CN118325857A - 硫氧还蛋白基因HbCXXS2的转录本及其编码蛋白与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了硫氧还蛋白基因HbCXXS2的转录本及其编码蛋白与应用，属于基因工程技术领域，用于从分子层面提高橡胶树对氧化胁迫的抗性。本发明提供了硫氧还蛋白基因HbCXXS2的转录本HbCXXS2.1、转录本HbCXXS2.2及其编码的蛋白，转录本HbCXXS2.1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，转录本HbCXXS2.2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明分离鉴定调控氧化胁迫抗性的基因，通过基因工程手段增强植物对氧化胁迫的抗性，提高植物抵御各种不利胁迫的能力。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，更具体地涉及硫氧还蛋白基因HbCXXS2的转录本及其编码蛋白与应用。
背景技术
活性氧(Reactive oxygen species，ROS)是植物有氧代谢的副产物，主要包括过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子(O2 -)、羟自由基(OH-)等。在正常环境条件下，植物体内ROS的产生和清除处于动态平衡，ROS不会发生大量积累对植物产生毒害。但是，在生物或非生物逆境胁迫下，植物体内ROS的产生和清除动态平衡被打破，导致ROS的过量积累，产生氧化胁迫，对植物细胞的结构功能造成氧化损伤，阻碍植物正常的生长发育，甚至导致植物死亡。为了适应不利的逆境环境，植物在进化过程中形成了复杂的ROS平衡调控机制，以提高自身对氧化胁迫的抗性，避免或减轻ROS大量积累对细胞造成的氧化损伤。
硫氧还蛋白(Thioredoxin)是真核和原核生物体内普遍存在的一类重要小分子氧化还原调控蛋白，在维持生物体内氧化还原平衡过程中起着重要作用。植物硫氧还蛋白家族成员众多，如拟南芥基因组中至少存在20个硫氧还蛋白基因。根据氨基酸序列和结构特征等，植物硫氧还蛋白被分为f、m、h、o、x、y和z等不同类型。绝大多数植物硫氧还蛋白具有一个高度保守的、含两个半胱氨酸残基的WC(G/P)PC活性中心，极少数h型硫氧还蛋白活性中心的第二个半胱氨酸变成了丝氨酸，为CXXS。目前，已知拟南芥含有两个活性中心为CXXS的硫氧还蛋白基因：AtCXXS1和AtCXXS2。此外，在杨树和蒺藜苜蓿中也发现含有CXXS硫氧还蛋白基因，但橡胶树(Hevea brasiliensis Muell.Arg.)中是否存在CXXS硫氧还蛋白基因仍不清楚。
橡胶树是重要工业原料和战略物资天然橡胶的主要商业化来源。我国橡胶树种植面积约1700万亩，分布在海南、云南和广东。这些地区属于非传统植胶区，不是橡胶树种植的最佳区域，易受低温和干旱等非生物逆境胁迫的影响。此外，橡胶树割面干涸(tappingpanel dryness，TPD，国内常称为死皮)的发生率也比较高，导致严重的产量和经济损失。橡胶树割面干涸是一种复杂的生理综合症，主要症状表现为割胶后割线局部甚至全部不排胶。研究表明，氧化还原稳态失衡是导致橡胶树割面干涸的重要原因之一，氧化胁迫的应答受多基因调控，转录本是一个基因通过转录形成的一种或多种可供编码蛋白质的成熟的mRNA，转录本与生物功能活性有关。因此，本发明研究了硫氧还蛋白基因HbCXXS2的转录本及其在调控氧化胁迫中的应用。
发明内容
本发明提供硫氧还蛋白基因HbCXXS2的转录本及其编码蛋白与应用，用于从分子层面提高生物对氧化胁迫的抗性。
第一方面，本发明提供了硫氧还蛋白基因HbCXXS2的转录本，所述转录本为转录本HbCXXS2.1或转录本HbCXXS2.2，所述转录本HbCXXS2.1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述转录本HbCXXS2.2的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。转录本：一个基因通过转录形成的一种或多种可供编码蛋白质的成熟的mRNA。本发明中，基因HbCXXS2通过不同的选择性剪接方式表达两个转录本：转录本HbCXXS2.1和转录本HbCXXS2.2。
第二方面，本发明提供了硫氧还蛋白HbCXXS2，由第一方面所述基因HbCXXS2的转录本编码得到，所述蛋白HbCXXS2的氨基酸序列如SEQ IDNo.2或SEQ ID No.4所示。
第三方面，本发明提供了一种载体，包含第一方面所述转录本HbCXXS2.1的开放阅读框序列或所述转录本HbCXXS2.2的开放阅读框序列；所述转录本HbCXXS2.1的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID No.1中的第160至537位所示，所述转录本HbCXXS2.2的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID No.3中的第160至414位所示。
作为一种可能的实现方式，将所述转录本HbCXXS2.1的开放阅读框序列或所述转录本HbCXXS2.2的开放阅读框序列插入pCAMBIA1301质粒的Nco I和BstEⅡ酶切位点之间，得到植物表达载体；或，将所述转录本HbCXXS2.1的开放阅读框序列或所述转录本HbCXXS2.2的开放阅读框序列插入pYES2质粒的Kpn I和Xba I酶切位点之间，得到酵母表达载体。
第四方面，本发明提供了第一方面所述基因HbCXXS2的转录本或第二方面所述蛋白HbCXXS2或第三方面所述的载体在提高生物对氧化胁迫的抗性中的应用。
作为一种可能的实现方式，第一方面所述基因HbCXXS2的转录本或第二方面所述蛋白HbCXXS2或第三方面所述的载体用于提高酵母在氧化胁迫下的存活率和/或生长活性。
作为一种可能的实现方式，第一方面所述基因HbCXXS2的转录本或第二方面所述蛋白HbCXXS2或第三方面所述的载体用于促进烟草在氧化胁迫下的生长。
作为一种可能的实现方式，第一方面所述基因HbCXXS2的转录本或第二方面所述蛋白HbCXXS2或第三方面所述的载体用于调控橡胶树割面干涸的发生或恢复。
作为一种可能的实现方式，第一方面所述基因HbCXXS2的转录本或第二方面所述蛋白HbCXXS2或第三方面所述的载体用于制备预防或调节橡胶树割面干涸的产品。
第五方面，本发明提供了一种培育割面干涸发生率降低的橡胶树品种的方法，通过上调第一方面所述基因HbCXXS2的转录本的表达来实现。
本发明分离鉴定调控氧化胁迫抗性的基因HbCXXS2及其转录本，通过基因工程手段增强生物对氧化胁迫的抗性，提高了生物抵御各种不利外界环境的能力，获得了具有抗氧化胁迫能力的生物。
本发明分离鉴定通过调节抗氧化性调控割面干涸的橡胶树基因HbCXXS2及其转录本，通过基因工程手段提高橡胶树对氧化胁迫的抗性，降低割面干涸的发生，对于增强橡胶树对不利环境的适应性、提高天然橡胶的产量以及培育氧化胁迫抗性提高的橡胶树具有重要作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的橡胶树HbCXXS2基因的PCR扩增结果。
图2为本发明实施例提供的橡胶树HbCXXS2基因及其两个转录本的结构。
图3为本发明实施例提供的橡胶树HbCXXS2基因两个转录本编码蛋白的序列比对及保守结构域分析，其中，有背景的部分为硫氧还蛋白保守结构域，下划线的部分为CXXS活性基序。
图4为本发明实施例提供的两个转录本在橡胶树各组织中的表达。
图5为本发明实施例提供的两个转录本在健康、TPD及TPD恢复植株胶乳中的表达差异，其中，不同小写字母表示样本间差异显著(P<0.05)。
图6为本发明实施例提供的H2O2诱导的氧化胁迫处理下两个转录本的表达变化，其中，不同小写字母表示处理时间点间差异显著(P<0.05)。
图7为本发明实施例提供的甲基紫精(MV)诱导的氧化胁迫处理下两个转录本的表达变化，其中，不同小写字母表示处理时间点间差异显著(P<0.05)。
图8为本发明实施例提供的重组酵母的PCR阳性检测，其中，M为DL2000DNAMarker(TaKaRa)，N1和N2为未加模板的阴性对照，P1为pYES2质粒阳性对照，P2为pYES2-HbCXXS2.1质粒阳性对照，P3为pYES2-HbCXXS2.2质粒阳性对照，1～3为pYES2转化酵母单克隆，4～6为pYES2-HbCXXS2.1转化酵母单克隆，7～9为pYES2-HbCXXS2.2转化酵母单克隆。
图9为本发明实施例提供的半定量RT-PCR检测重组酵母中HbCXXS2基因的表达，其中，M代表DL2000 DNAMarker(TaKaRa)；1～3为重组酵母INVSc1(pYES2)单克隆诱导24h时的cDNA样品；4～6为重组酵母INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)单克隆诱导24h时的cDNA样品；7～9为重组酵母INVSc1(pYES2-HbCXXS2.2)单克隆诱导24h时的cDNA样品。
图10为本发明实施例提供的H2O2处理24h后，重组酵母INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)、INVSc1(pYES2-HbCXXS2.2)与INVSc1(pYES2)的存活情况。
图11为本发明实施例提供的H2O2诱导的氧化胁迫下培养36h时重组酵母的生长(OD600值)差异，其中，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
图12为本发明实施例提供的转基因再生本氏烟草植株的PCR检测，其中，M为DL2000 DNAMarker(TaKaRa)；N为非转基因本氏烟草，P1和P2分别为pCAMBIA1301-HbCXXS2.1和pCAMBIA1301-HbCXXS2.2质粒；1～7为pCAMBIA1301-HbCXXS2.1转基因植株；8～19为pCAMBIA1301-HbCXXS2.2转基因植株。
图13为本发明实施例提供的qRT-PCR检测转基因植株中转录本HbCXXS2.1和转录本HbCXXS2.2的表达量，其中，Wt为非转基因本氏烟草。
图14为本发明实施例提供的本氏烟草中超量表达HbCXXS2转录本HbCXXS2.1或HbCXXS2.2均提高了对氧化胁迫的抗性，其中，A为培养4周后植株的表型差异，A中，Wt为2个重复实验的Wt植株，HbCXXS2.2-11表示2个重复实验的HbCXXS2.2-11株系的植株、HbCXXS2.2-16表示2个重复实验的HbCXXS2.2-16株系的植株、HbCXXS2.1-5表示2个重复实验的HbCXXS2.1-5株系的植株、HbCXXS2.1-7表示2个重复实验的HbCXXS2.1-7株系的植株，B为植株的鲜重，C为植株的株高；Wt为非转基因本氏烟草；不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案清楚、完整地进行描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为从分子层面提高生物对氧化胁迫的抗性，本发明提供了硫氧还蛋白基因HbCXXS2的转录本及其编码蛋白与应用。
本发明提供了硫氧还蛋白基因HbCXXS2的转录本，基因HbCXXS2通过不同的选择性剪接方式表达两个转录本：转录本HbCXXS2.1和转录本HbCXXS2.2。转录本HbCXXS2.1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，转录本HbCXXS2.2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
本发明分离鉴定调控氧化胁迫抗性和割面干涸的基因，通过基因工程手段增强生物对氧化胁迫的抗性，提高了生物抵御各种不利外界环境的能力，获得了抗氧化胁迫能力增强的生物。
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步阐述。
本发明实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，实验结果以平均值表示，采用SigmaPlot 12.0统计软件对数据进行处理，不同小写字母表示显著性差异(P＜0.05)。
本发明实施例中采用的橡胶树(Hevea brasiliensis Muell.Arg.)品种为热研7-33-97：记载于“黄华孙，梁茂寰，吴云通，黎德舜，何进威.中规模推广级橡胶树优良品种热研7-33-97的选育.热带作物学报，1994，15(2):1-6”，为中国热带农业科学院橡胶研究所培育，从中国热带农业科学院橡胶研究所获得。
实施例1
本实施例提供了橡胶树硫氧还蛋白基因HbCXXS2的克隆及分析。
1、HbCXXS2基因两个不同转录本的克隆
对橡胶树的胶乳进行转录组测序分析，从中获得了候选HbCXXS2基因的序列。根据该序列，采用Primer Premier 5设计扩增该基因的引物。引物由海南楠山生物技术有限公司合成，引物HbCXXS2-F序列如SEQ ID No.6所示，引物HbCXXS2-R序列如SEQ ID No.7所示；
SEQ ID No.6：5′-CCAGCAGGGAACCTTTCATA-3′；
SEQ ID No.7：5′-GAGTTAAATGGTAAGGCCACAA-3′。
采用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取橡胶树热研7-33-97的胶乳总RNA。使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific)对胶乳总RNA进行反转录，得到胶乳cDNA。以胶乳cDNA为模板，采用前述引物HbCXXS2-F/R，通过PCR扩增目标基因。PCR反应体系为：5×TransStart FastPfuBuffer 5μL，2.5mM dNTPs 2μL，TransStart FastPfu DNAPolymerase(2.5U/μL)(北京全式金生物技术有限公司)0.5μL，F1/R1引物(10μmol/L)各0.5μL，胶乳cDNA2μL，加ddH2O至总体积25μL。PCR反应程序为：95℃3min；95℃20s，56℃20s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。得到PCR产物。
对PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出如图1所示的大小不同的两条带，表明HbCXXS2基因表达大小不同的两个转录本，将大小条带代表的转录本分别命名为HbCXXS2.1和HbCXXS2.2。分别切下这两条带，采用琼脂糖凝胶回收试剂盒(OMEGA公司)回收相应片段。将纯化的两个DNA片段分别与pEASY-Blunt Simple CloningVector(北京全式金生物技术有限公司)连接，连接产物热激转化大肠杆菌Trans1-T1 Phage ResistantChemically Competent Cell(北京全式金生物技术有限公司)。菌落PCR鉴定阳性单克隆，送海南楠山生物技术有限公司测序。
测序结果表明，转录本HbCXXS2.1核苷酸序列长753bp，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；HbCXXS2.1的开放阅读框长度为378bp，其序列如SEQ IDNo.1的第160～537位核苷酸所示，其编码的蛋白质命名为HbCXXS2.1，HbCXXS2.1具有125个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。转录本HbCXXS2.2核苷酸序列长630bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；HbCXXS2.2的开放阅读框长度为255bp，其序列如SEQ ID No.3的第160～414位核苷酸所示，其编码的蛋白质命名为HbCXXS2.2，HbCXXS2.2具有84个氨基酸，其氨基酸序列如SEQID No.4所示。
SEQ ID No.1：
CCAGCAGGGAACCTTTCATATTTTGCTAATCTGGTAGCAATGGAAGCATGAAAGAAATGGTAGTGTCTACTCTAGTCTAGAACAAGAATCAAAGCTCCAGGGAAGGAGGTAAAGAAGAGAAACCAAGACAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAAGGAGACGAGATGGAGACCCAAGAGCAGCAAGCTAAGTCACGAGTTGTGAAGGTGGATTCGGTGGAGTCTTGGGATTTCTATGTTACCCAAGCCAATAATCAAGGCTGCCCTATTGTTGTACACTTTACTGCTTCATGGTGTATCCCCTCTGTGGCCATGAACCCTTTTTTCGAGGAATTAGCCTCGGCTTATCCAGATGTCCTGTTTCTAGCTGTTGATGTCGATGAAGTCAAGGAGGTGGCTTCTAAACTGGAGGTAAAGGCCATGCCTACATTTGTGCTGATGAAGGATGGTGCACAAATTGACAGGCTGGTGGGTGCCAATCCAGAGGAGATAAAGAAAAGGATTGGTGGGTTTGCACAGTCCATTCGTGTGGCTGTAGCCTAGTTACTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGTGGAGAGAGATCTTGTATATTATGAACAGGTAAAATATGTGGTTATGGTGGACGGTGGAGCAGCACTTTAAACAGAAACGATGTTGATGATTGTGGTTTGTATATGTTGATTACTGTCGCAAATCATGTAGTTAGAAAGTGTTTTACTTTGTGGCCTTACCATTTAACTC
SEQ ID No.2：
METQEQQAKSRVVKVDSVESWDFYVTQANNQGCPIVVHFTASWCIPSVAMNPFFEELASAYPDVLFLAVDVDEVKEVASKLEVKAMPTFVLMKDGAQIDRLVGANPEEIKKRIGGFAQSIRVAVA
SEQ ID No.3：
CCAGCAGGGAACCTTTCATATTTTGCTAATCTGGTAGCAATGGAAGCATGAAAGAAATGGTAGTGTCTACTCTAGTCTAGAACAAGAATCAAAGCTCCAGGGAAGGAGGTAAAGAAGAGAAACCAAGACAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAAGGAGACGAGATGGAGACCCAAGAGCAGCAAGCTAAGTCACGAGTTGTGAAGGTGGATTCGGTGGAGTCTTGGGATTTCTATGTTACCCAAGCCAATAATCAAGGCTGCCCTGAGGTGGCTTCTAAACTGGAGGTAAAGGCCATGCCTACATTTGTGCTGATGAAGGATGGTGCACAAATTGACAGGCTGGTGGGTGCCAATCCAGAGGAGATAAAGAAAAGGATTGGTGGGTTTGCACAGTCCATTCGTGTGGCTGTAGCCTAGTTACTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGTGGAGAGAGATCTTGTATATTATGAACAGGTAAAATATGTGGTTATGGTGGACGGTGGAGCAGCACTTTAAACAGAAACGATGTTGATGATTGTGGTTTGTATATGTTGATTACTGTCGCAAATCATGTAGTTAGAAAGTGTTTTACTTTGTGGCCTTACCATTTAACTC
SEQ ID No.4：
METQEQQAKSRVVKVDSVESWDFYVTQANNQGCPEVASKLEVKAMP TFVLMKDGAQIDRLVGANPEEIKKRIGGFAQSIRVAVA
2、HbCXXS2基因结构分析
采用植物DNA提取试剂盒(OMEGA公司)提取橡胶树热研7-33-97叶片的DNA，以叶片DNA作为模版，采用前述HbCXXS2-F/R引物进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测、回收纯化后与pEASY-Blunt Simple Cloning Vector(北京全式金生物技术有限公司)连接，连接产物热击转化大肠杆菌Trans1-T1 Phage Resistant Chemically CompetentCell(北京全式金生物技术有限公司)。菌落PCR鉴定阳性单克隆，送海南楠山生物技术有限公司测序。
测序结果表明，来源橡胶树热研7-33-97的HbCXXS2的基因组序列长3435bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。将转录本HbCXXS2.1、HbCXXS2.2与HbCXXS2的基因组序列进行比对分析，确定HbCXXS2.1转录本由图2中Exon 1、2和3所示的3个外显子构成，Exon 1的序列如SEQ ID No.5的第1～261位核苷酸所示，Exon 2的序列如SEQ ID No.5的第678～800位核苷酸所示，Exon3的序列如SEQ ID No.5的第3067～3435位核苷酸所示。如图2所示，与HbCXXS2.1转录本相比，HbCXXS2.2转录本缺失Exon 2，仅由Exon 1和3构成。表明，HbCXXS2基因前体mRNA通过外显子跳跃(exon skipping)的剪接方式产生HbCXXS2.1和HbCXXS2.2两个转录本。
SEQ ID No.5：
CCAGCAGGGAACCTTTCATATTTTGCTAATCTGGTAGCAATGGAAGCATGAAAGAAATGGTAGTGTCTACTCTAGTCTAGAACAAGAATCAAAGCTCCAGGGAAGGAGGTAAAGAAGAGAAACCAAGACAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAAGGAGACGAGATGGAGACCCAAGAGCAGCAAGCTAAGTCACGAGTTGTGAAGGTGGATTCGGTGGAGTCTTGGGATTTCTATGTTACCCAAGCCAATAATCAAGGCTGCCCTGTAAGTTATTTTTCTGTGTTTCTACAATTTTCGTACTGGGAATCTTGTGTTAGCCCCTTCTTCCCATCTTTTATTTTTAGAAAGAATTAAATTTCAATCACCCAAAAAATTCGGGGCATTGAATATTGATAGCCATCTCAACCTGGAAGTTGTCTGTAATGTAACATAGTTGATTCTTGCTATATGGTTCCTATTTAAAATCTTCTTTAATTTAGCCTAAAGCCTCAGACCACCGCCTTTGATTCCATGAAGTGGCAATCTAATATGTGTCTTCCATAATCCATACACATTAATTGATTACCAATCAAAAGGTTTGTTTGATTTTGGAGATGAGTTGGAGGATTTGTAATAAAGAAATCTCTTTTGGCAAATCATTTGGTTCATTGATGTTCATTTTTTAGTTTGACTTGTTGTAGATTGTTGTACACTTTACTGCTTCATGGTGTATCCCCTCTGTGGCCATGAACCCTTTTTTCGAGGAATTAGCCTCGGCTTATCCAGATGTCCTGTTTCTAGCTGTTGATGTCGATGAAGTCAAGGTAATATATTAATTTTTCAGTGAACACCTGTCTGTATACTTAAATTTCTTGTTTCTGCATTCTGACAAGCTGCGGAATAATTGATATATTGATGGAATACAACAGAAACAGCAGTATTAGAATCCTTGACTTCAATATCGAATGCATTAGAGGTTGAATCTTGTGATATTGTTTGTTTTCAACTTCTTGTGGTGGATATTTCTAAGAAATATCTTTACAAGGGTATGAATTAGCTTGTCCTTCATGTATTTGCCAACTAGATTACCTTTTATGAGGTCAGGGATGTATTGTATATGTATTTAGGTTGTTAAGTCATATAGAAGCTCATCAATGGACTATGATTTATAACACCAGGAATATTATACTAGGTAATTTTTTATCAATTTTCATATGATTCTGAGTATTAGTATTTAATATCATGTACTCTGTTTGTATGTTTTAGTCTTTTGATGTGTAGAAATTTCAATTAATGACACACTGGGCTTCAGGTCCATTGGGAAAAGATGCTCTGGTGTTTGATAAGGTTCAAACTAACTGTTATTTTCTTCTTACAAAATCACAGATATTGATTAATGTATTGCATTATATTAAGCTTACTGTTGGAGTTGATGAGATTTAGTATATACAAGTAAAGAAAAAGTCATATCCAAGCATGGTGCAAGTATGGGCTATGTTGACTAAAGAAGCAATCTTTCCCTATAAAAGGAAGAGGTTACTGCTACTGGATATAGATAGAATTGCTACTGGAAAGAGAGAGAGCAGAGAGAATTTGAGAGAGCTGGAAAGAGAGTTTGAAAGAGTTAAGAAAATGAGGAAGAAAAGGAAGGAAAAATATCTTTGAATTTGTATATGTAAATCCTCTGTTTTAGTAATGAATTTATGGTTTTCTTTCTCCTACTTGTTCTAGCATAAACCTCTCTTAAATTTCTTAGTTTTTTCTTCCTTTAAACCCAACACTTACATCTCATGAACACTCAGCAGCTACAGCTACAAGGGTTGTGAATGGACTTATGTTCATTTGATGATCATCCCAATTTTGGCATCTTATTTGTCAAAGGTGATGATGATTGAATGATCATTTGTTGAGCAAACAGTTTAGGAAGGTGTTCAAGCTAAACTATAGCTTTTTCCATCAAACCTGTAACTGACACTACAAGGGTAGTGGCCATCTTGTGGAAACTTCTCAGTTGAGTAATTAACTTCAGGTTCTGCAGTGGGATGTTCCAGTGTCCACTTCTGATGAATTTTTGGTGTATTGGGTGTTTTAGTTCACTAACCTTTGTTCTTCTAGATGTGTGACTTTTGCAGTGCTTGCATGGTTTCTTAATATTCTTTTGTTCTGGTAGAATGATTAGCAGATTTTTTGCAACATATATTTCAACATATACATCATTTCAAATGTTTTCACGGACATGGTTGTTATGAATTAGCTAATTTGCATTCATTGGGATAGTTATACCTTATACCAATGACAATCTTTTTGTTTAAGATCAGGAGATAAACAACTATGAGTTTAATGTTTATTTAATCAAGATAATTAATTAGGCAATTAGAAATGTCTAATGGCTGCTCTTCTATGATATTTTTGTGAGCGTTCATGTGCATATAGATAATCATCTCACTATCAAAATGACAAGCTAATTTAAAAGCCGTGTTTCAATAGATTGTCATAATCACCTGATGAAGACAAGGCTTGCAGATTGATATTGGATAAATTTTGACAACTGTCATTGAACTTATCTAGTTGTAATATTACAGTCCCTCAACTTAAAAATGTAATATAAAATCCCATCAACTTTCAAATTTTACACAGTAAAATTCCTCTAACCTCCAATTACCAGTTTTTTAGTTAGACGCTGACCTAAACAGTTCTAACATGGAGTTTAGTTAGTATTTATATTTTATCTCTCAAGCTATGTCTCAAGCTATGTGTAAATTGAATCATTTTTCTCTTAAGTGTAAAGAGAATAATTTTACACTTTGCACAAGAGAGGAGAGAGAAATGTTGGCTAAGCACCATGCGGGAGTTATTAACATCAGTTTCTAACTAAAAAATCAGTAATTGAAAGTTATAGAGATTTTACTGTGTAAAATTTAAAAGTTTTGGGGGTTTTATGTTACATTTTAAAATTAAATAACTGTAGTTTTATAACTATATAAGTTCAGGGACAGTTATTGAAATTTATCCGATTCATATTTCTCGTGTTAAGCTTTGTTGGATTATGATATGCTTACGAATGCATTTTTGTGTGTGCGGTTTGGCTAGGAGGTGGCTTCTAAACTGGAGGTAAAGGCCATGCCTACATTTGTGCTGATGAAGGATGGTGCACAAATTGACAGGCTGGTGGGTGCCAATCCAGAGGAGATAAAGAAAAGGATTGGTGGGTTTGCACAGTCCATTCGTGTGGCTGTAGCCTAGTTACTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGTGGAGAGAGATCTTGTATATTATGAACAGGTAAAATATGTGGTTATGGTGGACGGTGGAGCAGCACTTTAAACAGAAACGATGTTGATGATTGTGGTTTGTATATGTTGATTACTGTCGCAAATCATGTAGTTAGAAAGTGTTTTACTTTGTGGCCTTACCATTTAACTC
3、HbCXXS2蛋白序列分析
采用Compute pI/Mw(https://web.expasy.org/compute_pi/)在线程序预测HbCXXS2两个转录本编码蛋白的分子量和理论等电点，结果表明，HbCXXS2.1蛋白分子量13.82kDa，理论等电点4.82；HbCXXS2.2蛋白分子量9.27kDa，理论等电点6.22。利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)在线程序对HbCXXS2.1和HbCXXS2.2的氨基酸序列进行保守结构域分析，得到如图3所示的结果，可知，HbCXXS2.1和HbCXXS2.2蛋白均含有硫氧还蛋白(Thioredoxin)结构域。不同的是，HbCXXS2.1的硫氧还蛋白结构域含有CXXS活性基序，而HbCXXS2.2的硫氧还蛋白结构域缺失了CXXS活性基序。
实施例2
本实施例提供了HbCXXS2不同转录本的表达特性分析。
1、HbCXXS2不同转录本的组织表达分析
采集健康橡胶树热研7-33-97(树龄16年)植株的树皮、胶乳、新梢、古铜期叶片、淡绿期叶片、变色期叶片、稳定期叶片、衰老期叶片、雌花、雄花以及的热研7-33-97组培苗(移栽培养8个月)的根组织样品，液氮冻存。使用通用植物总RNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)提取各组织样品总RNA，具体提取方法参照试剂盒说明书。采用PrimeScriptRTreagent Kit with gDNAEraser(Perfect Real Time，TaKaRa)将各样品RNA反转录为cDNA，具体实施参照试剂盒说明书。内参基因使用橡胶树HbUBC4基因，采用Primer Premier5设计并合成用于实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测HbUBC4以及转录本HbCXXS2.1和HbCXXS2.2表达的特异性引物。
用于检测转录本HbCXXS2.1的引物HbCXXS2.1-QF的序列如SEQ ID No.8所示，引物HbCXXS2.1-QR的序列如SEQ ID No.9所示：
SEQ ID No.8：5′-ATGGTGTATCCCCTCTGTGG-3′；
SEQ ID No.9：5′-TCGACATCAACAGCTAGAAACAG-3′。
用于检测转录本HbCXXS2.2的引物HbCXXS2.2-QF的序列如SEQ IDNo.10所示，引物HbCXXS2.2-QR的序列如SEQ ID No.11所示：
SEQ ID No.10：5′-CTGCCCTGAGGTGGCTTCTA-3′；
SEQ ID No.11：5′-CACGAATGGACTGTGCAAAC-3′。
用于检测HbUBC4基因的引物HbUBC4-QF的序列如SEQ ID No.12所示，引物HbUBC4-QR的序列如SEQ ID No.13所示：
SEQ ID No.12：5′-TACAAAGAGGTGCAGCGTGA-3′；
SEQ ID No.13：5′-ACTCCGCCCTCATAAGGAGT-3′。
qRT-PCR反应体系：SYBR Premix Ex Taq(2×)(TaKaRa)5μL，正、反向引物各0.4μL，cDNA模板1μL，补ddH2O至总体积10μL。检测使用CFX96荧光定量PCR仪(Bio-Rad公司)，反应条件：95℃30s；95℃5s，60℃30s，40个循环。基因相对表达量的计算采用公式2-ΔΔCt。
HbCXXS2基因两个转录本在橡胶树各组织中的表达如图4所示，HbCXXS2.1和HbCXXS2.2在橡胶树根、树皮、胶乳、新梢、古铜期叶片、淡绿期叶片、变色期叶片、稳定期叶片、衰老期叶片、雌花和雄花组织中均有表达。其中，两个转录本均以在胶乳中的表达量最高。在同一组织中，HbCXXS2.1的表达量均高于HbCXXS2.2。HbCXXS2基因在胶乳中高表达，推测其可能参与橡胶树产排胶调控。
2、橡胶树割面干涸(TPD)发生与恢复过程中HbCXXS2的表达变化
对胶园橡胶树进行TPD症状观测，选取割线割面干涸率在60％～80％的橡胶树90株，随机分为两组：TPD恢复处理组(60株)和TPD对照组(30株)。同时，选择割线排胶完全正常的橡胶树30株，作为健康对照组。采用死皮康复组合制剂(死皮康胶剂和死皮康水剂，为中国热带农业科学院橡胶研究所研发，可以从中国热带农业科学院橡胶研究所获得)对TPD恢复处理组植株进行处理，处理方法与周期参照死皮康复组合制剂的说明书，处理5个月，观测各组植株的TPD症状。从TPD恢复处理组中选择TPD长度恢复率在80％以上的植株15株，从TPD对照组选择与恢复组处理前割线长度割面干涸率接近的植株15株，从健康对照组选择割线排胶始终完全正常的植株15株。采集各植株胶乳样品，液氮冻存。每株取等量胶乳样品，5株混在一起作为一个生物学重复。按照实施例中1的方法，抽提各样品总RNA，反转录合成cDNA，并采用qRT-PCR检测各样品中HbCXXS2基因两个转录本的表达量。
检测结果如图5所示，由图5可知，同健康植株胶乳相比，TPD植株的胶乳中HbCXXS2.1和HbCXXS2.2的表达均显著降低；同TPD植株胶乳相比，恢复植株胶乳中HbCXXS2.1的表达显著回升，与健康植株胶乳中的表达无显著差异，HbCXXS2.2的表达也显著回升，但未回升到正常水平，仍显著低于健康植株胶乳。以上结果表明，HbCXXS2基因的表达与橡胶树TPD发生与恢复密切相关，提高正常植株中HbCXXS2基因的表达能降低TPD发生，而促进TPD植株胶乳中HbCXXS2基因的表达有助于TPD恢复。
3、氧化胁迫下HbCXXS2不同转录本的表达变化
过氧化氢(H2O2)诱导的氧化胁迫下HbCXXS2不同转录本的表达分析：挑选移栽培养8个月的橡胶树热研7-33-97组培苗健康植株54株，将20mmol/LH2O2溶液均匀喷洒于植株叶片正反面，在处理后0、3、6、12、24和48h时分别采集植株第2和3片叶，每3株植株的叶片作为1个生物学重复，每时间点3次生物学重复，样品采集后液氮冻存。按照实施例中1的方法，抽提各样品总RNA，反转录合成cDNA，并采用qRT-PCR检测各样品中HbCXXS2基因两个转录本的表达量。以处理0h的叶片样品作为对照。得到如图6所示的结果。
甲基紫精(MV)诱导的氧化胁迫下HbCXXS2不同转录本的表达分析：以200μmol/LMV溶液(溶质为MV，溶剂为无菌蒸馏水)替代20mmol/L H2O2溶液，其余操作同H2O2诱导的氧化胁迫下HbCXXS2不同转录本的表达分析。得到如图7所示的结果。
由图6可知，H2O2诱导的氧化胁迫下，HbCXXS2两个转录本的表达变化模式基本一致，均呈先逐步降低后回升趋势；在处理12h时表达量下降到最低点，之后逐步回升，但处理48h时仍显著低于对照(0h)。由图7可知，MV诱导的氧化胁迫下，HbCXXS2两个转录本的表达变化模式基本一致，在处理3h时表达量显著下降，之后有所回升；不同的是，在处理6h时，HbCXXS2.2的表达量回升至正常水平，而HbCXXS2.1的表达量仍显著低于对照(0h)。与H2O2诱导的氧化胁迫相同，两个转录本的表达在MV处理12h时下降至最低点，之后逐步回升，但处理48h时仍显著低于对照(0h)。以上结果表明，H2O2和MV诱导的氧化胁迫显著抑制了HbCXXS2两个转录本的表达。本实施例的结果表明，基因HbCXXS2的两个转录本与橡胶树的氧化胁迫显著相关，表明，基因HbCXXS2与橡胶树的氧化胁迫显著相关。
实施例3
本实施例提供了酵母中表达HbCXXS2提高了对氧化胁迫的抗性。
1、HbCXXS2不同转录本酵母表达载体的构建
根据SEQ ID No.1和SEQ ID No.3设计并扩增HbCXXS2两个转录本开放阅读框的引物对，正、反向引物5′端分别引入限制性内切酶Kpn I和Xba I的识别序列(下述引物中划线部分所示)及保护碱基，引物HbCXXS2-YF的序列如SEQ ID No.14所示，引物HbCXXS2-YR的序列如SEQ ID No.15所示：
SEQ ID No.14：5′-GGGGTACCATGGAGACCCAAGAGCAGC-3′；
SEQ ID No.15：5′-GCTCTAGACTAGGCTACAGCCACACGAA-3′。
以实施例2中的胶乳cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为：cDNA模板2μL，5×TransStartFastPfuBuffer 5μL，2.5mM dNTPs 2μL，正、反向引物(10μmol/L)各0.5μL，TransStartFastPfuDNAPolymerase(2.5U/L)0.5μL，加ddH2O至总体积25μL。PCR反应程序为：95℃3min；95℃20s，56℃20s，72℃30s，35个循环；72℃10min。
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，分别切胶回收纯化HbCXXS2.1和HbCXXS2.2目标片段，并与pEASY-Blunt Simple CloningVector(北京全式金生物技术有限公司)连接。连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell。挑取单克隆，进行菌落PCR阳性检测。阳性单克隆送海南楠山生物技术有限公司测序。使用质粒提取试剂盒(OMEGA公司)抽提测序正确单克隆及酵母表达载体pYES2(Invitrogen公司)质粒，采用限制性内切酶Kpn I和Xba I(Thermo Scientific)进行双酶切。双酶切体系：2μLKpn I(10U/μL)，8μLXba I(10U/μL)，5μL 10×Kpn I Buffer，10μL质粒DNA，25μL ddH2O。37℃水浴4h。采用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，切下目标片段胶块，采用GelExtractionKit(OMEGA)回收目标条带。采用T4 DNA连接酶(Thermo Scientific)分别将回收的HbCXXS2.1和HbCXXS2.2片段与pYES2载体骨架连接，连接体系：HbCXXS2.1/HbCXXS2.2回收产物5.5μL，pYES2载体骨架回收产物2.5μL，10×Buffer 1μL，T4 DNA连接酶1μL。22℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂在LB固体(含100mg/L氨苄青霉素)平板上，37℃培养过夜。挑取单克隆摇菌，采用pYES2载体引物(T7：5′-CCCGGATCGGACTACTAGC-3′)加HbCXXS2-YR引物进行菌落PCR鉴定，提取阳性单克隆质粒。获得HbCXXS2基因不同转录本的酵母表达载体pYES2-HbCXXS2.1和pYES2-HbCXXS2.2。pYES2-HbCXXS2.1是用核苷酸序列为SEQ ID No.1中的第160至537位(HbCXXS2.1的开放阅读框)替换pYES2的Kpn I和Xba I识别位点之间的片段，保持pYES2的其他核苷酸序列不变得到的重组质粒；pYES2-HbCXXS2.2是用核苷酸序列为SEQ ID No.3中的第160至414位(HbCXXS2.2的开放阅读框)替换pYES2的Kpn I和Xba I识别位点之间的片段，保持pYES2的其他核苷酸序列不变得到的重组质粒。pYES2-HbCXXS2.1表达氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.2的蛋白质HbCXXS2.1。pYES2-HbCXXS2.2表达氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.4的蛋白质HbCXXS2.2。
2、重组酵母的获得
将-80℃保存的酿酒酵母菌株INVScl(Invitrogen公司)划线在YPD固体培养基上，30℃培养2～3d。挑单克隆至10mLYPD液体培养基中，30℃、200rpm培养12h。测菌液OD600值，吸取适量菌液到50mLYPD液体培养基中，调整使OD600＝0.4，30℃、200rpm培养4h。2500rpm离心5min，弃上清，用40mL1×TE缓冲液重悬菌体。2500rpm离心5min，弃上清，用2mL 1×LiAc/0.5×TE重悬菌体，室温孵育10min，获得酵母感受态细胞。将酵母感受态细胞分装到1.5mL离心管，每管100μL。取3管酵母感受态细胞，分别加入1μgpYES2-HbCXXS2.1/pYES2-HbCXXS2.2/pYES2质粒、100μg变性鲑鱼精DNA，混匀。向每管中加入700μL 1×LiAc/40％PEG-3350/1×TE，混匀，30℃孵育30min。向每管中加入DMSO 88μL，混匀后，42℃热击7min。室温、5000rpm离心2min，弃去上清。用1mL 1×TE缓冲液重悬菌体，室温、5000rpm离心1min，弃去上清。用100μL 1×TE缓冲液重悬菌体，并涂于SC-Ura固体选择培养基[1L：0.78g DOSupplement-Ura(Clontech)、6.7g无氨基酵母氮源(YNB)、20g葡萄糖、20g琼脂粉]上，30℃倒置培养2～3天。挑取每种质粒转化生长的单克隆3个，分别置于5mL SC-Ura液体选择培养基(1L：0.78g DO Supplement-Ura(Clontech)、6.7gYNB、20g葡萄糖)中，30℃、200rpm振荡培养2d。采用酵母质粒提取试剂盒(OMEGA)提取各单克隆的质粒DNA。以酵母质粒DNA作为模板，采用T7和HbCXXS2-YR引物对pYES2-HbCXXS2.1/pYES2-HbCXXS2.2转化酵母质粒进行PCR检测，采用T7和pYES2-R：5′-ATTAAAGCCTTCGAGCGTCC-3′(SEQ ID No.24)引物对pYES2转化酵母质粒进行PCR检测。
PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测结果如图8所示，如图8中的1、2、3所示的3个转pYES2空载体的重组酵母质粒扩增出与阳性对照(pYES2质粒，图8中的P1)大小(长度402bp)一致的条带，表明pYES2空载体已成功转入酿酒酵母INVScl，将转pYES2空载体的重组酵母命名为INVSc1(pYES2)。如图8中4、5、6所示的3个转pYES2-HbCXXS2.1的重组酵母质粒扩增出与阳性对照(pYES2-HbCXXS2.1质粒，图8中的P2)大小(长度448bp)一致的条带，表明pYES2-HbCXXS2.1载体已成功转入酿酒酵母INVScl，将转pYES2-HbCXXS2.1载体的重组酵母命名为INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)。如图8中7、8、9所示的3个转pYES2-HbCXXS2.2的重组酵母质粒扩增出与阳性对照(pYES2-HbCXXS2.2质粒，图8中的P3)大小(长度325bp)一致的条带，表明pYES2-HbCXXS2.2载体已成功转入酿酒酵母INVScl，将转pYES2-HbCXXS2.2载体的重组酵母命名为INVSc1(pYES2-HbCXXS2.2)。
3、重组酵母中HbCXXS2基因表达的检测
将重组酵母INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)、INVSc1(pYES2-HbCXXS2.2)和INVSc1(pYES2)阳性克隆划线于SC-Ura固体选择培养基上，30℃倒置培养2～3d。挑单克隆接种于2mL SC-Ura液体选择培养基中，30℃、200rpm振荡培养24h，测量OD600值。取适量菌液，室温、4000rpm离心3min。弃上清，用5mL SC-Ura液体诱导培养基[1L：0.78g DO Supplement-Ura(Clontech)、6.7gYNB、20g半乳糖]重悬菌体，使OD600为0.2左右。30℃、200rpm振荡培养36h，各取2mL菌液，室温、4000rpm离心3min。弃上清液，收集菌体。参照试剂盒说明书，使用酵母总RNA快速提取试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取重组酵母总RNA，并采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(TaKaRa)将总RNA反转录为cDNA。以酿酒酵母Actin(GeneBank登录号：L00026.1)基因为内参，采用半定量RT-PCR检测重组酵母中HbCXXS2.1或HbCXXS2.2的表达。
酿酒酵母Actin的引物Actin-RF的序列如SEQ ID No.16所示，引物Actin-RR的序列如SEQ ID No.17所示：
SEQ ID No.16：5′-AGTTGCCCCAGAAGAACACC-3′；
SEQ ID No.17：5′-TACCGGCAGATTCCAAACCC-3′。
检测HbCXXS2.1和HbCXXS2.2表达的引物HbCXXS2-RF的序列如SEQ IDNo.18所示，引物HbCXXS2-RR的序列如SEQ ID No.19所示：
SEQ ID No.18：5′-ACCCAAGAGCAGCAAGCTAA-3′；
SEQ ID No.19：5′-CACGAATGGACTGTGCAAAC-3′。
PCR反应体系为：2.5μL 10×EasyTaq Buffer，0.5μL EasyTaq DNAPolymerase(北京全式金生物技术有限公司)，2μL dNTPs(2.5mM)，各0.5μL正、反向引物(10μM)，1～3μLcDNA模板，补ddH2O至总体积25μL。PCR反应程序为：94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。
半定量RT-PCR检测结果如图9所示，在诱导培养36h时，3个重组酵母INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)克隆(图9中4、5、6)中检测到HbCXXS2.1表达，3个重组酵母INVSc1(pYES2-HbCXXS2.2)克隆(图9中7、8、9)中检测到HbCXXS2.2表达，而在对照酵母INVSc1(pYES2)中未检测到HbCXXS2.1和HbCXXS2.2表达(图9中1、2、3)。以上结果表明，橡胶树HbCXXS2基因的两个转录本均成功转入重组酵母并被诱导表达。
4、酵母中表达HbCXXS2基因提高了其对氧化胁迫的抗性
(1)氧化胁迫处理后重组酵母的存活差异
将重组酵母INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)、INVSc1(pYES2-HbCXXS2.2)和INVSc1(pYES2)阳性克隆划线于SC-Ura固体选择培养基上，30℃倒置培养2～3d。分别挑取各重组酵母单克隆接种于5mL SC-Ura液体选择培养基中，30℃、200rpm振荡培养24h。取适量菌液，室温、4000rpm离心3min，弃上清液，用10mL SC-Ura液体诱导培养基重悬菌体，使OD600＝0.2。30℃、200rpm振荡培养36h以诱导HbCXXS2基因表达。测定各诱导培养液OD600值。取适量INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)、INVSc1(pYES2-HbCXXS2.2)和INVSc1(pYES2)诱导培养液，室温、4000rpm离心3min，弃上清液。用无菌水重悬菌体，并调整OD600＝2.0。分别得到OD600＝2.0的INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)、INVSc1(pYES2-HbCXXS2.2)和INVSc1(pYES2)菌液。
INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)10mM H2O2处理组：取OD600＝2.0的INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)菌液0.5mL于离心管中，加入0.5mL 20mM H2O2溶液，得到OD600＝1.0、10mM H2O2处理的INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)菌液。30℃、160rpm处理24h。用无菌蒸馏水将处理后的菌液以5倍进行浓度梯度稀释(5-1、5-2、5-3、5-4、5-5)。将未稀释的菌液以及不同稀释倍数稀释的菌液各取5μL分别点样在SC-Ura固体选择培养基上，每处理3次重复。30℃倒置培养3d。
INVSc1(pYES2-HbCXXS2.2)10mM H2O2处理组：以INVSc1(pYES2-HbCXXS2.2)替代INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)，其余操作同INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)10mM H2O2处理组。
INVSc1(pYES2)10mM H2O2处理组：以INVSc1(pYES2)替代INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)，其余操作同INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)10mM H2O2处理组。
INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)15mM H2O2处理组：取OD600＝2.0的INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)菌液0.5mL于离心管中，加入0.5mL 30mM H2O2溶液，得到OD600＝1.0、15mM H2O2处理的INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)菌液。30℃、160rpm处理24h。用无菌蒸馏水将处理后的菌液以5倍进行浓度梯度稀释(5-1、5-2、5-3、5-4、5-5)。将未稀释的菌液以及不同稀释倍数稀释的菌液各取5μL分别点样在SC-Ura固体选择培养基上，每处理3次重复。30℃倒置培养3d。
INVSc1(pYES2-HbCXXS2.2)15mM H2O2处理组：以INVSc1(pYES2-HbCXXS2.2)替代INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)，其余操作同INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)15mM H2O2处理组。
INVSc1(pYES2)15mM H2O2处理组：以INVSc1(pYES2)替代INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)，其余操作同INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)15mM H2O2处理组。
INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)对照组：取OD600＝2.0的INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)菌液0.5mL于离心管中，加入0.5mL无菌蒸馏水，得到OD600＝1.0的INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)菌液。30℃、160rpm处理24h。用无菌蒸馏水将处理后的菌液以5倍进行浓度梯度稀释(5-1、5-2、5-3、5-4、5-5)。将未稀释的菌液以及不同稀释倍数稀释的菌液各取5μL分别点样在SC-Ura固体选择培养基上，每处理3次重复。30℃倒置培养3d。
INVSc1(pYES2-HbCXXS2.2)对照组：以INVSc1(pYES2-HbCXXS2.2)替代INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)，其余操作同INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)对照组。
INVSc1(pYES2)对照组：以INVSc1(pYES2)替代INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)，其余操作同INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)对照组。
上述各组INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)、INVSc1(pYES2-HbCXXS2.2)和INVSc1(pYES2)重组酵母的生长情况如图10所示，由图10可知，对照组(无氧化胁迫处理)相同稀释倍数下，INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)、INVSc1(pYES2-HbCXXS2.2)和INVSc1(pYES2)的菌斑数(CFU)无显著差异。10mM H2O2处理组，5-3稀释后，INVSc1(pYES2)无菌斑生长，而INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)和INVSc1(pYES2-HbCXXS2.2)有菌斑生长，且INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)的菌斑数量多于INVSc1(pYES2-HbCXXS2.2)；5-4稀释后，仅INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)有菌斑生长，INVSc1(pYES2-HbCXXS2.2)和INVSc1(pYES2)无菌斑生长。15mMH2O2处理组，5-2稀释后，INVSc1(pYES2)仅有1个菌斑生长，而INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)和INVSc1(pYES2-HbCXXS2.2)仍有较多菌斑生长，且INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)的菌斑数量多于INVSc1(pYES2-HbCXXS2.2)；5-3稀释后，INVSc1(pYES2)无菌斑生长，而INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)和INVSc1(pYES2-HbCXXS2.2)仍有菌斑生长，且INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)的菌斑数量多于INVSc1(pYES2-HbCXXS2.2)。以上结果表明，在酵母中表达HbCXXS2基因的转录本HbCXXS2.1或HbCXXS2.2均提高了重组酵母在高浓度H2O2诱导的氧化胁迫处理后的存活率，增强了重组酵母对氧化胁迫的抗性，且表达转录本HbCXXS2.1的重组酵母的抗氧化性优于表达转录本HbCXXS2.2的重组酵母。
(2)氧化胁迫下重组酵母的生长差异
将重组酵母INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)、INVSc1(pYES2-HbCXXS2.2)和INVSc1(pYES2)阳性克隆划线于SC-Ura固体选择培养基上，30℃倒置培养2～3d。分别挑取各重组酵母单克隆接种于5mL SC-Ura液体选择培养基中，30℃、200rpm振荡培养24h。取适量菌液，室温、4000rpm离心3min，弃上清液，用10mL SC-Ura液体诱导培养基重悬菌体，使OD600＝0.2。30℃、200rpm振荡培养36h以诱导HbCXXS2基因表达。测定各诱导培养液OD600值。取适量INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)、INVSc1(pYES2-HbCXXS2.2)和INVSc1(pYES2)诱导培养液，室温、4000rpm离心3min，弃上清液。用SC-Ura液体诱导培养基重悬菌体，并调整OD600＝0.4。
INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)2.5mM H2O2处理组：取前述OD600＝0.4的INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)菌液2.5mL于50mL无菌离心管中，加入含5mM H2O2的SC-Ura液体诱导培养基2.5mL，得到OD600＝0.2、2.5mM H2O2处理的INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)菌液。每个处理设置3次重复。30℃、200rpm振荡培养。在培养36h时，采用分光光度计测定各培养液的OD600值。
INVSc1(pYES2-HbCXXS2.2)2.5mM H2O2处理组：以INVSc1(pYES2-HbCXXS2.2)替代INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)，其余操作同INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)2.5mM H2O2处理组。
INVSc1(pYES2)2.5mM H2O2处理组：以INVSc1(pYES2)替代INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)，其余操作同INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)2.5mM H2O2处理组。
INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)3mM H2O2处理组：取前述OD600＝0.4的INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)菌液2.5mL于50mL无菌离心管中，加入含6mM H2O2的SC-Ura液体诱导培养基2.5mL，得到OD600＝0.2、3mM H2O2处理的INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)菌液。每个处理设置3次重复。30℃、200rpm振荡培养。在培养36h时，采用分光光度计测定各培养液的OD600值。
INVSc1(pYES2-HbCXXS2.2)3mM H2O2处理组：以INVSc1(pYES2-HbCXXS2.2)替代INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)，其余操作同INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)3mM H2O2处理组。
INVSc1(pYES2)3mM H2O2处理组：以INVSc1(pYES2)替代INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)，其余操作同INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)3mM H2O2处理组。
INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)对照组：取前述OD600＝0.4的INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)菌液2.5mL于50mL无菌离心管中，加入SC-Ura液体诱导培养基2.5mL，得到OD600＝0.2、无H2O2处理的INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)菌液。每个处理设置3次重复。30℃、200rpm振荡培养。在培养36h时，采用分光光度计测定各培养液的OD600值。
INVSc1(pYES2-HbCXXS2.2)对照组：以INVSc1(pYES2-HbCXXS2.2)替代INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)，其余操作同INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)对照组。
INVSc1(pYES2)对照组：以INVSc1(pYES2)替代INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)，其余操作同INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)对照组。
培养36h时，各组酵母菌液OD600值如图11所示。对照组中，INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)和INVSc1(pYES2-HbCXXS2.2)的OD600值略低于INVSc1(pYES2)，但差异不显著。H2O2处理明显抑制了酵母的生长，且H2O2浓度越高抑制越严重。在2.5和3mM H2O2处理组中，INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)和INVSc1(pYES2-HbCXXS2.2)的OD600值均显著高于INVSc1(pYES2)，且INVSc1(pYES2-HbCXXS2.1)的OD600值显著高于INVSc1(pYES2-HbCXXS2.2)。以上结果表明，在酵母中表达HbCXXS2基因的转录本HbCXXS2.1或HbCXXS2.2均增强了重组酵母对氧化胁迫的抗性，提高了重组酵母在H2O2诱导的氧化胁迫处理下的生长活性，且表达转录本HbCXXS2.1的重组酵母的抗氧化性优于表达转录本HbCXXS2.2的重组酵母。
实施例4
本实施例提供了基因HbCXXS2的转录本提高了烟草对氧化胁迫的抗性。
1、HbCXXS2不同转录本植物超量表达载体的构建及烟草遗传转化
根据SEQ ID No.1和SEQ ID No.3设计并扩增HbCXXS2两个转录本开放阅读框的引物对，正、反向引物5′端分别引入限制性内切酶Nco I和BstEII的识别序列(下述引物中划线部分所示)及保护碱基，引物HbCXXS2-OF的序列如SEQ ID No.20所示，引物HbCXXS2-OR的序列如SEQ ID No.21所示：
SEQ ID No.20：5′-TACCATGGATGGAGACCCAAGAGCAGC-3′；
SEQ ID No.21：5′-GTGGTTACCCTAGGCTACAGCCACACGAA-3′。
参照实施例3中的反应体系和程序进行PCR扩增。回收纯化HbCXXS2.1和HbCXXS2.2目标片段，并与pEASY-Blunt Simple CloningVector(北京全式金生物技术有限公司)连接。连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell。挑取单克隆，进行菌落PCR阳性检测，阳性单克隆送海南楠山生物技术有限公司测序。抽提测序正确单克隆及植物超量表达载体pCAMBIA1301质粒，采用限制性内切酶Nco I和BstEII(Thermo Scientific)进行双酶切。琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，并回收目标条带。采用T4 DNA连接酶(Thermo Scientific)分别将回收的HbCXXS2.1和HbCXXS2.2片段与pCAMBIA1301载体骨架连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂在LB固体(含100mg/L氨苄青霉素)平板上，37℃培养过夜。挑取单克隆摇菌，采用CaMV35S启动子引物(35S：5′-TGACGCACAATCCCACTATCC-3′)加HbCXXS2-OR引物进行菌落PCR鉴定。获得HbCXXS2基因不同转录本的植物超量表达载体pCAMBIA1301-HbCXXS2.1和pCAMBIA1301-HbCXXS2.2。抽提pCAMBIA1301-HbCXXS2.1和pCAMBIA1301-HbCXXS2.2质粒，并分别转入农杆菌EHA105感受态细胞(Coolaber公司)。采用农杆菌介导的烟草叶盘转化法将两个植物超量表达载体转入本氏烟草(Nicotiana benthamiana，从中国热带农业科学院橡胶研究所获得)。
2、转基因烟草的分子检测
采用植物DNA提取试剂盒(OMEGA公司)提取转基因烟草再生植株叶片DNA。以叶片DNA作为模版，采用前述CaMV35S启动子引物加HbCXXS2-OR引物进行PCR扩增。参照实施例3中的反应体系和程序进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测。使用通用植物总RNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)提取各阳性转基因植株叶片的总RNA，具体提取方法参照试剂盒说明书。采用PrimeScript RTreagentKitwithgDNAEraser(Perfect Real Time，TaKaRa公司)将各样品总RNA反转录为cDNA，具体实施参照试剂盒说明书。参照实施例2的qRT-PCR反应体系和条件检测HbCXXS2.1和HbCXXS2.2基因在相应转基因植株中的表达。检测转录本HbCXXS2.1和HbCXXS2.2的qRT-PCR引物同实施例2，内参基因采用本氏烟草EF1a(AY206004.1)，引物EF1a-QF的序列如SEQ ID No.22所示，引物EF1a-QR的序列如SEQ IDNo.23所示：
SEQ ID No.22：5′-TACCACCCCCAAGTACTCCA-3′；
SEQ ID No.23：5′-ATATTGTCCCCCTCGAAACC-3′。
琼脂糖凝胶电泳检测结果如图12所示。图12表明，获得转HbCXXS2.1基因阳性植株7株、转HbCXXS2.2基因阳性植株12株。分别检测对应植株中对应基因的表达量，得到如图13所示的结果，可知，7株转HbCXXS2.1基因阳性植株中有6株(2～7)检测出较高的HbCXXS2.1表达，12株转HbCXXS2.2基因阳性植株中有8株(10、11、13、15～19)检测出较高的HbCXXS2.2表达。
3、转基因株系的抗氧化性鉴定
取适量表达量较高的纯合T3代转基因株系(HbCXXS2.1-5、-7和HbCXXS2.2-11、-16)和野生型(wildtype，Wt)烟草种子，经75％酒精消毒30s、30％次氯酸钠消毒10min、无菌水清洗后，接种于固体MS培养基上，在人工气候箱中培养14d。选取长势相近的幼苗，移栽到含有0(对照组)或4mM H2O2(H2O2处理组)的固体MS培养基中。人工气候箱中培养4周后，测量植株的鲜重和株高，每株系测定12株，比较转基因株系和野生型植株的差异。
培养4周，得到如图14所示的结果。由图14可知，对照组中，HbCXXS2.1和HbCXXS2.2转基因株系和Wt植株表型无明显差异，植株大小、株高和鲜重基本相近，表明烟草中超量表达HbCXXS2.1和HbCXXS2.2对植株在正常条件下的生长发育无明显影响。4mmol/L H2O2诱导的氧化胁迫处理显著抑制转基因株系和Wt烟草幼苗的生长，但对转HbCXXS2.1和HbCXXS2.2基因株系植株的抑制作用明显小于Wt。氧化胁迫培养4周后，转HbCXXS2.1和转HbCXXS2.2基因株系之间无显著差异，但转HbCXXS2.1和HbCXXS2.2基因株系植株均明显大于Wt。HbCXXS2.1-5、HbCXXS2.1-7、HbCXXS2.2-11、HbCXXS2.2-16株系植株的平均鲜重分别为93、83、85和89mg，均显著重于Wt(58mg)。HbCXXS2.1-5、HbCXXS2.1-7、HbCXXS2.2-11、HbCXXS2.2-16株系植株的平均株高分别为1.63、1.58、1.57和1.58cm，均显著高于Wt(1.17cm)。以上结果表明，在本氏烟草中超量表达HbCXXS2.1和HbCXXS2.2均促进了转基因植株在H2O2诱导的氧化胁迫下的生长，提高了对氧化胁迫的抗性。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.硫氧还蛋白基因HbCXXS2的转录本，其特征在于，所述转录本为转录本HbCXXS2.1或转录本HbCXXS2.2，所述转录本HbCXXS2.1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述转录本HbCXXS2.2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
2.硫氧还蛋白HbCXXS2，其特征在于，由权利要求1所述基因HbCXXS2的转录本编码得到，所述蛋白HbCXXS2的氨基酸序列如SEQ ID No.2或SEQ ID No.4所示。
3.一种载体，其特征在于，包含权利要求1所述转录本HbCXXS2.1或所述转录本HbCXXS2.2的开放阅读框序列；
所述转录本HbCXXS2.1的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID No.1中的第160至537位所示，所述转录本HbCXXS2.2的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID No.3中的第160至414位所示。
4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，将所述转录本HbCXXS2.1的开放阅读框序列或所述转录本HbCXXS2.2的开放阅读框序列插入pCAMBIA1301载体质粒的NcoI和BstEⅡ酶切位点之间，得到植物表达载体；或
将所述转录本HbCXXS2.1的开放阅读框序列或所述转录本HbCXXS2.2的开放阅读框序列插入pYES2质粒的KpnI和XbaI酶切位点之间，得到酵母表达载体。
5.权利要求1所述基因HbCXXS2的转录本或权利要求2所述蛋白HbCXXS2或权利要求3所述载体或权利要求4所述载体在提高生物对氧化胁迫的抗性中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述基因HbCXXS2的转录本或所述蛋白HbCXXS2，或所述载体用于提高酵母在氧化胁迫下的存活率和/或生长活性。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述基因HbCXXS2的转录本或所述蛋白HbCXXS2或所述载体用于促进烟草在氧化胁迫下的生长。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述基因HbCXXS2的转录本或所述蛋白HbCXXS2或所述载体用于调控橡胶树割面干涸的发生或恢复。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述基因HbCXXS2的转录本或所述蛋白HbCXXS2或所述载体用于制备预防或调节橡胶树割面干涸的产品。
10.一种培育割面干涸发生率降低的橡胶树品种的方法，其特征在于，通过上调权利要求1所述基因HbCXXS2的转录本的表达来实现。
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| 王帅等: "橡胶树硫氧还蛋白基因HbCXXS1的克隆及表达分析", 生物技术通报, vol. 38, no. 12, 31 December 2022 (2022-12-31), pages 214 - 222 * |
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