CN118325994A - 纳豆低聚肽及其制备方法和在溶栓降压中的应用 - Google Patents

Abstract

纳豆低聚肽及其制备方法和在溶栓降压中的应用，属于活性肽制备领域，为了解决获取具有抗血栓作用的纳豆来源的多聚肽的问题，生物活性肽数据库中检索并确定与纳豆抗血栓功能相关肽的特性，特性的信息包括分子量低于2000Da，N端氨基酸残基种类为甘氨酸G，C端氨基酸残基种类为赖氨酸K或精氨酸R，净电荷为±2；统计肽的溶液中的各肽位于甘氨酸G前位的氨基酸残基种类以及位于精氨酸R前位的氨基酸残基种类及数量；根据统计数量排序，将其中的肽键作为酶切位点，使用复合蛋白酶对酶切位点切分；收集低分子量的肽的溶液以及净电荷±2的肽的溶液，效果是保留纳豆中纳豆激酶溶栓活性的同时，释放游离L‑精氨酸，提高终产物纳豆低聚肽的抗血栓降压效果。

Description

纳豆低聚肽及其制备方法和在溶栓降压中的应用

技术领域

本发明属于活性肽制备领域，具体涉及一种纳豆低聚肽的制备方法及其在溶栓降压中的应用。

背景技术

血栓类疾病作为典型的心血管疾病严重威胁着人类的生命健康，具有高发病率、高致残率、高死亡率等特点，其发病率和死亡率居各类疾病前列，不仅给患者带来极大痛苦，也给相应的家庭带来诸多影响。同时包括血栓在内的一系列的心血管疾病很可能由持续的高血压(hypertension)引发。目前临床上已经有多种用于溶栓治疗的溶栓剂，如链激酶、尿激酶、葡激酶、单链尿激酶、组织型纤溶酶原激活剂等。这些溶栓剂具有较高的溶栓特异性，但同时易引发过敏反应及大出血等。

大量研究表明纳豆具有防止骨质疏松、促进凝血、降低血压、改善血糖等医疗保健功效。纳豆之所以有良好的保健功效，与其在生产过程中大豆基本成分的改变有密切关系，大豆中的蛋白质、脂肪、淀粉、异黄酮等在纳豆芽孢杆菌的作用下会发生复杂的生化反应，在保留原有活性成分的同时会产生新的活性物质，如纳豆激酶(nattokinase，NK)、抗氧化肽和抗菌肽等。相关研究显示纳豆激酶具有一定的抗血小板聚集、体外溶解血栓、降血压、降血脂等作用。其溶栓机理包括纳豆激酶通过直接水解纤维蛋白和纤溶酶底物来溶解血凝块。它将内源性的激酶转化为尿激酶，还降解纤溶酶原激活物抑制剂，升高组织纤溶酶原激活物的水平，从而使血栓溶解。

然而对纳豆激酶以外纳豆成分，尤其是活性肽类成分的研究尚较为欠缺。YahuiSong通过发酵纳豆发现了其中含有较高ACE抑制作用的多肽(RBPs)，对其性质进行测定发现，RBPs能显著降低自发性高血压大鼠的发病几率，对肾、胸主动脉和心脏具有保护作用。Kousuke Sato研究确定了纳豆分离肽的体外DPPIV抑制活性。这些研究表明纳豆中含有多种具有生理活性的活性肽成分。中国发明专利申请CN202310653994.6一种纳豆及纳豆活性肽的制备方法和产品通过接种复合菌发酵大豆，将成熟鲜纳豆研磨成半流体后进行干燥处理再粉碎，得到纳豆活性肽。上述研究均为对纳豆成品中固有的活性肽成分进行分离，没有对纳豆蛋白/活性肽资源的进一步挖掘利用。中国发明专利申请CN202311164212.9一种纳豆降脂肽的制备方法及其应用，以及中国发明专利CN202311164254.2申请一种纳豆抗氧化活性肽及其饮料的制备方法公开了通过酶解来获取特定活性纳豆肽的制备方法，但并没有涉及纳豆最引人瞩目的抗血栓效果，同时酶解过程的酸碱环境以及灭酶时的高温环境极为容易破坏纳豆激酶的活性。Lee K-A等人从大豆蛋白中分离出两个抗血栓活性肽段SSGE与DEE，具有抑制血小板聚集的效果，虽然经过纳豆菌发酵大豆蛋白成分产生了一定程度的变化，但是有理由相信纳豆中具有抗血栓肽的挖掘潜力。目前市面上除了纳豆以外最为常见的纳豆产品是纳豆冻干粉，并以纳豆激酶活性分为不同规格，相关研究多集中于如何通过改良发酵工艺来使纳豆激酶含量更高，对于纳豆激酶以外成分的开发利用极为少见，如何开发纳豆激酶以外的活性成分以加强纳豆产品在血栓性的心脑血管疾病方面的改善作用对于最大化利用纳豆资源显得极为重要。

发明内容

为了解决获取功能性低聚肽的问题，并进一步解决获取具有抗血栓作用的纳豆来源的多聚肽的问题，在第一方面，根据本申请一些实施例中的低聚肽的制备方法，包括

生物活性肽数据库中检索并确定与生物对象的功能性相关的肽的特性，所述特性包括分子量分布、N端氨基酸残基种类、C端氨基酸残基种类以及净电荷；

将生物对象制备为肽的溶液，分别统计肽的溶液中的各肽特定N端氨基酸的前位氨基酸的种类及数量；

将其中全部或部分特定N端氨基酸及其前位氨基酸的肽键和/或C端氨基酸羧基端肽键为酶切点，使用复合蛋白酶对酶切位点切分；

将切分后的肽的溶液过滤，收集分子量符合所述特性中的分子量分布的肽的溶液；

将所述符合所述特性中的分子量分布的肽的溶液分离纯化，收集符合所述特性中净电荷的肽的溶液，得所述低聚肽。

在第二方面，根据本申请一些实施例中的低聚肽的制备方法，包括

生物活性肽数据库中检索并确定与纳豆抗血栓功能相关肽的特性，所确定的特性的信息包括分子量低于2000Da，N端氨基酸残基种类为甘氨酸G，C端氨基酸残基种类为赖氨酸K或精氨酸R，净电荷为±2；

制备纳豆的肽的溶液，分别统计所述肽的溶液中的各肽位于甘氨酸G前位的氨基酸残基种类和数量以及位于精氨酸R前位的氨基酸残基种类和数量；

根据统计数量排序，依据排序将其中的酪氨酸-甘氨酸肽键、苯丙氨酸-甘氨酸肽键、酪氨酸-精氨酸肽键、赖氨酸羧基端肽键以及精氨酸羧基端肽键作为酶切位点，使用复合蛋白酶对酶切位点切分，所述复合蛋白酶由胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶组成，其中，胰蛋白酶：胰凝乳蛋白酶＝1:(1-3)，酶解温度：37-45℃，酶解pH：7.5-8.5，酶解时间：3-6h；

将切分后的肽的溶液过滤，收集分子量低于2000Da的肽的溶液；

将分子量低于2000Da的肽的溶液分离纯化，收集净电荷±2的肽的溶液，得第一低聚肽。

根据本申请一些实施例中的低聚肽的制备方法，还包括将所述净电荷±2的肽的溶液与纳豆激酶组分的溶液混合得第二低聚肽，其中，

制备所述纳豆激酶组分的溶液，包括：

将纳豆粉溶液通过分子量29000Da的超滤膜，得第一透过液；

将所述第一透过液通过分子量26000Da的超滤膜，得第二透过液和第二截流液；

其中，所述第二截流液是所述纳豆激酶组分的溶液；

根据本申请一些实施例中的低聚肽的制备方法，所述纳豆由大豆制备。

根据本申请一些实施例中的低聚肽的制备方法，还包括将第一低聚肽冷冻干燥，得纳豆低聚肽粉。

根据本申请一些实施例中的低聚肽的制备方法，还包括将第二低聚肽冷冻干燥，得纳豆低聚肽粉。

根据本申请一些实施例中的低聚肽的制备方法，其中，制备所述纳豆的小肽溶液，包括向所述第一透过液，所述第二截流液中加入消化酶，得所述纳豆的小肽溶液。

根据本申请一些实施例中的低聚肽的制备方法，所述消化酶为胰蛋白酶。

根据本申请一些实施例中的低聚肽的制备方法，其中，将切分后的肽的溶液过滤的步骤，包括将切分后的肽的溶液通过分子量2000Da的纳滤膜过滤，其中，所述纳滤膜的透过液是低于2000Da的肽的溶液；

其中，将分子量低于2000Da的肽的溶液分离纯化的步骤，包括将分子量低于2000Da的肽的溶液通过离子交换色谱分离纯化。

根据本申请一些实施例中的低聚肽的制备方法，所述离子交换色谱包括强阳离子交换柱。

根据本申请一些实施例中的低聚肽的制备方法，所述离子交换色谱包括SPSepharose High Performance强阳离子交换柱，上样后，以20mmol/L PB(pH 6.0)平衡强阳离子交换柱，以0-40min：0-1M NaCl浓度梯度进行洗脱，收集时间11-19min的洗脱液，得所述净电荷±2的肽的溶液。

根据本申请一些实施例中的低聚肽的制备方法，其中，对纳豆的肽的溶液中的肽进行测序，根据所述测序，分别统计所述肽的溶液中的各肽位于甘氨酸G前位的氨基酸残基种类以及位于精氨酸R前位的氨基酸残基种类及数量；

其中，根据统计数量排序的步骤，包括

对不同种类的甘氨酸G前位的氨基酸残基，按照数量排序；

对不同种类的精氨酸R前位的氨基酸残基，按照数量排序；

依据不同种类的甘氨酸G前位的氨基酸残基数量的排序，将其中数量最多或前几多的氨基酸残基种类，与甘氨酸G的肽键切分得N端氨基酸残基种类为甘氨酸G的肽；

依据不同种类的精氨酸R前位的氨基酸数量的排序，将其中数量最多或前几个最多的氨基酸残基种类，与精氨酸R的肽键切分得N端氨基酸残基种类为精氨酸R的肽；

对赖氨酸羧基端肽键切分得C端氨基酸残基种类为赖氨酸K的肽；

对非N端氨基酸残基种类为精氨酸R的肽的精氨酸羧基端肽键切分得C端氨基酸残基种类为精氨酸R，对N端氨基酸残基种类为精氨酸R的肽的精氨酸R切分得游离的L-精氨酸。

在第三方面，根据本申请一些实施例中的任一项所述的方法制备的低聚肽。

在第四方面，根据本申请一些实施例中的所述低聚肽在制备溶栓药物中的用途或者在制备治疗降压药物中的用途或者在制备同步溶栓和降压的药物中的用途。

有益效果：

(1)本发明在第一方面上，通过在线数据库分析功能性肽段的理化性质特征，选择分子量分布、N端氨基酸残基种类、C端氨基酸残基种类以及净电荷为特性，以此确定酶切位点。将小肽通过复合蛋白酶对酶切位点切分，并进一步过滤和分离纯化，以符合特性的分子量及净电荷要求，得对应特性的小肽，使其能够表现目标功能性。

(2)本发明在具体实例中，通过在线数据库分析抗血栓肽段的理化性质特征，从纳豆中尽可能地释放出具有抗血栓活性的肽段。结合纳豆激酶组分以进一步提高纳豆冻干粉原料的溶栓活性，同时在此过程中，提高原料中游离的L-精氨酸(L-Arginine，简称L-Arg)的数量，进一步实现舒张血管调节血压，减少由于血管高压冲刷下引起的血管内皮损伤进而激活内外源凝血系统引发的血栓风险，缓解如动脉粥样硬化等引起的血栓性心血管疾病的症状。

(3)L-Arg是所有哺乳动物体内产生一氧化氮(NO)的唯一底物，而NO能够促进血管扩张，帮助增加血液流动量和改善血液循环，有助于调节血压，此外可以抑制血小板聚集和凝血过程，从而降低血栓形成的风险。在动物身上获得的实验结果以及临床研究表明，L-Arg通过NO途径对血小板、凝血过程和纤溶系统都有一定的影响。本发明通过复合酶切分，一方面能够提高特性的小肽的量，实现目标功能，另一方面，在切分中考虑L-Arg作用，设计复合酶，能够一方面实现特性的小肽为目标的切分，同时还能够提高游离L-Arg的数量，使得本发明能既具有溶栓的作用，还同时具有降压的作用，并且降压作用还能够降低血栓形成的风险。

附图说明

图1甘氨酸前一位氨基酸残基种类分布。

图2精氨酸前一位氨基酸残基种类分布。

图3N端氨基酸残基种类分布。

图4C端氨基酸残基种类分布。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步说明，需要说明的是，实施例并不构成对本发明要求保护范围的限制。

本发明提供一种纳豆低聚肽的制备方法及其在溶栓降压中的应用，制备方法包括下列步骤：

S1：以经过纳豆菌发酵制备的纳豆冻干粉为原料，溶于生理盐水后，通过超滤膜分离，截取26000-29000Da分子量之间的成分的溶液，作为纳豆激酶组分F1。对超滤膜分离所得纳豆激酶组分F1后剩余的成分，称为纳豆组分F2的溶液，即分子量小于26000Da和分子量大于29000Da的成分的溶液。

S2：从BIOPEP数据库中通过“Bioactive peptides”模块搜索“antithrombotic”关键词，分析具有抗血栓的活性肽的特性，包括分子量分布、N端氨基酸残基种类、C端氨基酸残基种类、净电荷等基本特性，在本发明中，特性信息具体是指以低于2000Da，N端氨基酸残基种类为甘氨酸G，C端氨基酸残基种类为赖氨酸K或精氨酸R，净电荷为±2作为潜在的抗血栓活性肽段的特征。

S3：对截取纳豆激酶组分F1后剩余的纳豆组分F2通过消化酶如胰蛋白酶消化4小时后，获得第一纳豆酶解液，第一纳豆酶解液经过LC-MS/MS及从头测序法进行肽段分析，基于上述特性，本发明要实现所得低聚肽中，部分或全部的N端氨基酸残基种类为甘氨酸，C端氨基酸残基种类为赖氨酸K或精氨酸R。C端氨基酸残基种类为赖氨酸K、精氨酸R是对赖氨酸羧基端肽键、精氨酸羧基端肽键为目标酶切位点，进行切分即可，如使用胰蛋白酶进行酶切，可得C端氨基酸残基种类为赖氨酸K或精氨酸R的低聚肽。

为了获得N端氨基酸残基种类为甘氨酸的低聚肽，应统计位于甘氨酸前位的氨基酸残基种类和数量，然而，考虑复合蛋白酶进行酶切的影响，如一个复合蛋白酶对于多种位点能够实现酶切，因此，难以实现对全部种类的甘氨酸前位的氨基酸与甘氨酸的肽键的酶切，在本发明中，可以选择数量统计最多的一种或者前最多的两种进行酶切，一方面可以得到有效数量的N端氨基酸残基种类为甘氨酸低聚肽，另一方面也能够降低用于酶切的复合蛋白酶的设计难度。

本发明还统计位于精氨酸前位的氨基酸残基种类和数量，并对精氨酸前位的氨基酸和精氨酸的肽键设计复合蛋白酶与上述酶切同时进行，以得到有效数量的N端氨基酸残基种类为精氨酸的低聚肽，本发明根据步骤S2的特性，并不需要N端氨基酸残基种类为精氨酸的低聚肽，然而，本发明上述表明酶切还得到C端氨基酸残基种类为精氨酸R的低聚肽，因此，对于这部分低聚肽，若得到N端氨基酸残基种类为精氨酸的低聚肽，则因为得到C端氨基酸残基种类为精氨酸R的低聚肽而进行的酶切，则使得N端氨基酸残基种类为精氨酸的低聚肽形成了游离的L-精氨酸，而本发明通过增加产品中的游离的L-精氨酸，以起到舒张血管、降低血压的作用。因此，本发明还进行了上述位于精氨酸前位的氨基酸残基种类和数量和酶切。

以上述统计，确定酶切位点设计复合蛋白酶组合，并根据该蛋白酶组合的适宜酶解条件对纳豆组分F2进行酶解获得第二酶解液。本发明的蛋白复合酶既要对上述特性的酶切目响应，又要对获得游离的L-精氨酸目的响应，本发明使用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的组合实现上述目的。

S4：通过截留2000Da的纳滤膜对第二酶解液进行分离，第二酶解液通过纳滤膜，收集透过液获得纳豆酶解液组分F3的溶液。

S5：通过离子交换色谱对纳豆酶解液组分F3的溶液进行进一步分离纯化，收集净电荷±2的纳豆酶解液组分F4的溶液。此处所得纳豆酶解液组分F4的溶液，其具有溶栓和降压的作用。

S6：将纳豆酶解液组分F4的溶液与步骤S1具有一定的抗血小板聚集、体外溶解血栓、降血压、降血脂等作用的纳豆激酶组分F1的溶液充分混合后进行冷冻干燥，获得纳豆低聚肽粉。

由上述，在第一方面，本发明先分离纳豆激酶组分F1，避免后续酶解过程对于纳豆激酶的破坏，并在制备具有溶栓和降压的作用的纳豆酶解液组分F4后，再将纳豆激酶组分F1与纳豆酶解液组分F4混合，进一步提高产物的治疗作用以及能够用于治疗产物的量。

由上述，在第二方面，本发明通过对纳豆组分F2的肽段序列进行分析统计，分别以甘氨酸前位氨基酸，精氨酸前位氨基酸，赖氨酸的羧基端以及精氨酸的羧基端为目标酶切位点，设计复合蛋白酶制剂进行酶切，获得纳豆酶解液组分F3，使纳豆酶解液组分F3溶液中中含有高含量的具有降压作用的游离的L-精氨酸，同时增加具备抗血栓活性肽段N端与C端氨基酸残基种类特征的肽段含量。

由上述，在第三方面，本发明通过超滤膜分离与离子交换色谱进一步纯化出2000Da分子量以下，净电荷在±2的具备潜在抗血栓活性的纳豆酶解液组分F4，由于精氨酸带1个正电荷可以在离子交换色谱中与组分F4一同洗脱。由此，本发明酶解所得L-精氨酸，并不引起在分离纯化步骤中的改进要求。

实施例1:一种低聚肽的制备方法，包括如下步骤：

S1：取大豆经过纳豆菌发酵制备的纳豆冻干粉100g，溶于1000ml生理盐水后溶解，纳豆冻干粉溶液通过29000分子量超滤膜，取透过液，得到分子量低于29000的成分。将透过液通过26000分子量超滤膜，取截留液，得到分子量高于26000但低于29000的成分，作为纳豆激酶组分F1，将第一次超滤截留液与第二次超滤透过液合并为纳豆组分F2。

S2：纳豆组分F2的溶液通过消化酶如胰蛋白酶水解4小时后获得纳豆酶解液(酶解pH为8.5，酶解温度50℃)，酶解的目的是通过消化酶将蛋白质分解为小肽(小分子肽，通常由2到20个氨基酸残基组成)，酶解液经过LC-MS/MS及De Novo从头测序法进行肽段分析，分析条件如下：

色谱柱：C18，3μm，75μm*15cm，流动相：A：0.1％Formic acid in water；B：0.1％Formic acid in 80％Acetonitrile/H2O，色谱梯度：，喷雾电压：2.0kV，毛细管温度：320℃，RF Lens:40，分辨率设置：一级120,000@m/z 200，二级30,000@m/z 200，母离子扫描范围：m/z 350-1550；子离子扫描范围：start from m/z110，碎裂模式：HCD。

将质谱采集到的原始数据使用De Novo数据分析软件PEAKS进行从头测序分析，软件参数设定如下：

Enzyme：No-specific，Variable modification：Oxidation(M)，Deamidated(N，Q)，Peptide mass tolerance：±10ppm，Fragment mass tolerance：0.02Da。(酶:无特异性，可变修饰:氧化(M)，脱酰胺(N,Q)，肽质量容差:±10ppm，片段质量容差:0.02Da。)

分别统计位于甘氨酸前位的氨基酸残基种类和数量、及精氨酸前位的氨基酸残基种类和数量，结果表明位于甘氨酸与精氨酸的前一位氨基酸残基种类和数量分布分别如下图1和图2所示。从中可知，以酪氨酸-甘氨酸的肽键、苯丙氨酸-甘氨酸的肽键、酪氨酸-精氨酸的肽键、赖氨酸羧基端的肽键、精氨酸羧基端的肽键为目标酶切位点，对纳豆组分F2进行酶解，酶解条件如下：胰蛋白酶：胰凝乳蛋白酶＝1:1-3，酶添加量：1-3％，酶解温度：37-45℃，酶解pH：7.5-8.5，酶解时间3-6小时，获得第二酶解液。

S3：通过截留2000Da的纳滤膜对第二酶解液进行分离，收集透过液获得纳豆酶解液组分F3，即得到分子量低于2000Da的低聚肽。

S4：采用SP Sepharose High Performance强阳离子交换柱，以20mmol/L PB(pH6.0)平衡阳离子交换柱。本发明上样再平衡后，以0-40min：0-1M NaCl浓度梯度进行洗脱，收集保留时间11-19min的洗脱液作为纳豆酶解液组分F4。

S5：将纳豆酶解液组分F4与纳豆激酶组分F1充分混合后冷冻干燥，获得纳豆低聚肽粉。

实验例1.L-精氨酸含量测定

将实施例1中的步骤S1中采用的纳豆冻干粉原料及步骤S5中获得的纳豆低聚肽粉分别按照100μg/ml的浓度制备成水溶液样品，标准L-精氨酸用去离子水配置成0.625、1.25、2.5、5.0μmol/ml浓度的标品溶液，样品与标品各取10μL加入6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯溶液20μL进行衍生化，高效液相色谱-荧光检测两种样品与标品中游离L-精氨酸含量。纳豆冻干粉样品中游离L-精氨酸含量为0.23g/100g，纳豆低聚肽粉样品中游离L-精氨酸含量为5.5g/100g，说明对于纳豆冻干粉蛋白中的精氨酸前后位点的肽键酶切效果良好，且酶切获得的游离L-精氨酸在强阳离子交换柱中与抗血栓活性肽成分一同洗脱。相比于纳豆冻干粉原料，纳豆低聚肽粉中游离L-精氨酸的含量大大提高。

实验例2.肽段分析

采用与实施例1中步骤S2相同的检测方法测定纳豆低聚肽粉中的肽段序列，统计N端与C端氨基酸残基种类占比，结果如图3、图4所示，纳豆低聚肽粉中N端氨基酸残基种类主要为甘氨酸，C端氨基酸残基种类主要为赖氨酸及部分精氨酸、酪氨酸与色氨酸，符合目标酶解效果。

实验例3.SHR自发性高血压大鼠慢性血栓模型

纳豆冻干粉、纳豆低聚肽粉用去离子水配置成1g/ml的膏剂。8只WKY大鼠为对照组；24只SHR随机分为3组，每组8只，分别为：模型组、纳豆冻干粉组(10g/kg·d)、纳豆低聚肽粉高剂量组(10g/kg·d)。SHR大鼠腹腔注射3％戊巴比妥钠(2mL/kg)麻醉后仰从中线纵行切开颈部皮肤约2cm，仔细分离双侧颈主动脉。颈主动脉下放置自制塑料垫保护血管周围组织；将吸有2μL 50％FeCl₃溶液的小片滤纸环敷在此段动脉上,用镊子轻夹接口处使滤纸环贴紧动脉壁50min后取下,形成非闭塞性动脉血栓，约占据血管腔1/3至1/2空间，用生理盐水冲洗局部组织。伤口撒适量青霉素抗感染,然后逐层缝合,回笼饲养。假手术组将吸有2μL生理盐水的小片滤纸环敷在此段动脉上,50min后取下,伤口缝合。造模后第二天开始，用药组按照上述剂量灌胃给药，对照组及模型组给予等量生理盐水，为期一周。给药后第1、3、5、7天血压计测量各组大鼠血压，每只共测量5次，每次分别读取并记录SBP值，取平均值；第8天用20％乌拉坦麻醉,取颈主动脉血栓部位血管,放于滤纸上吸干残血,以电子分析天平称量其质量。

结果如表1所示，SHR自发性高血压大鼠SBP值远高于对照组，且由于颈主动脉非闭塞性血栓的形成，相比正常SHR血压偏高。经过灌胃纳豆冻干粉的SHR与模型组相比没有出现显著性差异，而经过纳豆低聚肽粉灌胃的SHR在给药后1周内血压值逐步降低，与模型组表现出显著性差异，说明纳豆低聚肽粉具有较好的舒缓血管，降低血压的作用。同时各组SHR大鼠颈主动脉血栓质量的结果显示，纳豆冻干粉组与纳豆低聚肽粉组都较模型组组血栓质量显著降低(p<0.01),其中纳豆低聚肽粉干预组由于抗血栓肽组分F4的抗血小板凝集以及抗凝血作用，在纳豆激酶组分F1的纤维蛋白溶解效果基础之上，降低由于内皮细胞损伤等引起的进一步血栓形成，因此相比纳豆冻干粉取得的抗血栓效果更好(p<0.01)。

本发明公开了一种纳豆低聚肽的制备方法及其在溶栓降压中的应用，该方法以纳豆为原料，先通过超滤分离截取纳豆激酶组分，对剩余组分进行肽段序列检测，统计所有位于精氨酸N端的氨基酸残基种类比例，设计针对该位点的复合蛋白酶制剂对剩余组分进行酶解反应，使水解产物中含有高的L-精氨酸含量，同时对纳豆抗血栓肽及ACE抑制肽的进一步释放，再将纳豆激酶组分与水解产物混合后冷冻干燥获得纳豆低聚肽粉末。该制备方法在保留纳豆中纳豆激酶溶栓活性的同时，提高终产物纳豆低聚肽的溶栓效果，结合L-精氨酸的血管调节作用，在溶栓降压等缓解血栓性心血管病症的应用中具有广阔前景。

实施例4纳豆酶解液组分F4的抗血栓作用

将30只ICR雄性小鼠随机分为空白对照组、模型组、抗血栓组，每组10只。空白组每天腹腔注射生理盐水溶液(0.01mL/g体重)，模型组腹腔注射0.20％的角叉菜胶生理盐水溶液(0.01mL/g体重)，抗血栓组在同剂量注射角叉菜胶时经口投喂纳豆酶解液组分F4(20mg/g体重)，10天后观察并记录各组小鼠黑尾长度，收集血液采用半自动血凝仪检测血凝四项。结果如表3所示，模型组小鼠在尾部形成血栓黑尾，而纳豆酶解液组分F4干预组的小鼠尾部血栓长度相比模型组显著缩短，同时凝血4项指标相比模型组表现出显著改善，表明纳豆酶解液组分F4具备一定的抗血栓活性。

表3.各组小鼠出栓长度及凝血四项结果(n＝10)

与模型组比较，*P<0.01.

本发明的纳豆低聚肽的制备方法以纳豆为原料，先通过超滤分离截取纳豆激酶组分，对剩余组分进行肽段序列检测，统计所有位于精氨酸N端的氨基酸残基种类比例，设计针对该位点的复合蛋白酶制剂对剩余组分进行酶解反应，使水解产物中含有高的L-精氨酸含量，同时对纳豆抗血栓肽及ACE抑制肽的进一步释放，再将纳豆激酶组分与水解产物混合后冷冻干燥获得纳豆低聚肽粉末。该制备方法在保留纳豆中纳豆激酶溶栓活性的同时，提高终产物纳豆低聚肽的溶栓效果，结合L-精氨酸的血管调节作用，在溶栓降压等缓解血栓性心血管病症的应用中具有广阔前景。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有衍生，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种低聚肽的制备方法，其特征在于，包括

生物活性肽数据库中检索并确定与生物对象的功能性相关的肽的特性，所述特性包括分子量分布、N端氨基酸残基种类、C端氨基酸残基种类以及净电荷；

将生物对象制备为肽的溶液，分别统计肽的溶液中的各肽特定N端氨基酸的前位氨基酸的种类及数量；

将其中全部或部分特定N端氨基酸及其前位氨基酸的肽键和/或C端氨基酸羧基端肽键为酶切点，使用复合蛋白酶对酶切位点切分；

将切分后的肽的溶液过滤，收集分子量符合所述特性中的分子量分布的肽的溶液；

将所述符合所述特性中的分子量分布的肽的溶液分离纯化，收集符合所述特性中净电荷的肽的溶液，得所述低聚肽。

2.一种低聚肽的制备方法，其特征在于，包括

生物活性肽数据库中检索并确定与纳豆抗血栓功能相关肽的特性，所确定的特性的信息包括分子量低于2000Da，N端氨基酸残基种类为甘氨酸G，C端氨基酸残基种类为赖氨酸K或精氨酸R，净电荷为±2；

制备纳豆的肽的溶液，分别统计所述肽的溶液中的各肽位于甘氨酸G前位的氨基酸残基种类和数量以及位于精氨酸R前位的氨基酸残基种类和数量；

根据统计数量排序，依据排序将其中的酪氨酸-甘氨酸肽键、苯丙氨酸-甘氨酸肽键、酪氨酸-精氨酸肽键、赖氨酸羧基端肽键以及精氨酸羧基端肽键作为酶切位点，使用复合蛋白酶对酶切位点切分，所述复合蛋白酶由胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶组成，其中，胰蛋白酶：胰凝乳蛋白酶＝1:(1-3)，酶解温度：37-45℃，酶解pH：7.5-8.5，酶解时间：3-6h；

将切分后的肽的溶液过滤，收集分子量低于2000Da的肽的溶液；

将分子量低于2000Da的肽的溶液分离纯化，收集净电荷±2的肽的溶液，得第一低聚肽。

3.根据权利要求2所述的的低聚肽的制备方法，其特征在于，还包括将所述净电荷±2的肽的溶液与纳豆激酶组分的溶液混合得第二低聚肽，其中，

制备所述纳豆激酶组分的溶液，包括：

将纳豆粉溶液通过分子量29000Da的超滤膜，得第一透过液；

将所述第一透过液通过分子量26000Da的超滤膜，得第二透过液和第二截流液；

其中，所述第二截流液是所述纳豆激酶组分的溶液；

优选地，所述纳豆由大豆制备。

优选地，还包括将第一低聚肽冷冻干燥，得纳豆低聚肽粉。

优选地，还包括将第二低聚肽冷冻干燥，得纳豆低聚肽粉。

4.根据权利要求3所述的的低聚肽的制备方法，其特征在于，其中，制备所述纳豆的小肽溶液，包括向所述第一透过液，所述第二截流液中加入消化酶，得所述纳豆的小肽溶液；

优选地，所述消化酶为胰蛋白酶。

5.根据权利要求2所述的的低聚肽的制备方法，其特征在于，

其中，将切分后的肽的溶液过滤的步骤，包括将切分后的肽的溶液通过分子量2000Da的纳滤膜过滤，其中，所述纳滤膜的透过液是低于2000Da的肽的溶液；

其中，将分子量低于2000Da的肽的溶液分离纯化的步骤，包括将分子量低于2000Da的肽的溶液通过离子交换色谱分离纯化。

6.根据权利要求5所述的的低聚肽的制备方法，其特征在于，所述离子交换色谱包括强阳离子交换柱。

7.根据权利要求6所述的的低聚肽的制备方法，其特征在于，所述离子交换色谱包括SPSepharose High Performance强阳离子交换柱，上样后，以20mmol/L PB(pH 6.0)平衡强阳离子交换柱，以0-40min：0-1M NaCl浓度梯度进行洗脱，收集时间11-19min的洗脱液，得所述净电荷±2的肽的溶液。

8.根据权利要求2所述的的低聚肽的制备方法，其特征在于，其中，对纳豆的肽的溶液中的肽进行测序，根据所述测序，分别统计所述肽的溶液中的各肽位于甘氨酸G前位的氨基酸残基种类以及位于精氨酸R前位的氨基酸残基种类及数量；

其中，根据统计数量排序的步骤，包括

对不同种类的甘氨酸G前位的氨基酸残基，按照数量排序；

对不同种类的精氨酸R前位的氨基酸残基，按照数量排序；

依据不同种类的甘氨酸G前位的氨基酸残基数量的排序，将其中数量最多或前几多的氨基酸残基种类，与甘氨酸G的肽键切分得N端氨基酸残基种类为甘氨酸G的肽；

依据不同种类的精氨酸R前位的氨基酸数量的排序，将其中数量最多或前几个最多的氨基酸残基种类，与精氨酸R的肽键切分得N端氨基酸残基种类为精氨酸R的肽；

对赖氨酸羧基端肽键切分得C端氨基酸残基种类为赖氨酸K的肽；

对非N端氨基酸残基种类为精氨酸R的肽的精氨酸羧基端肽键切分得C端氨基酸残基种类为精氨酸R，对N端氨基酸残基种类为精氨酸R的肽的精氨酸R切分得游离的L-精氨酸。

9.一种权利要求1-8中任一项所述的方法制备的低聚肽。

10.一种权利要求9所述低聚肽在制备溶栓药物中的用途或者在制备治疗降压药物中的用途或者在制备同步溶栓和降压的药物中的用途。