CN101928735A - 阿藿烯(ajoene)的制备工艺 - Google Patents

Abstract

一种制备阿藿烯的工艺方法，此方法是利用大蒜中的蒜氨酶将天然的蒜氨酸或合成蒜氨酸在水溶液中转变成为蒜素，加入水溶性有机溶剂如醇、酮、醚等方法去除部分杂质，制备到蒜素溶液，再加入脱水剂进行适度脱水，在适当的温度下蒜素90％的转变成为阿藿烯，蒸去溶剂后即可得到纯度90％的阿藿烯产品。本工艺方法简便易行，适合规模化制备阿藿烯产品。

Description

阿藿烯(ajoene)的制备工艺 

技术领域

本发明涉及生物化学与天然产物技术领域，涉及一种用生物方法制备大蒜素allicin，用化学方法转变成为阿藿烯的工艺。 

背景技术

阿藿烯是从大蒜中分离的一种活性物质，这种物质有广泛的生理活性，它是一种新型的抗血栓剂、抑菌剂，脂肪酶抑制剂，在抗艾滋病和恶性肿瘤方面也有一定的作用，因此阿藿烯是一个引人注目的活性物质。多年来人民一直在寻找适合的方法来制备阿藿烯，早在在80年代，美国Eric Block就从大蒜中成功地制备到了阿藿烯，其方法将大蒜剁成小块，在甲醇中浸泡三天，分出滤液经过浓缩后用乙醚萃取，乙醚萃取物经过浓缩后再次溶于甲醇中，在-20℃的冰箱中放置四天，萃取层析方式分离可以制备到产率0.0108％的阿藿烯，之后他们又用了合成的蒜素allicim为原料，在丙酮水溶液在50～65℃加热24小时后将蒜素allicin转变成阿藿烯，其产率可以达到34％，(Apitz Castro，Rafael J.US 4,665,088)。之后，日本Hibi Takayoshi(US 5,612,007)改用了一个新的方法来制备阿藿烯，将大蒜与水按照1∶1的比例粉碎，取得到蒜汁在0～50℃与食用油混合，保持蒜汁的PH值为6～8之间。阿藿烯在食用油相中1～7天内形成产品，含量可以达到500～700mu.g/g。此方法的一个明显不足就是难以获得纯净的阿藿烯产品。在蒜汁与食用油长时间混合时还存在由于水解使食用油酸值偏高，乳化现象较重等问题。法国的Dnessnandt，Guenter等发明了一种让蒜素在环状糊精转变成为阿藿烯的方法(US 5,741,932)，即将蒜素 allicin的水溶液(或水醇)在室温下与环状糊精混合3小时，之后在室温下干燥成为固体细粉，再用乙酸乙酯萃取，萃取溶液去除溶剂后可以得到产率30％的阿藿烯(以蒜素allicin计)其中Z-式和E-式的比例为1∶2～3∶1不等。通过制备的用HPLC分离可以制备到98％纯度的浓缩阿藿烯产物。 

到目前为止还未见文献报道可以高产率的制备阿藿烯的方法，目前的方法仅仅可以达到蒜素30～40％转化成为阿藿烯，而且要经过层析才能获得较高纯度的产品。本文发明的方法可以90％的转化率来制备阿藿烯，形成的产品未经特殊的纯化处理产品纯度达到90％以上。 

发明内容

本发明的目的是提供一种高转化率、高纯度的阿藿烯制备方法，产品可用作医药和保健品的原料。 

本发明采用的技术方案如下： 

一种可用蒜氨酶将蒜氨酸转化成为蒜素，再将蒜素转变成为阿藿烯，去除溶剂后得到90％纯度的阿藿烯产品的方法。 

所述的蒜氨酶是指未经分离的大蒜蒜氨酸，或者经过粗分离的蒜氨酶固化在载体上，或者经过层析精分离的固化在载体的蒜氨酶，所述的载体是指活化的琼脂糖、葡聚糖、纤维素、壳聚糖等高分子载体。 

所述的蒜氨酸包括天然的未经分离的蒜氨酸(即大蒜本身所含的蒜氨 酸)，从天然产物中分离的蒜氨酸以及用化学合成方法制备合成蒜氨酸。 

所述的蒜氨酸转变成为蒜素是指酶促作用将蒜氨酸完全转变成为蒜素allicin，为了保证蒜氨酸完全发生转化，通常加入0～10倍的水通过粉碎让其中蒜氨酸和蒜氨酶溶到水溶液中，经过酶促作用使其转变成为蒜素。如果用合成或者天然提取的蒜氨酸，又是用非固定化的大蒜中的蒜氨酶，可以直接加入到粉碎大蒜所用的水中，形成溶液后经过破碎、搅拌使酶与底物充分作用完成转化，或先通过磨碎过滤去除不溶物分离出含蒜氨酶的水溶液，再加入适量合成或天然的蒜氨酸，通常为0～10％(以大蒜重量计)，以保证在酶促反应结束之后所有的蒜氨酸均已发生转变。 

当用固定化的蒜氨酶时，先让合成蒜氨酸或天然蒜氨酸溶解在PH4～7的磷酸缓冲液中，直接加入固定酶充分作用直到蒜氨酸完全发生转化，也可以将固化酶装在柱子中，将溶有蒜氨酸的磷酸缓冲溶液在柱子中循环，直到蒜氨酸完全发生转变。 

所述的酶促转化还可以在溶液中添加一些增强酶的活性和稳定性的无机离子和有机物，如EDTA，Mg2+，Fe2+，盐酸吡哆锌等等成分。 

所述的蒜素高转化率地转变成为阿藿烯，是先将酶促转变所得的蒜素溶液加入有机溶剂去除固体物和一些大分子物质，制备到含蒜素且适合转变ajoene的有机溶剂水溶液。所用的有机溶剂是指水溶性的有机溶液，包括醇类、酮类、醚类等。如甲醇、乙醇、丙酮、丁酮、四氢呋喃、乙二醇单甲醚等。之后进行适度脱水，保证体系能更适合高转化率地将蒜素Allicin转变成为阿藿烯。使用干燥剂进行适度脱水，包括无机或有机干燥剂。主要使用无机盐进行 脱水，无机盐包括：硫酸镁、氯化钙、硫酸钠、、分子筛、硅胶等。脱水在0～50℃的条件下进行，最好在0～15℃条件下进行，脱水剂量为含水量的5～20倍，脱水时间为0.5～6小时，最好为2～4小时。经适度脱水的蒜素溶液，在过滤去除固体脱水剂后，室温放置或加热即可转变成为阿藿烯，温度宜0～70℃，在0.5小时～2天内完成转变，最好在50～65℃，2～4小时内完成转变。 

所述的阿藿烯产物分离提纯，是指通过上述方法制备的阿藿烯溶液经过减压蒸馏脱去溶剂，包括旋转蒸发，薄膜蒸发等蒸馏，在温度小于65℃取得的阿藿烯溶液。将大部分水溶液溶剂脱去，此时阿藿烯以液体形式可以水分层，油水分离后油层即为阿藿烯，残余在水中的阿藿烯可以用非水溶性的有机溶剂萃取再经过蒸馏后得到阿藿烯油，残留在阿藿烯油中有机溶剂可以采用反复薄膜蒸馏的方式去除，直到残留量在允许的范围。 

具体实施方式

以下用具体实例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此，按此发明专利思想设计的方法都属于本专利的范围。 

实施例1 

取100克大蒜，加入100克水，用剪切式搅拌或胶体磨在冰浴下磨成浆液，维持冰浴，搅拌混合1小时，加入预冷的丙酮(0～5℃)800ml搅拌混合30分钟，过滤去除固体沉渣，得到澄清的溶液，向其中加入400克的无水硫酸镁，在0～15℃的温度下搅拌混合4小时，之后过滤去除固体物，滤液在50～ 60℃的冰浴下维持3～4小时，用薄层分析方法跟踪直到其完全转变成为止。用旋转蒸发仪在小于60℃下蒸去水溶性有机溶剂丙酮，得到含油滴的混浊液，加入乙酸乙酯萃取(50ml*3)三次，合并萃取液，加入5克的无水硫酸钠干燥2小时，之后用旋转蒸发仪在小于60℃的水浴下蒸去乙酸乙酯，可以得到红棕色的阿藿烯油。 

产品可以用正己烷∶乙酸乙酯(4∶1)作为展开剂进行薄层分析。以乙腈∶水或甲醇∶水混合液作为流动相，240nm作为检测波长进行高效液相色谱分析。从图谱可以看出，面积归一化阿藿烯纯度为90％以上。 

实施例2 

按文献报道的方法合成蒜氨酸(Stoll，H.Experimentia，1950，6：330)。 

按文献报道的方法制备天然蒜氨酸(黄雪松，食品科学，2004，25(11)：200～203)。 

取100毫升水，往其中加入4克合成蒜氨酸或天然蒜氨酸，加入和Cl2，盐酸吡咯醇，如：EDTA，Mg2+，Fe2+，盐酸吡哆锌等作为酶活促进剂，充分搅拌后溶解加入100克的大蒜，按实施例1的方法进行酶促反应和转化成为产物阿藿烯。以正丁醇∶甲醇∶乙酸∶水(4∶1∶1∶0.5)作为展开剂进行薄层分析，茚三酮作为显色剂，来跟踪酶促转化。分析表明，无论是合成蒜氨酸还是天然的蒜氨酸可以酶促转化完全。高效液相色谱法分析所得的产物，阿藿烯峰面积归一化纯度在90％以上。 

实例3 

取100克大蒜和100克的纯水，在冰浴下用剪切式搅拌机或胶体磨成浆液，用低温离心机离心去除固体沉淀，或用200目的滤布快速过滤，得到略混的溶液，转入到冰浴中，按实例2的方法加入酶活促进剂、稳定剂和4克蒜氨酸，进行酶促反应和转化成阿藿烯，也可以完成酶促反应和实现阿藿烯的制备。 

实施例4 

按文献报道的方法分离制备粗品蒜氨酶和高纯度的蒜氨酶(E.Bartholomecus Kuettner，Archives of Biochemistry and Biophysics.2002，402：192～200)。 

取已经活化的琼脂糖4B，其活化基团为含长链臂的活化酯，加入到含粗品蒜氨酶或纯化蒜氨酶的PH为8.5的磷酸盐缓冲液中，在室温下联偶反应4小时，将蒜氨酶完全固化到琼脂糖上，其中固化的蒜氨酶的量为每克琼脂糖载体蒜酶量0.1％～10％。过滤去水溶液得到载有蒜酶的琼脂糖。 

取100毫升水，加入4克的合成蒜氨酸或天然蒜氨酸，再加入酶活促进剂，如EDTA，Mg2+，Fe2+，盐酸吡哆锌等，并加入磷酸钠调PH为6±0.5，将此溶液加入到载有蒜氨酶的琼脂糖上，余者按实施例2的方法进行酶促反应和转化成为产物阿藿烯，薄层分析表明无论是合成蒜氨酸还是天然蒜氨酸，固定化的大蒜酶可以将其酶促转化完全，制备的阿藿烯产品经高效液相色谱，峰面积归一化，其纯度载90％以上。 

Claims (8)

1.一种制备高产率、高纯度的阿藿烯的工艺路线，其特征在于：

1.用天然大蒜为蒜氨酶的来源，在粉碎后形成含有蒜氨酶的水溶液，权利要求粉碎条件是加入0～50倍的水(大蒜重量)，用具备破壁的装置，在温度0～50℃条件进行，最好在0℃条件下进行，破壁装置包括均质粉碎机、中药粉碎机、胶体磨、剪切搅拌机等。

2.直接利用上述制备的含蒜氨酶的混悬溶液或者经过滤除渣的混浊液，大蒜中的蒜氨酸经酶促作用转变成为大蒜素(Allicin)，或在含蒜氨酶的混悬液或混浊液中添加入适量的合成蒜氨酸或天然蒜氨酸，通过酶促作用将大蒜中的蒜氨酸和添加的蒜氨酸转变成为大蒜素(Allicin)。权利要求蒜氨酸酶促转变成为大蒜素的温度在0～65℃，最好在0～15℃，在搅拌或静止的容皿中，加入或不加入酶活增强剂(EDTA，Mg²⁺，Fe²⁺，盐酸吡哆锌等)等条件下进行。外加的蒜氨酸量以能完全转变成为大蒜素计，通常在0～20％的范围内，最好在5％左右。

3.实现酶促反应也可以在固化蒜氨酶中进行，大蒜粉碎后的混悬液经过澄清处理后，用如(NH₄)₂SO₄或PEG沉淀出粗酶，或者将粗酶经过柱层析制备到精制的蒜氨酶，酶偶联到活化的固定酶载体，再按上述的条件完成酶促转化。

4.用水溶性的有机溶剂加入到已完成酶促转化的混悬液或混浊液，通过沉淀去除固状物或高分子杂质，也可加入到用固定蒜氨酶酶促转变后的溶液中，制备到蒜素(allicin)的澄清溶液。权力要求所用的水溶性有机溶剂包括醇类(如甲醇、乙醇、丙醇)、酮类(如丙酮)、醚类(如四氢呋喃)等，加入的溶剂量为酶促转化后混悬液或溶液的1～30倍，最好是5～8 倍，操作可以在0～50℃条件下进行，最好在0～15℃下进行。

5.制备的蒜素(allicin)有机溶液，加入适量的干燥剂处理，进行适度的脱水。权利要求使用的干燥剂包括MgSO₄、MgCl₂、Na₂SO₄、CaCl₂等，可以用单一干燥剂或多个干燥剂的混合物，加入的干燥剂用量按吸水量计可以将溶液中的水份完全去除作为最少加入量，加入后维持搅拌在0～50℃下至少维持2小时以上，最好在0～15℃下进行。

6.适度脱水处理的蒜素(allicin)溶液热转变为阿藿烯。权利要求在20～75℃条件下转化，最好在50℃-60℃条件下转化，转化时间为2～48小时。最好在4～6小时，此过程中蒜素allicin 90％以上转变成为阿藿烯。

7.阿藿烯产品的分离纯化。权利要求用蒸馏方法去除水溶性有机溶剂，包括在薄膜蒸发仪和旋转蒸馏仪等装置中进行，去除水溶性有机溶剂的残液加入水不溶的溶剂萃取，包括乙醚，乙酸乙酯、超临界或液体二氧化碳分方法分离出阿藿烯产品。经过蒸馏去除残余的有机溶剂。