CN118324882A - 转录因子erf12在提高水稻穗粒数上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了转录因子ERF12在提高水稻穗粒数上的应用，属于基因工程育种技术领域。本发明要解决的技术问题是如何提高植物的产量。为解决上述技术问题，本发明提供蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物产量中的应用；所述蛋白质为氨基酸序列是SEQ ID No.1第41‑229位的蛋白质。本发明构建的稳定表达ERF12蛋白的过表达植系中有效分蘖数、主穗的穗粒数和粒长显著高于野生型，具有提高水稻产量的潜能，为培育优质、高产的水稻等禾本科作物及其他作物的研究提供理论基础，具有重要的经济意义和实用价值。

Description

转录因子ERF12在提高水稻穗粒数上的应用

技术领域

本发明属于基因工程育种技术领域，涉及水稻ERF12转录因子及其应用，更具体地，涉及转录因子ERF12在提高水稻穗粒数上的应用。

背景技术

水稻是全球最重要的粮食作物之一，全球有超过一半的人口以其作为主要食物来源。一直以来科学家致力于提高水稻的产量，从以胞质基因雄性不育为理论基础的三系杂交技术，到以雄性光温敏不育为基础的两系杂交技术，到以人类目标的导向的分子精准设计育种技术，这些技术的应用有效缓解了人口增长带来的粮食需求与耕地减少、土壤质量下降以及极端气候等因素造成的粮食减产之间的矛盾。

利用分子育种技术提高水稻产量，建立在产量相关基因的研究基础上，包括基因资源发掘与克隆、功能鉴定、调控网络分析等一系列过程。了解这些基因的功能，是进行设计育种的前提。水稻花序由花序轴，一级枝梗，二级枝梗，以及着生在枝梗上的小穗组成，枝梗和小穗的数目，以及种子大小是决定水稻产量的重要因素。挖掘参与调控枝梗数目、小穗数目以及种子大小的基因资源，可以为分子育种提供着力点。利用成熟的生物技术，通过调节一个或多个影响产量的基因的表达水平，有望培育出高产的水稻品种。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何提高植物的产量。

为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质的应用，所述应用为下述任一种：

D1)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物产量中的应用；

D2)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备调控植物产量的产品中的应用；

D3)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物分蘖数中的应用；

D4)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备调控植物分蘖数的产品中的应用；

D5)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物穗粒数中的应用；

D6)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备调控植物穗粒数的产品中的应用；

D7)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表的达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物籽粒长度中的应用；

D8)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备调控植物籽粒长度的产品中的应用；

D9)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物枝梗数中的应用；

D10)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备调控植物枝梗数的产品中的应用；

D11)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在植物育种中的应用；

所述蛋白质为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1第41-229位的蛋白质；

A2)A1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与植物籽粒长度和/或籽粒重相关的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。

其中，SEQ ID No.1由229个氨基酸残基组成。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag蛋白标签、His蛋白标签、MBP蛋白标签、HA蛋白标签、myc蛋白标签、GST蛋白标签和/或SUMO蛋白标签等。

进一步地，上述的应用中，所述蛋白质来源于水稻。

进一步地，上述的应用中，所述调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质为生物材料，所述生物材料为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)编码上述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有B3)所述重组载体的转基因植物器官。

进一步地，上述的应用中，B1)所述核酸分子为如下g1)至g3)任一项所示的DNA分子：

g1)编码链的编码序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；

g2)编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；

g3)与g1)或g2)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码上述蛋白质的DNA分子。

进一步地，上述的应用中，所述调控可为正向调控或提高或促进。所述调控蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质为正向调控或提高或促进蛋白质编码基因表达的物质或正向调控或提高或促进所述蛋白质活性或含量的物质。所述调控植物的产量可为提高植物的产量。所述调控植物穗粒数可为提高植物穗粒数。在本发明的一个实施例中，所述穗粒数为主穗的穗粒数。所述调控植物的分蘖数可为提高植物的分蘖数。所述调控植物籽粒长度可为提高所述植物的籽粒长度。所述调控植物的枝梗数可为提高植物的枝梗数。

进一步地，上述的应用中，所述植物可为下述任一种：

P1)单子叶植物，

P2)禾本目植物，

P3)禾本科植物，

P4)稻属植物，

P5)水稻。

上述应用中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述应用中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

上述相关生物材料中，B2)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达上述蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动基因转录的启动子，还可包括终止基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

上述相关生物材料中，B3)所述重组载体可含有SEQ ID No.2所示的用于编码上述蛋白质的DNA分子。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(例如潮霉素标记物、庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

上述相关生物材料中，B4)所述重组微生物具体可为酵母、细菌、藻和真菌。

上述相关生物材料中，B6)所述植物组织可来源于根、茎、叶、花、果实、种子、花粉、胚和花药。

上述相关生物材料中，B7)所述转基因植物器官可为转基因植物的根、茎、叶、花、果实和种子。

上述相关生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官可包括繁殖材料，也可不包括繁殖材料。

上述应用中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

为解决上述技术问题，第二个方面，本发明提供提高植物产量的方法，所述方法包括向受体植物中导入上述蛋白质的编码基因，得到产量高于所述受体植物的目的植物。

为解决上述技术问题，第三个方面，本发明提供培育高产植物的方法，所述方法包括向受体植物中导入上述蛋白质的编码基因，得到产量高于所述受体植物的目的植物。

所述目的植物中，所述编码基因的表达量高于所述受体植物。

所述编码基因可通过携带有所述编码基因的植物表达载体导入受体植物中。如所述编码基因可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化受体植物的细胞或组织。

进一步地，上述的方法中，所述编码基因为下述g1)或g2)：

g1)编码链的编码序列是如SEQ ID No.2所示的cDNA分子或DNA分子；

g2)编码链的核苷酸序列是如SEQ ID No.2所示的cDNA分子或DNA分子。

进一步地，上述方法中，所述植物可为下述任一种：

P1)单子叶植物，

P2)禾本目植物，

P3)禾本科植物，

P4)稻属植物，

P5)水稻。

为解决上述技术问题，第四个方面，本发明提供上述的蛋白质或上述的生物材料。

本发明的实验证明，利用重组载体将ERF12基因导入野生型水稻中，得到转基因水稻，其与野生型水稻相比，ERF12基因过量表达，水稻的粒长粒长显著增加，分蘖数及枝梗数显著增加。因此通过提高ERF12基因的表达为培育高产新品种作物提供了新的思路。

本发明提供的稳定过表达ERF12的水稻株系的有效分蘖数、主穗的穗粒数和籽粒粒长均显著高于野生型，具有增产潜能。为培育优质、高产的水稻等禾本科作物及其他作物的研究提供理论基础，具有重要的经济意义和实用价值。

附图说明

图1为pOx载体骨架的图谱。

图2为ERF12相对表达量的测定结果。

图3为5×flag-ERF12 western blot的测定结果。

图4为野生型中花11和过表达ERF12的中花11的株型图。

图5为野生型中花11和过表达ERF12的中花11的穗型图。

图6为野生型中花11和过表达ERF12的中花11的十粒长。

图7为野生型中花11和过表达ERF12的中花11的有效分蘖数。

图8为野生型中花11和过表达ERF12的中花11的一级枝梗数。

图9为野生型中花11和过表达ERF12的中花11的二级枝梗数。

图10为野生型中花11和过表达ERF12的中花11的主穗穗粒数。

图11为野生型中花11和过表达ERF12的中花11的十粒长差异显著性分析。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量实验，如无特殊说明均设置三次重复，结果取平均值。

下述实施例中的水稻品种中花11为本实验室保存，在硕士学位论文“戴魁玫β’-cop调控水稻花药发育的功能研究.2017年6月.”中公开。公众可从申请人获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的过表达载体POX-5×flag为华南农业大学生命科学学院刘耀光实验室赠送，在博士学位论文“马坤.OsEDM2L调控水稻雄性生殖分子机制研究.2019年6月.”中公开(其中过表达载体POX-5×flag在实施例中简称为pOx载体)。公众可从申请人获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

以下实施例中的定量试验，采用Excel统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用T-test对每个过表达株系分别与野生型进行检测，P＜0.05(*)表示与野生型水稻相比具有显著性差异，P＜0.01(**)表示与野生型水稻相比具有极显著性差异。

实施例1、水稻ERF12蛋白及其编码序列

前期我们发现一个水稻突变体，表现为枝梗数目减少，穗粒数明显降低，种子长度变短。通过重测序发现一个AP2/ERF转录因子家族的成员ERF12(Os05g0497200,LOC4339208)发生了突变。目前还没有关于ERF12调控水稻枝梗数和种子长度的报道。通过用ubi启动子过表达ERF12，我们发现过表达植株一级枝梗和二级枝梗数目增多，穗粒数明显增多，种子长度变长。因为过表达株系的每穗粒数与野生型相比明显的增多，有效分蘖数变多，因此ERF12的过表达具有增产潜能。ERF12蛋白的氨基酸序列是SEQ ID No.1第41-299位，其编码序列为核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子。

实施例2、过表达载体构建及遗传转化

在ERF12基因起始密码子和终止密码子处设计引物F/R如下：

F：5’-AAGCTTATGGAGCTGGACATGGGAGC-3’(下划线标记为HindIII限制性核酸内切酶识别位点)；

R：5’-GGATCCTCACGAGCCGAACAGCAGCG-3’(下划线标记为BamH1限制性核酸内切酶识别位点)。

以中花11(ZH11)基因组DNA为模板、以引物F/R为引物进行PCR扩增获得含有ERF12基因CDS序列的扩增产物，将扩增产物命名为ERF12片段。ERF12基因没有内含子，PCR扩增得到的ERF12基因CDS序列即为编码序列。

其中PCR扩增体系和反应程序为如下：

表1：反应体系

反应程序：95℃，3min；(95℃，30s；58℃，30s；72℃，30s)×30个循环；72℃，5min；4℃，1s。

用HindIII和BamH1限制性核酸内切酶ERF12片段和pOx载体(pOx载体骨架的图谱如图1所示)，使得两者具有相同的粘性末端，然后用T4连接酶将酶切产物连接，将连接产物转化到大肠杆菌进行扩繁后提取质粒测序，获得测序验证正确的重组表达载体pOx-ERF12。重组表达载体pOx-ERF12的结构为用核苷酸序列是SEQ IDNo.2的DNA分子替换pOx载体的HindIII和BamH1识别位点之间的片段(HindIII和BamH1识别位点之间的小片段)，重组表达载体pOx-ERF12可表达氨基酸序列是SEQ ID No.1的重组蛋白5×flag-ERF12蛋白。

其中酶切体系和反应程序及连接体系和反应程序如下：

酶切反应程序：37℃,30min；85℃，5min；4℃，1s。

表2：酶切体系

表3：连接体系

连接反应程序：16℃连接过夜。

实施例3、过表达株系构建及筛选

将测序正确的重组表达载体pOx-ERF12用电击转化技术转化农杆菌。然后通过农杆菌介导的遗传转化法，将重组载体上LB和RB之间的序列整合到水稻品种中花11愈伤组织的基因组DNA里面。整合到水稻基因组的DNA片段含有由35S启动子调控的潮霉素抗性基因HPT，感染后的愈伤经潮霉素筛选，分化和生根成苗，将转基因植株种植于大田。具体转化及筛选方法如下：

3.1、水稻苗的获取：以水稻成熟胚为材料诱导愈伤组织

1、消毒与诱导

取成熟的中花11水稻种子，机械脱壳，挑选饱满无菌斑优质种子，用75％的乙醇进行表面消毒5min，用无菌水洗一次，约30s。然后用2％的次氯酸钠(NaClO)消毒20min，用无菌水洗一次。再次用2％的次氯酸钠(NaClO)消毒20min，用无菌水洗4次，置于无菌滤纸上吸干水分。

将消毒过后的种子接种到诱导培养基上。培养的条件为25℃条件下暗培养4-7天后，将从成熟胚盾片处诱导出初生愈伤组织，同时需要在超净台中用镊子夹断长出的新芽。25℃条件下暗培养4-5周。为了得到较好的愈伤，培养两周后更换一次诱导培养基进行继代培养，以保证充足的营养供应。其中，诱导培养基(pH5.8)：N6大量(20×50ml)，B5微量(1000×1ml)，B5有机(100×10ml)，Fe盐(100×10ml)，2,4-D 3mg/L，6-BA 1mg/L，水解酪蛋白300mg/L，谷氨酰胺500mg/L，脯氨酸500mg/L，肌醇100mg/L，蔗糖30g/L，琼脂粉8g/L。121℃灭菌20min。

2、农杆菌培养

挑取转化了重组表达载体pOx-ERF12的农杆菌单菌落(农杆菌菌种为EH105)，置于AAM液体培养液中振荡培养至OD600约为0.1左右。其中培养条件为28℃，200rpm。AAM培养液(pH5.2)的制备方法为：AA大量(20×50ml)，AA有机(100×10ml)，B5微量(1000×1ml)，B5有机(100×10ml)，Fe盐(100×10ml)，水解酪蛋白300mg/L，蔗糖68.5g/L。121℃灭菌20min后，加入葡萄糖36g/L(用AAM培养基溶解，抽滤灭菌)，100μM乙酰丁香酮(抽滤灭菌)。

3、共培养

将状态良好的愈伤收集到无菌100ml锥形瓶中，将OD600达标的菌液倒入装有愈伤组织的锥形瓶中，200rpm摇2min,将愈伤组织取出平摊在无菌滤纸上，放到超净工作台中吹2h以上，使愈伤干燥，将愈伤组织平摊在垫有无菌滤纸的共培养基上，黑暗条件下，28℃培养2-3天。共培养基(pH5.5)：N6大量(20×50ml)，B5微量(1000×1ml)，B5有机(100×10ml)，Fe盐(100×10ml)，水解酪蛋白300mg/L，肌醇2g/L，蔗糖30g/L，琼脂粉8g/L。121℃灭菌20min后加入1/1000体积的乙酰丁香酮。

4、筛选

将共培养基上的愈伤组织收集到无菌锥形瓶中，用1/1000的羧苄水洗涤愈伤，120rpm摇20min，重复3-4次。再用无菌水洗涤，120rpm摇5min，重复3-4次。将愈伤组织转移到无菌滤纸上，在超净工作台中吹干约2h，转接到筛选培养基中。28℃黑暗培养两周，换新的筛选培养基进行第二次筛选。其中，筛选培养基(pH5.8)的组成为：N6大量(20×50ml)，B5微量(1000×1ml)，B5有机(100×10ml)，Fe盐(100×10ml)，2,4-D 3mg/L，6-BA 1mg/L，水解酪蛋白300mg/L，谷氨酰胺500mg/L，脯氨酸500mg/L，肌醇100mg/L，蔗糖30g/L，琼脂粉8g/L。121℃灭菌20min后，分别加入1/1000体积的头孢，羧苄，潮霉素。

5、抗性愈伤的诱导分化及生根

将筛选出来的抗性愈伤组织转接到分化培养基中，光照培养，两周后再转接到新的分化培养基进行二次分化，得到转化苗。将转化苗转移到生根壮苗培养基中，光照培养。待小苗长至10cm左右时，打开封口膜，加入少量无菌水。光照下炼苗5-7天后，将组织培养苗移栽至土中生长。

一个月后取转化苗的叶子，放到含有1/1000潮霉素和1/1000 6-BA溶液里面处理3-4天，阳性植株含有潮霉素抗性基因，能抵抗潮霉素的毒性，阴性植株因为不能抵抗潮霉素的毒性叶片会发生溃烂，以此筛选出阳性转化植株。

分化培养基(pH5.8)的配方为：MS大量(20×50ml)，MS有机(100×10ml)，MS微量(1000×1ml)，Fe盐(100×10ml)，6-BA 3mg/L，NAA 1mg/L，水解酪蛋白300mg/L，蔗糖30g/L，山梨醇20g/L，琼脂8g/L，121℃灭菌20min后，加入头孢，羧苄，潮霉素各1/1000。

生根壮苗培养基(pH5.8)的配方为：1/2MS大量(20×50ml)，1/2MS有机(100×10ml)，1/2MS微量(1000×1ml)，1/2Fe盐(100×10ml)，NAA 0.5mg/L，蔗糖15g/L，琼脂6g/L，121℃灭菌20min后，加入头孢，羧苄，潮霉素各1/1000，IAA0.5mg/L。

3.2、过表达株系的筛选

(二)RT-PCR验证

取潮霉素抗性阳性转化苗的叶片提取RNA，利用RT-PCR技术，筛选出表达水平相对野生型水稻上调的阳性转化苗，结果如图2。取表达量上调的阳性转化苗的叶片，提取蛋白做western blot检测，结果如图3。重组蛋白5×flag-ERF12含有5×flag标签，利用靶向该标签的抗体，筛选出表达重组蛋白的转化苗，即为T0代转化苗，T0代转化苗结实收获的籽粒即为T1代，T1代自交获得的籽粒即为T2代籽粒，经过多代种植，检测每代植株潮霉素阳性情况，待子代植株潮霉素抗性均为阳性，没有阴性和阳性的性状分离，即认为得到稳定表达ERF12的株系，用于进行农艺性状的考察。

其中RT-PCR验证的过程如下：

1、水稻RNA提取

全程带口罩和手套，在冰上操作，所用枪头和离心管都要121℃灭菌40min。取0.1-0.2g水稻叶片，在液氮中将叶片磨碎，将粉末转移到2ml离心管里面，加入1ml Trizontotal RNA提取液，激烈摇晃15秒，加入200μl氯仿，激烈摇晃15秒，12000rpm4℃离心15min。取上清加等体积RNA专用异丙醇，冰上静止5min，7500rcf离心10min，去上清得到沉淀。用75％乙醇(用DEPC水与RNA专用乙醇配制)洗涤两次，7500rcf离心5min。用枪头吸干净上清，加入30μl DEPC水溶解沉淀，放置-80℃备用。

2、反转录

反转录体系及反应条件如下：

表4：反转录体系

以上操作在冰上进行。

反应条件：37℃，2min；50℃,15min；85℃,2min。反应得到的cDNA置于冰上进行实验或-20℃保存。

3、RT-PCR

每个株系取3个生物重复，每个生物样品做3个实验操作重复。每个生物重复同时检测水稻叶片中Actin和ERF12两个基因的表达量，用每个样品中ERF12相对于Actin的表达量代表该样品中ERF12的表达水平。

RT-PCR体系及反应条件如下：

表5：RT-PCR体系

反应程序：95℃，3min；(95℃，10s；60℃，10s；72℃，15s)×40个循环。软件：qPCRsoft4.1，仪器：qTOWER³G。

引物的核苷酸序列如下：

Q-Actin-F：5’-CACATTCCAGCAGATGTGGA-3’；

Q-Actin-R：5’-GCGATAACAGCTCCTCTTGG-3’；

Q-ERF12-F：5’-AGCTTCACCACCGCATGCA-3’；

Q-ERF12-R：5’-AGTAGACATAGTGCCACGGC-3’。

(三)western blot检测

1、蛋白的提取

取3-4cm的水稻叶片，用液氮冷冻研磨成粉末状，将粉末加到1.5毫升离心管里，加入250μl的蛋白提取液，插入冰里放置30min，每隔5min摇一下。4℃，12000rpm离心10min，取上清到新的离心管中，放到-20℃冰箱保存备用。

蛋白提取液：50mM Tris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl，1％ NP-40，4mM MgCl，5％β-巯基乙醇。

2、SDS-PAGE凝胶电泳和western blot：

(1)清洗并烘干配胶用的玻璃板,组装好制胶架,用琼脂糖封住玻璃板底部以防漏液。

(2)配胶：按表6配制浓缩胶与分离胶。

表6：SDS-PAGE胶配方

(3)灌胶：充分摇匀溶液液，向两玻璃板间加入分离胶，需要防止气泡产生。加入异丙醇压平胶面，静置。分离胶凝固后倒掉上面的异丙醇，加入配好的浓缩胶，插好梳子，静置凝固。

(4)样品处理：取出20ul样品，加入6μl 6×SDS载样缓冲液，在99℃的条件下加热10min。

(5)电泳：将制好的胶安置在电泳槽中，倒入电泳液，拔去梳子点样，80V电泳，待样品经浓缩进入分离胶后，把电压上调到100V，当溴酚蓝到达胶底端时停止电泳。

(6)转膜。将电泳后得到的胶拆下来，进行合适的剪裁后，按胶在负极，PVDF膜在正极的方式，将胶和膜用模具夹好。倒上转膜缓冲液，200mA恒流，转膜2h，将胶上的蛋白转移到膜上。

(7)杂抗体。转膜结束后，把膜拆下来，用1×TBS洗涤5min。将膜转入封闭液中室温，50rpm摇1h。用1xTBS洗涤两次，每次5min。加入杂交液1，室温50rpm摇2h。用1×TBS洗涤3次，每次10min。加入杂交液2，室温50rpm摇1h。用1×TBS洗涤4次，每次10min。

封闭液：5％脱脂奶粉+TBS(现配现用)。杂交液1：5％脱脂奶粉+TBS+1/8000一抗(Abmart公司，DYKDDDK-Tag，code:M20008M,Lot:334077)。杂交液2：5％脱脂奶粉+TBS+1/10000二抗(BOSTER公司，BA1050，HRP-羊抗小鼠，LotNo:BST16G15B16H50)。

(8)显影。按1:1的比例混好发光液A和B，把混好的发光液加到膜上，等待3min，用化学发光成像仪进行显影。

图2结果表明，过表达株系OE1、OE2和OE3中的ERF12表达水平相对于野生型WT中的ERF12表达水平分别都有提高。

5×flagDNA序列长度为120bp，ERF12基因CDS序列长度为570bp，加上起始密码子ATG和去除终止密码子TGA，最终5×flag-ERF12基因编码的蛋白质含有230个氨基酸残基。氨基酸残基的平均分子量通常按110Da，因此5×flag-ERF12融合蛋白分子量大小约为25300Da.。图3的结果表明，5×flag-ERF12融合蛋白在OE1、OE2和OE3株系中成功表达。

实施例4、农艺性状的考察

将野生型和过表达植株种植于大田。在水稻成熟期取样统计(由于存在边缘效应，不取种植在边缘的样品)野生型中花11和过表达植株至少15株苗的有效分蘖数，主穗的穗粒数，一级枝梗和二级枝梗的数目。随机取出野生型和过表达植株10粒种子，进行10粒长的比较。上述实验重复三次。

图4为野生型中花11和过表达ERF12的中花11的株型图，图4中的标尺为10cm。图4结果表明过表达株系与野生型株系相比，分蘖变多，株高变高。

图5为野生型中花11和过表达ERF12的中花11的穗型图，图5中的标尺为2cm。图5中A为水稻的穗型图，图5中B为水稻的穗型图，图5结果表明过表达株系的稻穗比野生型的更大。

图6为野生型中花11和过表达ERF12的中花11的十粒长，图6结果表明过表达株系的种子要比野生型的种子更长。

图7为野生型中花11和过表达ERF12的中花11的有效分蘖数，图7结果表明过表达株系的有效分蘖比野生型的显著变多。

图8为野生型中花11和过表达ERF12的中花11的一级枝梗数，图8结果表明过表达株系的一级枝梗数比野生型的显著变多。

图9为野生型中花11和过表达ERF12的中花11的二级枝梗数，图9结果表明过表达株系的二级枝梗数比野生型的显著变多。

图10为野生型中花11和过表达ERF12的中花11主穗的穗粒数，图10结果表明过表达株系的主穗粒数要比野生型的显著提高。

图11为野生型中花11和过表达ERF12的中花11的十粒长差异显著性分析，图11结果表明过表达株系的种子十粒长要比野生型的种子十粒长显著变长。

以上结果表明：ERF12过表达植株与野生型ZH11相比有效分蘖数增加(图7)，一级枝梗(图8)和二级枝梗(图9)增加，穗粒数增加(图10)，种子长度增加(图6和图11)。本发明构建的稳定表达ERF12蛋白的过表达植系中有效分蘖数、主穗的穗粒数和粒长显著高于野生型，具有提高水稻的产量的潜能。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质的应用，其特征在于：所述应用为下述任一种：

D1)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物产量中的应用；

D2)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备调控植物产量的产品中的应用；

D3)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物分蘖数中的应用；

D4)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备调控植物分蘖数的产品中的应用；

D5)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物穗粒数中的应用；

D6)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备调控植物穗粒数的产品中的应用；

D7)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物籽粒长度中的应用；

D8)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备调控植物籽粒长度的产品中的应用；

D9)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物枝梗数中的应用；

D10)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备调控植物枝梗数的产品中的应用；

D11)蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在植物育种中的应用；

所述蛋白质为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1第41-229位的蛋白质；

A2)A1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与植物产量相关的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述蛋白质来源于水稻。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质为生物材料，所述生物材料为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有B3)所述重组载体的转基因植物器官。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下g1)至g3)中任一项所示的DNA分子：

g1)编码链的编码序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；

g2)编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；

g3)与g1)或g2)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于：所述调控可为正向调控或提高或促进。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的应用，其特征在于：所述植物为下述任一种：

P1)单子叶植物，

P2)禾本目植物，

P3)禾本科植物，

P4)稻属植物，

P5)水稻。

7.提高产量的方法，其特征在于：包括向受体植物中导入权利要求1中所述蛋白质的编码基因，得到产量高于所述受体植物的目的植物。

8.培育高产植物的方法，其特征在于：所述方法包括向受体植物中导入权利要求1中所述蛋白质的编码基因，得到产量高于所述受体植物的目的植物。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述编码基因为下述g1)或g2)：

g1)编码链的编码序列是如SEQ ID No.2所示的DNA分子；

g2)编码链的核苷酸序列是如SEQ ID No.2所示的DNA分子。

10.根据权利要求7-9中任一项所述方法，其特征在于：所述植物为下述任一种：

P1)单子叶植物，

P2)禾本目植物，

P3)禾本科植物，

P4)稻属植物，

P5)水稻。