除去,并通过生物手段将阿魏酸产物转化为香兰素终产物。阿魏酸转化为香兰素是通过已知将阿魏酸转化为香兰素的生物制剂实现的,包括但不限于:假单胞菌属,包括萤光假单胞菌、萤光假单胞菌BF13-1p4、恶臭假单胞菌、恶臭假单胞菌KT2440、Amycolatopsis sp.,包括Amycolatopsis sp.ATCC 39116(也称为Streptomyces setonii)、Amycolatopsis sp.HR167、Streptomyces sp.,包括,链霉菌菌株V-1、酸性片球菌、肠杆菌Px6-4、大肠杆菌、大肠杆菌JM109/pBB1、金孢子菌、金孢子菌NCIM 1197、朱砂霉菌和/或黑曲霉菌。该用于将阿魏酸转化为香兰素的生物制剂清单并非详尽无遗,并且需要注意的是,本领域技术人员将了解可用于完成阿魏酸向香兰素转化的其它微生物和生物制剂。微生物可以使用常规培养基和方法在摇瓶或生物反应器中培养,使用间歇或连续进料底物和其他营养物质。培养装置可以包括由琼脂、琼脂糖、海藻酸盐、聚氨酯泡沫或其他类似的合适的凝胶状或固体材料组成的固相,以促进微生物生长。培养装置还可以包括用于吸附基质和/或产品的树脂,以促进产品的进料和收获,并增加通过系统的通量。
实施例16
在一个假设的例子中,乙酸乙酯溶剂从约33%的纯阿魏酸产品中除去。然后通过生物手段将所得的阿魏酸转化为香兰素的最终产品。阿魏酸转化为香兰素是通过已知将阿魏酸转化为香兰素的生物制剂实现的,包括但不限于:假单胞菌属,包括萤光假单胞菌、萤光假单胞菌BF13-1p4、恶臭假单胞菌、恶臭假单胞菌KT2440、Amycolatopsis sp.,包括Amycolatopsis sp.ATCC 39116(也称为Streptomyces setonii)、Amycolatopsis sp.HR167、Streptomyces sp.,包括,链霉菌菌株V-1、酸性片球菌、肠杆菌Px6-4、大肠杆菌、大肠杆菌JM109/pBB1、金孢子菌、金孢子菌NCIM 1197、朱砂霉菌和/或黑曲霉菌。该用于将阿魏酸转化为香兰素的生物制剂清单并非详尽无遗,并且需要注意的是,本领域技术人员将了解可用于完成阿魏酸向香兰素转化的其它微生物和生物制剂。微生物可以使用常规培养基和方法在摇瓶或生物反应器中培养,使用间歇或连续进料底物和其他营养物质。培养装置可以包括由琼脂、琼脂糖、海藻酸盐、聚氨酯泡沫或其他类似的合适的凝胶状或固体材料组成的固相,以促进微生物生长。培养装置还可以包括用于吸附基质和/或产品的树脂,以促进产品的进料和收获,并增加通过系统的通量。
实施例17
在一个假设的例子中,从实施例3的选择性溶解产物中除去乙酸乙酯溶剂,得到纯度约为40%的阿魏酸。然后通过生物手段将所得的阿魏酸转化为香兰素的最终产品。阿魏酸转化为香兰素是通过已知将阿魏酸转化为香兰素的生物制剂实现的,包括但不限于:假单胞菌属,包括萤光假单胞菌、萤光假单胞菌BF13-1p4、恶臭假单胞菌、恶臭假单胞菌KT2440、Amycolatopsis sp.,包括Amycolatopsis sp.ATCC 39116(也称为Streptomycessetonii)、Amycolatopsis sp.HR 167、Streptomyces sp.,包括,链霉菌菌株V-1、酸性片球菌、肠杆菌Px6-4、大肠杆菌、大肠杆菌JM109/pBB1、金孢子菌、金孢子菌NCIM 1197、朱砂霉菌和/或黑曲霉菌。该用于将阿魏酸转化为香兰素的生物制剂清单并非详尽无遗,并且需要注意的是,本领域技术人员将了解可用于完成阿魏酸向香兰素转化的其它微生物和生物制剂。微生物可以使用常规培养基和方法在摇瓶或生物反应器中培养,使用间歇或连续进料底物和其他营养物质。培养装置可以包括由琼脂、琼脂糖、海藻酸盐、聚氨酯泡沫或其他类似的合适的凝胶状或固体材料组成的固相,以促进微生物生长。培养装置还可以包括用于吸附基质和/或产品的树脂,以促进产品的进料和收获,并增加通过系统的通量。
实施例18
在一个假设的例子中,纯度小于90%的阿魏酸通过生物手段转化,产生香兰素终产物。香兰素产品包含在独特的产品混合物中,其中来自初始阿魏酸的杂质存在于香兰素产品混合物中。阿魏酸转化为香兰素是通过已知将阿魏酸转化为香兰素的生物制剂实现的,包括但不限于:假单胞菌属,包括萤光假单胞菌、萤光假单胞菌BF13-1p4、恶臭假单胞菌、恶臭假单胞菌KT2440、Amycolatopsis sp.,包括Amycolatopsis sp.ATCC 39116(也称为Streptomyces setonii)、Amycolatopsis sp.HR 167、Streptomyces sp.,包括,链霉菌菌株V-1、酸性片球菌、肠杆菌Px6-4、大肠杆菌、大肠杆菌JM109/pBB1、金孢子菌、金孢子菌NCIM 1197、朱砂霉菌和/或黑曲霉菌。该用于将阿魏酸转化为香兰素的生物制剂清单并非详尽无遗,并且需要注意的是,本领域技术人员将了解可用于完成阿魏酸向香兰素转化的其它微生物和生物制剂。微生物可以使用常规培养基和方法在摇瓶或生物反应器中培养,使用间歇或连续进料底物和其他营养物质。培养装置可以包括由琼脂、琼脂糖、海藻酸盐、聚氨酯泡沫或其他类似的合适的凝胶状或固体材料组成的固相,以促进微生物生长。培养装置还可以包括用于吸附基质和/或产品的树脂,以促进产品的进料和收获,并增加通过系统的通量。用于本示例的≤90%纯阿魏酸含有≥10%木质素或木质素衍生化合物作为污染物。产品混合物含有22.5-90%的香兰素;0-67.5%其他生物制品,包括但不限于愈创木酚、香草酸、香草醇、4-乙烯基愈创木酚、原儿茶酸、儿茶酚和阿魏酸;和0-10%木质素或木质素衍生化合物。
实施例19
在一个假设的例子中,纯度小于80%的阿魏酸通过生物手段转化,产生香兰素终产物。香兰素产品包含在独特的产品混合物中,其中来自初始阿魏酸的杂质存在于香兰素产品混合物中。阿魏酸转化为香兰素是通过已知将阿魏酸转化为香兰素的生物制剂实现的,包括但不限于:假单胞菌属,包括萤光假单胞菌、萤光假单胞菌BF13-1p4、恶臭假单胞菌、恶臭假单胞菌KT2440、Amycolatopsis sp.,包括Amycolatopsis sp.ATCC 39116(也称为Streptomyces setonii)、Amycolatopsis sp.HR 167、Streptomyces sp.,包括,链霉菌菌株V-1、酸性片球菌、肠杆菌Px6-4、大肠杆菌、大肠杆菌JM109/pBB1、金孢子菌、金孢子菌NCIM 1197、朱砂霉菌和/或黑曲霉菌。该用于将阿魏酸转化为香兰素的生物制剂清单并非详尽无遗,并且需要注意的是,本领域技术人员将了解可用于完成阿魏酸向香兰素转化的其它微生物和生物制剂。微生物可以使用常规培养基和方法在摇瓶或生物反应器中培养,使用间歇或连续进料底物和其他营养物质。培养装置可以包括由琼脂、琼脂糖、海藻酸盐、聚氨酯泡沫或其他类似的合适的凝胶状或固体材料组成的固相,以促进微生物生长。培养装置还可以包括用于吸附基质和/或产品的树脂,以促进产品的进料和收获,并增加通过系统的通量。用于本示例的≤80%纯阿魏酸含有≥20%木质素或木质素衍生化合物作为污染物。产品混合物含有20-80%的香兰素;0-60%其他生物製品,包括但不限于愈创木酚、香草酸、香草醇、4-乙烯基愈创木酚、原儿茶酸、儿茶酚和阿魏酸;和0-20%木质素或木质素衍生化合物。
实施例20
在一个假设的例子中,纯度小于60%的阿魏酸通过生物手段转化,生产出香兰素终产物。香兰素产品包含在独特的产品混合物中,其中来自初始阿魏酸的杂质存在于香兰素产品混合物中。阿魏酸转化为香兰素是通过已知将阿魏酸转化为香兰素的生物制剂实现的,包括但不限于:假单胞菌属,包括萤光假单胞菌、萤光假单胞菌BF13-1p4、恶臭假单胞菌、恶臭假单胞菌KT2440、Amycolatopsis sp.,包括Amycolatopsis sp.ATCC 39116(也称为Streptomyces setonii)、Amycolatopsis sp.HR 167、Streptomyces sp.,包括,链霉菌菌株V-1、酸性片球菌、肠杆菌Px6-4、大肠杆菌、大肠杆菌JM109/pBB1、金孢子菌、金孢子菌NCIM 1197、朱砂霉菌和/或黑曲霉菌。该用于将阿魏酸转化为香兰素的生物制剂清单并非详尽无遗,并且需要注意的是,本领域技术人员将了解可用于完成阿魏酸向香兰素转化的其它微生物和生物制剂。微生物可以使用常规培养基和方法在摇瓶或生物反应器中培养,使用间歇或连续进料底物和其他营养物质。培养装置可以包括由琼脂、琼脂糖、海藻酸盐、聚氨酯泡沫或其他类似的合适的凝胶状或固体材料组成的固相,以促进微生物生长。培养装置还可以包括用于吸附基质和/或产品的树脂,以促进产品的进料和收获,并增加通过系统的通量。用于本示例的小于60%纯阿魏酸含有0-40%木质素或木质素衍生化合物和0-40%碳水化合物、半纤维素或碳水化合物衍生物作为污染物。产品混合物含有15-60%的香兰素;0-45%其他生物製品,包括但不限于愈创木酚、香草酸、香草醇、4-乙烯基愈创木酚、原儿茶酸、儿茶酚、阿魏酸;和0-40%木质素或木质素衍生化合物;以及0-40%的碳水化合物、半纤维素或碳水化合物衍生材料。
实施例21
在一个预言性的例子中,纯度小于30%的阿魏酸通过生物手段转化,产生香兰素终产物。香兰素产品包含在独特的産品混合物中,其中来自初始阿魏酸的杂质存在于香兰素产品混合物中。阿魏酸转化为香兰素是通过已知将阿魏酸转化为香兰素的生物制剂实现的,包括但不限于:假单胞菌属,包括萤光假单胞菌、萤光假单胞菌BF13-1p4、恶臭假单胞菌、恶臭假单胞菌KT2440、Amycolatopsis sp.,包括Amycolatopsis sp.ATCC 39116(也称为Streptomyces setonii)、Amycolatopsis sp.HR 167、Streptomyces sp.,包括,链霉菌菌株V-1、酸性片球菌、肠杆菌Px6-4、大肠杆菌、大肠杆菌JM109/pBB1、金孢子菌、金孢子菌NCIM 1197、朱砂霉菌和/或黑曲霉菌。该用于将阿魏酸转化为香兰素的生物制剂清单并非详尽无遗,并且需要注意的是,本领域技术人员将了解可用于完成阿魏酸向香兰素转化的其它微生物和生物制剂。微生物可以使用常规培养基和方法在摇瓶或生物反应器中培养,使用间歇或连续进料底物和其他营养物质。培养装置可以包括由琼脂、琼脂糖、海藻酸盐、聚氨酯泡沫或其他类似的合适的凝胶状或固体材料组成的固相,以促进微生物生长。培养装置还可以包括用于吸附基质和/或产品的树脂,以促进产品的进料和收获,并增加通过系统的通量。用于本示例的小于30%纯度的阿魏酸含有0-70%木质素或木质素衍生化合物和0-50%碳水化合物、半纤维素或碳水化合物衍生物作为污染物。产品混合物含有7.5-30%的香兰素;0-22.5%其他生物製品,包括但不限于愈创木酚、香草酸、香草醇、4-乙烯基愈创木酚、原儿茶酸、儿茶酚和阿魏酸;和0-70%木质素或木质素衍生化合物;以及0-50%的碳水化合物、半纤维素或碳水化合物衍生材料。
实施例22
在一个假设的例子中,纯度小于20%的阿魏酸通过生物手段转化,产生香兰素终产物。香兰素产品包含在独特的产品混合物中,其中来自初始阿魏酸的杂质存在于香兰素产品混合物中。阿魏酸转化为香兰素是通过已知将阿魏酸转化为香兰素的生物制剂实现的,包括但不限于:假单胞菌属,包括萤光假单胞菌、萤光假单胞菌BF13-1p4、恶臭假单胞菌、恶臭假单胞菌KT2440、Amycolatopsis sp.,包括Amycolatopsis sp.ATCC 39116(也称为Streptomyces setonii)、Amycolatopsis sp.HR 167、Streptomyces sp.,包括,链霉菌菌株V-1、酸性片球菌、肠杆菌Px6-4、大肠杆菌、大肠杆菌JM109/pBB1、金孢子菌、金孢子菌NCIM 1197、朱砂霉菌和/或黑曲霉菌。该用于将阿魏酸转化为香兰素的生物制剂清单并非详尽无遗,并且需要注意的是,本领域技术人员将了解可用于完成阿魏酸向香兰素转化的其它微生物和生物制剂。微生物可以使用常规培养基和方法在摇瓶或生物反应器中培养,使用间歇或连续进料底物和其他营养物质。培养装置可以包括由琼脂、琼脂糖、海藻酸盐、聚氨酯泡沫或其他类似的合适的凝胶状或固体材料组成的固相,以促进微生物生长。培养装置还可以包括用于吸附基质和/或产品的树脂,以促进产品的进料和收获,并增加通过系统的通量。用于本示例的小于20%纯度的阿魏酸含有0-70%木质素或木质素衍生化合物,0-60%碳水化合物或碳水化合物衍生物,以及0-30%蛋白质、氨基酸或蛋白质衍生物作为污染物。产品混合物含有5-20%的香兰素;0-15%其他代谢物,包括但不限于愈创木酚、香草酸、香草醇、4-乙烯基愈创木酚、原儿茶酸和儿茶酚;和0-70%木质素或木质素衍生化合物;和0-60%的碳水化合物或碳水化合物衍生材料;以及0-30%的蛋白质、氨基酸或蛋白质衍生物。
在描述了各种过程和系统之后,某些方面可以包括但不限于:
在第一个方面,有机分子与生物质分离的过程包括生物质与碱接触;根据碱与生物质的反应从生物质中提取产品以形成浆料;过滤浆料以回收液相和固相,其中液相包括产品,其中产品包括:a)阿魏酸盐、香豆酸盐、阿魏酸、香豆酸或其任意组合;并将产物与液相分离。
第二个方面可以包括第一个方面的方法,其中生物质含有水分。
第三方面可以包括第一或第二方面的方法,其中生物质具有0.1至75重量%的水。
第四方面可以包括第一至第三方面中的任何一个的方法,还包括将生物质与溶剂接触,其中溶剂包括水、醇、丙酮、有机溶剂或其任意组合。
第五方面可以包括第一至第四方面中的任何一个的方法,其中碱的浓度在约0.01M至约6M之间。
第六方面可以包括第一至第五方面中的任何一个的方法,其中溶剂与生物质在干重上的比例在约1:1至约30:1之间,或在约1:1至25:1之间。
第七方面可以包括第一至第六方面中任一的方法,还包括:用含有醇、丙酮、乙醚、有机溶剂或其任意组合的溶剂冲洗固体产物以回收液相,其中该液相与其他液相合并。
第八方面可以包括第一至第三方面中任一的方法,其中将产物与液相分离包括:将液相浓缩为粘稠的液体或半固体;将粘稠的液体或半固体溶解在有机溶剂中;形成有机溶剂相,其中有机溶剂相至少包括产品的一部分。
第九方面可以包括第八方面的方法,其中大多数一种或多种副产物保持未溶解在有机溶剂中。
第十方面可以包括第八或第九方面的方法,其中有机溶剂包括己烷、庚烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醚、脂肪醇或其任意组合中的至少一种。
第十一个方面可以包括第八至第十方面中的任何一个的方法,还包括:从有机溶剂相中除去至少一部分有机溶剂以回收产物。
第十二方面可以包括第一至第十一个方面中的任何一个的方法,其中生物质与碱和溶剂的接触发生在约5至200℃的温度之间。
第十三个方面可以包括第一至第十一个方面中的任何一个的方法,其中生物质与碱和溶剂的接触发生在约10至90℃的温度之间,或低于约35℃,或小于或等于30℃。
第十四方面可以包括第十三方面的方法,其中液相不包含酚类木质素,或包含少于1%的酚类木质素分子。
第十五方面可以包括第一至第十四方面中的任何一个的方法,还包括:在将产物与液相分离之前水解液相。
第十六方面可以包括第十五方面的方法,其中水解液相包括:使用碱性或酸性水解将液相内的阿拉伯木聚糖或半纤维素水解为阿拉伯糖、木糖或其任意组合。
第十七个方面可以包括第十五或第十六方面的方法,还包括:水解后液相与有机溶剂接触;形成有机溶剂相,其中有机溶剂相至少包括产品的一部分。
第十八方面可以包括第一至第十七方面中的任何一个的方法,还包括:向液相中加入醇、醚、丙酮、己烷、庚烷、有机溶剂或其任意组合;以及由于加入醇而从液相中沉淀阿拉伯木聚糖或半纤维素。
第十九方面可以包括第十八方面的方法,其中,将溶剂加入到浓度等于或大于10重量%或大于40重量%的液相中。
第二十个方面可以包括第一至第十九方面中的任何一个的方法,还包括:将产品的至少一部分转化为香兰素。
在第二十一条技术中,一种纯化含有阿魏酸或阿魏酸盐的液体产品的方法,该方法包括提供一种含有水相和产物的液体产品,其中该产品包含阿魏酸、阿魏酸或其任意组合中的至少一种;并将产品的至少一部分从水相中分离出来。
第二十二方面可以包括第二十一方面的方法,其中,分离部分产品包括使用浓缩、选择性溶解、吸附、热水过滤、热水过滤、有机溶剂提取、沉淀、升华、阳离子交换、阴离子交换、树脂吸附、超滤、微滤、纳滤或其任意组合。
第二十三方面可以包括第二十一方面的方法,其中,分离分部产品包括:利用蒸发使产品在水相中浓缩以形成浓缩物;并将浓缩物的pH值调节至约1-5之间。
第二十四方面可以包括第二十三方面的方法,还包括:将浓缩物与有机溶剂接触,形成有机相和水相;将大部分产物溶解在有机相中;将有机相与水相分离;并从有机相中除去至少一部分有机溶剂,以形成浓缩产物混合物。
第二十五方面可以包括第二十四方面的方法,还包括:将浓缩产物混合物通过二氧化硅、氧化铝、阳离子交换、阴离子交换或树脂基柱;用稀释剂冲洗色谱柱;从色谱柱上收集洗脱液;并浓缩洗脱液以形成富集的产物混合物。
第二十六方面可以包括第二十五方面的方法,还包括:将富集产物混合物与水混合形成溶液;将溶液加热至室温以上;形成液体部分和固体沉淀,以回应于将富集产物混合物与水混合并加热溶液;将固体沉淀物与液体部分分离;将液体部分冷却至室温以下;在冷却反应中形成产物沉淀;将产物沉淀物从液体部分分离,其中产物沉淀物包含浓度大于30%、60%或80%纯度的产物。
第二十七个方面可以包括第二十四方面的方法,还包括:将浓缩产物混合物与有机溶剂接触,形成有机溶剂相,作为两相混合物的一部分;将低极性杂质提取到有机溶剂相中,使产品浓缩在浓缩产品混合物中;并将有机溶剂相与浓缩产物混合物分离。
第二十八方面可以包括第二十七个方面的方法,还包括:将浓缩产物混合物与水混合形成溶液;煮沸溶液;形成液体部分和固体沉淀;将固体沉淀物与液体部分分离;将液体部分冷却至室温以下;在冷却反应中形成产物沉淀;将产物沉淀物从液体部分分离,其中产物沉淀物包含浓度大于30%、60%或80%纯度的产物。
第二十九方面可以包括第二十四方面的方法,还包括:将浓缩产物混合物与有机溶剂接触;形成三相混合物,其中三相混合物包括:有机溶剂相、粘性相;和固相;从三相混合物中过滤固相,其中固相包括产品的一部分;将粘性相与有机溶剂相分离;粘性相与第二有机溶剂接触,形成第二有机相和第二固相;分离第二有机相;;通过除去至少一部分第二有机溶剂来浓缩第二有机相,以形成第二产物混合物;并将第二产物混合物和固相结合,形成第三产物混合物。
第三十个方面可以包括第二十九方面的方法,还包括:将第三产品混合物与水结合形成溶液;煮沸溶液;形成液体部分和固体沉淀,以回应于将富集产物混合物与水混合并加热溶液;将固体沉淀物与液体部分分离;将液体部分冷却至室温以下;在冷却反应中形成产物沉淀;将产物沉淀物从液体部分分离,其中产物沉淀物包含浓度大于30%、60%或80%纯度的产物。
第三十一方面可以包括第二十四方面的方法,还包括:将浓缩产物混合物与有机溶剂接触;响应接触形成三相混合物,其中三相混合物包括:有机溶剂相、粘性相;和固相;从三相混合物中过滤固相,其中固相包括产品的一部分;将粘性相与有机溶剂相分离;粘性相与第二有机溶剂接触,形成第二有机相和第二固相;分离第二有机相;并通过除去至少一部分第二有机溶剂来浓缩第二有机相,以形成第二产物混合物。
第三十二方面可以包括第三十一方面的方法,还包括:使第二产物混合物通过凝胶柱;用稀释剂冲洗凝胶柱;从凝胶柱中收集洗脱液;并浓缩洗脱液以形成富集的产物混合物。
第三十三方面可以包括第二十一方面的方法,其中分离产品的至少部分包括:利用蒸发使产品在水相中浓缩以形成浓缩物;将浓缩物通过凝胶柱;用稀释剂冲洗凝胶柱;从凝胶柱中收集洗脱液;并浓缩洗脱液以形成富集的产物混合物。
第三十四方面可以包括第三十三方面的方法,进一步包括:将富集产物混合物与水结合形成溶液;煮沸溶液;形成液体部分和固体沉淀;将固体沉淀物与液体部分分离;将液体部分冷却至室温以下;在冷却反应中形成产物沉淀;将产物沉淀物与液体部分分离,其中产物沉淀物包含浓度大于80%纯度的产品。
第三十五方面可以包括第二十一方面的方法,其中分离产品的至少部分包括:利用蒸发使产品在水相中浓缩以形成浓缩物;冷却浓缩物形成固体;在低于10℃的温度下从固体中形成粉末或喷雾干燥形成固体;将粉末加入水性液体中形成混合物;将混合物煮沸;形成三相混合物,其中三相混合物包括液相、粘性相和固相;从三相混合物中分离液相;冷却液相形成沉淀;将沉淀物从液相中分离出来作为产物。
第三十六方面可以包括第三十五方面的方法,进一步包括:将液相与有机溶剂结合;液相与有机溶剂的结合而从液相中析出杂质;沉淀杂质后浓缩液相。
第三十七个方面可以包括第二十一至第三十六个方面中的任何一个的方法,其中,所述液体产物是从第一至第二十个方面的任何方法中获得的。
第三十八个方面可以包括第二十一至第三十六个方面中的任何一个的方法,还包括:将产品的至少一部分转化为香兰素。
第三十九方面可以包括第二十一至第三十六方面中的任何一个的方法,其中液体产品是从用于加工含有阿魏酸或阿魏酸盐的有机材料中使用的水中获得的。
第四十个方面可以包括第三十一至第三十六个方面中的任何一个的方法,其中纯度为≤90%的阿魏酸转化为香兰素,形成含有22.5-90%香兰素的产品混合物;0-67.5%生物制品,其中生物制品包括愈创木酚、香草酸、香草醇、4-乙烯基愈创木酚、原儿茶酸、儿茶酚和阿魏酸中的至少一种;和0-10%木质素或木质素衍生化合物。
第41方面可以包括第31至第36方面中任何一个方面的方法,其中纯度为≤80%的阿魏酸转化为香兰素,形成含有20-80%香兰素的产品混合物产品;0-60%的生物制品,包括香草酸、香草醇、4-乙烯基愈创木酚、原儿茶酸、邻苯二酚和阿魏酸中的至少一种;和0-20%木质素或木质素衍生化合物。
第四十二方面可以包括第三十一至第三十六方面中的任何一个的方法,其中将纯度为≤20%或纯度高达60%的阿魏酸转化为香兰素,形成含有5-60%香兰素的产品混合物产品;0-45%的生物制品,包括愈创木酚、香草酸、香草醇、4-乙烯基愈创木酚、原儿茶酸、儿茶酚和阿魏酸中的至少一种;0-70%木质素或木质素衍生化合物;0-60%碳水化合物,半纤维素或碳水化合物衍生物;以及0-30%的蛋白质、氨基酸或蛋白质衍生物。
在前面的讨论和权利要求中,“包括”这个术语是以开放行式使用的,因此应解释为“包括但不限于......”。至少公开了一个实施例,并且由具有本领域普通技术人员对实施例和/或实施例的特征所做的变化、组合和/或修改均在本公开范围内。由组合、集成和/或省略实施例的特征而产生的替代实施例也在公开的范围内。在明确说明数值范围或限制的情况下,此类明示范围或限制应理解为包括落在明确规定的范围或限制范围内的类似大小的反覆运算范围或限制(例如,从大约1到大约10包括2、3、4等;大于0.10包括0.11、0.12、0.13等)。例如,每当公开具有下限Rl和上限Ru的数值范围时,都会专门公开属于该范围的任何数位。具体地,具体公开了该范围内的以下数位:R=Rl+k*(Ru-Rl),其中k是1%到100%的变数,增量为1%,即k为1%,2%,3%,4%,5%,...,50%,51%,52%,...,95%,96%,97%,98%、99%或100%。此外,还特别公开了由上述定义的两个R数定义的任何数值范围。对权利要求的任何要素使用“选择性地”一词意味着该要素是必需的,或者不是必需的,这两种备选方案都在权利要求的范围内。使用较宽泛的术语,如包括、包括和具有,应理解为为扩展狭义术语,如组成、主要由和基本组成。因此,保护范围不受上述描述的限制,而由随后的权利要求界定,该范围包括权利要求标的物的所有等同物。每一项权利要求都作为进一步公开并入说明书中,并且这些权利要求是本发明的实施例。
Claims (27)
1.从生物质中分离有机分子的过程包括:
生物质与碱接触;
根据碱与生物质的反应从生物质中提取产品以形成浆料;
过滤浆料以回收液相和固相,其中液相包括产物,其中产物包括:阿魏酸盐、香豆酸盐、阿魏酸、香豆酸或其任意组合;
将产物与液相分离。
2.根据权利要求1所述的方法,还包括将生物质与溶剂接触,其特征在于,所述溶剂包括水、醇、丙酮、有机溶剂或其任意组合。
3.根据权利要求1所述的方法,还包括:用含有醇、丙酮、乙醚、有机溶剂或其任意组合的溶剂冲洗固体产物以回收第二液相,其中将第二液相合并到液相中。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述产物与液相分离包括:
将液相浓缩成粘稠的液体或半固体;和
将粘稠的液体或半固体溶解在有机溶剂中;
形成有机溶剂相,其中有机溶剂相至少包括产品的一部分。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述一种或多种副产物中的大多数仍未溶解在有机溶剂中。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述有机溶剂包含以下至少一种:己烷、庚烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醚、脂肪醇或其任何组合。
7.根据权利要求4所述的方法,还包括:从有机溶剂相中除去至少一部分有机溶剂以回收产物。
8.根据权利要求1所述的方法,还包括:
在将产品与液相分离之前水解液相。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述液相水解包括:
使用碱性或酸性水解将液相中的阿拉伯木聚糖水解为阿拉伯糖、木糖或其任何组合。
10.根据权利要求8所述的方法,还包括:
水解后液相与有机溶剂接触;
形成有机溶剂相,其中有机溶剂相至少包括产品的一部分。
11.根据权利要求1所述的方法,还包括;
在液相中加入醇、醚、丙酮、己烷、庚烷、有机溶剂或其任何组合;和
从液相中沉淀阿拉伯木聚糖或半纤维素。
12.根据权利要求11所述的方法,其特征在于,所述溶剂以等于或大于10重量%或大于40重量%的浓度加入液相中。
13.根据权利要求1所述的方法,还包括:
将至少一部分产品转化为香兰素。
14.一种纯化含有阿魏酸或阿魏酸盐的液体产品的方法,该方法包括:
提供一种液体产品,其中该产品包含阿魏酸、阿魏酸盐或其任意组合中的至少一种;和
将产品的至少一部分从水相中分离出来。
15.根据权利要求14所述的方法,其特征在于,分离产品的方法包括使用浓缩、选择性溶解、吸附、热水过滤、热水过滤、有机溶剂提取、沉淀、升华、阳离子交换、阴离子交换、树脂吸附、超滤、微滤、纳滤或其任意组合。
16.根据权利要求14所述的方法,其特征在于,分离产品的方法包括:
利用蒸发使产物在水相中浓缩,形成浓缩物;和
将浓缩液的pH值调节至约1-5之间。
17.根据权利要求16所述的方法,还包括:
浓缩物与有机溶剂接触,形成有机相和水相;
将大部分产物溶解在有机相中;
将有机相与水相分离;和
从有机相中除去至少一部分有机溶剂,形成浓缩产物混合物。
18.根据权利要求17所述的方法,还包括:
将浓缩产品混合物通过二氧化硅、氧化铝、阳离子交换、阴离子交换、活性炭或树脂基柱;
用稀释剂冲洗色谱柱;
从色谱柱上收集洗脱液;和
浓缩洗脱液以形成富含产物的混合物。
19.根据权利要求18所述的方法,还包括:
将富含产物的混合物与水混合形成溶液;
将溶液加热至室温以上;
形成液体部分和固体沉淀;
将固体沉淀物与液体部分分离;
将液体部分冷却至室温以下;
在冷却反应中形成产物沉淀;和
将产物沉淀物从液体部分分离,其中产物沉淀物包含纯度大于30%、60%或80%的产物。
20.根据权利要求17所述的方法,还包括:
将浓缩产物混合物与有机溶剂接触,形成有机溶剂相,作为两相混合物的一部分;
将低极性杂质提取到有机溶剂相中,使产品浓缩在混合物中;和
将有机溶剂相与浓缩产物混合物分离。
21.根据权利要求20所述的方法,还包括:
将浓缩产品混合物与水混合形成溶液;
煮沸溶液;
形成液体部分和固体沉淀;
将固体沉淀物与液体部分分离;
将液体部分冷却至室温以下;
在冷却反应中形成产物沉淀;和
将产物沉淀物从液体部分分离,其中产物沉淀物包含纯度大于30%、60%或80%的产物。
22.根据权利要求17所述的方法,还包括:
将浓缩产物混合物与有机溶剂接触;
形成三相混合物,其中三相混合物包括:有机溶剂相、粘性相;和固相;
从三相混合物中过滤固相,其中固相包括产品的一部分;
将粘性相与有机溶剂相分离;
粘性相与第二有机溶剂接触,形成第二有机相和第二固相;
分离第二有机相;和
通过除去至少一部分第二有机溶剂来浓缩第二有机相以形成第二产物混合物。
23.根据权利要求14-22中任一项的方法,还包括:
将至少一部分产品转化为香兰素。
24.根据权利要求14-22中任一项所述的方法,其特征在于,所述液体产品是从用于加工含有阿魏酸或阿魏酸盐的有机材料中获得的。
25.根据权利要求14-22中任一项的方法,其中纯度为≤90%的阿魏酸转化为香兰素,形成含有22.5-90%香兰素的产品混合物;0-67.5%的生物制品,其中,所述生物制品包括愈创木酚、香草酸、香草醇、4-乙烯基愈创木酚、原儿茶酸、儿茶酚和阿魏酸中的至少一种;以及0-10%木质素或木质素衍生化合物。
26.根据权利要求14-22中任一项的方法,其中将纯度为≤80%的阿魏酸转化为香兰素,形成含有20-80%香兰素的产品混合物产品;0-60%的生物製品,包括香草酸、香草醇、4-乙烯基愈创木酚、原儿茶酸、邻苯二酚和阿魏酸中的至少一种;
和0-20%木质素或木质素衍生化合物。
27.根据权利要求14-22任一的方法,其中纯度为≤20%或纯度高达60%的阿魏酸转化为香兰素,形成含有5-60%香兰素的产品混合物;0-45%的生物制品,包括愈创木酚、香草酸、香草醇、4-乙烯基愈创木酚、原儿茶酸、儿茶酚和阿魏酸中的至少一种;0-70%木质素或木质素衍生化合物;0-60%碳水化合物,半纤维素或碳水化合物衍生物;以及0-30%的蛋白质、氨基酸或蛋白质衍生物。
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EP4408559A1 (en) | 2024-08-07 |
WO2023056398A1 (en) | 2023-04-06 |
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