CN118294659A - 一种识别HICTL的HIV-1膜蛋白gp120荧光标记中和抗体诊断标志物及其用途 - Google Patents
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Abstract
一种识别HICTL的HIV‑1膜蛋白gp120荧光标记中和抗体诊断标志物及其用途，属于生物医药技术领域。本发明提供了一种用于识别活的HICTL的诊断标志物为HIV‑1膜蛋白gp120的荧光标记中和抗体；中和抗体靶向HIV‑1膜蛋白gp120上的基因保守区。本发明HIV‑1膜蛋白gp120荧光标记中和抗体特异性地识别并结合HICTL表面的gp120蛋白抗原，不需要细胞膜打孔剂和醛类固定剂处理，不会导致被检测的细胞死亡，通过流式细胞术识别HICTL细胞膜表面的gp120荧光标记中和抗体所标识的特异性荧光信号，将HIV‑1感染的活的细胞与未感染的活细胞区分开。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及基于HIV-1膜蛋白gp120的荧光标记中和抗体，通过流式细胞术或其它荧光分析仪器分析检测活的HICTL中的应用(检测过程和检测后细胞不死亡)，可将HIV-1感染者体内的HICTL或感染细胞模型的HICTL和未感染CD4+T淋巴细胞区分开来，为获取活的HICTL提供技术支持。
背景技术
艾滋病全称为获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)，是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)感染引起的一种具有严重机体免疫功能危害性的传染病。HIV-1属于逆转录病毒科慢病毒属，主要感染CD4+T淋巴细胞(简称CD4+T细胞)，并通过多种机制导致细胞死亡和功能缺失，引起感染者体内CD4+T细胞数量进行性下降及免疫功能紊乱。目前关于HIV-1对感染者CD4+T细胞病理损伤的研究主要是基于CD4整个细胞亚群，但在CD4+T细胞中，HIV-1感染的CD4+T淋巴细胞(HIV-1Infected CD4 T Lymphocytes，HICTL)只占很小的比例(0.001％-5％)。因此，对HIV-1感染者CD4+T细胞的病理分析结果是非HICTL和HICTL的混合结果，无法精准地阐述HIV-1对HICTL的直接病理损伤。这里，需注意的是HIV-1感染的细胞并不会立即死亡，HIV-1会在细胞内持续复制、释放新病毒，最终导致大部分被感染细胞死亡，这是一个过程，而这个过程是研究HIV-1对细胞直接破坏作用的机会，也就是说分离到活的HICTL并与没被HIV-1感染的CD4+T细胞进行比较是有重要研究价值的。同时，一小部分HIV-1感染的细胞会由于一些尚不清楚的机制转变为HIV-1感染的潜伏库(Latent Reservoir)，将活的HICTL分离出来并进行后续研究也是揭开HIV-1感染后潜伏的关键，而HIV-1感染的潜伏库的存在是艾滋病难以治愈的关键。所以，开发HICTL的检测方法对于今后艾滋病的深入研究非常重要。
目前，检测HICTL主要是以p24抗原、HIV-1RNA和DNA为标志物，基于流式细胞术、RNA Flow-FISH和单细胞测序技术检测技术进行检测。但是，p24抗原、HIV-1RNA和DNA这些标志物都是细胞内的标志物，基于流式细胞术、RNAFlow-FISH的方法需要在检测时使用打孔剂在细胞膜上打孔以使荧光标记的p24抗体、HIV-1RNA和DNA互补探针进入细胞内，与HIV-1感染的细胞内的p24抗原、HIV-1RNA和DNA特异性结合；同时，还需要使用醛类分子(主要是甲醛)对细胞膜打孔之后的细胞内容物进行固定(即胞内物质被甲醛共价交联)，这样才能避免被打孔后的细胞内容物漏出或细胞裂解。细胞膜打孔和醛类物质固定(共价键反应)均会导致细胞死亡。基于单细胞测序技术检测HICTL，则需要裂解细胞并提取HICTL内部的mRNA后进行基因测序(细胞在样本处理中已经死亡)，通过识别mRNA中是否含有HIV-1核酸序列将HICTL识别出来。上述两种操作均会在样本处理和检测过程中导致细胞死亡，使得虽然可以检测HICTL，但无法得到活的HICTL进行后续的研究。
HIV-1为基因高变异病毒，而HIV-1膜蛋白gp120的基因变异率在全部HIV-1基因中变异率最大，因此，检测HIV-1膜蛋白gp120时，需要使用HIV-1中和抗体。HIV-1中和抗体目前有三十多种(论文报道)，靶向HIV-1膜蛋白gp120上的基因保守区，可以检测大多数HIV-1变异病毒株。
因此，我们定制了荧光标记的HIV-1膜蛋白gp120中和抗体作为诊断标志物，为深入研究活的HICTL的功能提供了可能。
发明内容
针对上述现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于设计提供一种识别活的HICTL的gp120荧光标记中和抗体诊断标志物及其在识别和/或分离活的HICTL中的应用，以及该方法在艾滋病相关检测、诊断和治疗方面的应用。本发明HIV-1膜蛋白gp120荧光标记中和抗体特异性地识别并结合HICTL表面的gp120蛋白抗原，不需要细胞膜打孔剂和醛类固定剂处理，不会导致被检测的细胞死亡，通过流式细胞术识别HICTL细胞膜表面的gp120荧光标记中和抗体所标识的特异性荧光信号，将HIV-1感染的活的细胞与未感染的活细胞区分开。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供了一种用于识别活的HICTL的诊断标志物，所述诊断标志物为HIV-1膜蛋白gp120的荧光标记中和抗体；
所述中和抗体靶向HIV-1膜蛋白gp120上的基因保守区；
所述荧光标记为采用荧光素标记。
所述的一种用于识别活的HICTL的诊断标志物，所述中和抗体为gp120(0.5Beta)或gp120(5i20)。
所述的一种用于识别活的HICTL的诊断标志物，所述荧光标记为APC荧光素和/或FITC荧光素标记。
第二方面，本发明提供了所述的诊断标志物在制备检测或诊断或治疗艾滋病的产品中的应用。
第三方面，本发明提供了所述的诊断标志物在制备识别和/或分离活的HIV-1感染的CD4+T淋巴细胞，和未感染CD4+T淋巴细胞的产品中的应用。
第四方面，本发明提供了所述的诊断标志物在制备特异性识别和/或分离活的HIV-1感染的CD4+T淋巴细胞的产品中的应用。
所述的应用，其特征在于，所述识别和/或分离的方法为荧光分析方法。
所述的应用，其特征在于，所述识别和/或分离的方法为流式细胞术。
第五方面，本发明提供了一种用于识别活的HICTL的试剂盒，包含如权利要求1或2所述的诊断标志物。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明提供了一种基于HIV-1膜蛋白gp120的荧光标记抗体的诊断标志物，可以特异性识别大多数HIV-1病毒株感染的活的HICTL，因为荧光标记抗体是和HICTL细胞膜上的gp120非共价结合，在识别HICTL时不会导致细胞死亡，在检测过程中和检测之后也不会导致样本中的细胞死亡，基于这个方法可以识别并分离活的HICTL，为深入研究HICTL的功能提供了可能。
2.本发明基于两种HIV-1膜蛋白gp120的荧光标记抗体进行分析以验证该方法的可行性，两种gp120的荧光标记抗体标记不同的荧光分子，通过流式细胞术识别两种不同的荧光分子，可以进行单荧光分子的识别和双荧光分子的识别，单荧光分子的识别是指识别一个荧光阳性的HICTL(标记为gp120+)，双荧光分子的识别是指识别两个荧光均为阳性的HICTL(标记为gp120++)，两个gp120荧光标记抗体的共同识别，可以降低单个gp120荧光标记抗体可能存在的非特异性结合，更精准地识别具有活性的HICTL。上述方法是定制两个gp120荧光标记抗体，以胞内染色法分析HICTL最常用的标记分子HIV-1-P24抗原的抗体为对照，对HIV-1感染者人群和健康对照人群进行细胞表面染色和胞内染色方法的比较，结果符合理论预测。通过流式细胞术或其它荧光分析方法，将活的HICTL流式细胞术圈门识别出来，从而使示踪并获得活的HICTL成为可能。采用HIV-1膜蛋白gp120的中和抗体特异性识别被HIV-1感染的活细胞，并能检测到有基因变异的HIV-1病毒株感染的HICTL。
3.本发明进一步使用HIV-1(NL4-3)假病毒感染的Rev-A3R5-GFP细胞进行验证，进一步确定本发明方法既可以用于HIV-1感染者体内HICTL的检测，也可以用于HIV-1(NL4-3)假病毒或其他HIV-1假病毒感染的传代细胞模型。不存在由其他研究给出任何技术启示的可能。
4.本发明以目前最常用的HICTL检测标记物P24抗体胞内染色法为对照，并通过流式细胞术对我们定制的gp120(0.5Beta)、gp120(5i20)两种gp120荧光标记抗体进行检测分析，不但在HIV感染人群和对照人群，也对感染细胞模型进行了验证，结果证明这两种gp120荧光标记抗体可以识别HIV-1感染者血液中的HICTL和感染细胞模型中的HICTL。进一步，其它荧光素标记的HIV-1中和抗体也具有同样技术效果，所述方法可以应用于艾滋病相关检测、诊断和治疗方面，具有良好的开发应用前景。
附图说明
图1为健康者(Healthy Control)和HIV-1感染者(HIV)流式细胞分析图；其中，A为健康者和HIV-1感染者gp120(0.5Beta)-APC、gp120(5i20)-FITC和p24(KC57)-FITC流式分析图；B为健康者和HIV-1感染者gp120++(5i20和0.5Beta)流式分析图；
图2为HIV-1(NL4-3)感染的Rev-A3R5-GFP细胞的GFP、gp120和p24表达的流式图；
图2为HIV-1(NL4-3)感染的Rev-A3R5-GFP细胞的GFP、gp120和p24表达的流式图；其中，A为GFP、gp120(0.5Beta)-APC、gp120(5i20)-FITC和p24(KC57)-FITC表达的流式图；B.gp120++表达的流式图；C为GFP+gp120(0.5Beta)+表达的流式图；D为GFP+gp120(5i20)+表达的流式图；E为GFP+p24+表达的流式图。
具体实施方式
为便于理解，以下将结合附图和实施例对本发明进行详细地描述。需特别说明的是，以下附图仅示出了本发明的某些实施例。本领域的普通技术人员可以根据记载内容，在本发明的范围内对本发明做出适当的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
本发明所涉及的gp120-FITC(5i20)购买自美国USBiological公司，货号H6003-34F3。gp120-APC(0.5Beta)购买自英国absolute antibody，货号：Ab02051-10.3。细胞死活染料Sytox-blue和live-dead Violet(购买自美国赛默飞公司(ThermoFisher)，货号为S34857和L34964。转染试剂和REV-A3R5-GFP细胞购买自中国湖北富荣吉生物科技有限公司(Virongy Biotech Co.Ltd)。HEK293T细胞购买自中国科学院昆明细胞库。
其它用到的流式细胞试剂如下：CD45-BV510(HI30)(货号：563204)，CD3-BV650(UCHT1)(货号：563852)，CD4-BUV496(SK3)(货号：612936)，HorizonTM Brilliant StainBuffer Plus(货号：566385)，均购买自美国BD公司(Becton,Dickinson and Company)。p24(KC57)-FITC购买自贝克曼公司(Beckman)，货号6604665。P24抗体染色的细胞破膜固定剂为Cytofix/CytopermTM Fixation/Permeablization Kit，购买自BD公司，货号554714。
实施例1：健康者(图1中Healthy Control)和HIV-1感染者(图1中HIV)CD4+T淋巴细胞中gp120和p24的表达差异
本发明以定制的两种荧光标记的HIV-1膜蛋白gp120中和抗体(gp120(0.5Beta)、gp120(5i20))为识别HICTL的标志物，其中gp120(0.5Beta)标记的为APC荧光素(Allophycocyanin，简称APC)，gp120(5i20)标记的为FITC荧光素(Fluoresceinisothiocyanate，简称FITC)。以健康者为阴性对照样本，检测HIV-1感染者血液中CD4+T细胞表面的gp120。该方法基于流式细胞术检测HIV-1感染者荧光标记的HIV-1膜蛋白gp120中和抗体与细胞表面上HIV-1膜蛋白gp120结合后的荧光分子信号，以FITC标记的p24(KC57)为检测的阳性对照(这是公认的HICTL的胞内检测方法)，同时分析APC-gp120(0.5Beta)、FITC-gp120(5i20)及FITC-p24(KC57)单阳性细胞群和双阳性细胞群。
1、选择研究对象
本次研究包括4名健康者和12名首次确诊的未经治疗的HIV-1感染者，在抽血后24小时内使用PBMCs进行染色并上机检测。所有受试者年龄在20-50岁内，均通过抗体检测排除HCV和TP感染。人群样本使用获得了伦理学批件。
2、血液样本前处理、流式检测、门控策略及数据分析
Gp120+CD4+T细胞的检测：分离PBMCs，调整细胞浓度至1×106-107个/mL，分别染0.4uL CD45-BV510、0.8ul CD3-BV650和CD4-BUV496，1.5ul gp120(5i20)-FITC、1.5uLgp120(0.5Beta)-APC和0.25uL死活染料Sytox-Blue，避光孵育20min，采用BD FACSAriaTMFusion流式细胞仪进行检测。
P24+CD4+T细胞的检测：分离PBMCs，首先进行gp120抗体膜染色，再进行破膜和固定处理，其他抗体体积与上述相同，另外再加5uLp24(KC57)-FITC抗体，避光孵育30min，采用BD FACSAriaTM Fusion流式细胞仪进行检测。
门控策略：Sytox-blue圈定活细胞，CD45、CD3和CD4圈定CD4+T细胞，随后分别圈出gp120(5i20)、gp120(0.5Beta)和p24(KC57)的单阳和双阳细胞群。在每次实验中均采用健康者为生物学对照设置阴、阳性群的门控阈值。
数据分析：使用软件进行流式检测数据分析，采用Microsoft Excel 2019进行数据的整合和统计分析。分类数据用中位数(IQR)表示，连续数据用平均值(range)或中位数(IQR)表示。两组间比较采用Mann-Whitney-U检验，P<0.05则认为差异具有统计学意义。
3、结果
本申请对gp120(5i20)、gp120(0.5Beta)和p24(KC57)三种荧光标记抗体对健康者和HIV-1感染者CD4+T淋巴细胞中gp120和p24的表达检测。如下表1为健康对照和HIV-1感染者gp120(0.5Beta and 5i20)和p24单阳和双阳CD4+T细胞百分比。
表1健康对照和HIV-1感染者gp120(0.5Betaand 5i20)和p24单阳和双阳CD4+T细胞百分比
从表1的结果数据分析可知，健康者p24+细胞比例为0.026％，HIV-1感染者p24+、gp120(0.5Beta)+和gp120(5i20)+细胞比例分别为0.633％、0.528％、0.222％，感染者p24+细胞比例显著高于健康者(P＝0.040)；健康者gp120(0.5Beta)+细胞比例为0.320％，感染者gp120(0.5Beta)+细胞比例为0.528％；健康者gp120(5i20)+细胞比例为0.083％，感染者gp120(5i20)+细胞比例为0.222％，显著高于健康者(P＝0.034)；健康者gp120++双阳(即gp120(0.5Beta)+和gp120(5i20)+)细胞比例为0.001％，感染者gp120++细胞群比例为0.031％，显著高于健康者(P＝0.028)，与其他研究者检测的感染者的p24双阳比例相近。
健康对照和HIV-1感染者gp120(0.5Beta)+的差异没有统计学上的显著性，这是因为样本量不够大，但是可以看出，HIV-1感染者gp120(0.5Beta)+明显高于健康对照，这种差异足以区分阴性和阳性结果。
所以，基于本申请定制的两种HIV-1膜蛋白gp120中和抗体(gp120(0.5Beta)、gp120(5i20))的流式细胞术检测新方法可以用于HICTL的胞外检测并不损伤细胞，传统的基于P24的检测细胞也可以检测HICTL但是检测时细胞全部死亡；采用两种HIV-1膜蛋白gp120中和抗体，取双阳性群检测可以提高HICTL检测的特异性。
如图1为健康者和HIV-1感染者流式细胞分析图，图1中的gp120(0.5Beta)-APC、gp120(5i20)-FITC细胞群均是通过细胞死活染料Sytox-blue和live-deadViolet进行染色后，排除死细胞剩余的活细胞；p24(KC57)-FITC的染色需要对细胞进行破膜处理和固定，处理后的细胞均死亡，染色时不使用细胞死活染料Sytox-blue和live-deadViolet，流式细胞分析只能对死细胞进行分析。
实施例2：HIV-1(NL4-3)感染的Rev-A3R5-GFP细胞和未感染的Rev-A3R5-GFP细胞(对照组，Control)对照组的gp120和p24表达差异
采用HIV假病毒感染的传代细胞模型进行验证，HIV-1假病毒具有gp120基因片段，可以进入具有CD4分子的T细胞模型。HIV-1假病毒选择HIV-1(NL4-3)，传代细胞模型为Rev-A3R5-GFP细胞，这也是有文献报道的研究HIV-1假病毒感染靶细胞的模型。通过这种常用方法来验证定制的两种gp120抗体的有效性。
1、包装HIV-1(NL4-3)假病毒
Rev-A3R5-GFP依赖的指示细胞来源于CEM-SS和A3.01细胞，没有过多的受体，更接近天然T细胞HIV受体密度，能特异性示踪检测低水平的HIV复制。
包装HIV-1(NL4-3)，使用HEK293T细胞、pNL4-3质粒和转染试剂，制备了HIV-1(NL4-3)的假病毒液，使用CAP4800(Roche公司)全自动病毒载量仪检测病毒载量，病毒工作使用滴度需要超过109copies/mL，-80℃储存。取100ul(细胞浓度约为2×106个/mL)培养好的Rev-A3R5-GFP细胞，加入100uL前面制备好的病毒上清液，同时设置空白对照组，预孵育4h后，补充培养液体积至1mL，培养48h，收集细胞。
2、Rev-A3R5-GFP细胞gp120和p24表达的检测
Gp120表达的检测：上述Rev-A3R5-GFP细胞重悬，将细胞浓度调整至106-107个/mL，加入gp120(5i20)-FITC和gp120(0.5Beta)-APC抗体，以死活染料Sytox-Bule染色找到活细胞群，室温孵育15分钟，采用SONY ID7000全光谱流式仪进行检测，同时观察GFP和gp120信号的表达。
P24表达的检测：取上述Rev-A3R5-GFP细胞(106-107个/mL)进行破膜固定处理，破膜固定采用BD公司Cytofix/CytopermTM Fixation/Permeablization Kit，加入5uLp24(KC57)-FITC抗体，室温避光孵育30min后上机检测。
3、结果
为了验证这两种gp120抗体的有效性，我们培养并收集了HIV-1(NL4-3)感染的Rev-A3R5-GFP细胞，与gp120(5i20)-FITC、gp120(0.5Beta)-APC抗体及p24(KC57)-FITC抗体孵育，并通过全光谱流式仪检测确定GFP、gp120和p24的表达。如图2结果显示，这两种荧光标记的gp120抗体在HIV-1感染的Rev-A3R5-GFP细胞上均可以检测到(图2A)，空白对照组的gp120和p24抗体的非特异性结合很低(均<0.03％)，在HIV-1(NL4-3)组中gp120(0.5Beta)+细胞群比例为0.13％，gp120(5i20)+细胞群比例为0.28％，p24+细胞群比例为0.75％(图2A)；未感染的Rev-A3R5-GFP细胞gp120(0.5Beta)+细胞群比例为0.015％，gp120(5i20)+细胞群比例为0.021％，p24+细胞群比例为0.011％，HIV-1感染的Rev-A3R5-GFP细胞与未感染的Rev-A3R5-GFP细胞三种荧光标记抗体的阳性率均有显著性差异(p<0.05)。
HIV-1感染的Rev-A3R5-GFP细胞gp120++细胞群比例为0.065％，未感染的Rev-A3R5-GFP细胞gp120++细胞群比例为0％(图2B)。此外，我们还检测了GFP和p24及gp120的双阳细胞群，GFP+gp120(0.5Beta)+细胞群为0.014％(图2C)，GFP+gp120(5i20)+细胞群为0.14％(图2D)，GFP+p24+细胞群为0.15％(图2E)。这说明，基于gp120荧光标记中和抗体可以识别HIV-1(NL4-3)感染的活的Rev-A3R5-GFP传代细胞。基于定制的两种HIV-1膜蛋白gp120中和抗体(gp120(0.5Beta)、gp120(5i20))的流式细胞术检测新方法可以用于HICTL的胞外检测并不损伤细胞，传统的基于P24的检测细胞也可以检测HICTL但是检测时细胞全部死亡；采用两种HIV-1膜蛋白gp120中和抗体，取双阳性群检测可以提高HICTL检测的特异性。
Claims (9)
1.一种用于识别活的HICTL的诊断标志物，其特征在于，所述诊断标志物为HIV-1膜蛋白gp120的荧光标记中和抗体；
所述中和抗体靶向HIV-1膜蛋白gp120上的基因保守区；
所述荧光标记为采用荧光素标记。
2.如权利要求1所述的一种用于识别活的HICTL的诊断标志物，其特征在于，所述中和抗体为gp120(0.5Beta)或gp120(5i20)。
3.如权利要求1所述的一种用于识别活的HICTL的诊断标志物，其特征在于，所述荧光标记为APC荧光素和/或FITC荧光素标记。
4.如权利要求1所述的诊断标志物在制备检测或诊断或治疗艾滋病的产品中的应用。
5.如权利要求1所述的诊断标志物在制备识别和/或分离活的HIV-1感染的CD4+T淋巴细胞，和活的未感染CD4+T淋巴细胞的产品中的应用。
6.如权利要求1所述的诊断标志物在制备特异性识别和/或分离活的HIV-1感染的CD4+T淋巴细胞的产品中的应用。
7.如权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述识别和/或分离的方法为荧光分析方法。
8.如权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述识别和/或分离的方法为流式细胞术。
9.一种用于识别活的HICTL的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1-3任一项所述的诊断标志物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410215554.7A CN118294659A (zh) | 2024-02-27 | 2024-02-27 | 一种识别HICTL的HIV-1膜蛋白gp120荧光标记中和抗体诊断标志物及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN202410215554.7A CN118294659A (zh) | 2024-02-27 | 2024-02-27 | 一种识别HICTL的HIV-1膜蛋白gp120荧光标记中和抗体诊断标志物及其用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118294659A true CN118294659A (zh) | 2024-07-05 |
Family
ID=91687127
Family Applications (1)
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Country Status (1)
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-
2024
- 2024-02-27 CN CN202410215554.7A patent/CN118294659A/zh active Pending
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