CN118355123A

CN118355123A - 用于个人医疗保健应用的适配体

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Publication number: CN118355123A
Application number: CN202280080279.1A
Authority: CN
Inventors: J·E·委拉斯奎兹; S·C·鲁帕德; A·V·特雷乔; A·M·皮茨; K·L·舒梅切尔; E·N·斯威格特; G·A·彭纳; H·A·纳曼贾-马利亚诺; M·S·瓦格纳
Original assignee: Procter and Gamble Co
Current assignee: Procter and Gamble Co
Priority date: 2021-12-14
Filing date: 2022-12-14
Publication date: 2024-07-16

Abstract

公开了一种适配体组合物，该适配体组合物具有一种或多种寡核苷酸，该寡核苷酸包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸的衍生物、核糖核苷酸的衍生物、或它们的混合物中的至少一者。该适配体组合物对一种或多种选自由以下组成的组的细胞膜糖蛋白具有结合亲和力：细胞间粘附分子1(ICAM‑1)、低密度脂蛋白受体(LDLR)家族成员和钙粘蛋白相关家族成员3(CDHR3)、优选地细胞间粘附分子1(ICAM‑1)，并且被配置为减少一种或多种人鼻病毒与该细胞间粘附分子1(ICAM‑1)的结合。

Description

用于个人医疗保健应用的适配体

技术领域

本文描述了对细胞膜糖蛋白并且优选地对细胞间粘附分子-1(“ICAM-1”)具有高结合亲和力和特异性的核酸适配体，并且更具体地，描述了这种适配体用于抑制人鼻病毒与这种糖蛋白结合并进入鼻腔和咽喉内的细胞的用途。

序列表以引用方式并入

本申请含有作为本公开的单独部分的计算机可读形式的序列表(文件名：CM05385M.txt；大小：337千字节；创建日期：2022年12月1日)，该序列表以引用方式全文并入本文。

背景技术

适配体是特异性且复杂的三维形状的短单链寡核苷酸，其结合至靶标分子。适配体的分子识别基于结构相容性和分子间相互作用，包括静电力、范德华相互作用、氢键以及芳环与靶材料的π-π堆叠相互作用。适配体的靶标包括但不限于肽、蛋白质、核苷酸、氨基酸、抗生素、低分子量有机或无机化合物、甚至全细胞。适配体的解离常数通常在微摩尔水平和皮摩尔水平之间变化，这与抗体对它们的抗原的亲和力相当。适配体也可被设计成具有高特异性，从而能够区分靶分子与密切相关的衍生物。

适配体通常通过指数富集的配体系统进化(SELEX)从大型随机核酸库中体外设计。当针对低分子量染料选择单链RNA时，在1990年首次引入了SELEX方法(Ellington,A.D.,Szostak,J.W.，1990年.Nature346:818-822)。几年后，还描述了单链DNA适配体和包含化学修饰的核苷酸的适配体(Ellington,A.D.，Szostak,J.W.，1992年.Nature355:850-852；Green,L.S.，等人，1995.Chem.Biol.第2卷：第683–695页)。自那时起，已选择用于数百个微观靶标诸如阳离子、小分子、蛋白质、细胞或组织的适配体。来自文献的示例汇编包括在以下网站的数据库中：http://www.aptagen.com/aptamer-index/aptamer-list.aspx。

感冒是美国最常见的疾病，每年有6200万人受感染。成人每年可感染感冒2次-4次，而儿童每年可感染8次-12次。这导致发病、经常缺勤、生产力下降和抗生素使用不当。这意味着美国每年花费600亿美元。

人鼻病毒引起50％-80％的感冒。鼻病毒是小的(30nm)、无包膜的单链RNA病毒。虽然鼻病毒感染在免疫活性宿主中是轻度和自限性的，但它与免疫抑制患者的肺炎、婴幼儿的毛细支气管炎有关，并且可加剧先前存在的肺部疾病，诸如哮喘和慢性阻塞性肺病。

当病毒附着于鼻上皮上的表面受体并感染宿主细胞时，鼻病毒感染主要发生在鼻咽中。百分之五十七的鼻病毒附着于气道沿线的ICAM-1受体。一旦病毒进入细胞，它就会劫持细胞的复制机制以制作自身的拷贝。这导致细胞裂解和死亡，使病毒后代扩散到其他附近的细胞以重复感染周期。最终，这触发宿主免疫应答，导致呼吸道症状(例如，咳嗽、鼻漏、鼻塞、喉咙痛等)。尽管公共卫生负担沉重，但没有针对人鼻病毒的许可疫苗或抗病毒药物。

先前已经描述了针对靶蛋白诸如细胞间粘附分子1(ICAM-1)的适配体。然而，没有报道这种适配体与膜结合蛋白的结合或这些适配体防止天然配体或人鼻病毒与ICAM-1结合的能力的数据。因此，仍然需要选择性结合细胞膜糖蛋白(包括ICAM-1)并且防止人鼻病毒与这种糖蛋白的结合，从而减轻感冒症状或预防(再)感染的适配体。

发明内容

本文描述了SELEX用于选择针对细胞间粘附分子1(ICAM-1)的亲本适配体的用途和从中截短的适配体用于防止人鼻病毒与这种糖蛋白结合的用途。

本文还描述了一种适配体组合物。该适配体组合物包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸包含：脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸的衍生物、核糖核苷酸的衍生物以及它们的混合物；其中所述适配体组合物对细胞间粘附分子1(ICAM-1)具有结合亲和力，并且其中该适配体组合物被配置为减少一种或多种人鼻病毒与所述细胞间粘附分子1(ICAM-1)的结合，并且其中该适配体组合物包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸包含从选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:200组成的组的亲本寡核苷酸截短的约30个至约60个连续核苷酸。

适配体组合物可进一步显示对低密度脂蛋白受体(LDLR)家族成员、钙粘蛋白相关家族成员3(CDHR3)以及它们的组合中的一者或多者的结合亲和力。

该适配体组合物可包含选自由以下组成的组的至少一种寡核苷酸：SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:240、SEQ ID NO:241、SEQ ID NO:242、SEQID NO:243、SEQ ID NO:244、SEQ ID NO:245和SEQ ID NO:246。

本文还描述了一种个人医疗保健组合物。该个人医疗保健组合物包含如本文所述的适配体组合物。该个人医疗保健组合物可包含至少一种核酸适配体；其中该核酸适配体对细胞间粘附分子1(ICAM-1)具有结合亲和力，其中该核酸适配体被配置为减少一种或多种人鼻病毒与该细胞间粘附分子1(ICAM-1)的结合，并且其中该适配体组合物包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸包含从选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:200组成的组的亲本寡核苷酸截短的约30个至约60个连续核苷酸。在一方面，该医疗保健组合物可包含该适配体组合物，该适配体组合物包含选自由SEQ ID NO:237至SEQ ID NO:246组成的组的寡核苷酸序列中的至少一种寡核苷酸序列。

本文还描述了一种适配体组合物，该适配体组合物包含至少一种肽或蛋白质，其中该肽或蛋白质由本文公开的截短寡核苷酸中的至少一种截短寡核苷酸翻译。

该个人医疗保健组合物还可显示对低密度脂蛋白受体(LDLR)家族成员、钙粘蛋白相关家族成员3(CDHR3)以及它们的组合中的一者或多者的结合亲和力。

还提供了一种用于将本文公开的个人医疗保健组合物递送至上呼吸道的方法。该方法包括施用如本文所述的个人医疗保健组合物；该个人医疗保健组合物包含至少一种核酸适配体；其中该至少一种核酸适配体对细胞间粘附分子1(ICAM-1)具有结合亲和力，其中该核酸适配体被配置为减少一种或多种人鼻病毒与该细胞间粘附分子1(ICAM-1)的结合，并且其中该适配体组合物包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸包含从选自由SEQID NO:1至SEQ ID NO:200组成的组的亲本寡核苷酸截短的约30个至约60个连续核苷酸。在一方面，该组合物可包含该适配体组合物，该适配体组合物包含选自由SEQ ID NO:237至SEQ ID NO:246组成的组的寡核苷酸序列中的至少一种寡核苷酸序列。

在一方面，该个人医疗保健组合物还可包含一种或多种附加活性成分；其中至少一种核酸适配体和一种或多种活性成分是共价或非共价附接的。

本文还描述了本文公开的适配体组合物的用途和/或本文公开的个人医疗保健组合物的用途，该适配体组合物和/或该个人医疗保健组合物用于通过抑制与细胞间粘附分子1(ICAM-1)的结合并由此抑制病毒进入鼻腔和咽喉内的细胞来抑制人鼻病毒感染。该用途可包括将如本文所公开的适配体组合物和/或个人医疗保健组合物递送至上呼吸道。

附图说明

虽然本说明书通过特别指出并清楚地要求保护本发明主题的权利要求作出结论，但据信由以下说明结合附图可更容易地理解本发明，其中：

图1示出了DNA库的示意图。

图2示出了在选择轮次1至11期间的亲本适配体选择策略。

图3示出了在选择轮次12至14期间的亲本适配体分裂选择策略的示意图。

图4示出了前二十个亲本适配体的富集轨迹。

图5示出了所选亲本适配体在人鼻上皮细胞(HNEpC)和HEK293细胞上的结合测定结果。

图6A至图6D示出了与HNEpC细胞结合并与HEK293细胞结合的荧光标记的亲本适配体Nas.R-4(SEQ ID NO:04)，其中图6A示出了荧光图像，并且图6B示出了HNEp细胞的明场图像，并且图6C示出了荧光图像，并且图6D示出了HEK293细胞的明场图像。

图7A至图7H示出了使用亲本适配体Nas.R-2(SEQ ID NO:02)、亲本适配体Nas.R-8和阴性对照适配体在HeLa细胞上的病毒抑制测试，其中图7A示出了荧光图像，并且图7B示出了使用Nas.R-2适配体的明场图像；图7C示出了荧光图像，并且图7D示出了使用Nas.R-8适配体的明场图像；图7E示出了荧光图像，并且图7F示出了使用对照适配体的明场图像；并且图7G示出了荧光图像，并且图7H仅示出了细胞的明场图像。

图8示出了通过表面等离子体共振(SPR)确定的亲本适配体Nas.R-1、Nas.R-2、Nas.R-4和Nas.R-8(SEQ ID NO:01,02,04和08)与250nM外源ICAM-1的结合亲和力。

图9示出了通过表面等离子体共振(SPR)确定的亲本适配体Nas.R-1、Nas.R-2、Nas.R-4和Nas.R-8(SEQ ID NO:01,02,04和08)与作为对照的250nM人血清白蛋白的结合亲和力。

图10示出了ICAM-1、ICAM-3和ICAM-5(SEQ ID NO:214、232和263)的细胞外结构域的氨基酸序列比对。

图11示出了在鼻细胞阳性选择中表现出比在HEK293细胞阳性选择中更高的富集水平的序列的示例。在12个、13个和14个选择轮次之后给出数据点。

图12示出了选择轮次14中的序列的示例，该序列在HEK293阳性选择中表现出比在针对鼻细胞的阳性选择中更高的富集水平。在12个、13个和14个选择轮次之后给出数据点。

图13示出了在选择过程中鉴定的具有至少90％核苷酸序列同一性的示例性序列的比对。

图14示出了在选择过程中鉴定的具有至少70％核苷酸序列同一性的示例性序列的比对。

图15示出了在选择过程中鉴定的具有至少50％核苷酸序列同一性的示例性序列的比对。

图16示出了亲本适配体Nas.D-1(SEQ ID NO:101)的随机区域的基序分析的结果。

图17示出了亲本适配体Nas.R-1(SEQ ID NO:01)及其用圆圈突出显示的保守基序的预测二级结构。

图18示出了基于示出为DNA序列的前100个亲本适配体的随机区域的基序频率的基序分析。

图19示出了适配体Nas.D-4(SEQ ID NO:104)的随机区域的基序分析的结果。

图20A示出了亲本适配体Nas.D-4(SEQ ID NO:104)的预测二级结构。图20B和图20C示出了从Nas.D-4截短的适配体(SEQ ID NO:244)(图20A中的虚线所示)的两个替代性预测二级结构。

图21示出了亲本适配体Nas.D-8(SEQ ID NO:108)的随机区域的基序分析的结果。

图22A示出了亲本适配体Nas.D-8(SEQ ID NO:108)的预测二级结构。图22B示出了从Nas.D-8截短的适配体(SEQ ID NO:246)(图22A中的虚线所示)的预测二级结构，该适配体包括虚线圆圈所示的两个突变。

图23示出了SEQ ID NO.242的截短适配体(表示为2.1)与亲本适配体序列SEQ IDNO.102(表示为2.0)相比的结合力。

图24示出了SEQ ID NO.244的截短适配体(表示为4.1)于亲本适配体序列SEQ IDNO.104(表示为4.0)相比的结合力。

图25示出了SEQ ID NO.245的截短适配体(表示为5.1)与亲本适配体序列SEQ IDNO.105(表示为5.0)相比的结合力。

图26示出了SEQ ID NO.246的截短适配体(表示为8.1)与亲本适配体序列SEQ IDNO.108(表示为8.0)相比的结合力

图27A示出了在本文公开的适配体的二级结构中形成的前三个结构基序。图27B示出了图27A所示的基序在示例序列中的分布。

图28示出了包括特殊序列基序的适配体在结合实验中的功效。

图29示出了SEQ ID NO:264的突变适配体4.1(表示为状态1)在33℃和37℃下的最有可能的二级结构。

图30示出了SEQ ID NO:265的突变适配体4.1(表示为状态2)在33℃和37℃下的最有可能的二级结构。

图31示出了突变适配体状态2的最有可能形成的三个二级结构；图31A示出了最有可能形成的二级结构(表示为结构1)，图31B示出了第二可能形成的二级结构(表示为结构2)，并且图31C示出了第三可能形成的二级结构(表示为结构3)。

图32示出了突变适配体状态2的二级结构的分布；图32A示出了在33℃下的分布并且图32B示出了在37℃下的分布。

图33A示出了SEQ ID NO:267的突变适配体4.1(表示为状态4)在33℃下最有可能的二级结构，并且图33B示出了SEQ ID NO:267的突变适配体4.1(表示为状态4)在37℃下最有可能的二级结构。

具体实施方式

I.定义

如本文所用，术语“适配体”是指对特定靶标具有结合亲和力的单链寡核苷酸或肽。

如本文所用，术语“核酸”是指核苷酸的聚合物或低聚物。当核苷酸的糖部分是D-核糖时，核酸也被称为“核糖核酸”，当糖部分为2-脱氧-D-核糖时，核酸也被称为“脱氧核糖核酸”。

如本文所用，术语“核苷酸”是指由经由糖部分的5-碳的羟基基团酯化成单磷酸酯、多磷酸酯或磷酸酯衍生基团的核苷组成的化合物。当糖部分是D-核糖时，核苷酸也被称为“核糖核苷酸”，并且当糖部分为2-脱氧-D-核糖时，核苷酸也被称为“脱氧核糖核苷酸”；在本文公开的组合物、用途、方法和应用中，核糖核苷酸可以被脱氧核糖核苷酸替换，并且反之亦然。

如本文所用，术语“核苷”是指由通常通过β-糖苷键连接至5-碳糖(例如，D-核糖或2-脱氧-D-核糖)的核碱基诸如嘌呤或嘧啶组成的糖胺。当糖部分是D-核糖时，核苷也被称为“核糖核苷”，当糖部分为2-脱氧-D-核糖时，核苷也被称为“脱氧核糖核苷”。

如本文所用，术语“核碱基”是指具有碱基的化学性质的包含氮原子的化合物。核碱基的非限制性示例为包含吡啶、嘌呤或嘧啶部分的化合物，包括但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶。

如本文所用，术语“寡核苷酸”是指由核苷酸组成的低聚物。

如本文所用，在两种或更多种寡核苷酸、核酸或适配体的上下文中，术语“相同”或“序列同一性”是指当比较和比对以达到最大对应性时两个或更多个相同或具有指定百分比的相同核苷酸的序列，如使用序列比较算法或通过目测进行测量的。

如本文所用，在两种或更多种寡核苷酸、核酸或适配体的上下文中，术语“基本上同源”或“基本上相同”通常是指当比较和比对以达到最大对应性时两个或更多个具有至少40％、60％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％核苷酸同一性的序列或亚序列，如使用序列比较算法或通过目测进行测量的。

如本文所用，术语“表位”是指靶标的与适配体相互作用的区域。表位可以是靶标内的邻接片段，或者可由在靶标的折叠形式中物理上邻近的多个点表示。

如本文所用，术语“基序”是指存在于具有与特定靶标的结合亲和力的适配体库中的连续的或一系列连续的核苷酸序列，并且与随机寡核苷酸库相比表现出比预期的统计学显著更高的发生概率。基序序列通常是适配体选择过程的结果或驱动因素。

如本文所用，术语“个人医疗保健组合物”是指以可直接递送至上呼吸道的形式的组合物。

如本文所用，“药学有效量”是指足以对受试者赋予治疗效果的量。在一些方面，治疗效果减少了鼻病毒与细胞膜糖蛋白，诸如ICAM-1的结合，降低了感冒的严重程度和/或持续时间，或降低了由于鼻病毒引起的呼吸道疾病的发生率。

如本文所用，术语“亲本”(优选地与序列、寡核苷酸和/或适配体组合)将用于被另外修饰、特别是长度缩短或从中截短较短部分的分子、优选地序列、寡核苷酸和/或适配体。

如本文所用，术语“截短”(优选地与序列、寡核苷酸和/或适配体组合)将用于从亲本分子截短的分子、优选地序列、寡核苷酸和/或适配体。

如本文所用，术语“杂交的”是指本领域已知的沃森/克里克(Watson/Crick)碱基对相互作用，其中核苷酸由于氢键而与特定的其他核苷酸配对。因此，碱基腺嘌呤与碱基胸腺嘧啶配对，而碱基胞嘧啶与碱基鸟嘌呤配对；另外或可替代地，碱基胸腺嘧啶也可以与碱基鸟嘌呤配对。术语核苷酸对在这个意义上将与“杂交的”意思相同。

如本文所用，术语“内部”是指通过彼此杂交的核苷酸(下文定义的“茎”)与适配体的两端(5'-端和3'-端)分开的结构。为了保持一致性，术语“外部”是指与任一端核苷酸(5'-端或3'-端)相邻的结构。

如本文所用，二级结构中形成的术语“环”表示未配对的一个或多个内部核苷酸。二级结构中“环”的示例是发夹环或内环。

如本文所用，术语“发夹环”表示在二级结构内部形成的环，其中该环仅在一个“茎”区域附近形成。字母“H”将用于形成发夹环的核苷酸的结构序列中。

如本文所用，术语“内环”表示在二级结构内部形成的环，其中该环在两个或更多个“茎”区域附近形成。字母“I”将用于形成内环的核苷酸的结构序列中。

如本文所用，术语“茎”表示具有配对核苷酸的区域，其中形成至少一个核苷酸对，优选地形成两个或三个连续的核苷酸对以构建茎。字母“S”将用于形成茎的核苷酸的结构序列中。

如本文所用，术语“末端”表示二级结构内的区域，该区域包括寡核苷酸的5'-端的至少一个第一核苷酸或寡核苷酸的3'-端上的至少一个最后一个核苷酸。字母“E”将用于形成寡核苷酸的末端的核苷酸的结构序列中。

如本文所用，如果5'端上的至少一个第一核苷酸未与另一核苷酸杂交，并且/或者3'端上的至少一个最后一个核苷酸未与另一核苷酸杂交，则将使用术语“悬空端”。如此，相应末端被称为“悬空”，因为该末端仅从一个点保持空的。

II.适配体组合物

人鼻病毒(RV)是感冒的主要原因。它们被分类为三组(RV-A、RV-B和RV-C)，包括表达不同表面蛋白的约160种类型。尽管存在这种多样性，但鼻病毒主要利用上皮细胞的三种糖蛋白穿过细胞膜并进入宿主细胞复制机制：大多数RV-A和所有RV-B类型利用的细胞间粘附分子1或ICAM-1蛋白；至少十二种RV-A类型使用的低密度脂蛋白受体或LDLR家族成员；以及主要由RV-C类型使用的钙粘蛋白相关家族成员3或CADHR3蛋白。

适配体组合物包含选自由以下组成的组的至少一种寡核苷酸：脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸的衍生物、核糖核苷酸的衍生物以及它们的混合物，其中适配体组合物对细胞间粘附分子1(ICAM-1)具有结合亲和力。基于脱氧核糖核苷酸的适配体和基于核糖核苷酸的适配体包括在本发明中。基于脱氧核糖核苷酸的适配体由于较低成本和较高寡核苷酸稳定性而在一些示例中可能是有利的。在一方面，适配体组合物可对一种或多种选自由以下组成的组的细胞膜糖蛋白具有结合亲和力：细胞间粘附分子1(ICAM-1)、低密度脂蛋白受体(LDLR)家族成员和钙粘蛋白相关家族成员3(CDHR3)以及它们的组合。适配体组合物被配置为减少或抑制一种或多种人鼻病毒与细胞间粘附分子1(ICAM-1)的结合。适配体组合物可以包含至少一种寡核苷酸，其中该至少一种寡核苷酸包含提供与ICAM-1分子的结合亲和力的二级结构。形成所述二级结构的合适寡核苷酸包括30个至60个核苷酸、或30个至55个核苷酸、或30个至50个核苷酸、或30个至45个核苷酸、或35个至40个核苷酸的长度。形成的二级结构可以包含至少一个双链茎区域、由未配对/未杂交的核苷酸形成的至少一个发夹环和5'-端以及3'-端或它们的组合。5'-端和3'-端可以是未整合到任何其他结构基序中的悬空端。由本文公开的二级结构形成的一个示例环是发夹。如果相邻未杂交碱基任一端上的碱基相互杂交，就会形成稳定的发夹。本文公开的二级结构还可以包括第二未配对区域，该第二未配对区域形成包括相邻未杂交碱基的内环，这些未杂交碱基的任一侧是不同的杂交碱基(茎)。未配对环和双链茎的大小和长度可以变化。要在本文公开的序列的二级结构中形成的示例环的合适大小在1个至15个未配对核苷酸的范围内，或在1个至10个未配对核苷酸的范围内，或在2个至8个未配对核苷酸的范围内。示例发夹环可包括至少3个或更多个未配对核苷酸，或4个或更多个未配对核苷酸，或5个或更多个未配对核苷酸。示例内环可包括至少1个未配对核苷酸，或1个至5个未配对核苷酸，或1个至10个未配对核苷酸。要在本文公开的序列的二级结构中形成的示例双链茎的合适大小在1个至15个配对核苷酸的范围内，或在1个至10个配对核苷酸的范围内，或在2个至8个配对核苷酸的范围内，或在3个至6个配对核苷酸的范围内，特别是对于位于5'-悬空端和/或3'-悬空端附近的第二茎来说。

5'-悬空端和/或3'-悬空端的长度也可以变化，但是悬空端的合适长度可以包括至少1个未配对/未杂交的核苷酸，或至少3个未配对/未杂交的核苷酸，或至少4个未配对/未杂交的核苷酸，或至少5个未配对/未杂交的核苷酸。例如，5'-悬空端和3'-悬空端可以延伸至多达15个未配对/未杂交的核苷酸，但是适配体的二级结构必须是保守的。本文公开的二级结构中悬空端的合适长度在3个至15个未配对/未杂交的核苷酸的范围内。

示出对ICAM-1的结合亲和力并且被配置为抑制人鼻病毒的结合的合适的二级结构可包括从5'-端到3'-端的结构序列：5'-EEEYYSSSSYSSSSYHHHHYYYYYYYYSYYYYYEEEE-3'(结构I)，其中H表示形成发夹环的核苷酸，S表示位于茎中的核苷酸，E表示位于悬空端中的核苷酸，并且Y表示核苷酸不存在或者是H、S、E或I，其中I表示如本文分类的内环。该结构序列基于P.Danaee等人；NucleicAcidsResearch，第46卷，第11期，2018年6月20日，第5381-5394页；该文献通过引用并入本文。结构I中的发夹环可以包括至少一个嘌呤碱基，或者发夹环可以包括至少三个嘧啶碱基，或者发夹环可以包括它们的组合。结构I中发夹环的长度为至少4个未配对/未杂交的核苷酸，但是本文公开的发夹环的合适长度可包括5个未配对/未杂交的核苷酸或更多，其中发夹可以例如形成为使从5'-端开始的发夹环中第一核苷酸是嘌呤碱基。为了形成未配对/未杂交的核苷酸的发夹环，在结构I中形成包括配对核苷酸并封闭发夹环的茎区域。

在本文公开并且结构I中示例性示出的合适的二级结构中，在从5'-端开始的发夹环之前的茎区域中的最后一个核苷酸可为嘌呤碱基并且/或者在从5'-端开始的发夹环之后的茎中的第一核苷酸可为嘧啶碱基。另外或可替代地，茎中邻近5'-悬空端的第一核苷酸可为嘧啶碱基，其中在5'-悬空端与发夹环之间的所述茎区域还可包括三个核苷酸的序列基序，即基序胸腺嘧啶-胞嘧啶-腺嘌呤(TCA)。

在本文公开并且结构I中示例性示出的合适的二级结构中，合适的碱基也可存在于邻近3'-悬空端的茎中，其中茎中从5'-端开始并且邻近3'-悬空端的最后一个核苷酸可为嘌呤碱基。另外或可替代地，邻近3'-悬空端的茎还可包括3个核苷酸的序列基序，即基序鸟嘌呤-胞嘧啶-胸腺嘧啶(GCT)。邻近悬空端的茎的长度可以变化，并且可以包括至少3个杂交碱基对，或至少4个杂交碱基对，或至少5个杂交碱基对。

悬空端的长度也可以变化，如结构I示例性示出的。例如，5'-悬空端可包括至少4个未配对核苷酸，在一个示例中4个至15个未配对核苷酸，其中未配对核苷酸中的至少两个未配对核苷酸可为嘌呤碱基。另外或可替代地，3'-悬空端可包括至少3个或4个未配对核苷酸，在一个示例中3个至15个未配对核苷酸，其中3'-悬空端的至少四个未配对核苷酸是嘌呤碱基。较长的3'-悬空端有利地包括5个、6个或7个未配对核苷酸，它们可以都是嘌呤碱基。另外或可替代地，3'-悬空端还可包括序列基序，该序列基序包括4个至7个未配对核苷酸，即基序GAGGYYZ，其中Y和Z不存在或选自鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、腺苷(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)。在一方面，Y可为A或G；或Y可为GAGGYYZ基序中的A。GAGGYYZ基序可以至少部分地未杂交，在有利的方面，基序可以完全未杂交。在一方面，GAGGYYZ基序可位于3'-端附近和/或在3'-端处。例如，GAGGYYZ基序中的Y可以是最后15个核苷酸中的至少一个核苷酸并且/或者GAGGYYZ基序中的Z可以是最后13个核苷酸中的至少一个核苷酸或3'-端处的最后一个核苷酸。因此，3'-端可为悬空端，并且基序可完全位于悬空端，也可仍部分位于茎区域中。例如，GAGGYYZ基序的GAG可在茎区域中成对排列并且/或者GAGGYYZ基序的GYYZ可未配对地位于3'-悬空端。在一方面，整个GAGGYYZ基序可以未配对地位于3'-悬空端。

形成本文公开的二级结构的至少一种寡核苷酸可以从本文公开的亲本序列中截短。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸包含从由作为亲本序列的SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:200组成的组截短的约30个至约60个连续核苷酸。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸包括从本文公开的亲本序列截短的至少32个连续核苷酸。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸包括从本文公开的亲本序列截短的至少33个连续核苷酸。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸包括从本文公开的亲本序列截短的至少34个连续核苷酸。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸包括从本文公开的亲本序列截短的至少35个连续核苷酸。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸包括从本文公开的亲本序列截短的至少36个连续核苷酸。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸包括从本文公开的亲本序列截短的至少37个连续核苷酸。

另外或可替代地，适配体组合物可包括至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸形成本文公开的二级结构并且从本文公开的亲本序列的3'-端、5'-端或中间截短，例如选自由作为亲本序列的SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:200组成的组。该适配体组合物可包含从本文公开的亲本序列的中间截短的至少一种寡核苷酸。

本发明的至少一种截短寡核苷酸可从本文公开的亲本序列的3'-端计算的核苷酸12处开始或结束。本发明的至少一种截短寡核苷酸可从本文公开的亲本序列的3'-端计算的核苷酸10处开始或结束。本发明的至少一种截短寡核苷酸可从本文公开的亲本序列的3'-端至3'-端计算的从9开始的任何核苷酸处开始或结束。

该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸形成本文公开的二级结构并且从由作为亲本序列的寡核苷酸组成的组中截短，该至少一种寡核苷酸与选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:200组成的组的序列具有至少80％核苷酸序列同一性，其中截短寡核苷酸包含本文公开的GAGGYYZ基序，包括但不限于所有变体和另外的说明书。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸从由作为亲本序列的寡核苷酸组成的组截短的至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸与选自由SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:200组成的组的序列具有至少90％核苷酸序列同一性。与SEQ ID NO:3具有至少90％核苷酸序列同一性的寡核苷酸的非限制性示例例如为SEQ ID NO:88。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸从由作为亲本序列的寡核苷酸组成的组截短的至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸与选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:200组成的组的序列具有至少93％核苷酸序列同一性。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸从由作为亲本序列的寡核苷酸组成的组截短的至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸与选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:200组成的组的序列具有至少96％核苷酸序列同一性。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸从由作为亲本序列的寡核苷酸组成的组截短的至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸与选自由SEQID NO:1至SEQ ID NO:200组成的组的序列具有至少99％核苷酸序列同一性。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸从选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:200组成的组的作为亲本序列的寡核苷酸截短，该至少一种寡核苷酸示出小于100％核苷酸序列同一性，其中具有嘧啶碱基的核苷酸被具有嘧啶碱基的另一核苷酸替换，具有嘌呤碱基的核苷酸被具有嘌呤碱基的另一核苷酸替换，或它们的组合。

该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸形成本文公开的二级结构并且从由作为亲本序列的SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:200组成的组截短。该适配体组合物可包含RNA寡核苷酸的至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸从由作为亲本序列的SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10组成的组截短。该适配体组合物可包含DNA寡核苷酸的至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸从由作为亲本序列的SEQ ID NO:101至SEQ ID NO:110组成的组截短。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸从选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:200组成的组的作为亲本序列的寡核苷酸截短，其中一个或多个核苷酸从截短的寡核苷酸序列中缺失。如果一个或多个核苷酸从截短的寡核苷酸序列中缺失，则截短寡核苷酸与亲本序列的对应部分相比显示出小于100％的序列同一性。合适的缺失不会改变截短的二级结构。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸从选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:200组成的组的作为亲本序列的寡核苷酸截短，其中从截短的序列中缺失不超过10个核苷酸。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸从选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:200组成的组的作为亲本序列的寡核苷酸截短，其中从截短的序列中缺失不超过5个核苷酸。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸从选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:200组成的组的作为亲本序列的寡核苷酸截短，其中从截短的序列中缺失不超过4个核苷酸。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸从选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:200组成的组的作为亲本序列的寡核苷酸截短，其中从截短的序列中缺失不超过3个核苷酸。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸从选自由SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:200组成的组的作为亲本序列的寡核苷酸截短，其中从截短的序列中缺失不超过2个核苷酸。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸从选自由SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:200组成的组的作为亲本序列的寡核苷酸截短，其中从截短的寡核苷酸序列中缺失1个核苷酸。

该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸形成本文公开的二级结构并且从选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:200组成的组的作为亲本序列的寡核苷酸截短，其中将一个或多个核苷酸插入截短的寡核苷酸序列中。如果将一个或多个核苷酸插入截短的寡核苷酸序列中，则截短寡核苷酸与亲本序列的对应部分相比显示出小于100％的序列同一性。合适的插入不会改变截短寡核苷酸的二级结构。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸从选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:200组成的组的作为亲本序列的寡核苷酸截短，其中将不超过10个核苷酸插入截短的序列中。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸从选自由SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:200组成的组的作为亲本序列的寡核苷酸截短，其中将不超过5个核苷酸插入截短的序列中。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸从选自由SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:200组成的组的作为亲本序列的寡核苷酸截短，其中将不超过4个核苷酸插入截短的序列中。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸从选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:200组成的组的作为亲本序列的寡核苷酸截短，其中将不超过3个核苷酸插入截短的序列中。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸从选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:200组成的组的作为亲本序列的寡核苷酸截短，其中将不超过2个核苷酸插入截短的序列中。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸从选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:200组成的组的作为亲本序列的寡核苷酸截短，其中将1个核苷酸插入截短的寡核苷酸序列中。

该适配体组合物的截短寡核苷酸可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸选自由包含选自由SEQ ID NO:201至SEQ ID NO:212组成的组的序列的至少10个连续的核苷酸的寡核苷酸组成的组。该适配体组合物的截短寡核苷酸可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸含有来自选自由寡核苷酸核苷酸组成的组的序列的至少10个相邻核苷酸，这些寡核苷酸核苷酸来自由SEQ ID NO:201至SEQ ID NO:212组成的组。至少一种寡核苷酸可包含一个或多个基序，该基序选自由以下组成的组：SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:207、SEQID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211和SEQ ID NO:212。适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:201、SEQ IDNO:202、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211和SEQ ID NO:212组成的组的序列具有至少80％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211和SEQ IDNO:212组成的组的序列具有至少90％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:204、SEQID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211和SEQ ID NO:212组成的组的序列具有至少95％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。

该适配体组合物可包含RNA寡核苷酸的至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸形成公开的二级结构并且从由作为亲本序列的SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10组成的组截短。该适配体组合物可包含从由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的作为亲本序列的组截短的至少一种寡核苷酸。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的作为亲本序列的序列具有至少80％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的作为亲本序列的序列具有至少90％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的作为亲本序列的序列具有至少93％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQID NO:8组成的组的作为亲本序列的序列具有至少96％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的作为亲本序列的序列具有至少99％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。

该适配体组合物可包含DNA寡核苷酸的至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸形成公开的二级结构并且从由作为亲本序列的SEQ ID NO:101至SEQ ID NO:110组成的组截短。该适配体组合物可包含从由作为亲本序列的SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ IDNO:105、SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:108组成的组截短的至少一种寡核苷酸。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:102、SEQ IDNO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:108组成的组的作为亲本序列的序列具有至少80％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:108组成的组的作为亲本序列的序列具有至少90％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107和SEQ IDNO:108组成的组的作为亲本序列的序列具有至少93％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:108组成的组的作为亲本序列的序列具有至少96％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ IDNO:105、SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:108组成的组的作为亲本序列的序列具有至少99％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。

本文公开的适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸形成公开的二级结构并且选自由寡核苷酸组成的组，这些寡核苷酸选自由SEQ ID NO:237至SEQID NO:246组成的组，或者包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸显示与选自由SEQID NO:237至SEQ ID NO:246组成的组的序列具有至少80％核苷酸序列同一性。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸显示与选自由SEQ ID NO:237至SEQID NO:246组成的组的序列具有至少90％核苷酸序列同一性。该适配体组合物可包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸显示与选自由SEQ ID NO:237至SEQ ID NO:246组成的组的序列具有至少95％核苷酸序列同一性。该适配体组合物可选自由SEQ ID NO:237至SEQID NO:246组成的组和/或选自显示与选自由SEQ ID NO:237至SEQ ID NO:246组成的组具有至少80％核苷酸序列同一性或至少90％核苷酸序列同一性或至少95％核苷酸序列同一性的寡核苷酸序列。

在一方面，适配体组合物对人细胞间粘附分子1(ICAM-1)(SEQ ID NO:213)、其天然变体、多态性变体或所述蛋白质的任何翻译后修饰形式具有结合亲和力。ICAM-1的翻译后修饰的非限制性示例是二硫键(例如，在Cys48和Cys92之间、Cys52和Cys96之间、Cys135和Cys186之间、Cys237和Cys290之间、Cys332和Cys371之间、Cys403和Cys419之间、Cys431和Cys457之间)、糖基化(例如在Asn130、Asn145、Asn183、Asn202、Asn267、Asn296、Asn385和Asn406处)、磷酸化(例如在Thr521或Thr530处)和泛素化。

在一方面，适配体组合物对人细胞间粘附分子1(ICAM-1)(SEQ ID NO:214)的细胞外结构域或所述结构域的任何翻译后修饰的形式具有结合亲和力。在一方面，适配体组合物对细胞间粘附分子1(ICAM-1)的一个或多个结构域具有结合亲和力，该结构域选自由以下组成的组：Ig样C2型1结构域(SEQ ID NO:215)、Ig样C2型2结构域(SEQ ID NO:216)、Ig样C2型3结构域(SEQ ID NO:217)、Ig样C2型4结构域(SEQ ID NO:218)、Ig样C2型5结构域(SEQID NO:219)、所述结构域的任何翻译后修饰的形式以及它们的混合物。在一方面，适配体组合物对细胞间粘附分子1(ICAM-1)的Ig样C2型1结构域(SEQ ID NO:215)、所述结构域的任何翻译后修饰的形式以及它们的混合物具有结合亲和力。

在一方面，该适配体组合物对人细胞间粘附分子1、2、3或4的一个或多个区域具有结合亲和力，其中所述区域包括选自由SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:223以及所述序列的片段组成的组的氨基酸序列。

化学改性可将新特征引入到适配体中，诸如与靶标的不同分子相互作用、改善的结合能力、增强的寡核苷酸构象稳定性或增加的核酸酶抗性。在一方面，适配体组合物的至少一种寡核苷酸可包含天然或非天然核碱基。天然核碱基为腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。非天然核碱基的非限制性示例可包括次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、硫尿嘧啶、1-甲基次黄嘌呤、6-甲基异喹啉-1-硫酮-2-基、3-甲氧基-2-萘基、5-丙炔基尿嘧啶-1-基、5-甲基胞嘧啶-1-基、2-氨基腺嘌呤-9-基、7-去氮-7-碘腺嘌呤-9-基、7-去氮-7-丙炔基-2-氨基腺嘌呤-9-基、吩噁嗪基、吩噁嗪基-G-clam、溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶以及它们的混合物。

寡核苷酸的磷酸酯主链的修饰也可增加对核酸酶消化的抗性。在一方面，寡核苷酸的核苷可通过选自由以下组成的组的化学基序连接：天然磷酸二酯、手性硫代磷酸酯、手性甲基膦酸酯、手性氨基磷酸酯、手性磷酸酯手性三酯、手性硼烷磷酸酯、手性硒代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、亚甲基甲基亚氨基、3'-酰胺、3'非手性氨基磷酸酯、3'非手性亚甲基膦酸酯、硫缩甲醛、乙硫醚、氟磷酸酯以及它们的混合物。在一方面，寡核苷酸的核苷可通过天然磷酸二酯链接。

在一方面，寡核苷酸的核苷的糖部分可选自由以下组成的组：核糖、脱氧核糖、2'-氟脱氧核糖、2'-O-甲基核糖、2'-O-(3-氨基)丙基核糖、2'-O-(2-甲氧基)乙基核糖、2'-O-2-(N,N-二甲基胺基氧)乙基核糖、2'-O-2-[2-(N,N-二甲基胺基)乙氧基]乙基核糖、2'-O-N,N-二甲基乙酰胺基核糖、N-吗啉基膦酰二胺、α-脱氧呋喃核糖基、其他戊糖、己糖以及它们的混合物。

在一方面，核糖核苷酸的衍生物或所述脱氧核糖核苷酸的衍生物可选自由以下组成的组：锁寡核苷酸、肽寡核苷酸、二醇寡核苷酸、苏阿糖寡核苷酸、己糖醇寡核苷酸、阿卓糖醇寡核苷酸、丁基寡核苷酸、L-核糖核苷酸、阿拉伯糖寡核苷酸、2'-氟阿拉伯糖寡核苷酸、环己烯寡核苷酸、二氨基磷酸酯吗啉代寡核苷酸以及它们的混合物。

在一方面，至少一种寡核苷酸的5'-端和3'-端处的核苷酸可为反向的。在一方面，至少一种寡核苷酸的至少一个核苷酸可在戊糖基团的2'位置处被氟化。在一方面，所述至少一种寡核苷酸的嘧啶核苷酸可在戊糖基团的2'位置处被氟化。在一方面，所述适配体组合物可包含至少一种聚合物材料，其中所述至少一种聚合物材料共价地连接到所述至少一种寡核苷酸。在一方面，所述至少一种聚合物材料可为聚乙二醇。

在一方面，所述至少一种寡核苷酸的长度可介于约30个核苷酸和约60个核苷酸之间。在一方面，所述至少一种寡核苷酸的长度可小于约50个核苷酸，另选地所述至少一种寡核苷酸的长度可小于约40个核苷酸。

在一方面，所述至少一种寡核苷酸可共价地或非共价地附接到一种或多种附加的活性成分。在一方面，所述一种或多种活性成分可选自由以下组成的组：呼吸道疾病治疗剂、感冒治疗剂、流感治疗剂、抗病毒剂、抗微生物剂、凉爽感觉剂、温热感觉剂、恶臭吸收剂、天然提取物、肽、酶、药物活性成分、金属化合物以及它们的混合物。在一方面，所述一种或多种活性成分可包括但不限于药物活性成分、薄荷醇、左旋薄荷醇、锌和其盐、桉树、樟脑以及它们的组合。合适的活性成分包括通常被认为是安全并且提供医疗保健有益效果的任何材料。

在一方面，所述至少一种寡核苷酸可经由分子相互作用非共价地附接到所述一种或多种活性成分。分子相互作用的示例是芳环的静电力、范德华相互作用、氢键合和π-π堆积作用。

在一方面，可使用一种或多种接头或间隔子将所述至少一种寡核苷酸共价地附接到所述一种或多种活性成分。接头的非限制性示例是化学上不稳定的接头、酶不稳定的接头和不可裂解的接头。化学上不稳定的接头的示例是酸可裂解的接头和二硫化物接头。酸可裂解的接头利用低pH来触发酸可裂解的键诸如腙键的水解，以释放活性成分或有效载荷。二硫化物接头可在还原环境下释放活性成分。酶不稳定的接头的示例为可在蛋白酶存在下裂解的肽接头和由释放有效载荷的葡糖苷酸酶裂解的β-葡糖苷酸接头。如果适配体通过核酸酶降解，则不可裂解的接头也可释放活性成分。

在一方面，所述至少一种寡核苷酸可共价地或非共价地附接到一种或多种纳米材料。在本发明中，所述至少一种寡核苷酸和所述一种或多种活性成分可共价地或非共价地附接到一种或多种纳米材料。在一方面，所述一种或多种活性成分可由所述一种或多种纳米材料携带。纳米材料的非限制性示例可包括金纳米粒子、纳米级铁氧化物、碳纳米材料(诸如单壁碳纳米管和石墨烯氧化物)、介孔二氧化硅纳米粒子、量子点、脂质体、聚(丙交酯-共-乙醇酸)纳米粒子、聚合物胶束、树枝状聚合物、血清白蛋白纳米粒子、基于DNA的纳米材料以及它们的组合。这些纳米材料可用作大体积活性成分的载体，而适配体可有利于将具有活性物质的纳米材料递送至预期靶标。

纳米材料可具有多种形状或形态。形状或形态的非限制性示例可包括球体、矩形、多边形、盘、环状、圆锥体、棱锥、杆/圆柱体和纤维。在本发明的上下文中，纳米材料通常具有至少一个小于约100μm并且更优选地小于约10μm的空间尺寸。纳米材料包括固相、半固相或液相的材料。

适配体也可以是以高亲和力和特异性结合靶标的肽。这些肽适配体可以是支架蛋白的一部分。肽适配体可从组合库分离，并通过定向突变或多轮可变区诱变和选择来改善。在一方面，所述适配体组合物可包含至少一种肽或蛋白质；其中所述适配体组合物对一种或多种细胞膜糖蛋白具有结合亲和力，其中所述一种或多种细胞膜糖蛋白可选自由以下组成的组：细胞间粘附分子1(ICAM-1)、低密度脂蛋白受体(LDLR)家族成员和钙粘蛋白相关家族成员3(CDHR3)；优选地细胞间粘附分子1(ICAM-1)，并且其中所述适配体被配置成减少一种或多种人鼻病毒与所述细胞膜糖蛋白，优选地细胞间粘附分子1(ICAM-1)的结合。特别地，所述适配体组合物可包含从本文公开的至少一种寡核苷酸翻译的至少一种肽或蛋白质。

III.设计亲本适配体组合物的方法

设计核酸适配体的方法被称为指数富集的配体系统进化(SELEX)，其已被广泛研究和改善，以用于针对小分子和蛋白质选择适配体(WO 91/19813)。简而言之，在SELEX的常规型式中，该过程以合成由随机生成的固定长度序列组成的大型寡核苷酸库开始，该固定长度序列两侧为充当引物的恒定5'-端和3'-端。然后将库中的寡核苷酸暴露于靶标配体，并且移除不结合靶标的那些。通过PCR(聚合酶链反应)洗脱和扩增结合的序列以准备随后几轮选择，其中洗脱条件的严格性通常增加以鉴定最紧密结合的寡核苷酸。除了常规的SELEX之外，还存在改善的型式，诸如毛细管电泳SELEX、基于磁珠的SELEX、细胞SELEX、自动化的SELEX、复合靶标SELEX等。对适配体筛选方法的综述见于(1)Kim,Y.S.和M.B.Gu，“Advances in Aptamer Screening and Small Molecule Aptasensors”，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.2014140:29-67(Biosensors based on Aptamers and Enzymes)以及(2)Stoltenburg,R.等人.(2007年)“SELEX-A(r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands”Biomol.Eng.200724(4):381-403，它们的公开内容以引用方式并入本文。虽然已广泛应用SELEX方法，但对于每个靶标，它既非预测型的也非标准化的。相反，必须为每个特定靶标开发一种方法，以使该方法产生可行的适配体。

尽管选择了大量的适配体，但SELEX尚未常规地用于选择对细胞膜糖蛋白诸如细胞间粘附分子1(ICAM-1)、低密度脂蛋白受体(LDLR)家族成员和钙粘蛋白相关家族成员3(CDHR3)具有结合亲和力并且防止人鼻病毒与这种蛋白质结合的适配体。出乎意料地，本发明人发现SELEX可用于防止人鼻病毒与ICAM-1受体结合的亲本适配体的设计。

选择库

在SELEX中，初始候选库通常为化学合成的DNA寡核苷酸的混合物，每种寡核苷酸包含n个核苷酸的长可变区，该长可变区在3'端和5'端两侧为该库的所有候选物的保守区或引物识别区。这些引物识别区允许在SELEX期间具体地讲通过PCR手段来操纵中心可变区。

可变区的长度决定库的多样性，其等于4ⁿ，因为每个位置可由四个核苷酸A、T、G或C中的一个占据。对于长可变区，会产生巨大的库复杂性。例如，当n＝50时，理论多样性为4⁵⁰或10³⁰，这在实践中是不可访问的值，因为此值对应于库中超过105吨的材料，其中每个序列表示一次。实验极限为约10¹⁵个不同的序列，这是其中表示具有25个核苷酸的可变区的所有候选序列的库。如果选择操纵包含理论多样性为约10¹⁸的30个核苷酸的可变区的库，则将仅探索1/1000的可能性。实际上，这通常足以获得具有所需性质的适配体。另外，因为所使用的聚合酶不可靠并且以大约10^-4的速率引入误差，因此它们有助于在整个SELEX过程中显著富集序列池的多样性。对于长度为100个核苷酸的随机区域的库，100个中的一个候选物将在每个扩增循环中被修饰，从而导致整个库出现10¹³个新候选物。

在一方面，寡核苷酸的起始混合物可包含多于约10⁶个不同的寡核苷酸并且更优选地介于约10¹³个和约10¹⁵个之间的不同寡核苷酸。在一方面，可变区的长度可介于约10个和约100个核苷酸之间。在一方面，可变区的长度可介于约20个和约60个核苷酸之间。在一方面，可变区的长度可为约40个核苷酸。可使用短于10个核苷酸的随机区域，但它们形成二级或三级结构的能力以及它们结合靶分子的能力可能受到限制。也可使用长于100个核苷酸的随机区域，但在合成成本方面可能存在困难。可变区的随机性不是对本发明的约束。例如，如果存在与结合到给定靶标的寡核苷酸有关的先前知识，则具有这种序列的库也可用作或优于完全随机的库。

设计引物识别序列时，应注意最小化序列间的潜在退火、序列内的折叠后区或相同序列本身的退火。在一方面，引物识别序列的长度可介于约10个和约40个核苷酸之间。在一方面，引物识别序列的长度可介于约12个和约30个核苷酸之间。在一方面，引物识别序列的长度可介于约18个和约26个核苷酸之间，即约18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或26个核苷酸。引物识别序列的长度和序列决定了它们的退火温度。在一方面，所述寡核苷酸的引物识别序列可具有介于约60℃和约72℃之间的退火温度。

适配体可以是核糖核苷酸(RNA)、脱氧核苷酸(DNA)、或它们的衍生物。当适配体是核糖核苷酸时，第一SELEX步骤可包括经由引物识别序列在5'端处转录化学合成的DNA寡核苷酸的初始混合物。在选择后，候选物在扩增前通过逆转录转化回DNA。具有能与之相比的特性的RNA和DNA适配体已经针对相同的靶标进行了选择，并且在本领域中有报道。另外，这两种类型的适配体可以是彼此竞争性抑制剂，从而表明相互作用位点的潜在重叠。

可通过在选择之前或之后修饰核碱基而将新的功能诸如疏水性或光反应性并入寡核苷酸中。在嘧啶的C-5位置或在嘌呤的C-8或N-7位置处的修饰尤其常见，并且与SELEX的扩增步骤期间使用的某些酶相容。在一方面，所述寡核苷酸可包含天然或非天然核碱基。天然核碱基为腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。非天然核碱基的非限制性示例为次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、硫尿嘧啶、1-甲基次黄嘌呤、6-甲基异喹啉-1-硫酮-2-基、3-甲氧基-2-萘基、5-丙炔基尿嘧啶-1-基、5-甲基胞嘧啶-1-基、2-胺基腺嘌呤-9-基、7-去氮-7-碘腺嘌呤-9-基、7-去氮-7-丙炔基-2-胺基腺嘌呤-9-基、吩噁嗪基、吩噁嗪基-G-clam、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、以及它们的混合物。一些非天然核碱基诸如5-溴尿嘧啶或5-碘尿嘧啶可用于产生可光交联的适配体，该可光交联的适配体可通过UV光活化以与靶标形成共价连接。

在一方面，所述寡核苷酸的核苷可通过选自由以下组成的组的化学基序连接：天然磷酸二酯、手性硫代磷酸酯、手性甲基膦酸酯、手性氨基磷酸酯、手性磷酸酯手性三酯、手性硼烷磷酸酯、手性硒代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、亚甲基甲基亚氨基、3'-酰胺、3'非手性氨基磷酸酯、3'非手性亚甲基膦酸酯、硫缩甲醛、乙硫醚、氟磷酸酯以及它们的混合物。在一方面，所述寡核苷酸的核苷可通过天然磷酸二酯链接。

在一方面，所述寡核苷酸的核苷的糖部分可选自由以下组成的组：核糖、脱氧核糖、2'-氟脱氧核糖、2'-O-甲基核糖、2'-O-(3-氨基)丙基核糖、2'-O-(2-甲氧基)乙基核糖、2'-O-2-(N,N-二甲基胺基氧)乙基核糖、2'-O-2-[2-(N,N-二甲基胺基)乙氧基]乙基核糖、2'-O-N,N-二甲基乙酰胺基核糖、N-吗啉基膦酰二胺、α-脱氧呋喃核糖基、其他戊糖、己糖以及它们的混合物。

在一方面，所述核糖核苷酸的衍生物或所述脱氧核糖核苷酸的衍生物可选自包含以下的组：锁寡核苷酸、肽寡核苷酸、二醇寡核苷酸、苏阿糖寡核苷酸、己糖醇寡核苷酸、阿卓糖醇寡核苷酸、丁基寡核苷酸、L-核糖核苷酸、阿拉伯糖寡核苷酸、2'-氟阿拉伯糖寡核苷酸、环己烯寡核苷酸、二氨基磷酸酯吗啉代寡核苷酸以及它们的混合物。

当在SELEX过程中使用经修饰的核苷酸时，它们应当与扩增步骤期间使用的酶相容。与商业酶相容的修饰的非限制性示例包括在RNA库中糖的2'位置处的修饰。嘧啶核苷酸的核糖2'-OH基团可替换为2'-氨基、2'-氟、2'-甲基或2'-O-甲基，这些基团保护RNA不被核酸酶降解。磷酸接头中的另外改性诸如硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯也与聚合酶相容并赋予核酸酶抗性。

在一方面，所述寡核苷酸的至少一个核苷酸可在戊糖基团的2'位置处被氟化。在一方面，所述寡核苷酸的嘧啶核苷酸可至少部分地在戊糖基团的2'位置处被氟化。在一方面，所述寡核苷酸的所有嘧啶核苷酸可在戊糖基团的2'位置处被氟化。在一方面，所述寡核苷酸的至少一个核苷酸可在戊糖基团的2'位置处被胺化。

另一种方法，最近描述为二维SELEX，同时应用体外寡核苷酸选择和动态组合化学(DCC)，例如寡核苷酸的某些基团(胺基)与醛化合物库之间的可逆反应。该反应产生以与常规SELEX相同的原理选择的亚胺寡核苷酸。因此，可以鉴定与天然适配体不同的靶向发夹RNA修饰的适配体。

一种非常不同的方法涉及光学异构体的使用。天然寡核苷酸是D-异构体。L-类似物具备核酸酶抗性，但不能由聚合酶合成。根据光学异构的规则，L-系列适配体可与其靶标(T)形成复合物，所述复合物具有与由D-系列异构体和靶标(T)的对映体(T')形成的复合物相同的特性。因此，如果化合物T'可为化学合成的，则其可用于进行天然适配体(D)的选择。一旦鉴定，该适配体可化学合成为L-系列。这一L-适配体是天然靶标(T)的配体。

选择步骤

单链寡核苷酸可折叠以产生二级结构和三级结构，类似于碱基对的形成。因此，初始序列库是三维形状的库，每个三维形状对应于可触发静电相互作用、产生氢键等的单元分布。选择变成了在库中鉴定适合靶标的形状的问题，即允许最大数量的相互作用和形成最稳定的适配体-靶标复合物的形状。对于小靶标(染料、抗生素等)，所鉴定的适配体的特征在于微摩尔范围内的平衡解离常数，而对于蛋白质靶标，低于10^-9M的Kd值并不罕见。

在每一轮中的选择通过从游离寡核苷酸物理分离与靶标相关的寡核苷酸进行。可以应用多种技术(色谱法、过滤保留、电泳等)。调节选择条件(靶标/候选物的相对浓度、离子浓度、温度、洗涤等)，使得在寡核苷酸之间发生靶结合竞争。一般来讲，严格性随着轮检的进行而增加，以便促进捕获具有最高亲和力的寡核苷酸。此外，进行反选择或阴性选择以消除识别载体或不需要的靶标(例如，过滤器、小珠等)的寡核苷酸。

用于选择靶标特异性亲本适配体的SELEX过程的特征在于重复五个主要步骤：(1)将寡核苷酸结合到靶标，(2)分配或移除具有低结合亲和力的寡核苷酸，(3)洗脱具有高结合亲和力的寡核苷酸，(4)扩增或复制具有高结合亲和力的寡核苷酸，以及(5)调节或制备用于下一个循环的寡核苷酸。设计该选择过程以鉴定对靶材料具有最大亲和力和特异性的寡核苷酸。

在一方面，设计可从中截短形成本文公开的所需二级结构的适配体的亲本适配体的组合物的方法可包括使以下物质接触的步骤：a)寡核苷酸的混合物，b)选择缓冲液，以及c)靶材料，该靶材料包含一种或多种选自由以下组成的组的细胞膜糖蛋白：细胞间粘附分子1(ICAM-1)、低密度脂蛋白受体(LDLR)家族成员、钙粘蛋白相关家族成员3(CDHR3)、它们的截短物以及它们的混合物；优选地细胞间粘附分子1(ICAM-1)及其截短物。在另一方面，设计本文公开的亲本适配体的组合物的方法可包括使以下物质接触的步骤：a)寡核苷酸的混合物，b)选择缓冲液，以及c)细胞，该细胞表达一种或多种选自由以下组成的组的细胞膜糖蛋白：细胞间粘附分子1(ICAM-1)、低密度脂蛋白受体(LDLR)家族成员、钙粘蛋白相关家族成员3(CDHR3)、它们的截短物以及它们的混合物；优选地细胞间粘附分子1(ICAM-1)及其截短物。在又另一方面，设计本文公开的亲本适配体的组合物的方法可包括使以下物质接触的步骤：a)寡核苷酸的混合物，b)选择缓冲液，以及c)人鼻上皮细胞，该人鼻上皮细胞表达一种或多种选自由以下组成的组的细胞膜糖蛋白：细胞间粘附分子1(ICAM-1)、低密度脂蛋白受体(LDLR)家族成员、钙粘蛋白相关家族成员3(CDHR3)、它们的截短物以及它们的混合物；优选地细胞间粘附分子1(ICAM-1)及其截短物。

在一方面，所述寡核苷酸的混合物可包括选自由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸的衍生物、核糖核苷酸的衍生物以及它们的混合物组成的组的寡核苷酸。此外，所述一种或多种细胞膜糖蛋白或其截短物可与其他物质诸如蛋白质或肽或表达所述糖蛋白的细胞的一部分混合分离。

通常重复SELEX循环几次，直到鉴定出具有高结合亲和力的寡核苷酸。循环次数取决于多个变量，包括靶标特征和浓度、起始随机寡核苷酸库的设计、选择条件、靶标结合位点与寡核苷酸的比率、以及分配步骤的效率。在一方面，所述接触步骤可进行至少5次。在一方面，所述接触步骤可进行介于6次和30次之间的次数。在一方面，所述方法还可包括在所述接触步骤期间移除不结合所述靶材料的寡核苷酸的步骤。

寡核苷酸是寡阴离子，每个单元在特定pH下具有电荷和氢键供体/受体位点。因此，选择缓冲液的pH和离子强度是重要的并且应代表预期适配体应用的条件。在一方面，所述选择缓冲液的pH可在约2和约9之间，另选地在约5和约8之间。

阳离子不仅有利于寡核苷酸的正确折叠，而且还可提供有益效果。在一方面，所述选择缓冲液可包含阳离子。阳离子的非限制性示例为Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺。

为了使适配体在其应用期间保持其结构和功能，体外选择过程可在与其正在开发的那些条件类似的条件下进行。在一方面，所述选择缓冲液可包括个人医疗保健组合物的溶液或悬浮液，该个人医疗保健组合物选自由以下组成的组：片剂、冻干片剂、棒糖、锭剂、液体中心填充糖果、糖果、粉末、颗粒物质、膜、液体、溶液、悬浮液、口腔冲洗剂或漱口水、盐水洗涤液、可分散流体、喷雾剂、快速溶解纤维、蒸气、乳膏、软膏、粉末、颗粒物质、膜以及它们的组合。

在一方面，所述选择缓冲液可包含至少一种表面活性剂。在一方面，至少一种表面活性剂可选自由以下组成的组：阴离子表面活性剂、两性或两性离子表面活性剂以及它们的混合物。阴离子表面活性剂的非限制性示例为烷基和烷基醚硫酸盐或磺酸盐，包括月桂基硫酸铵、月桂基聚氧乙烯醚硫酸铵、月桂基硫酸三乙基胺、月桂基聚氧乙烯醚硫酸三乙基胺、月桂基硫酸三乙醇胺、月桂基聚氧乙烯醚硫酸三乙醇胺、月桂基硫酸单乙醇胺、月桂基聚氧乙烯醚硫酸单乙醇胺、月桂基硫酸二乙醇胺、月桂基聚氧乙烯醚硫酸二乙醇胺、月桂酸单甘油酯硫酸钠、月桂基硫酸钠、月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠、月桂基硫酸钾、月桂基聚氧乙烯醚硫酸钾、月桂基肌氨酸钠、月桂酰肌氨酸钠、月桂基肌氨酸、椰油酰肌氨酸、椰油酰硫酸铵、月桂酰硫酸铵、椰油酰硫酸钠、月桂酰硫酸钠、椰油酰硫酸钾、月桂基硫酸钾、月桂基硫酸三乙醇胺、月桂基硫酸三乙醇胺、椰油酰硫酸单乙醇胺、月桂基硫酸单乙醇胺、十三烷基苯磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠、椰油酰羟乙磺酸钠、以及它们的组合。非限制性两性表面活性剂包括被广义描述为脂族仲胺和叔胺的衍生物的那些表面活性剂，其中脂族基团可为直链或支链的，并且其中脂族取代基之一包含约8个至约18个碳原子，并且一个脂族取代基包含阴离子基团，诸如羧基、磺酸根、硫酸根、磷酸根、或膦酸根，包括椰油酰两性基乙酸盐、椰油酰两性基二乙酸盐、月桂酰两性基乙酸盐、月桂酰两性基二乙酸盐以及它们的混合物。两性离子表面活性剂的非限制性示例包括被广义地描述为脂族季铵、鏻鎓和锍化合物的衍生物的那些表面活性剂，其中脂族基团可为直链或支链的，并且其中脂族取代基之一包含约8个至约18个碳原子，并且一个脂族取代基包含阴离子基团，诸如羧基、磺酸根、硫酸根、磷酸根或膦酸根和甜菜碱。

选择缓冲液可包含至少一种材料，该至少一种材料选自包含以下的组：含水载体、凝胶基质、硅氧烷调理剂、有机调理材料、非离子聚合物、沉积助剂、流变改性剂/悬浮剂、有益剂以及它们的混合物。含水载体的非限制性示例为水以及低级烷基醇和多元醇(包括乙醇、异丙醇、丙二醇、己二醇、甘油和丙二醇)的水溶液。凝胶基质的非限制性示例包含脂肪醇水溶液，包括鲸蜡醇、硬脂醇、二十二醇以及它们的混合物。硅氧烷调理剂的非限制性示例包含聚二甲基硅氧烷、聚二甲基硅氧烷醇、环状硅氧烷、甲基苯基聚硅氧烷、和具有各种官能团的改性硅氧烷，该官能团诸如氨基基团、季铵盐基团、脂族基团、醇基团、羧酸基团、醚基团、糖或多糖基团、氟改性的烷基基团、烷氧基基团、或这种基团的组合。有机调理材料的非限制性示例包括烃油、聚烯烃、脂肪酯、氟化调理化合物、脂肪醇、烷基葡糖苷和烷基葡糖苷衍生物、季铵化合物、具有至多约2,000,000分子量的聚乙二醇和聚丙二醇(包括CTFA名称为PEG-200、PEG-400、PEG-600、PEG-1000、PEG-2M、PEG-7M、PEG-14M、PEG-45M的那些)以及它们的混合物。非离子聚合物的非限制性示例包括聚亚烷基二醇，诸如聚乙二醇类。沉积助剂的非限制性示例包括具有阳离子胺或季铵官能团的乙烯基单体与水溶性间隔单体(诸如丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、烷基和二烷基丙烯酰胺、烷基和二烷基甲基丙烯酰胺、丙烯酸烷基酯、甲基丙烯酸烷基酯、乙烯基己内酯和乙烯基吡咯烷酮)的共聚物；乙烯基酯、乙烯醇(通过聚乙酸乙烯酯的水解制备)、马来酸酐、丙二醇和乙二醇、阳离子纤维素、阳离子淀粉和阳离子瓜尔胶。流变改性剂/悬浮剂的非限制性示例包括基于丙烯酸、甲基丙烯酸或其他相关衍生物的均聚物、基于藻酸的材料，以及纤维素衍生物。有益剂的非限制性示例包括增白剂、强化剂、抗真菌剂、抗菌剂、抗微生物剂、去头皮屑剂、抗恶臭剂、香料、嗅觉增强剂、抗痒剂、凉爽剂、抗粘附剂、保湿剂、光滑剂、表面改性剂、抗氧化剂、天然提取物和精油、染料、颜料、漂白剂、营养物质、肽、维生素、酶、螯合剂以及它们的混合物。

阴性选择或反选择步骤可最小化与不期望的靶标或靶标内的不期望表位结合的寡核苷酸的富集。在一方面，设计亲本适配体组合物的所述方法还可包括使以下物质接触的步骤：a)寡核苷酸的混合物，b)选择缓冲液，以及c)一种或多种不期望的靶标。用于针对未结合靶标对适配体进行阴性选择或反选择的方法已于WO201735666公布，其内容以引用方式并入本文。

设计亲本适配体组合物的方法可包括以下步骤：a)合成寡核苷酸的混合物；b)使以下物质接触：i.所述寡核苷酸的混合物，ii.选择缓冲液，以及iii.包含一种或多种细胞膜糖蛋白的靶材料；其中所述糖蛋白选自由以下组成的组：细胞间粘附分子1(ICAM-1)、其片段以及它们的组合，以产生靶标悬浮液；c)从所述靶标悬浮液中去除液相以产生靶标-寡核苷酸混合物；d)使所述靶标-寡核苷酸混合物与洗涤缓冲液接触，并且移除液相以产生靶标-适配体混合物；以及e)使所述靶标-适配体混合物与洗脱缓冲液接触，并且回收液相以产生适配体混合物。在一方面，所述步骤可重复进行至少5次。在一方面，所述步骤可进行介于6次和30次之间的次数，优选地小于20次。

在另一方面，设计亲本适配体组合物的方法包括以下步骤：a)合成包含寡核苷酸的脱氧核糖核苷酸的随机混合物，该寡核苷酸由下列组成：i.位于5'-端处的T7启动子序列、ii.位于中部的可变40-核苷酸序列、和iii.位于3'-端处的保守反向引物识别序列；b)使用在戊糖基团的2'位置处被氟化的嘧啶核苷酸和天然嘌呤核苷酸以及突变T7聚合酶转录所述脱氧核糖核苷酸的随机混合物以产生氟化核糖核苷酸的混合物；c)使以下物质接触：i.所述氟化核糖核苷酸的混合物，ii.选择缓冲液，以及iii.包含一种或多种细胞膜糖蛋白的靶材料；其中所述糖蛋白选自由以下组成的组：细胞间粘附分子1(ICAM-1)、其片段以及它们的组合，以产生靶标悬浮液；d)从所述靶标悬浮液中移除液相以产生靶标-寡核苷酸混合物；e)使所述靶标-寡核苷酸混合物与洗涤缓冲液接触，并且移除液相以产生靶标-适配体混合物；f)使所述靶标-适配体混合物与洗脱缓冲液接触，并且回收液相以产生RNA适配体混合物；g)逆转录并扩增所述RNA适配体混合物以产生所述RNA适配体混合物的DNA拷贝；以及h)对所述RNA适配体混合物的所述DNA拷贝进行测序。

选择后的修饰

为了提高适配体的稳定性，可在选择过程之后在适配体中引入化学修饰。例如，核糖部分的2'-OH基团可替换为2'-氟、2'-氨基或2'-O-甲基。此外，适配体的3'-端和5'-端可用不同的基团封端，诸如链霉亲和素-生物素、反向胸腺嘧啶核苷、胺、磷酸根、聚乙二醇、胆固醇、脂肪酸、蛋白质、酶、荧光团等，从而使得寡核苷酸具有核酸外切酶抗性或提供一些附加有益效果。其他修饰描述于本公开的先前章节中。

与可导致适配体-靶标相互作用特性丧失的主链改性不同，有可能在寡核苷酸的3'-端或5'-端中的一者处缀合各种基团，以便将其转化成递送载体、工具、探针或传感器而不破坏其特性。这种灵活性构成了适配体的显著优点，尤其是它们在本发明中的应用。在一方面，一种或多种个人护理活性成分可共价地附接到所述至少一种寡核苷酸的3'-端。在一方面，一种或多种个人护理活性成分可共价地连接到所述至少一种寡核苷酸的5'-端。在一方面，一种或多种个人护理活性成分可共价地附接到所述至少一种寡核苷酸的随机位置。

对适配体的修饰的并入可使用酶法或化学方法进行。用于修饰适配体的酶的非限制性示例是末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)、T4RNA连接酶、T4多核苷酸激酶(PNK)、DNA聚合酶、RNA聚合酶、以及本领域技术人员已知的其他酶。TdT为可向脱氧核糖核苷酸的3'端添加修饰的脱氧核苷酸的模板非依赖性聚合酶。T4RNA连接酶可用于通过使用经适当修饰的核苷3',5'-双膦酸酯来标记3'-端处的核糖核苷酸。PNK可用于磷酸化合成寡核苷酸的5'-端，从而令其能够进行其他化学转化(参见下文)。DNA聚合酶和RNA聚合酶通常用于在整个序列中随机并入修饰的核苷酸，前提条件是这种核苷酸与酶相容。

用于改性适配体的化学方法的非限制性示例为本领域的技术人员已知的并入本文的核糖核苷酸的高碘酸盐氧化、5'-磷酸的EDC活化、随机化学标记方法、以及其他化学方法。

在高碘酸盐氧化期间，偏高碘酸盐和原高碘酸盐裂解3'-核糖核苷酸的相邻二醇之间的C-C键，从而产生两个醛部分，这些醛部分使得能够在RNA适配体的3'-端处缀合标记或活性成分。所得的醛可容易地与含肼或含伯胺的分子反应。当使用胺时，可用氰基硼氢化钠(NaCNBH3)将产生的席夫碱还原为更稳定的仲胺。

当使用5'-磷酸的EDC活化时，寡核苷酸的5'-磷酸通常用EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐)和咪唑活化以产生反应性咪唑中间体，然后与伯胺反应以产生在5'端修饰的适配体。因为反应需要5'磷酸酯基团，所以可首先用激酶(例如，PNK)处理合成寡核苷酸。

可以用不同的方法进行随机化学标记。因为它们允许在沿着适配体的随机位点处进行标记，所以与末端标记方法相比可获得更高程度的修饰。然而，由于核碱基被修饰，因此可破坏适配体与其靶标的结合。最常见的无规化学修饰方法涉及使用光反应性试剂，诸如基于叠氮基苯的试剂。当叠氮基苯基团暴露于UV光下时，其形成不稳定的氮宾，该氮宾与适配体的双键以及C-H和N-H位点反应。

关于用于改性适配体的方法的附加信息概述于Hermanson G.T.的“BioconjugateTechniques”(第969-1002页，第2版，Academic Press,San Diego，2008年)中，其内容以引用方式并入本文。

在选择之后，除了化学改性之外，还可进行序列截短以移除对于结合或对于折叠成结构不是必需的区域。此外，可将适配体连接在一起以提供不同的特征或更好的亲和力。因此，本文所述的适配体的任何截短物或组合也可掺入适配体组合物中。

IV.鉴定要从亲本适配体截短的适配体的方法

形成本文公开的合适的二级结构的合适的截短序列可以通过理论分析来鉴定。因此，亲本适配体的主要有效区域必须基于稳定二级结构形成来确定。通常，亲本适配体在37℃下在可能的形状之间变动，并且单个序列可以形成的可能形状可以例如使用由维也纳大学Institute for Theoretical Chemistry的Theoretical Biology Group创建的ViennaRNA Web Services提供的在线软件通过理论分析来表征。除了理论上的可能性之外，还可以计算出给定温度下每种形状的相对比例。因此，可以选择截短适配体，这些截短适配体以高稳定性水平表现出这些形状中的某些形状，以用于进一步分析。

V.适配体组合物在个人医疗保健产品中的应用

本文描述了个人医疗保健组合物和使用这种组合物来预防和治疗由于呼吸道病毒感染引起的感冒样症状的方法。在一些方面，个人医疗保健组合物包含如本文所公开的至少一种适配体；其中该至少一种适配体对ICAM-1具有结合亲和力并且被配置成减少一种或多种人鼻病毒与细胞间粘附分子1(ICAM-1)的结合。个人医疗保健组合物可优选地应用于上呼吸道区域，诸如鼻腔和咽喉，以提供对鼻病毒结合和进入细胞的屏障。

个人医疗保健组合物优选地包含本文公开的药学有效量的至少一种适配体。在一些方面，个人医疗保健组合物可包含约0.001％至约1％，或者约0.005％至约0.5％，或者约0.01％至约0.1％的至少一种适配体，所有百分比均按组合物的重量计。

个人医疗保健组合物可口服施用或鼻内施用。在一方面，个人医疗保健组合物可为口腔组合物。口服组合物可以是液体形式、半固体形式、悬浮液形式或能够快速溶解在口中的任何固体形式。口服剂型的非限制性示例可包括片剂、冻干片剂、棒糖、锭剂、液体中心填充糖果、糖果、粉末、颗粒物质、膜、液体、溶液、悬浮液、口腔冲洗剂或漱口水、盐水洗涤液、可分散流体、喷雾剂、快速溶解纤维诸如聚乙烯吡咯烷酮和聚(乙烯醇)、以及它们的组合。考虑到其在崩解之前不应被吞咽并且可以容易地放入口中，固体口服剂型可具有任何期望的大小、形状、重量、稠度或硬度。另选地，个人医疗保健组合物可以是鼻用组合物。鼻用组合物可以是能够快速分散在鼻子中的任何剂型。鼻用剂型的非限制性示例可包括蒸气、乳膏、软膏、粉末、颗粒物质、膜、液体、可分散流体、喷雾剂以及它们的组合。

如本文所用，关于人/哺乳动物的术语“施用”是指人/哺乳动物摄取或被引导摄取，或摄取，或递送，或咀嚼，或饮用或喷雾，或置于口腔或鼻子中，或吸入一种或多种个人医疗保健组合物。施用可按需要或期望进行，例如每周一次或每天，包括每天多次，例如每天至少一次、每天至少两次、每天至少三次或每天至少四次。

可施用个人医疗保健组合物以预防和治疗感冒样症状。如本文所用，“感冒样症状”是指通常与呼吸道病毒感染相关的症状。这些症状包括但不限于鼻塞、胸闷、打喷嚏、鼻漏、疲劳或不适、咳嗽、发烧、喉咽痛、头痛和其他已知的感冒症状。

如本文进一步使用的，关于呼吸道疾病的“治疗”是指施用所提及的组合物预防、缓解、改善、抑制或减轻呼吸道疾病的一种或多种症状或呼吸道疾病本身，或相对于有需要的哺乳动物受试者，优选地人类的呼吸道疾病的任何类似益处。因此，这种益处包括例如：预防呼吸道疾病或其相关症状在哺乳动物中发生，例如当哺乳动物易患呼吸道疾病但尚未被诊断出患有该疾病时；抑制呼吸道疾病或其相关症状；和/或缓解、逆转或治愈呼吸道疾病或其相关症状。就本发明的方法涉及预防呼吸道疾病而言，应理解，术语“预防”不要求完全阻挡呼吸道疾病。相反，如本文所用，术语“预防”等是指技术人员识别对呼吸道疾病(诸如例如，在冬季月份的人类中)的易感性的能力，使得所提及的组合物的施用可在与疾病相关的症状发作之前发生。

本发明的个人医疗保健组合物和方法可包括、由或基本上由以下因素组成：本文所述的本发明的基本要素和限制，以及本文所述或以其他方式用于旨在供受试者使用的个人医疗保健组合物中的任何附加或任选的成分、组分或限制。

除非另外指明，否则本文中所有份数、百分比和比率均按重量计。除非另外指明，否则所有这种涉及所列成分的重量均基于活性物质水平计，并且因此不包括可包含于可商购获得的材料中的溶剂或副产物。除非另外指明，否则本文所涉及的所有测量均在25℃下进行。

本发明的个人医疗保健组合物可包含一种或多种以下物质：

个人医疗保健组合物可包含溶剂。溶剂的非限制性示例包括水、丙二醇、乙醇、甘油、聚乙二醇以及它们的混合物。溶剂可以按组合物的重量计约2％至约99％，或者约5％至约95％，或者约10％至约80％，或者约12％至约65％，或者约20％至约50％的量存在。

个人医疗保健组合物可包含增稠剂。增稠剂的非限制性示例可包括羧甲基纤维素(CMC)、羧甲基纤维素钠；以及它们的混合物。当存在时，组合物可包含约0.01％至约60％，或者约0.1％至约40％，或者约1％至约30％，或者约2％至约20％，或者约3％至约15％的增稠剂，所有百分比均按组合物的重量计。在一方面，增稠剂可提供保湿和/或水合益处，其减轻了接触时的咳嗽和/或有助于愈合口腔和/或咽喉。

个人医疗保健组合物可包含稀释剂。稀释剂的非限制性示例可包括微晶纤维素、硅化微晶纤维素诸如SMCC90(可从JRSPharma,Patterson,NY,USA商购获得)、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇、麦芽糖糊精、麦芽糖醇以及它们的组合。合适的稀释剂水平为按组合物的重量计约20％至约90％，或者约30％至约85％，或者约40％至约83％，或者约50％至约80％，或者约60％至约78％的稀释剂。

个人医疗保健组合物可包含崩解剂。可包括崩解剂以在施用后制定固体口服剂型的快速崩解。崩解剂的非限制性示例可包括交联聚维酮、羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代的羟丙基纤维素、瓜尔胶、藻酸钠以及它们的混合物。合适的崩解剂水平为按组合物的重量计约1％至约20％，或者约2％至约15％，或者约3％至约10％，或者约5％至约8％。

在一方面，组合物可包含甘露糖醇和交联聚维酮以提供快速崩解和溶解。使用可溶性糖如甘露糖醇的一个优点是它可以吸收水并快速溶解。使用崩解剂如交联聚维酮的一个优点是它可以吸收水并溶胀，从而导致剂型分解。当剂型分解时，其暴露于液体，诸如口腔中的唾液，并且可更快地溶解。甘露糖醇与交联聚维酮的比率可为约15:1、可替代地约13:1、可替代地约10:1。

个人医疗保健组合物可包含润滑剂。润滑剂的非限制性示例可包括硬脂富马酸钠、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸、山嵛酸甘油酯、氢化植物油、滑石、聚乙二醇、矿物油以及它们的组合。润滑剂的合适水平为按组合物的重量计约0.05％至约5％，或者约0.1％至约3％，或者约0.25％至约1.5％，或者约0.3％至约1％，或者约0.4％至约0.6％的润滑剂。

在一方面，个人医疗保健组合物可以是非牛顿流体或触变流体，在经受剪切力时表现出降低的表观粘度，但在静止时表现出高的表观粘度。非牛顿流体的一个优点是它允许通过在施加剪切力(诸如通过剧烈摇动装置产生的那些)后立即用泵喷雾装置或挤压型喷雾瓶喷涂来施用，但使所喷涂的材料在粘膜或皮肤上保持至少暂时相对不可移动。优选地，组合物在撤回剪切力后可具有非常快速的粘度恢复率。

个人医疗保健组合物可包含流变改性剂。流变改性剂的非限制性示例可包括羧甲基纤维素钠、褐藻胶、角叉菜胶(包括ι、κ、λ角叉菜胶以及它们的组合)、卡波姆、半乳甘露聚糖、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基壳多糖钠、羧甲基葡聚糖钠、羧甲基淀粉钠、微晶纤维素、微晶纤维素和羧甲基纤维素钠的混合物(可从FMC Corporation,Philadelphia,Pa以RC-591商购获得)、黄原胶以及它们的组合。流变改性剂的合适水平可为约0.5％至约15％，或者约1％至约12％，或者约2％至约6％，所有百分比均按组合物的重量计。流变改性剂不仅可提供粘度益处，而且还可更长时间地涂覆鼻子和咽喉以舒缓和/或递送所选药剂。

个人医疗保健组合物还可包含湿润剂。可以是吸湿性物质，诸如甘油、聚乙烯或其他二醇、多糖、芦荟等的湿润剂用于抑制组合物的水分流失并且可增加保湿性质。

个人医疗保健组合物可包含酸性剂。酸性剂可包括有机酸、焦谷氨酸以及它们的组合。合适的有机酸可包括但不限于抗坏血酸、单羧酸、二羧酸、三羧酸以及它们的混合物。合适的单羧酸、二羧酸或三羧酸的具体非限制性示例包括水杨酸、富马酸、苯甲酸、戊二酸、乳酸、柠檬酸、丙二酸、乙酸、乙醇酸、苹果酸、己二酸、琥珀酸、天冬氨酸、邻苯二甲酸、酒石酸、谷氨酸、葡糖酸以及它们的混合物。不受理论的限制，据信在鼻用组合物中掺入酸可以为病毒创造恶劣环境，而不会显著刺激呼吸道的特定区域，诸如鼻组织。该组合物可包含约0.01％至约10％，或者约0.05％至约5％，或者约0.10％至约2.5％的有机酸，所有百分比均按组合物的重量计。

个人医疗保健组合物可包含表面活性剂扩散助剂，诸如以聚山梨醇酯80市售的聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯、以聚山梨醇酯20市售的聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯、聚乙二醇400硬脂酸酯、聚乙二醇、以泊洛沙姆407市售的聚乙烯-聚丙二醇以及它们的组合。表面活性剂可以按组合物的重量计在约0.001％至约10％，或者约0.01％至约5％，或者约0.1％至约3％范围内的浓度包含在组合物中。

附加组分

本文所述的个人医疗保健组合物可任选地包含一种或多种已知用于个人医疗保健产品的附加组分，前提条件是附加组分在物理和化学上与本文所述的组分相容，或不以其他方式不当地损害产品的稳定性、美观性或性能。适用于本文的任选组分包括以下物质，诸如防腐剂、pH调节剂、螯合剂、金属化合物、药物活性成分、维生素、草本成分、甜味剂、感觉剂、调味剂、天然蜂蜜、挥发性油、芳香组分(如樟脑、桉叶脑、薄荷醇、芳香剂等)、抗氧化剂、氨基酸、能量增强成分、睡眠助剂、氯化钠以及它们的组合。任选组分可以在约0.001％至约20％，或者约0.01％至约10％，或者约0.1％至约5％范围内的浓度包含在个人医疗保健组合物中，所有百分比均按组合物的重量计。

在一方面，个人医疗保健组合物可包含防腐剂。可任选地包含防腐剂以防止微生物污染。防腐剂的非限制性示例可包括苯扎氯铵、葡萄糖酸氯己定、苯乙醇、苯氧基乙醇、苄醇、山梨酸、硫柳汞、乙酸苯汞、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、氯丁醇以及它们的混合物。

在一方面，个人医疗保健组合物可包含pH调节剂。pH调节剂的非限制性示例可包括碳酸氢钠、磷酸钠、氢氧化钠、氢氧化铵、锡酸钠、三乙醇胺、柠檬酸钠、琥珀酸二钠以及它们的混合物。任选的pH调节剂可包含在组合物中以将pH调节至约2至约8，或者约2至约5的值。如果存在，pH调节剂通常以按组合物的重量计在约0.01％至约5.0％范围内的浓度包含在内。

在一方面，个人医疗保健组合物可包含螯合剂。合适的任选螯合剂的非限制性示例可包括植酸、乙二胺四乙酸(EDTA)的二钠盐和钙盐、EDTA四钠、六偏磷酸钠(SHMP)、二(羟乙基)甘氨酸、8-羟基喹啉以及它们的混合物。螯合剂可以按组合物的重量计在约0.001％至10％，优选地约0.005％至约5％，更优选地约0.01％至约2％范围内的浓度包含在内。

个人医疗保健组合物可包含金属化合物。适用于本文的金属化合物包括含有选自由以下组成的组的金属离子的那些金属化合物：锰(Mn)、银(Ag)、锌(Zn)、锡(Sn)、铁(Fe)、铜(Cu)、铝(Al)、镍(Ni)、钴(Co)以及它们的混合物。适用于本文的金属化合物的非限制性示例包括乙酸锌、氯化锌、抗坏血酸锌、葡糖酸锌、焦谷氨酸锌(zinc pidolate)、琥珀酸锌、硫酸锌、依地酸锌以及它们的混合物。乙酸锌是最优选的金属化合物。

当个人医疗保健组合物包含含有锌离子的金属化合物时，据信锌离子提供抗病毒特性。锌离子已被证明为抗病毒和抗菌的。据信它们抑制鼻病毒多肽的裂解，防止感染病毒粒子的复制和形成。锌离子部分地通过降低细胞间粘附分子ICAM的表达来降低鼻病毒穿透细胞膜的能力。锌离子也被证明刺激T细胞淋巴细胞，包括天然抗病毒、干扰素-γ的产生。这些锌离子稳定细胞质膜，保护细胞免受细胞毒性剂的影响，并防止细胞渗漏。此外，已知金属离子诸如铁、银、铜和锌可提供抗病毒特性以预防和治疗感冒和流感样症状。个人医疗保健组合物中金属化合物的浓度可以在约0.001％至约20％，或者约0.01％至约10％，或者约0.05％至约5％，或者约0.1％至约2％，或者0.2％至约1％的范围内，所有百分比均按组合物的重量计。

药物活性成分的非限制性示例可包括薄荷醇；麻醉剂，诸如苯佐卡因(benzocaine)和利多卡因(lidocaine)；减充血剂，诸如去氧肾上腺素、伪麻黄碱、丁苄唑啉(xylometazoline)和羟甲唑啉(oxymetazoline)；抗组胺药，诸如多西拉敏(doxylamine)、苯海拉明(diphenhydramine)、氯雷他定(loratadine)和西替利嗪(cetirizine)；祛痰剂，诸如愈创甘油醚(guaifenesin)、氨溴索(ambroxol)和溴已新(bromhexine)；止痛剂，诸如对乙酰氨基酚(APAP)、布洛芬(ibuprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、双氯芬酸(diclofenac)、萘普生(naproxen)和阿司匹林(aspirin)；镇咳剂，诸如右美沙芬(dextromethorphan)、可待因(codeine)、氯苯达诺(chlophedianol)和左旋丙嗪(levodropropizine)；它们的游离盐和加成盐；以及它们的组合。药物活性成分可以约0.01％至约25％，或者约0.05％至约15％，或者约0.1％至约10％、约1％至约5％的水平存在，所有百分比均按组合物的重量计。在一方面，个人医疗保健组合物可包含本文公开的至少一种适配体和一种或多种药物活性成分以缓解一种或多种症状并抑制鼻病毒结合。

维生素的非限制性示例可包括维生素A、维生素C、维生素D2、维生素D3、维生素E、维生素K1、维生素K3、维生素B1、维生素B3、叶酸、维生素B12、维生素B3、维生素B7以及它们的组合。在一些方面，该组合物可包含全部按组合物的重量计约0.1％至约10％、可替代地约1％至约8％、可替代地约2％至约6％的维生素。

草本成分的非限制性示例可包括迷迭香(叶)、姜、柠檬香脂、绿茶、圣罗勒、牛至、百里香、印度人参、假马齿苋、春黄菊、缬草、迷迭香、姜黄、葡萄籽、蓝莓、咖啡、姜黄素、接骨木莓、药用蜀葵根、常春藤叶、红茶、白茶、乌龙茶、绿茶以及它们的组合。在一些方面，草本成分可为全草本或植物部分、提取物、粉末、浓缩物或它们的组合。在一些方面，该组合物可包含全部按组合物的重量计约0.1％至约10％、可替代地约1％至约8％、可替代地约2％至约6％的草本成分。

在一方面，甜味剂可选自包含以下的组：糖醇、合成甜味剂、高强度天然甜味剂以及它们的组合。

营养甜味剂的非限制性示例可包括蔗糖、右旋糖、葡萄糖、果糖、乳糖、塔格糖、麦芽糖、海藻糖、高果糖玉米糖浆以及它们的组合。营养甜味剂可以按组合物的重量计约1％至约99％，或者约4％至约95％，或者约10％至约70％，或者约15％至约60％，或者约25％至约50％，在另一个示例中约35％至约45％的量存在。

糖醇的非限制性示例可包括木糖醇、山梨醇、甘露醇、麦芽糖醇、乳糖醇、异麦芽酮糖醇、赤藓醇以及它们的组合。糖醇可以按组合物的重量计约5％至约70％，或者约10％至约60％，或者约15％至约55％，或者约25％至约50％，或者约30％至约45％的量存在。

合成甜味剂的非限制性示例可包括天冬甜素、丁磺氨钾、阿力甜、糖精钠、三氯蔗糖、纽甜、环磺酸盐以及它们的组合。合成甜味剂可以按组合物的重量计约0.01％至约10％，或者约0.05％至约5％，或者约0.1％至约3％，或者约0.2％至约1％，或者约0.1％至约0.5％的量存在。

高强度天然甜味剂的非限制性示例可包括新橙皮苷二氢查耳酮、蛇菊苷、莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙C、杜尔可甙、甘草酸单铵、非洲甜果素以及它们的组合。高强度天然甜味剂可以按组合物的重量计约0.01％至约10％，或者约0.05％至约5％，或者约0.1％至约3％，或者约0.5％至约1％的量存在。

个人医疗保健组合物可包含调味体系，该调味体系包括感觉剂、调味剂、流涎剂以及它们的组合。

个人医疗保健组合物可包含感觉剂。感觉剂的非限制性示例可包括凉爽感觉剂、温热感觉剂、麻刺感觉剂以及它们的组合。感觉剂可将感觉信号递送到口腔、咽喉、鼻腔和/或鼻窦通道，使得个人医疗保健组合物可以被用户感知为立即用于缓解疾病和/或提供舒缓的感觉。

凉爽感觉剂的非限制性示例可包括WS-23(2-异丙基-N,2,3-三甲基丁酰胺)、WS-3(N-乙基-对薄荷烷-3-甲酰胺)、WS-30(1-甘油基-对薄荷烷-3-羧酸酯)、WS-4(乙二醇-对甲烷-3-羧酸酯)、WS-14(N-叔丁基-对薄荷烷-3-甲酰胺)、WS-12(N-(4-，乙氧苯基)-对薄荷烷-3-甲酰胺)、WS-5(3-(对薄荷烷-3-甲酰氨基)乙酸乙酯)、薄荷醇、左旋薄荷醇、l-薄荷酮甘油缩酮(由Symrise,Holzminden,Germany以MGA出售)、(-)-乳酸薄荷酯(由Symrise,Holzminden,Germany以ML出售)、(-)-薄荷氧基丙烷-l,2-二醇(由Vantage Specialty Ingredients,Inc.,Warren,NJ以10出售)、3-(l-薄荷氧基)-2-甲基丙烷-l,2-二醇、(-)-异胡薄荷醇(由Takasago International,Tokyo,Japan以出售)、顺式&反式对薄荷烷-3,8-二醇(由Takasago International以38D出售)、吡咯烷酮羧酸薄荷酯(由Givaudan Active Beauty,Verbuer,Switzerland以出售)、(lR,3R,4S)-3-薄荷基-3,6-二氧杂庚酸酯(可购自Firmenich,Geneva,Switzerland)、(lR,2S,5R)-3-薄荷基甲氧基乙酸酯(可购自Firmenich)、(lR,2S,5R)-3-薄荷基3,6,9-三氧杂癸酸酯(可购自Firmenich)、(lR,2S,5R)-薄荷基11-羟基-3,6,9-三氧杂十一酸酯(可购自Firmenich)、(lR,2S,5R)-3-薄荷基(2-羟基乙氧基)乙酸酯(可购自Firmenich)、Icilin也称为AG-3-5(化学名称l-(2-羟苯基)-4-(3-硝基苯基)-3,6-二氢嘧啶-2-酮)、4-甲基-3-(l-吡咯烷基)-2[5H]-呋喃酮、薄荷油、留兰香油、L-琥珀酸单薄荷酯、L-戊二酸单薄荷酯、2-1-薄荷氧基乙醇(5)、3-1-薄荷氧基丙烷-1,2-二醇(由Takasago International以TK10出售)、N-(4-氰基甲基苯基)-对薄荷烷甲酰胺(由Givaudan以Evercool^TM180出售)以及它们的组合。凉爽感觉剂可以按组合物的重量计约0.001％至约1％，或者约0.01％至约0.5％，或者约0.02％至约0.25％，或者约0.03％至约0.10％存在。

温热感觉剂的非限制性示例可包括香草醇正丁基醚(由Takasago International以TK-1000出售)、HeatenolTM(购自Sensient Pharmaceutical,St.Louis,MO)、Optaheat(由Symrise,Holzminden,Germany出售)、姜提取物、辣椒酊、肉桂、辣椒素、咖喱、异丁酸香兰酯(Isobutavan)、诺香草胺(Nonivamide)、香草基丁基醚(可以VBE商购获得)、胡椒碱以及它们的组合。温热感觉剂可以按组合物的重量计约0.005％至约2％，或者约0.01％至约1％，或者约0.1％至约0.5％存在。

调味剂的非限制性示例可包括天然调味剂、人工调味剂、人工提取物、天然提取物以及它们的组合。调味剂的非限制性示例可包括香草、蜂蜜、柠檬、柠檬蜂蜜、樱桃香草、桃子、蜜姜、春黄菊、樱桃、樱桃霜、薄荷、香草薄荷、黑莓(dark berry)、黑莓(black berry)、覆盆子、胡椒薄荷、留兰香、水蜜桃、巴西莓、蔓越莓、蜂蜜蔓越莓、热带水果、火龙果、枸杞、红茎薄荷、石榴、黑加仑、草莓、柠檬、酸橙、桃姜、橙子、橙皮霜、杏、茴香脑、姜、菠萝蜜、杨桃、蓝莓、什果宾治、柠檬草、香蕉、草莓-香蕉汁、葡萄、树莓、柠檬青柠汁、冬绿色薄荷、口香糖、酸蜂蜜柠檬、青苹果、苹果、橘子、柚子、猕猴桃、梨、橘子、橘子酸橙、薄荷醇以及它们的组合。调味剂可以按组合物的重量计约0.05％至约10％，或者约0.1％至约8％，或者约0.2％至约6％，或者0.4％至约3％，或者约0.6％至约1.5％存在。

本文还描述了包含本文所述的个人医疗保健组合物的试剂盒。在一方面，试剂盒可包括递送装置和包含在递送装置中的个人医疗保健组合物。在一方面，试剂盒可任选地包括至少一种附加组分，诸如补充剂或维生素组合物。

本文还描述了提供一种或多种保健益处的方法，该方法包括向有需要的受试者施用如本文所述的包含本文公开的至少一种适配体的个人医疗保健组合物，其中该适配体对ICAM-1具有结合亲和力。一种或多种保健益处的非限制性示例可包括提供物理屏障以防止鼻病毒结合并进入细胞，从而有助于阻止由鼻病毒引起的感冒形成、降低由鼻病毒引起的感冒的严重程度和/或持续时间、减少患感冒的可能性以及它们的组合。

实施例

以下实施例说明了本文所述的本发明的非限制性实施例。示例性的个人医疗保健组合物可通过常规制剂和混合技术来制备。应当理解，在不脱离本发明的实质和范围的情况下，这些制剂领域内的技术人员可对个人医疗保健组合物进行其他的改性。以下为本文所述的个人医疗保健组合物的非限制性实施例。

口腔组合物实施例

咽喉喷雾剂

口服溶解片剂配方

液体组合物

咽喉锭剂组合物

	实施例10(Wt％)
		薄荷醇	0.2882
颜色	0.1
		抗坏血酸	0.26
蔗糖	适量
		液体葡萄糖	33.26
风味剂	0-0.6
		适配体	0.001-1.0

鼻用组合物

盐水鼻喷剂组合物

	实施例11A(Wt％)	实施例11B(Wt％)
			水	适量	适量
氯化钠	2.0
			磷酸钾缓冲剂		1.745
芦荟	0-1.0
			碳酸氢钠	0-2.0
桉树油	0-0.3
			适配体	0.001-1.0	0.001

鼻喷剂组合物

成分	实施例12(Wt％)	实施例13(Wt％)
			水	适量	适量
Avicel^TM591	3	3
			聚乙烯吡咯烷酮	3	3
Carbowax^TMPEG 1450	5	5
			磷酸氢二钠	0.0975	0.0975
磷酸二氢钠	0.5525	0.5525
			左旋薄荷醇	0.027	0.027
桉叶脑	0.009	0.009
			樟脑	0.009	0.009
苯扎氯铵50％溶液	0.1471	0.1471
			苄醇	0.35	0.35
乙-二胺四乙酸二钠	0.03	0.03
			盐酸羟甲唑啉	0.05	0
适配体	0.001-1.0	0.001-1.0

附加鼻喷剂组合物

	实施例14(Wt％)	实施例15(Wt％)	实施例16(Wt％)
				焦谷氨酸	0.35	0.70	1.00
琥珀酸	1.00	0.70	0.35
				二水合乙酸锌	0.12	0.012	0.12
聚山梨醇酯80	0.05	0.05	0.05
				卡波普980	--	--	1.20
羟丙基甲基纤维素	1.20	--	--
				泊洛沙姆407	--	15.8	--
糖精钠	--	0.025	0.025
				三氯蔗糖	0.025	--	--
苯基乙醇	0.37	0.37	0.35
				氯化钠	0.20	0.20	0.50
樟脑	--	0.03	--
				薄荷醇	0.02	0.06	0.02
桉叶脑	--	0.02	--
				芳族体系	0.05	0.38	0.05
氢氧化钠(30％)	--	--	0.10
				琥珀酸二钠	1.00	0.50	--
水	适量	适量	适量
				适配体	0.001-1.0	0.001-1.0	0.001-1.0

VI.实施例

实施例1.适配体选择和下一代序列表征。

A.选择策略

本发明的一个目的是开发不仅与ICAM-1受体特异性结合而且将以抑制病毒颗粒与受体蛋白结合的方式这样做的适配体。单独针对ICAM-1受体的细胞外结构域的适配体的选择不一定足以抑制病毒与相同蛋白的结合，因为适配体相对较小并且它们的抑制足迹将限于它们结合的表位。如果适配体结合的表位不涉及病毒与ICAM-1受体的结合，则它们不会抑制病毒颗粒的结合。

此目的被有意识地纳入到选择策略中，首先通过包括针对ICAM-1蛋白(SEQ IDNO:214)的细胞外结构域的几轮阳性选择；其次，通过施加双重阳性选择，使得适配体将在鼻细胞的背景下富集，用于与ICAM-1细胞外结构域的结合；第三，通过针对携带类似受体蛋白(ICAM-3SEQ ID NO:232和ICAM-5SEQ ID NO:234；SEQ ID NO:263)的HEK293细胞施加反选择；以及第四，通过针对特定的期望和不期望的适配体结合结果进行选择通道，包括通过添加鼻病毒颗粒从鼻细胞中特异性洗脱结合的适配体，通过预先施用鼻病毒颗粒抑制适配体与ICAM-1细胞的结合，针对HEK293细胞的阳性选择，针对ICAM-1的细胞外结构域的阳性选择，以及针对ICAM-1和鼻细胞的细胞外结构域的双重阳性选择。

当ICAM-1受体存在于鼻细胞上时，双重阳性选择(ICAM-1和鼻细胞的细胞外结构域)确保所富集的适配体有利于与ICAM-1受体结合。如果仅针对ICAM-1的细胞外结构域进行选择，则可能存在体内不存在的表位。如果仅针对鼻细胞进行选择，则适配体将针对这种细胞表面上除ICAM-1之外的结合靶标进行富集。

实施针对HEK293细胞的反选择以驱动与ICAM-1细胞外结构域的N端结合的适配体的富集。HEK293细胞表达ICAM受体家族的其他成员ICAM-3和ICAM-5。这些受体蛋白在细胞外结构域主要在其N端不同于ICAM-1。ICAM-1受体的N端是与鼻病毒颗粒结合的细胞外结构域的区域。因此，包括该反选择步骤以驱使适配体选择朝向那些将抑制鼻病毒与鼻细胞结合的适配体。

最后，一旦经针对ICAM-1和鼻细胞的细胞外结构域的双重阳性选择和针对HEK293细胞的反选择使适配体库富集，则将所富集的库分离成等分试样，并且应用于几个不同的靶标，包括持续的双重阳性选择、针对HEK293细胞的阳性选择、仅针对细胞外结构域的阳性选择、基于与鼻细胞结合的适配体的鼻病毒颗粒洗脱的选择、以及基于通过用鼻病毒颗粒预处理抑制适配体与鼻细胞结合的选择。

这些所选择的库中的每个库均通过下一代测序来表征。针对双重阳性选择、细胞外结构域选择和鼻病毒颗粒启动选择方法中的任一者表现出更高水平富集和单独针对HEK293表现出更低富集的适配体将是抑制鼻病毒与鼻细胞结合的期望序列。所述适配体用作亲本适配体，本文公开的适配体从亲本适配体截短。

B.人细胞的生长

B.1.人鼻上皮细胞生长条件

将原代人鼻上皮细胞(HNEpC；PromoCell，目录号C-21060)在气道上皮细胞生长培养基(PromoCell，目录号C-21160)中于37℃和5％CO₂下生长。

B.2.HEK293细胞的生长

购自ATCC(CRL-1573)的HEK293细胞在Eagle氏最低必需培养基(EMEM)+10％胎牛血清(FBS)中于37℃和5％CO₂下生长。

B.3.人鼻病毒A16悬浮液

购买UV灭活的HRV16病毒颗粒(Zeptometrix Corporation)并在-80℃下储存直至使用。计算病毒颗粒(VP)的浓度为98,700vp/mL。

C.亲本适配体选择

C.1.库制备

在第一步骤中，约10¹⁵个不同序列的DNA库(TriLink BioTechnologies)，包含两侧是两个保守区域的40个核苷酸的随机区域、正向引物识别序列(5'-GGGTGCATCGTTTACGC-3'；SEQ ID No224)和3'反向引物识别序列(5'-CTGCTGCTGAGGAAGGATATGAG-3'SEQ IDNo225)(参见图1)使用2'-氟代嘧啶核苷酸(2F-UTP和2F-CTP)和天然嘌呤核苷酸的混合物转录成RNA。

简而言之，使用引物Lib7_T7Fwd引物(序列：5'-TAATACGACTCACTATAGGGTGCATCGTTTACGC-3'(SEQ ID No226)，转录从第一个带下划线的G开始)和Lib7_T7Rvs引物(序列5'-CTCATATCCTTCCTCAGCAGCAG-3'SEQ ID No227)在390x50μL PCR反应中扩增约1.66纳摩尔单链DNA，进行4个循环。使用Genejet PCR纯化试剂盒(Fisher Scientific，目录号K0701)纯化所扩增的DNA。ssDNA库的这种扩增产生具有T7启动子的dsDNA库，其用作模板以产生用于选择的修饰的RNA库。

DNA扩增后，通过使用突变T7聚合酶(T7R&DNA聚合酶，Lucigen，目录号D7P9205K)聚合酶以及rATP、rGTP和修饰的核苷酸2F-UTP和2F-CTP的混合物，在26×20μL转录反应中转录52μg纯化的dsDNA。将NTP以3:1修饰与未修饰的比率混合在一起。每种反应混合物含有4μL 5x T7R&D聚合酶、1μL NTP3:1混合物、2μL DTT(0.1M)、0.7μL T7R&D聚合酶、1.2μL无机焦磷酸酶、0.5μLRnase抑制剂和10.6μLDNA模板。将反应在37℃下温育16小时。

通过设置由10μL 10x Dnase缓冲液、4μL Dnase I、66μL Rnase游离水和20μL转录反应组成的反应混合物对转录库进行Dnase处理。然后将反应混合物在37℃下温育30分钟，添加1μL0.5MEDTA并混合，在75℃下进一步温育10分钟，并且使用Monarch RNA清除试剂盒(New England Biolabs，目录号T2040L)纯化。

C.2.将ICAM-1固定在His-PurNi-NTA树脂上

将在C端区域上具有His标签的冻干ICAM-1蛋白(50μg Ray-Biotech，目录号：228-21751-2)重悬于100μLsH₂O(最终浓度为0.5μg/μL或9.88μM)中。将溶液等分并在-20℃下储存直至使用。蛋白质序列为：QTSVSPSKVILPRGGSVLVTCSTSCDQPKLLGIETPLPKKELLLPGNNRKVYELSNVQEDSQPMCYSNCPDGQSTAKTFLTVYWTPERVELAPLPSWQPVGKNLTLRCQVEGGAPRANLTVVLLRGEKELKREPAVGEPAEVTTTVLVRRDHHGANFSCRTELDLRPQGLELFENTSAPYQLQTFVLPATPPQLVSPRVLEVDTQGTVVCSLDGLFPVSEAQVHLALGDQRLNPTVTYGNDSFSAKASVSVTAEDEGTQRLTCAVILGNQSQETLQTVTIYSFPAPNVILTKPEVSEGTEVTVKCEAHPRAKVTLNGVPAQPLGPRAQLLLKATPEDNGRSFSCSATLEVAGQLIHKNQTRELRVLYGPRLDERDCPGNWTWPENSQQTPMCQAWGNPLPELKCLKDGTFPLPIGESVTVTRDLEGTYLCRARSTQGEVTRKVTVNVLSPRYEVDHHHHHH(SEQ ID No228)。

将His-Pur Ni-NTA(Fisher Scientific，目录号PI88221)树脂的等分试样转移到0.6mL管中，并以700xg离心2分钟。去除上清液，并用500μL PBS缓冲液(pH7.4)洗涤树脂3次。然后，将1xPBS缓冲液(pH7.4)中的ICAM-1蛋白的等分试样与His-Pur Ni-NTA树脂在4℃下一起温育过夜，同时混合。对于选择轮次1，将300皮摩尔ICAM-1蛋白固定到50μL树脂上。对于随后的轮次，将50皮摩尔ICAM-1蛋白固定到25μL树脂上。在蛋白质固定后，将树脂转移到带有玻璃料过滤器的1mL筒中，并用2mL1x PBS缓冲液洗涤。最后，添加1xPBS缓冲液中0.5mM-1mM咪唑的等分试样并在4℃下与树脂一起温育30分钟，以阻断树脂上未反应的结合位点。用1mL等分试样的1xPBS缓冲液洗涤树脂三次。

为了用咪唑封端的树脂进行阴性选择，将His-PurNi-NTA树脂的等分试样与适当浓度的在1xPBS缓冲液中的咪唑一起温育30分钟，以阻断树脂上未反应的结合位点，随后用1x选择缓冲液洗涤。用于本申请中的所有实施例的选择缓冲液是补充有氯化钙(CaCl2，0.9mM)、氯化镁(MgCl20.49mM)、氯化钾(KCl，2.67mM)、磷酸二氢钾(KH2PO4，1.47mM)、氯化钠(NaCl，137.93mM)和磷酸氢二钠(Na2HPO4，8.06mM)的Dulbecco氏PBS缓冲液。

C.3.亲本适配体选择概述

适配体选择在十四个选择轮次(“SR”)中进行，其在图2中示出。选择轮次1至5富集了适配体库中与固定到Ni-NTA树脂上的ICAM-1结合的序列。在选择轮次6至9中，对适配体库进行相同的ICAM-1固定的Ni-NTA树脂程序，并将洗脱的适配体进一步朝向与人鼻上皮细胞(HNEpC)结合的序列富集，这被称为双重阳性选择。在选择轮次10至11中，进行针对HEK293细胞的反选择和针对HNEpC的阳性选择。图3中所示的选择轮次12至14突破到不同选择条件并且被称为分裂。进行五种不同的分裂：分裂A：鼻上皮细胞，分裂B：HEK293细胞，分裂C：ICAM-1蛋白，分裂D：人鼻病毒A16(HRV16)洗脱，以及分裂E：HRV16阻断。

C.4.亲本适配体选择过程

C.4.1选择轮次1

通过针对ICAM-1固定的Ni-NTA树脂进行阳性选择来完成适配体选择轮次1。将RNA库(如第C.1节中所述产生)加热至45℃持续10分钟，并使其冷却至室温持续10分钟。然后，将制备的适配体库添加到固定在Ni-NTA树脂上的300皮摩尔ICAM-1(如第C.2节中所述制备)中并在室温下旋转温育30分钟。用500μL选择缓冲液(pH7.4)从树脂上洗去未结合的RNA。

然后通过向树脂中添加200μL6M尿素的等分试样并将悬浮液在85℃下温育5分钟来洗脱结合的RNA两次。收集回收的RNA库并使用Monarch RNA清除试剂盒纯化。

按照ProtoscriptII逆转录酶制造商的方案逆转录所收集的适配体库。逆转录反应的数量根据进入该特定选择轮次的RNA的量而变化。

然后，使用标准PCR方案和以下扩增步骤通过聚合酶链反应(PCR)扩增逆转录的适配体库：

步骤1：95℃-5分钟

步骤2：95℃-10秒

步骤3：56℃-15秒

步骤4：72℃-30秒

重复步骤2至4，持续4个循环

步骤5：95℃-10秒

步骤6：59℃-15秒

步骤7：72℃-30秒

重复步骤5至7，持续至多26个循环。

然后将PCR所扩增的dsDNA适配体库转录回RNA中并使用第C.1节中描述的方案进行Dnase处理。

C.4.2选择轮次2至5

选择轮次2至5并入两种选择策略：针对咪唑封端的Ni-NTA树脂的阴性选择和用ICAM-1固定的Ni-NTA树脂的阳性选择(参见图2)。进行阴性选择以选择不与咪唑封端的Ni-NTA树脂结合的适配体序列(如第C.2节中所述制备)。首先，将50μL咪唑封端的树脂的等分试样转移到装有20μm玻璃料的1mL筒中，并且用1mL等分试样的选择缓冲液洗涤两次。然后，将来自先前选择轮次的制备的RNA库加热至45℃持续10分钟，并使其冷却至室温持续10分钟。将RNA库添加到筒中并与咪唑封端的Ni-NTA树脂在室温下一起温育30分钟。温育后，收集流过的溶液。然后，使用500μL选择缓冲液的等分试样洗涤该筒，并收集溶液。将流过的溶液和柱洗涤收集物汇集在一起并按照制造方案用Monarch RNA清除试剂盒纯化。

然后对从阴性选择获得的RNA库进行阳性选择，其选择与ICAM-1固定的Ni-NTA树脂(如第C.2节中所述制备)结合的序列。简而言之，将RNA库加热至45℃持续10分钟，并使其冷却至室温持续10分钟。然后，将RNA库添加到固定在Ni-NTA树脂上的50皮摩尔ICAM-1(如第C.2节中所述制备)中并在室温下旋转温育30分钟。用500μL选择缓冲液的等分试样从树脂上洗去未结合的RNA。洗涤次数根据选择轮次和完成阳性选择的数量而变化，并且通过选择建模预先确定。然后，通过向树脂中添加200μL6M尿素的等分试样并将悬浮液在85℃下温育5分钟来洗脱结合的RNA库两次。收集所洗脱的RNA库并用Monarch RNA清除试剂盒纯化，随后如第C.1节和第C.4.1节中所述进行逆转录、PCR扩增、转录和DNAse处理。

C.4.3.选择轮次6至9

从选择轮次1至5所富集的RNA适配体库在选择轮次6至9中进一步富集，其利用两种选择策略：用ICAM-1固定的Ni-NTA树脂的阳性选择和针对表达ICAM-1受体的人鼻上皮细胞(HNEpC)的另一阳性选择。这组选择轮次被称为“双重阳性选择”。在选择轮次8中，进行了针对HNEpC的两个阳性选择(即“三重阳性选择”)。

在选择轮次6和7中，将RNA库重悬于500μL1x选择缓冲液中。第一阳性选择(针对ICAM-1固定的Ni-NTA树脂选择)通过将所重悬的RNA添加到固定在Ni-NTA树脂上的ICAM-1中开始，随后在37℃下温育30分钟。丢弃未结合的RNA，并用500μL1x选择缓冲液的等分试样洗涤树脂。对于洗脱步骤，将200μL6M尿素的等分试样添加到树脂中并在85℃下温育5分钟，并收集洗脱溶液。重复洗脱步骤，并将洗脱液汇集在一起并使用Monarch RNA净化试剂盒清洗。

第二阳性选择开始于通过从细胞生长的6孔板(约3mL)抽吸培养基制备HNEpC细胞，随后用3mL预热的1x选择缓冲液洗涤细胞三次。将1mLRNA库于1x选择缓冲液中的溶液立即施加到所洗涤的细胞，并在37℃和50转/分钟(rpm)下温育30分钟。温育30分钟后，收集含有约50％细胞的上清液，将细胞以500xg沉淀2分钟，并用200μL预热的1x选择缓冲液洗涤两次。收集细胞沉淀，并通过添加6M尿素从细胞中洗脱结合的RNA，随后在85℃下温育并进行RNA纯化。

将粘附的细胞(即剩余的约50％细胞)用1mL预热的1x选择缓冲液洗涤两次。然后，添加1mL 10mM EDTA的等分试样并使其与细胞在37℃下以50rpm一起温育15分钟。将经EDTA处理的细胞以500xg沉淀2分钟。然后，将200μL6M尿素的等分试样添加到沉淀中，并将悬浮液加热至85℃持续5分钟，随后以13,000rpm离心以回收上清液中的RNA适配体。再次重复洗脱步骤，合并洗脱液，并纯化RNA适配体。按照第C.1节和第C.4.1节中的方案对纯化的样品进行逆转录、PCR扩增和转录。

在选择轮次8和9中，从方案中去除细胞的EDTA提升，并使用6M尿素将与细胞结合的RNA洗脱，同时它们仍附接到6孔板。另外，在两个轮次中包括阴性选择步骤以去除与6孔培养板的塑料结合的任何RNA序列。对于阴性选择，将RNA库重悬于1mL1x选择缓冲液中，随后加热至37℃持续至少10分钟。将6孔培养板中的一个孔用1mL1x选择缓冲液预洗涤两次。然后，将加热的RNA库添加到孔中并在37℃和50rpm下温育30分钟。收集孔中的溶液并使用选择缓冲液达到1mL体积。将所得的1mLRNA库溶液与在6孔板中生长的HNEpC在37℃下以50rpm一起培温育1小时。从细胞中去除未结合的RNA，并将细胞用1mL1x选择缓冲液(预热至37℃)洗涤两次。通过添加1mL6M尿素并将细胞在85℃下温育5分钟来洗脱结合的RNA。重复洗脱步骤。将洗脱液汇集在一起，并使用Monarch RNA净化试剂盒纯化RNA。如先前所述，对所选RNA进行逆转录、PCR扩增、转录和DNAse处理。

C.4.4.选择轮次10和11

在选择轮次10和11中，引入针对HEK293细胞的阴性选择(参见图2)。HEK293细胞不表达ICAM-1受体，其允许对结合在细胞表面上不是ICAM-1的其他地方的序列进行反选择。

HEK293细胞在6孔培养板中生长，并以80％或更高的融合度使用。通过从孔中去除并丢弃所有培养基并用3mL预热的1x选择缓冲液洗涤细胞三次来制备细胞。然后，将所制备的RNA库添加到细胞中，并在温和振荡(50rpm)下将库和细胞溶液在37℃下温育1小时。温育后，去除并收集具有未结合的RNA库的上清液。然后，用1mL预热的1x选择缓冲液洗涤细胞，并且还收集溶液。合并所收集的RNA溶液并用Monarch RNA清除试剂盒纯化。然后按照如选择轮次8和9所述的相同方案(参见第C.4.3节)对该纯化的RNA库进行针对HNEpC的阳性选择轮次。在选择轮次10中进行两个阳性选择，而在选择轮次11中完成单个阳性选择。

C.4.5.选择轮次12至14：鼻上皮细胞分裂

在选择轮次12至14的鼻上皮细胞分裂中(参见图3)，从选择轮次11中收集的RNA库进一步针对HEK293细胞进行阴性选择，随后使用在第C.4.4节中描述的方案用HNepC进行阳性选择。

C.4.6.选择轮次12至14：HEK293细胞分裂

在选择轮次12至14的HEK293细胞分裂中(参见图3)，从选择轮次11中收集的RNA库朝向结合HEK293细胞的序列富集。该选择轮次的方案遵循第C.4.4节中描述的选择轮次10至11的程序，不包括用HNepC进行选择。

C.4.7.选择轮次12至14：ICAM-1蛋白分裂

在选择轮次12至14的ICAM-1分裂中(参见图3)，从选择轮次11中收集的RNA库朝向结合固定在Ni-NTA树脂上的ICAM-1的序列富集。该选择轮次的方案遵循在第C.1节和第C.4.1节中描述的选择轮次1的程序。

C.4.8.选择轮次12至13：人鼻病毒A16(HRV16)洗脱分裂

仅在选择轮次12和13期间发生HRV16洗脱分离(参见图3)。在选择轮次11中收集的RNA库通过针对HEK293细胞的阴性选择进一步富集，随后使用人鼻病毒A16(HRV16)颗粒对HNepC进行阳性选择以洗脱适配体库。对HEK293细胞的阴性选择遵循在第C.4.4节中描述的选择轮次10和11的相同方案，但不包括针对HNepC的选择。

在用HEK293细胞进行阴性选择之后，将收集的RNA在1x选择缓冲液中稀释并加热至37℃持续15分钟。将HNepC细胞用1mL预热的选择缓冲液洗涤三次，并将加热的RNA库添加到细胞中并在37℃和50rpm下温育1小时。温育后，去除未结合的RNA并丢弃。将回收的细胞用1mL预热的1x选择缓冲液洗涤十次。然后，将50％(v/v)病毒颗粒(VP)(参见第B.3节)于1x选择缓冲液中的悬浮液与细胞混合并在37℃下以50rpm混合温育1小时。收集上清液，并按照第C.1节和第C.4.1节中描述的方案纯化并逆转录RNA。

C.4.9.选择轮次12和13：HRV16阻断分裂

在选择轮次12和13期间进行HRV16阻断分裂(参见图3)。选择轮次11的RNA库进一步通过对HEK293细胞的阴性选择来富集，随后在将细胞暴露于RNA库之前，用与ICAM-1受体结合的HRV16对HNepC进行阳性选择。HEK293阴性选择遵循第C.4.4节中描述的选择轮次10和11的相同方案，不包括用HNepC进行选择。

对HEK293细胞进行阴性选择之后，制备了50％(v/v)病毒颗粒(VP)于1x选择缓冲液中的悬浮液。然后，将悬浮液加热至37℃持续15分钟并与预洗涤的HNepC细胞混合，随后在37℃和50rpm下温育1小时。温育后，去除所有未结合的VP并丢弃。然后，将从阴性选择中回收的RNA库重悬于1x选择缓冲液中，添加到细胞中并在37℃下温育1小时。按照第C.1节和第C.4.1节中所述的方案收集，纯化并逆转录含有未结合RNA的上清液。

D.亲本适配体测序

在14个选择轮次之后，对适配体库进行测序。概括地说，轮次10至14的选择库通过两步PCR过程制备以用于下一代测序(NGS)。在第一步中，将不同的hex代码(6碱基序列)和通用测序引物的一部分添加到每个适配体库的5'端。在第二步中，将完整的通用测序引物添加到两端。在第二个PCR步骤之后，通过丙烯酰胺电泳纯化这些库并且平衡相对量。然后将这些库合并，并将这些库发送到多伦多的病童医院使用Illumina HiSeq2500仪器进行NGS。

将测序数据制成表格并进行分析。对总计16,116,086个序列进行分析，并且每个库包含超过200,000个序列。将来自选择轮次14(鼻上皮细胞分裂)的序列按拷贝数排序并按降序命名，其中最高拷贝数的序列命名为Nas.R-1。这些前面序列在表4中列出。

在从其他选择轮次获得的库上测定选择轮次14的前面序列的拷贝数。最后，通过将观察到的拷贝数除以在特定选择库中观察到的序列总数来计算每个序列的频率。绘制前20个序列在不同选择轮次的频率方面的富集轨迹(参见图4)。在选择期间，这些序列以相似的速率富集。

E：截短适配体的合成

如下文实施例2A.1中所公开的，合成了通过下文实施例4中所示的理论分析识别的合适的截短序列。合成的截短序列在结合测定(实施例2A.4)中进行测试，以证实对细胞间粘附分子1(ICAM-1)的结合亲和力，并能够减少一种或多种人鼻病毒与细胞间粘附分子1(ICAM-1)的结合。

实施例2.适配体结合特异性

期望鉴定特异性结合ICAM-1受体并抑制鼻病毒感染人鼻上皮细胞的能力的适配体序列。上一节(实施例1)详述了确定在ICAM-1存在下富集的序列的选择过程的方案。本节将突出显示用于确定实施例1中发现的对ICAM-1受体靶标具有最高亲和力和特异性的序列的方案。

实施多种策略以确定来自RNA适配体的选择过程的重要序列，该适配体与人上皮细胞(HNEpC)特异性结合并且对其具有高亲和力，但对不表达ICAM-1靶标的HEK293细胞不具有高亲和力。第一方案包括将HNEpC和HEK293细胞暴露于一些所选适配体序列，然后温育、洗脱和定量与每种细胞类型结合的适配体浓度。实施的另一种策略包括可视化和鉴定与HNEpC结合但不与HEK293细胞视觉结合的荧光标记的RNA适配体。最终策略包括固定前面RNA适配体序列，然后使ICAM-1蛋白和其他各种蛋白质的细胞外结构域流过适配体并使用等离子体共振来确定结合亲和力。以下部分详细描述了以上概述的策略。

A.通过qPCR检测结合特异性和亲和力

A.1.适配体RNA序列的合成

购买了对应于RNA适配体有义序列和反义序列以及T7RNA聚合酶启动子的DNA寡核苷酸(Integrated DNA Technologies)。将每种寡核苷酸以等摩尔浓度在含有50mM KCl和1.5mM MgCl2的10mM Tris缓冲液(pH8.3)中混合，然后在95℃下温育5分钟。然后，通过dsDNA模板的转录来合成修饰的RNA适配体，然后进行DNAse处理，并如实施例1第C.1节和第C.4.1节所述进行纯化。

A.2.RNA适配体、HNepC和Hek293细胞制备

将修饰的RNA适配体以28.2nM的浓度溶解在1x选择缓冲液中。按照实施例1第B.1节和第B.2节中概述的方案，使HNepC或HEK293细胞在24孔板的孔中以在70％-75％(HNepC)或90％-95％(HEK293细胞)范围内的密度生长。

A.3.qPCR分析程序

对于每个样品，使用Luna qPCR universal mastermix(New England Biolabs，目录号M3003L)、0.2μM每种引物(正向引物：5'-TAATACGACTCACTATAGGGTGCATCGTTTACGC-3'(SEQ ID No226)、反向引物：5'-CTCATATCCTTCCTCAGCAGCAG-3'(SEQ ID No227))和5μLcDNA样品制备两种20μLqPCR反应物。还制备含有已知量的有义DNA模板的qPCR反应。使用以下条件进行PCR反应：

步骤1：95℃持续3分钟

步骤2：95℃保持15秒

步骤3：56℃持续15秒

步骤4：60℃持续30秒

重复步骤2至4，持续40个循环。

将结合测定样品的Ct值与已知量的DNA样品的Ct值进行比较，以确定与细胞结合的RNA的量。

A.4.人鼻上皮和HEK293适配体结合测定

测试选择过程(实施例1)中鉴定的前面的亲本适配体序列中的六个序列(Nas.R-1、Nas.R-2、Nas.R-4、Nas.R-5、Nas.R-7和Nas.R-8)对HNEpC或HEK293细胞的结合特异性和亲和力。如第A.2节所述制备RNA适配体、HNEpC和HEK293细胞。

将适配体与HNEpC在37℃和5％CO2下温育1小时，每15分钟轻轻摇动。去除未结合的RNA，并用150μL在37℃下预热的1x选择缓冲液洗涤细胞四次。为了洗脱结合的RNA适配体，将200μL6M尿素的等分试样添加到细胞中，然后在85℃下温育5分钟。重复洗脱步骤，合并洗脱液，并按照制造商的方案使用Monarch RNA净化试剂盒纯化RNA适配体。按照制造商的方案，将每个RNA样品在20μL M-MμLV(New England Biolabs，M0253L)逆转录酶反应中逆转录。按照第A.3节中描述的方案，使用qPCR分析对逆转录序列进行定量。HEK293细胞遵循相同的步骤。结果示出于图5中。对于适配体Nas.R-2、Nas.R-4、Nas.R-5、Nas.R-7和Nas.R-8，对HNepC的结合亲和力高于对HEK293细胞的结合亲和力。

A.5.HNEpC和RH-30适配体结合测定：截短的脱氧核糖核苷酸序列与亲本脱氧核糖核苷酸序列

使用前面亲本脱氧核糖核苷酸适配体序列中的在结合测定(实施例2，A.4)中被识别为高度有效的四个亲本脱氧核糖核苷酸适配体序列(Nas.D-2、Nas.D-4、Nas.D-5和Nas.D-8)重复结合测定。选择用于这些实验的DNA，以表明RNA示例适配体和DNA示例适配体两者在本发明中都有效。此外，通过将寡核苷酸改变为DNA形式，寡核苷酸的稳定性得到改善，并且成本降低了。测试了亲本适配体(SEQ ID NO:102；SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:108)对人鼻上皮细胞(HNEpC)或横纹肌肉瘤细胞系(RH-30)细胞的结合特异性和亲和力，并与截短适配体序列(SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:244、SEQ ID NO:245和SEQID NO:246)进行了比较。荧光素脒(FAM)缀合的DNA适配体在37℃、5％CO₂中在24孔板中培养的细胞上以500nM的浓度温育4小时。在特定时间点(0.5h、1h、2h、4h)，抽吸细胞培养基，并且用1X选择缓冲液洗涤孔三次。为了洗脱和裂解细胞，向孔中加入200ul的6M尿素，并在37℃温育5分钟。将尿素-适配体溶液转移到96孔微孔板读数器中，并495nm吸光度进行测量。一式三份地测量样品。图23至图26示出了结果。

如图23所示，截短适配体Nas.D-2.1a(SEQ ID NO:242)的结合与在0.5小时后在HNEpC上显示出接近3000RFU的亲本适配体Nas.D-2(SEQ ID NO:102)相比显示出更高的结合亲和力(接近5000RFU)。与亲本寡核苷酸相比，与RH-30细胞的结合显示出相同的结果，即截短适配体具有更高的结合亲和力，其中与HNEpC结合的适配体的绝对数量高于与RH-30细胞结合的适配体。还可以看到截短适配体Nas.D-2.1a(SEQ ID NO:242)在2小时后显示出第二结合峰。

图24示出了截短适配体Nas.D-4.1(SEQ ID NO:244)与亲本适配体Nas.D-4(SEQID NO:104)相比在HNEpC细胞和RH-30细胞上的结合。2小时后可观察到最大结合，其中与HNEpC结合的截短序列的绝对数量是亲本适配体结合数量的2.5倍。对于两个适配体(截短序列(SEQ ID NO:244)和亲本序列(SEQ ID NO:104))，与RH-30细胞结合是类似的，并且低于500RFU。

可在0.5小时后观察截短序列Nas.D-5(SEQ ID NO:245)的最大结合，其中与亲本适配体相比，超过2倍的截短适配体与HNEpC结合。几乎检测不到与RH-30细胞的结合(图25)。

Nas.D-8.1(SEQ ID NO:246)与HNEpC的结合特性再次显示出在0,5小时和2个小时后最大结合的两个峰。截短适配体(SEQ ID NO:246)的结合寡核苷酸的绝对数量再次高于亲本序列(SEQ ID NO:108)的结合寡核苷酸的数量。对于两种适配体，与RH-30细胞的结合更差，并在1小时后示出其最大值(图26)。

B.1.通过荧光可视化与HNEpC和HEK293上的ICAM-1结合的适配体

B.1.1.荧光标记的RNA适配体的制备

合成了具有间隔子(AAACAAACAAAC；SEQ ID No235)和在3'端的有义结合序列(GUAUGGCGGUCUCCAACAGG；SEQ ID No236)的修饰的RNA适配体Nas.R-4，如先前在第A.1节中描述的。

5'-GGGUGCAUCGUUUACGCGCAACAUAAAAAUUUAAAGUGCUCAGUUGUCAAUCUAUGACUGCUGCUGAGGAAGGAUAUGAGAAACAAACAAACGUAUGGCGGUCUCCAACAGG-3'(SEQ ID No229)。

添加有义结合序列以退火到6-FAM标记的荧光反义寡核苷酸。在每次结合测定之前，将NAS-FAM反义寡核苷酸(5'6-FAM/CCTGTTGGAGACCGCCATAC-3'(SEQ ID No230))与等摩尔浓度的经过修饰的RNA适配体在1x选择缓冲液中混合，然后在37℃下温育15分钟。

B.1.2.HNepC和Hek293细胞制备

按照第A.2节中概述的程序制备HNepC和HEK293细胞，但在测定前一至两天以约50％的密度接种到浸没于24孔板的孔中的培养基中的12mm玻璃盖玻片(FisherScientific，目录号12-545-82)上。

B.1.3.荧光标记的适配体与细胞的结合

从HNepC培养物中抽吸培养基。然后，将如第B.1节所述制备的150μL适配体/NAS-FAM反义混合物的等分试样施加到细胞上，然后在37℃和5％CO₂下温育15分钟并每5分钟温和搅拌。抽吸未结合的RNA适配体，并用150μL在37℃下预热的1x选择缓冲液洗涤HNepC三次。去除盖玻片并将其浸没在玻璃显微镜载玻片上的一滴选择缓冲液中。使用Nikon反向荧光显微镜和FITC荧光滤光片监测细胞的荧光至多约1小时。使用Nikon D7500相机在1/30秒曝光下拍摄图像(参见图6A至图6B)。使用HEK293细胞遵循相同的过程(参见图6C和图6D)。如图6A和图6B所示，当标记的适配体与HNepC一起温育时观察到显著的荧光，而用HEK293细胞未检测到荧光(图6C和图6D)，证实了与HEK293细胞上的标志物相比，适配体对HNepC(例如ICAM-1)的表面上的表面标志物的更强结合亲和力。

B.2.通过使用荧光的病毒抑制测定可视化H1-HeLa细胞上的病毒抑制

与阴性对照适配体相比，在病毒抑制测定中测试与ICAM-1结合的RNA适配体Nas.R-2和Nas.R-8，以证明其在抑制鼻病毒感染中的功效(图7A至图7H)。

B.2.1.适配体温育和病毒感染

将RPMI+2％胎牛血清中的H1-HeLa细胞以1×10⁵个细胞/mL和1.0mL/孔接种到24孔板上。吸出接种培养基，并向宿主细胞孔中以40μM添加0.5mL每种适配体。将宿主细胞在33±2℃、5±3％CO₂下温育30±5分钟。将0.5mL14型鼻病毒以10³TCID₅₀/孔添加到宿主细胞孔中，无需抽吸。将宿主细胞在33±2℃、5±3％CO₂下温育120±10分钟。抽吸宿主细胞孔并在细胞培养基中用1.0mL每种适配体重新补充，并返回到33±2℃、5±3％CO₂下的温育。在18±1小时之后，在细胞培养基中用1.0mL2X浓度的适配体补充细胞，并在33±2℃、5±3％CO₂下温育12±1小时。

B.2.2.病毒抑制的定量

在总温育期后，将宿主细胞板在-60℃至-90℃冷冻过夜，并且然后在环境温度下解冻。分别收获每个孔的内容物并以2,000rpm离心10分钟。收集每次收获的上清液，在细胞培养基中连续稀释并接种到新鲜的H1-HeLa细胞上，以使用组织培养感染量50％(TCID₅₀)测定来确定感染性病毒的量。来自仅用细胞培养基处理的细胞的对照孔的病毒的平均产率用于计算每种适配体的病毒抑制活性(Log₁₀降低)。

B.2.3.表1：结果

适配体	Log病毒效价降低	降低(％)
			Nas.R-2	2.08	99.2
Nas.R-8	1.33	95.3

图7A至图7H将结果显示为图像。如果TRITC标记的病毒能够感染细胞，则在荧光图像中可以看到红色标记的细胞。荧光图像中细胞的位置基于明场图像中的对应位置用箭头标记。使用Nas.R-2适配体可能没有看到感染(图7A荧光图像；图7B明场图像)。使用Nas.R-8适配体可能几乎看不到感染(图7C荧光图像；图7D明场图像)。使用阴性对照适配体(图7F明场图像)感染细胞并呈现红色(图7E)，并且图7G和图7H显示未用病毒感染的对照细胞(图7G荧光图像；图7H明场图像)。

C.通过表面等离子体共振(SPR)测定结合亲和力

C.1.金芯片中RNA适配体的固定

将RNA适配体Nas.R-1、Nas.R-2、Nas.R-4、Nas.R-8和阴性对照固定在金芯片的表面上。简而言之，将RNA适配体溶解于补充有10mM EDTA的1xPBS缓冲液中。然后，将20μL该溶液的等分试样添加到1.5mL管中的3.375mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)中。接下来，将13.5μL胱胺-咪唑溶液的等分试样添加到RNA适配体和EDC溶液中，随后混合并离心。去除上清液，并添加另外的54μL100μM咪唑(pH6.0)的等分试样。将溶液在室温下温育过夜。最后，使用RNA清除柱去除未掺入的胱胺和咪唑。

在5'磷酸基团处将胱胺部分与氨基磷酸酯键缀合之后，通过将浓度为10μM的10nL适配体溶液的等分试样沉积到芯片表面上来将适配体固定在金芯片上。金将胱胺还原成一对硫醇，并且然后催化还原反应，导致金表面和修饰的适配体的硫醇基团之间的共价键。

C.2.表面等离子体共振(SPR)程序

使用Openplex表面等离子体共振系统(Horiba,Kyoto,Kyoto,Japan)将200μLICAM-1蛋白或人血清白蛋白的溶液以250nM的浓度和50μL/min的流速流过金芯片。因此，缔合阶段在注射后持续4分钟，并且紧接着进行解离阶段。从每个候选适配体观察到的总共振中减去阴性对照适配体的总共振。由于蛋白质与适配体的结合，结果对应于共振贡献。图8示出了250nM外源ICAM-1与亲本适配体Nas.R-1、Nas.R-2、Nas.R-4和Nas.R-8结合的观察到的结合曲线。所有适配体在约250分钟后显示出结合峰，其中对于Nas.R-2观察到最强结合。图9示出了来自使用250nM人血清白蛋白的比较实验的结果，该比较实验没有显示出任何显著结合。

通过将曲线拟合到等式[1]来计算kd(koff)值：

x'～-kd*x [1]

其中x是由于结合引起的共振，并且x'是在解离曲线上捕获的每个时间点处该值的导数。kd值然后用于通过使用等式[2]来确定ka值：

x'～ka*Rmax*c-(ka*c+kd)*x [2]

其中Rmax是由于观察到的结合引起的最大共振，并且c是注射剂的浓度。最后，将解离平衡常数kD计算为kd与ka的比率(参见表2)。针对不同适配体获得的低纳摩尔kD值证实了这种分子对ICAM-1的强结合亲和力并且验证实施例1中描述的适配体选择过程。如本文所用，“kd”是指解离速率，“ka”是指缔合速率，并且“kD”是指解离平衡常数。

表2.Nas.R-1、Nas.R-2、Nas.R-4和Nas.R-8在250nM外源性ICAM-1上的结合系数。

适配体	Nas.R-1	Nas.R-2	Nas.R-4	Nas.R-8
					kd，[1/s]	1.27E-02	1.42E-02	2.25E-02	2.63E-03
ka，[1/Ms]	1.97E+05	2.02E+05	5.08E+05	9.27E+04
					kD，[M]	6.44E-08	7.02E-08	4.43E-08	2.84E-08

D.适配体结合特异性

如实施例1中所述，在选择过程中，用HEK293细胞进行反选择。HEK293细胞不表达ICAM-1受体，但它们确实表达相关受体蛋白ICAM-3和ICAM-5。对于某些序列，例如Nas.R-2(SEQ ID NO:2)，与HEK293细胞相比，对鼻细胞的亲和力明显更高。不希望受理论约束，鉴于HEK293细胞上存在ICAM-5和ICAM-3，显然选择的适配体与来自ICAM-1受体蛋白区域的表位结合，该区域在序列上不同于来自ICAM-5或ICAM-3受体的那些。图10示出了ICAM-1(SEQ IDNO:214)、ICAM-3(SEQ ID NO:232)和ICAM-5(SEQ ID NO:263)的细胞外结构域的序列比对，并且突出显示可能产生ICAM-1特异性结合的区域，其中“*”标记显示氨基酸同一性完全保守的位置，“:”是指在PAM250矩阵上得分大于0.5的高度保守的氨基酸特性，并且“.”是指具有弱相似特性并且在PAM矩阵上小于0.5的PAM250的氨基酸保守性(Schwartz RM,DayhoffM.Matrices for detecting distant relationships.在以下文献中：Dayhoff M，编辑.Atlas of Protein Sequence and Structure.补充3.第5卷.National BiomedicalResearch Foundation；Silver Spring,MD:1978.Pp.第353–358卷)。PAM得分是指突变发生的概率，而不是特性的相似性，因此该定义是特性保守和发生概率的组合。对于适配体与蛋白质的结合，显然，当区域中存在完整的氨基酸同一性时，表位是完全保守的。然而，当存在不同的氨基酸但保持特性(正电荷或负电荷是最重要的特性)时，表位也可能是保守的，而当只有弱相似性或根本没有相似性时，表位不太可能是保守的。

鼻病毒与ICAM-1受体的N端Ig样C2型1结构域结合。鉴于选择策略，包括用人鼻病毒颗粒洗脱和针对HEK293细胞的反选择，本领域受过训练的人清楚地看到，成熟的选择的适配体库将在适配体序列中富集，该适配体序列不仅与ICAM-1受体的细胞外结构域结合，而且还特异性地结合在N端处的Ig样C2型1结构域。

图11示出了在适配体选择过程中应用的最后三个选择轮次中适配体频率的倍数比较。数据表示为针对鼻细胞选择的单个适配体序列的频率除以针对HEK293细胞的选择中观察到的相同序列的频率。对于适配体Nas.R-2、Nas.R-1和Nas.R-17，在针对HEK293细胞的选择中未观察到序列(图例是指选择轮次)。也就是说，至少就在下一代测序过程中观察到的序列的子样品而言，在针对鼻细胞的选择轮次14中以高频率观察到这些序列，但在针对HEK293细胞的选择中根本未观察到。

不希望受理论束缚，与HEK293细胞相比，在鼻细胞上选择时没有表现出频率富集的适配体应该被认为是可能不会抑制HRV结合的适配体。图12描绘了在选择轮次14中的序列，这些序列在HEK293阳性选择中均表现出比针对鼻细胞的阳性选择更高的富集水平。预期这些适配体将与不在N端并且与ICAM-3或ICAM-5区域具有相当大的序列同一性的ICAM-1受体的区域结合。

B.2.4.核糖核苷酸亲本适配体与截短适配体相比的结合

为了比较核糖核苷酸适配体的结合特异性和亲和力，在人鼻上皮细胞(HNEpC)和作为对照细胞的横纹肌肉瘤细胞系(RH-30)上用全长亲本和截短适配体两者进行结合测定。荧光素脒(FAM)缀合的RNA适配体在37℃、5％CO₂中在24孔板中培养的细胞上以500nM的浓度温育4小时。在特定时间点(0.5h、1h、2h、4h)，抽吸细胞培养基，并且用1X选择缓冲液洗涤孔三次。为了洗脱和裂解细胞，向孔中加入200ul的6M尿素，并在37℃温育5分钟。将尿素-适配体溶液转移到96孔微孔板读数器中，并495nm吸光度进行测量。一式三份地测量样品，并且结果在表3中示出。

B.2.3.表3：截短适配体与对应全长亲本序列相比的结合。

适配体	表面结合
		Nas.R-2	17％
Nas.R-2.1a	64％
		Nas.R-4	11％
Nas.R-4.1	26％
		Nas.R-8	12％
Nas.R-8.1	22％

表3显示出与HNEp细胞结合的最大比例的总结。截短适配体(Nas-R.2.1/SEQ IDNO:237、Nas-R.4.1/SEQ ID NO:239和Nas-R.8.1/SEQ ID NO:241)与其全长亲本序列(SEQID NO:2；SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:8)相比在结合方面全部表现出显著改进。截短适配体Nas-R.4.1(SEQ ID NO:239)和Nas-R.8.1(SEQ ID NO:241)的结合功效超过亲本适配体(SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:8)的结合功效的2倍，并且对于截短适配体Nas-R.2.1a(SEQ IDNO:237)来说，与亲本适配体(SEQ ID NO:2)相比，观察到超过3倍的结合。

实施例3.序列相似性分析。

使用软件AlignX进行SEQ ID NO:101至SEQ ID NO:200的比对，该软件是Invitrogen的Vector NTI Advanced11.5.4的部件。几个序列组具有至少90％、至少70％或至少50％的核苷酸序列同一性，如图13、图14和图15的示例比对所示，这些图示出了DNA适配体分析的结果。图13示出了Nas.D-3(SEQ ID NO:103)和Nas.D-88(SEQ ID No:188)的序列的中心区域的比对。所示序列(SEQ ID No:247和SEQ ID No:248)从亲本序列的位置18处开始，其中比对以灰色显示，非比对以白色显示。图14示出了Nas.D-45(SEQ ID NO:.145)和Nas.D-8(SEQ ID NO:108)的序列的中心区域以及Nas.D-47(SEQ ID NO:147)和Nas.D-78(SEQ ID NO:178)的序列的中心区域的比对。所示序列(SEQ ID NO:249和SEQ ID NO:250以及SEQ ID NO:251和SEQ ID NO:252)从亲本序列的位置18处开始，其中比对以灰色显示，非比对以白色显示，并且自由位置用“-”表示。图15示出了Nas.D-13(SEQ ID NO:113)和Nas.D-97(SEQ ID NO:197)、Nas.D-31(SEQ ID NO:131)和Nas.D-93(SEQ ID NO:193)、Nas.D-39(SEQ ID NO:139)和Nas.D-82(SEQ ID NO:182)、Nas.D-61(Seq ID NO:161)和Nas.D-91(SEQ ID NO:191)的序列的中心区域以及Nas.D-87(Seq ID NO:187)和Nas.D-94(SEQ ID NO:194)的序列的中心区域的对比。所示序列(SEQ ID NO:253和SEQ ID NO:254、SEQ ID NO:255和SEQ ID NO:256、SEQ ID NO:257和SEQ ID NO:258、SEQ ID NO:259和SEQID NO:260以及SEQ ID NO:261和SEQ ID NO:262)从亲本序列的位置18处开始，其中比对以灰色显示，非比对以白色显示，并且自由位置用“-”表示。在这些比对中，为了简单起见，仅包括适配体的中心可变区。因此，对于与显示能有效结合ICAM-1的序列具有至少50％、至少70％或至少90％核苷酸序列同一性的寡核苷酸，预期例如Nas.D-8(SEQ ID NO:108)具有类似的结合有效性。

实施例4.基序分析和预测二级结构。

适配体基于它们形成的自由能最低的形状结合到靶标分子。自由能最低的形状随着单链序列内的区域之间的同源性而变。这些同源性区域相互折叠，从而产生对于能够结合而言至关重要的适配体的二级和三级形状。我们通过对保守基序序列及其对整个适配体的预测结构的效应的组合分析来表征这些适配体的核心特性。在此上下文中，基序被定义为限定长度的核苷酸的连续序列。对于这个实施例，我们考虑了每个表征的适配体的随机区域内每个可能重叠的六个核苷酸基序。

确定选择轮次14的所有序列(鼻上皮细胞分裂库)中的来自前面适配体(Nas.R-1、Nas.R-2、Nas.R-4和Nas.R-8)的随机区域的六个核苷酸的基序的频率。然后，从每个基序的频率中减去平均基序频率，并且将该值除以该选择轮次中所有基序频率的标准偏差，从而得到每个基序的Z值。显然，包含高频基序的序列也结合到靶分子。

对适配体的二级结构的预测是用Vienna RNA Websuite(http://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi.GruberAR,Lorenz R,Bernhart SH,Hofacker IL；Nucleic Acids Research,Volume36,Issuesuppl_2,1July2008,Pages W70-W74,DOI:10.1093/nar/gkn188)进行的并且在这些结构内突出显示基序。

A.保守基序在适配体Nas.R-1/Nas.D-1内的结构上的作用的分析：

基序分析的结果在图16中示出。在该图中沿着x轴连续地提供包括适配体的随机区域的重叠六个核苷酸基序。y轴为库中的每个基序提供统计学显著性(Z值)。将Z值计算为观察到的这一基序在库中的频率减去库中所有基序的频率平均值，并且将所得之差除以库中所有基序的标准偏差以提供Z值。因此，Z值2表示该基序在库中的频率，该频率比所有基序的平均值大两个标准差。

序列AAACAAAAAGA和UAAAAAUCA以表示比平均值多两个标准偏差的水平进行保守。图17中示出了Nas.R-1适配体和共有序列的最低自由能量预测结构。

SEQ ID NO:201：5'-AAACAAAAAGA-3'

SEQ ID NO:202：5'-UAAAAAUCA-3'

还预期含有这些基序中的任何基序的序列与ICAM-1结合并作为本发明的亲本实施方案包括在内。在该实施例中得出的关于RNA序列中保守基序的结论也将适用于DNA序列(图16)。因此，含有对应的脱氧核糖核苷酸基序的任何序列

SEQ ID NO:203：5'-AAACAAAAAGA-3'

SEQ ID NO:204：5'-TAAAAATCA-3'

也作为亲本实施方案包括在内。

B.保守基序在适配体Nas.R-4/Nas.D-4内的结构上的作用的分析：

以与针对Nas.R-1描述的相同的方式进行保守基序在适配体Nas.R-4内的结构上的作用的分析，并且在该实施例中得出的关于RNA序列中保守基序的结论也将适用于DNA序列。图19提供了对适配体Nas.D-4的基序分析的总结。存在以与所选库中的总平均基序频率大于两个标准偏差的频率存在的十三个核苷酸基序，即

SEQ ID NO205:5'-AUAAAAAUUUAAA-3'和对应脱氧核糖核苷酸基序：

SEQ ID NO206：5'-ATAAAAATTTAAA-3'。

还预期含有该基序的序列与ICAM-1结合并作为本发明的亲本实施方案包括在内。

C.保守基序在适配体Nas.R-8/Nas.D-8内的结构上的作用的分析：

以与针对Nas.R-1和Nas.R-4所述相同的方式，对保守基序在适配体Nas.R-8内的结构上的作用进行分析。在该实施例中得出的关于RNA序列中保守基序的结论也将适用于DNA序列。图21提供了对适配体Nas.D-8的基序分析的总结。存在以与所选库中的总平均基序频率大于两个标准偏差的频率存在的十二个核苷酸基序，即

SEQ ID NO:207：5'-GUAAAAAUUAAA-3'

和对应的脱氧核糖核苷酸基序：

SEQ ID NO208:5'-GTAAAAATTAAA-3'

还预期含有该基序的序列与ICAM-1结合并作为亲本实施方案包括在内。

D.对适配体库内常见基序的分析：

根据频率对前100个序列内的常见基序进行搜索(参见图18)。在与随机分布的显著偏差方面，所鉴定的领头基序是SEQ ID NO:209和SEQIP NO:210。

SEQ ID NO:209：5'-GUAAAAAAA-3'

SEQ ID NO:210：5'-UNAGCANUUU-3'

包含基序SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210或两者的寡核苷酸作为本发明的亲本实施方案包括在内。类似地，还预期含有对应的脱氧核糖核苷酸基序的任何序列

SEQ ID NO:211：5'-GTAAAAAAA-3'

SEQ ID NO:212：5'-TNAGCANTTT-3'

与ICAM-1结合并作为本发明的亲本实施方案包括在内。

E.截短适配体的制备

E.1.：用于截短的合适序列的识别

为了识别更有效的适配体，将SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:200的寡核苷酸截短至通过理论分析确定的主要有效区域。在37℃下，全长亲本适配体通常在可能的形状中流动。其中表征了单个序列可能形成的可能形状，并用通过维也纳大学Institute forTheoretical Chemistry的Theoretical Biology Group创建的ViennaRNA Web Services提供的在线软件来确定每种形状在给定温度下的相对比例。然后，识别并合成了以尽可能高稳定性水平表现出这些形状中的某些形状的截短适配体，如上文在实施例2A.1中公开的。如果需要，将引入单个核苷酸替代来稳定形状。然后对这些截短的、优化的适配体进行结合再测试，从而为关于适配体形状和功能之间相互作用的假设奠定了基础。截短适配体被设计成保持亲本适配体的所有特性，特别是显示出对细胞间粘附分子1(ICAM-1)的结合亲和力，并能够减少一种或多种人鼻病毒与细胞间粘附分子1(ICAM-1)的结合。合适的截短适配体序列包括来自亲本适配体序列的约30个至约60个核苷酸，并且优选地包括SEQ IDNO:201至SEQ ID NO:212中公开的保守基序中的至少一个保守基序。所得的截短序列优选地能够形成本文公开的稳定二级结构，以充当能够随时间推移减少一种或多种人鼻病毒与细胞间粘附分子1(ICAM-1)结合的适配体。

前面适配体序列中被识别为在上文的结合特异性过程(实施例2)中示出与ICAM-1具有高结合亲和力的四个适配体序列Nas.D-2(SEQ ID NO:102)、Nas.D-4(SEQ ID NO:104)、Nas.D-5(SEQ ID NO:105)和Nas.D-8(SEQ ID NO:108)用作示例亲本序列，其中由于与核糖核苷酸适配体相比具有更高的稳定性，因此选择脱氧核糖核苷酸适配体用于实验。分析了亲本序列，并可视化了基于最低自由能的稳定二级结构。

图20A示出了SEQ ID NO:104的亲本寡核苷酸优选的二级结构。中心发夹结构表示用于与ICAM-1受体结合的有希望的结合候选物。虚线框中识别的核苷酸被识别以形成截短适配体序列SEQ ID NO:244。图20B和图20C示出SEQ ID NO:244的截短寡核苷酸出现在两种不同的稳定二级结构中。两种二级结构都包括：形成包括未配对/未杂交的核苷酸15至19(从5'-端计算)的中心环的发夹的共同结构概念，之后是包括第一个二级结构中的9个杂交碱基对(图20B)和分成4个碱基对的9个杂交碱基对的双链茎、包含5个未配对/未杂交的核苷酸的第二内环以及包括第二个二级结构中的6个杂交碱基对的第二双链茎(图20C)。两种二级结构都显示出未配对/未杂交的3'-端和5'端。二级结构的两种变体都是稳定的，并显示出共同结构概念。

图22A示出了SEQ ID NO:108的亲本适配体的优选的二级结构。在3'-端附近形成的发夹结构(用虚线框标记)表示用于与ICAM-1受体结合的有希望的结合候选物。因此截短亲本序列中不感兴趣的部分，从而形成SEQ ID NO:246的截短适配体。发夹包括包含10个未配对/未杂交的核苷酸的中央第一环、包括5个杂交碱基对的第一双链茎、包括3个未配对/未杂交的核苷酸的第二内环、包括3个杂交碱基对的第二双链茎以及未配对/未杂交的3'-端和5'-端(图22A)。图22B示出了二级结构，该二级结构可通过序列的小突变来实现。通过在位置15处由T变为C形成另一个G-C对，中央环减少到8个未配对/未杂交的核苷酸。第一双链茎仍然包括5个杂交碱基对，而第二环减少到在位置10处只有一个未配对/未杂交的核苷酸。因此，包括5个杂交碱基对的更大的第二双链茎可以通过未出8处的另一个T到C突变形成。未配对/未杂交的3'-端和5'-端保持不变(图22B)。

F.截短适配体的二级结构的详细分析

F.1.：基于截短适配体NasD-4.1制备突变的适配体

使用NasD-4.1截短适配体(SEQ ID NO:244)对二级结构基序及其与ICAM-1的结合亲和力的相关性进行了详细分析。利用针对鼻细胞的四个选择轮次分析单独基序的重要性和/或序列同一性的潜在相关性，并使用原始适配体和突变适配体(适配体内每个核苷酸上的突变负荷为9％)分析了与ICAM-1受体的结合，如上文根据C.4.3公开的。为了在选择轮次之间进行扩增，在5'-端处添加9个核苷酸(ATCTAATAA)，并且在3'-端处添加8个核苷酸(AAAAACCC)，以便不破坏适配体的预测二级结构。突变事件限于图20C所示的Nas-4.1适配体(SEQ ID NO:244)。通过下一代测序(NGS)分析了所有四个选择轮次的库以及原始的未选择的库。生成了37个核苷酸内所有可能的单突变和双突变的列表，并通过选择过程提取了这些突变序列中每个突变序列的频率。库中任何给定序列在选择轮次中的比例被认为是该序列结合ICAM-1受体的功效的度量。为了最小化PCR误差对这些结果解释的潜在影响，还计算了选择轮次3和4中的每个序列的平均频率，并除以该序列在原始库(选择轮次0)中的相应频率。从该被除数中减去一，以减少该分数，从而直接指示每个序列的比例变化(“比例”)。

F.2.：适配体功效和结构基序的相关性

序列对适配体功效的影响的分析可能会受到限制，但不同序列表现如此的原因是它们对适配体结构有不同的影响。这些差异表现在存在或不存在与ICAM-1受体相互作用的电荷基团以及这些相互作用之间的距离差异。可以将对构成给定突变负荷的所有序列的分析视为在非突变序列周围的水平上对序列空间的检查。因此，适配体序列基于P.Danaee等人.(Nucleic Acids Research，第46卷，第11期，2018年6月20日，第5381–5394页)中公开的代码并基于本文公开的预测适配体结构而转移到其结构基序中。将4.1适配体序列转移到结构代码中允许独立于适配体核苷酸序列来比较结构效应。

适配体4.1的结构代码是

5'-EEEEEEEEEESISSSSSSISSSSHHHHHSSSSIIIISSSSSSISEEEEEEEEEE-3'

然后，对这种结构信息串的数据库进行评估，以找到对有利选择表现出最强统计学意义的基序。MEME软件套件(T.L.Bailey等人；Nucleic Acids Research,43(W1):W39-W49,2015)用于探索共有基序及其与结构代码的关系，如上所示。在功效(比例)序列方面，将前500个双突变序列与后500个双突变序列进行比较。因此，确定了前500个序列与后500个序列中存在的最一致的结构基序。在识别了三个基序后，分析停止。图27A示出了结果。结构代码的相对高度是对信息确定性的测量，即它显示了在特定位置观察特定代码的确定程度。遥遥领先的第一基序是IISS^S/_EEEEEE。这隐含地指适配体3'端的悬空端，这是考虑到在E的5'侧附近有茎结构。其他感兴趣的基序是适配体底部的发夹弯，之后是3'侧的茎结构，以及长度为12个核苷酸的悬空5'端。这些基序在适配体中的分布在图27B中提供，该图示出了包括在以上识别的统计学显著类别中的一些序列的示例。第二基序(大方形灰色)的存在说明需要发夹/茎结构，但这些结构在适配体中的位置并不完全固定。第一基序(黑色)仅在3'端观察到，而第三基序(小方灰)同时在5'端和3'端均观察到。第三基序没有隐含锚定，因为它只表示一串连续的E(悬空端)。当该基序在适配体末端之前结束时，这仍然意味着适配体具有一直到端核苷酸的悬空端。该结论同样适用于第一基序(黑色)。如果该基序出现，则在它与3'端之间的所有位置也将是悬空端。

总之，通过结构分析，识别了适配体中三个重要的感兴趣区域。

1.)3'悬空端，包括悬空端与上游茎结构之间的连接。

2.)茎发夹结构，其在适配体中的位置不完全固定

3.)5'悬空端。

F.3.：适配体功效和结构基序的相关性

如上所示，有效适配体包括作为悬空端的两端以及内茎/发夹结构。分析了与识别的基序相关的序列，并且在3'-悬空端的结构基序中发现了感兴趣的累积。在图28中，示出了可视化包括所述序列的适配体的频率(平均比例)的图表的一部分。发现高度存在的所有适配体(意味着高度有效)在3'-悬空端的序列中包括基序GAGGYYZ。具有序列GAGGYYZ的适配体所观察到的平均比例为0.23，其中对于在所述位置不显示基序的适配体所观察到的平均比例为-0.17。

F.4.：突变Nas-4.1序列的结合分析

选择本文公开的适配体以在SELEX选择过程中在37℃下进行。此外，与在培养物中生长的细胞上执行的适配体性能相关的所有实验也是在37℃下进行的，因为这是最佳细胞生长的合适温度，并且与体温相对应。然而，适配体旨在体内作用于鼻腔的内表面，并且所述鼻细胞显示出稍低的平均温度33℃。如此，重要的是确保本发明的适配体在两种温度下都能发挥作用。因此，使用NanoITC(低体积TA器械)并遵循NasD-4.1适配体(SEQ ID NO:244)的用户说明，在37℃和33℃下使用等温滴定量热法(ITC)进行结合分析。对序列(SEQID NO:264-270)中的特定突变进行测试，以分析温度和二级结构的影响。将600nM浓度的NasD-4.1适配体分11次注射到193uL体积的100nM浓度的ICAM-1受体蛋白中，每次注射4.88uL。将相同浓度的突变适配体注射到缓冲液中，并将缓冲液注射到相同量的蛋白质中作为对照。ITC实验在33℃和37℃下载磷酸钾缓冲液中进行。

测试了以下适配体，其中突变以粗体显示：

NasD-4.1：5'-GTGCTCAGTTGTCAATCTATGACTGCTGCTGAG GAAG-3(SEQ ID NO.244)

状态1：5'-GTGGTCAGTTGTGAATCTATGACTGCTGCTGAG GAAG-3(SEQ ID NO.264)

状态2：5'-GAGCTCAGTTGTCAATCTATGACTGCTGCTGAG GAAG-3(SEQ ID NO.265)

状态3：5'-GTGCTCACTTGTCAATCTATGACTGCTGCTCAG GAAG-3(SEQ ID NO.266)

状态4：5'-GTGCTCACTTGTCAATCTATGACTGCTGCTGAG TAAG-3(SEQ ID NO.267)

状态5：5'-GTGCTCTCTTGTCAATCTATGACTGCTGGAGAG GAAG-3(SEQ ID NO.268)

状态6：5'-GTGCTCAGTTGTCAATCTAAGACTGCTGCTGAG GAAG-3(SEQ ID NO.269)

状态7：5'-GTGCTCAGTTGTCAAAGAATGACTGCTGCTGAG GAAG-3(SEQ ID NO.270)

将解离常数(kD)的测量值与原始/未突变的Nas-D4.1适配体进行比较，该测量值表示突变适配体结合亲和力的直接度量。kD值以nM为单位。高于Nas-D4.1适配体的测量值表明突变体的结合亲和力较低，并且反之亦然。表4中示出了结果：

表4

状态1的适配体(SEQ ID NO.264)中的突变位于5'-端附近。结构预测揭示了该结构在两种温度下都是稳定的，并且GAAGYYZ基序位于悬空的3'-端。使用RNAfold(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)在33℃和37℃下生成了所有突变适配体的预测二级结构。图29示出了突变体状态1最有可能的二级结构，其中灰度显示了核苷酸处于所示结构中的可能性，阴影越深可能性越高。与未突变的NasD-4.1适配体(SEQ ID NO.244)相比，没有观察到5'悬空端。这可能解释了突变体在33℃的体内条件下的结合亲和力较低。状态2的适配体(SEQ ID NO.265)中的突变也位于5'-端附近，但与对照NasD-4.1适配体(SEQ ID NO.244)相比旨在通过将GAGGYYZ基序固定在茎区域的一半来修正适配体的二级结构。然而，具有最大可能性的预测结构(图30)显示突变没有改变二级结构，并且GAGGYYZ基序仍然位于悬空的3'-端，这与体内条件下几乎不变的结合亲和力非常一致。为了理解突变适配体状态2在37℃下结合亲和力的降低，再次用ViennaRNA WebServices提供的在线软件来确定在平衡状态下形成的二级和三级优选的二级结构。图31示出了结果，其中杂交的核苷酸以深灰色显示，而未杂交的核苷酸以浅灰色显示。最有可能的结构1(图31A)是也在图30中计算的结构。第二可能的结构2(图31B)的不同之处在于形成了更大的内环，并且第二茎包括第五碱基对。因此，悬空端缩短，并且GAGGYYZ基序部分位于茎区域中。在第三可能的二级结构中(图31C)，形成了第二内环和第三茎，导致仅一个核苷酸在5'-端悬空，但完整的GAGGYYZ基序在3'-端悬空。图32示出了图31所示的三种二级结构变体在33℃(图32A)和37℃(图32B)下的分布。在两种温度下，结构1(如图31A所示)占主导地位。然而，与在33℃下的分布相比，在37℃下，结构3(如图31C所示)的份额显著更大。因此，与在33℃下的分布相比，在37℃下，结构2(如图31B所示)的份额显著更小。不同二级结构变体份额分布的这种差异导致突变适配体状态2结合亲和力的损失。不希望受理论的约束，据信，缺失的悬空5'-端对整个适配体的结合亲和力具有负面影响，这与突变适配体状态1中已经观察到的情况类似。

状态3的适配体(SEQ ID NO.266)中的突变是在GAGGYYZ基序的第一位置处。在两种温度下都观察到结合亲和力的降低。似乎在体内温度下，突变对适配体性能的影响较小。状态4的突变适配体(SEQ ID NO.267)中的突变是在GAGGYYZ基序的第4位置。令人惊讶的是，状态4的突变适配体的结合亲和力在37℃下几乎不受影响，其中在33℃下观察到结合亲和力下降。二级结构预测揭示了突变的GAGTAAG基序中的四个碱基杂交(如突变所预期的那样)，并形成在体内条件下导致较低结合亲和力的茎(图33A)。然而，在较高温度(37℃)下，基序序列中的突变将二级结构转变为GAGTAAG基序完全未杂交并且在3'-端悬空的形状(图31B)，从而与NasD-4.1结构更相似，并且在较高温度下的ITC结合实验中观察到该突变状态的全部功能。图33中的灰度示出核苷酸处于所示结构中的可能性，阴影越深可能性越高。不希望受理论的约束，据信，在3'-端悬空的序列的自由度补偿了序列基序突变的潜在负面影响，从而导致稍高的结合亲和力。

状态5的突变适配体(SEQ ID NO.268)中的突变位于刚好在GAGGYYZ基序之前的茎区域中。与对照NasD-4.1适配体(SEQ ID NO.244)相比，通过这些突变没有预测到突变适配体的二级结构的一般变化，并且观察到结合亲和力的轻微改进。

在状态6的突变适配体(SEQ ID NO:269)和状态7的突变适配体(SEQ ID NO:270)中，发夹基序发生了突变。在状态6中，发夹环被扩大，这降低了37℃时的结合亲和力并增加了33℃时的结合亲和力。不希望受理论的约束，据信，与在37℃下相比，在33℃下，发夹结构的大小更不相关。在突变适配体状态7下，与原始适配体(SEQ ID NO:244)相比，发夹环由不同的核苷酸形成，但是在两种温度下对结合亲和力的影响值得注意。

结合实验表明，本发明的适配体在33℃下也具有类似的功能，并且如此在体内对鼻细胞也适当地起作用。突变状态的性能分析，特别是在33℃下的性能分析还显示了本文所要求保护的与序列和/或结构相关的某些特征对体内性能的影响。例如，不影响二级结构的核苷酸突变对结合亲和力没有任何显著变化(状态5)。在发夹环序列中观察到交换的类似结果(状态7)。增加发夹环的大小(状态6)被认为在体内条件下是有利的，因为观察到结合亲和力增加。GAGGYYZ基序发生突变(状态3)或在将基序固定在茎区域的一半中(状态4)的情况下可观察到结合亲和力显著降低。不希望受理论的约束，由此得出结论，与仍然有效但包括在茎区域中部分杂交的GAGGYYZ基序的适配体相比，具有完全未杂交的GAGGYYZ基序(注入位于悬空的3'-端区域中)的适配体的结合亲和力更高。

表5.选择实验的前面核糖核苷酸亲本序列的列表。所有嘧啶核苷酸在戊糖基团的 2'位置处被氟化。

表6.基于来自选择实验的前面序列的脱氧核糖核苷酸亲本适配体的列表。

表7.保守基序的列表。

表8.基于前面核糖核苷酸的截短适配体和脱氧核糖核苷酸亲本适配体的列表。

表9.蛋白质序列的列表

组合

A.适配体组合物，该适配体组合物包含至少一种由以下组成的寡核苷酸：脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸的衍生物、核糖核苷酸的衍生物以及它们的混合物，其中该适配体组合物对细胞间粘附分子1(ICAM-1)具有结合亲和力，并且其中该适配体被配置为减少一种或多种人鼻病毒与该细胞间粘附分子1(ICAM-1)的结合，并且

其中该适配体组合物包含至少一种寡核苷酸，该至少一种寡核苷酸包含从由SEQID NO:1至SEQ ID NO:200组成的组的亲本寡核苷酸截短的约30个至约60个连续核苷酸。

B.根据段落A所述的适配体组合物，其中该至少一种寡核苷酸从选自由SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:101至SEQ ID NO:110组成的组的亲本寡核苷酸截短，优选地从选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:108组成的组的亲本寡核苷酸截短。

C.根据段落A或B所述的适配体组合物，其中该至少一种截短寡核苷酸包含至少32个连续核苷酸、优选地至少33个连续核苷酸、更优选地至少35个连续核苷酸、更优选地至少37个连续核苷酸。

D.根据段落A至C中任一项所述的适配体组合物，其中该至少一种截短寡核苷酸从该亲本序列的该3'-端、该5'-端或中间、优选地从该亲本序列的中间截短，更优选地其中该至少一种截短寡核苷酸在该亲本序列的该3'-端之前的核苷酸12处、更优选地在该3'-端之前的核苷酸10处、更优选地在该亲本序列的该3'-端之前的9至该3'-端的任何核苷酸处结束。

E.根据段落A至D中任一项所述的适配体组合物，其中该至少一种截短寡核苷酸能够形成包括发夹结构的二级结构，优选地其中该至少一种截短寡核苷酸的该二级结构包括一个或多个双链茎、包括至少一个未杂交核苷酸的一个或多个环、一个或两个悬空端或它们的组合。

F.根据段落A至E中任一项所述的适配体组合物，该适配体组合物包含选自SEQ IDNO:201至SEQ ID NO:212的寡核苷酸序列中的至少一种寡核苷酸序列或示出与选自SEQ IDNO:201至SEQ ID NO:212的序列具有至少80％核苷酸序列同一性、优选地90％核苷酸序列同一性、更优选地95％核苷酸序列同一性的至少一种寡核苷酸序列。

G.根据段落A至F中任一项所述的适配体组合物，该适配体组合物包含选自由SEQID NO:237至SEQ ID NO:246组成的组的寡核苷酸序列中的至少一种寡核苷酸序列，优选地其中该至少一种截短寡核苷酸序列选自由SEQ ID NO:237至SEQ ID NO:246组成的组。

H.根据段落A至G中任一项所述的适配体组合物，其中该至少一种截短寡核苷酸的核苷与选自包括以下的组的化学基序连接：天然磷酸二酯、手性硫代磷酸酯、手性甲基膦酸酯、手性氨基磷酸酯、手性磷酸酯手性三酯、手性硼烷磷酸酯、手性硒代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、亚甲基甲基亚氨基、3'-酰胺、3'-非手性氨基磷酸酯、3'-非手性亚甲基膦酸酯、硫缩甲醛、乙硫醚以及它们的组合。

I.根据段落A至H中任一项所述的适配体组合物，其中该核糖核苷酸的衍生物或该脱氧核糖核苷酸的衍生物选自包括以下的组：锁定的寡核苷酸、肽寡核苷酸、二醇寡核苷酸、苏阿糖寡核苷酸、己糖醇寡核苷酸、阿卓糖醇寡核苷酸、丁基寡核苷酸、L-核糖核苷酸、阿拉伯糖寡核苷酸、2′-氟阿拉伯糖寡核苷酸、环己烯寡核苷酸、二氨基磷酸酯吗啉代寡核苷酸以及它们的混合物。

J.根据段落A至I中任一项所述的适配体组合物，其中该至少一种截短寡核苷酸的5'-端和3'-端处的核苷酸为反向的。

K.根据段落A至J中任一项所述的适配体组合物，其中该至少一种截短寡核苷酸的至少一个核苷酸在戊糖基团的2'位置上被氟化，优选地其中该至少一种截短寡核苷酸的嘧啶核苷酸在该戊糖基团的该2'位置上被氟化。

L.根据段落A至K中任一项所述的适配体组合物，其中该至少一种截短寡核苷酸与一种或多种活性成分和/或至少一种聚合物材料、优选地聚乙二醇共价或非共价连接，其中该一种或多种活性成分选自由以下组成的组：呼吸道疾病治疗剂、感冒治疗剂、流感治疗剂、抗病毒剂、抗微生物剂、凉爽剂、恶臭吸收剂、天然提取物、肽、酶、药物活性成分、金属化合物以及它们的组合。

M.根据段落A至L中任一项所述的适配体组合物，其中该适配体对该细胞间粘附分子1(ICAM-1)的Ig样C2型1结构域(SEQ ID NO:215)、该结构域的任何翻译后修饰形式以及它们的混合物具有结合亲和力。

N.个人医疗保健组合物，该个人医疗保健组合物包含至少一种根据段落A至M中任一项所述的适配体组合物。

O.根据段落A至M中任一项所述的适配体组合物或根据段落N所述的个人医疗保健组合物，该适配体组合物或个人医疗保健组合物用于通过抑制该人鼻病毒与该细胞间粘附分子1(ICAM-1)的结合并由此抑制进入鼻腔和咽喉内的细胞中来抑制人鼻病毒感染和/或者用于优选地通过将该组合物递送到上呼吸道来预防和治疗与呼吸道病毒感染相关的症状。

本文所公开的量纲和值不应理解为严格限于所引用的精确数值。相反，除非另外指明，否则每个此类量纲旨在表示所述值以及围绕该值功能上等同的范围。例如，公开为“40mm”的量纲旨在表示“约40mm”。

本文所公开的作为范围端值的值不应被理解为严格限于所引用的精确数值。相反，除非另外指明，否则每个数值范围均旨在表示所引用的值和所述范围内的任何实数包括整数。例如，公开为“1至10”的范围旨在表示“1、2、3、4、5、6、7、8、9和10”，并且公开为“1至2”的范围旨在表示“1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9和2”。

除非明确排除或以其他方式限制，本文中引用的每一篇文献，包括任何交叉引用或相关专利或专利申请以及本申请对其要求优先权或其有益效果的任何专利申请或专利，均据此全文以引用方式并入本文。对任何文献的引用不是对其作为与本发明的任何所公开或本文受权利要求书保护的现有技术的认可，或不是对其自身或与任何一个或多个参考文献的组合提出、建议或公开任何此类发明的认可。此外，当本发明中术语的任何含义或定义与以引用方式并入的文献中相同术语的任何含义或定义矛盾时，应当服从在本发明中赋予该术语的含义或定义。

虽然已举例说明和描述了本发明的具体实施方案，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的实质和范围的情况下可作出各种其他变化和修改。因此，本文旨在于所附权利要求中涵盖属于本发明范围内的所有此类变化和修改。

Claims

1.适配体组合物，所述适配体组合物包含至少一种由以下组成的寡核苷酸：脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸的衍生物、核糖核苷酸的衍生物以及它们的混合物，其中所述适配体组合物对细胞间粘附分子1(ICAM-1)具有结合亲和力，并且其中所述适配体被配置为减少一种或多种人鼻病毒与所述细胞间粘附分子1(ICAM-1)的结合，并且

其中所述适配体组合物包含至少一种寡核苷酸，所述至少一种寡核苷酸包含从选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:200组成的组的亲本寡核苷酸截短的约30个至约60个连续核苷酸。

2.根据权利要求1所述的适配体组合物，其中所述至少一种寡核苷酸从选自由SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:101至SEQ ID NO:110组成的组的亲本寡核苷酸截短，优选地从选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:108组成的组的亲本寡核苷酸截短。

3.根据权利要求1或2所述的适配体组合物，其中至少一种截短寡核苷酸包含至少32个连续核苷酸、优选地至少33个连续核苷酸、更优选地至少35个连续核苷酸、更优选地至少37个连续核苷酸。

4.根据前述权利要求中任一项所述的适配体组合物，其中所述至少一种截短寡核苷酸从亲本序列的3'-端、5'-端或中间、优选地从所述亲本序列的中间截短，更优选地其中所述至少一种截短寡核苷酸在所述亲本序列的所述3'-端之前的核苷酸12处、更优选地在所述3'-端之前的核苷酸10处、更优选地在所述亲本序列的所述3'-端之前的9至所述3'-端的任何核苷酸处结束。

5.根据前述权利要求中任一项所述的适配体组合物，其中所述至少一种截短寡核苷酸能够形成包括发夹结构的二级结构，优选地其中所述至少一种截短寡核苷酸的所述二级结构包括一个或多个双链茎、包括至少一个未杂交核苷酸的一个或多个环、一个或两个悬空端或它们的组合。

6.根据前述权利要求中任一项所述的适配体组合物，所述适配体组合物包含选自SEQID NO:201至SEQ ID NO:212的寡核苷酸序列中的至少一种寡核苷酸序列或示出与选自SEQID NO:201至SEQ ID NO:212的序列具有至少80％核苷酸序列同一性、优选地90％核苷酸序列同一性、更优选地95％核苷酸序列同一性的至少一种寡核苷酸序列。

7.根据前述权利要求中任一项所述的适配体组合物，所述适配体组合物包含选自由SEQ ID NO:237至SEQ ID NO:246组成的组的寡核苷酸序列中的至少一种寡核苷酸序列，优选地其中所述至少一种截短寡核苷酸序列选自由SEQ ID NO:237至SEQ ID NO:246组成的组。

8.根据前述权利要求中任一项所述的适配体组合物，其中所述至少一种截短寡核苷酸的核苷与选自包括以下的组的化学基序连接：天然磷酸二酯、手性硫代磷酸酯、手性甲基膦酸酯、手性氨基磷酸酯、手性磷酸酯手性三酯、手性硼烷磷酸酯、手性硒代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、亚甲基甲基亚氨基、3'-酰胺、3'-非手性氨基磷酸酯、3'-非手性亚甲基膦酸酯、硫甲缩醛、乙硫醚以及它们的组合。

9.根据前述权利要求中任一项所述的适配体组合物，其中所述核糖核苷酸的衍生物或所述脱氧核糖核苷酸的衍生物选自包括以下的组：锁定的寡核苷酸、肽寡核苷酸、二醇寡核苷酸、苏阿糖寡核苷酸、己糖醇寡核苷酸、阿卓糖醇寡核苷酸、丁基寡核苷酸、L-核糖核苷酸、阿拉伯糖寡核苷酸、2′-氟阿拉伯糖寡核苷酸、环己烯寡核苷酸、二氨基磷酸酯吗啉代寡核苷酸以及它们的混合物。

10.根据前述权利要求中任一项所述的适配体组合物，其中在所述至少一种截短寡核苷酸的所述5'-端和所述3'-端处的核苷酸为反向的。

11.根据前述权利要求中任一项所述的适配体组合物，其中所述至少一种截短寡核苷酸的至少一个核苷酸在戊糖基团的2'位置上被氟化，优选地其中所述至少一种截短寡核苷酸的嘧啶核苷酸在所述戊糖基团的所述2'位置上被氟化。

12.根据前述权利要求中任一项所述的适配体组合物，其中所述至少一种截短寡核苷酸与一种或多种活性成分和/或至少一种聚合物材料、优选地聚乙二醇共价或非共价连接，其中所述一种或多种活性成分选自由以下组成的组：呼吸道疾病治疗剂、感冒治疗剂、流感治疗剂、抗病毒剂、抗微生物剂、凉爽剂、恶臭吸收剂、天然提取物、肽、酶、药物活性成分、金属化合物以及它们的组合。

13.根据前述权利要求中任一项所述的适配体组合物，其中所述适配体对所述细胞间粘附分子1(ICAM-1)的Ig样C2型1结构域(SEQ ID NO:215)、所述结构域的任何翻译后修饰形式以及它们的混合物具有结合亲和力。

14.个人医疗保健组合物，所述个人医疗保健组合物包含至少一种根据前述权利要求中任一项所述的适配体组合物。

15.根据权利要求1至13中任一项所述的适配体组合物或根据权利要求14所述的个人医疗保健组合物，所述适配体组合物或所述个人医疗保健组合物用于通过抑制人鼻病毒与所述细胞间粘附分子1(ICAM-1)的结合并由此抑制进入鼻腔和咽喉内的细胞中来抑制人鼻病毒感染和/或者用于优选地通过将所述组合物递送到上呼吸道来预防和治疗与呼吸道病毒感染相关的症状。