CN118291488A - 一种用于椰子原生质体的亚细胞定位方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种椰子原生质体亚细胞定位方法。以椰子胚培苗幼嫩叶片和愈伤组织为材料，通过优化酶解液组分筛选出分离椰子合子胚幼苗叶片和愈伤组织原生质体适合的条件；本发明首次在椰子基因组中克隆获得椰子CnGRF12基因，该基因含有核定位信号，可协助CnGRF12‑mNeonGreen融合蛋白进入细胞核，并通过瞬时转化椰子原生质体验证了该基因定位在细胞核中。该方法可用于验证候选椰子目标基因的亚细胞定位结果，是一种简便、快捷分离椰子原生质体进行亚细胞定位的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于椰子原生质体的亚细胞定位方法，属于生物技术领域。
背景技术
原生质体是植物、细菌、真菌等的脱去细胞壁的细胞，是细胞内有生命物质的总称，也是组成细胞的一个形态结构单位。活细胞中各种代谢活动均在此进行。原生质体包括细胞膜、细胞质、细胞核和细胞器等。原生质体化学成分十分复杂，其组分也随着细胞不断的新陈代谢活动在不断变化，其中蛋白质和核酸为主的复合物是与生命活动相关最主要的成分。因为原生质体没有细胞壁，且仍具有正常细胞的全部功能，因此，它非常容易进行细胞融合等人工操作，例如植物原生质体的研究已成为近代实验生物学一个重要领域，通过原生质体的融合而进行的体细胞杂交为杂交育种提供了新手段。
椰子主产于中国广东南部诸岛及雷州半岛、海南、台湾及云南南部热带地区；喜欢阳光照射，但也具有一定的耐阴性，要求在温暖湿润的环境中生长；热带和南亚热带地区的土壤，都适宜做绿化美化栽培。椰子未熟胚乳可作为水果食用；成熟椰肉可榨油、加工糖果、糕点；椰子树是热带地区绿化美化环境的优良树种。椰肉的含油量很高，对补充营养和美容都有好处；椰子还有使人放松，利尿和补益脾胃，缓解肠道病痛的功效。
椰子原生质体分离的方法尚未见报道，本发明以椰子合子胚无菌苗的幼嫩叶片和经胚诱导的愈伤组织为材料，建立了椰子叶片和愈伤组织原生质体分离体系，本发明可以为开展椰子基因瞬时表达及蛋白的亚细胞定位研究提供重要的技术支持。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于椰子原生质体亚细胞定位的方法。
本发明采用的技术方案为：本发明通过调节酶种类及配比、酶解液pH、酶解时间等因素，筛选出分离椰子原生质体最适宜的因素；通过克隆、构建一个含有核定位信号的椰子基因CnGRF12的表达载体实现了在椰子原生质体中的亚细胞定位，具体包括以下步骤：
（1）样品筛选：取暗培养2-3个月的椰子胚培苗整株幼苗，要求叶片健壮且大小适中；愈伤组织的取材标准是选取颜色呈浅黄白色的活力较好的愈伤组织。
（2）在超净台内将选取的整株幼苗或整团愈伤组织去掉残留培养基，用刀片切成0.5-1 mm的细条。
（3）将叶片或愈伤组织细条转移至盛有酶解液的培养皿中，置于摇床上黑暗条件下进行酶解，一段时间后发现酶解液中已无完整叶片或愈伤组织细条，而溶液转为浑浊后，将溶液制片于显微镜下观察，视野下会出现大量圆形的原生质体；其中所述的酶解液配方为：20～40mM MES+0.4～1.0M D-Mannitol+20～40mM KCl+10～20mM CaCl2·2H2O+0.10～0.50% BSA+7.5～10％纤维素酶 Cellulase R10+3.75～5.0％离析酶 Macerozyme R10+1～3％果胶酶 Pectolyase。
上述方法中，所述材料优选经暗培养的椰子合子胚胚培苗的叶片或愈伤组织。
上述方法中，步骤（3）中的暗培养摇床转速为60-80rpm。
上述方法中，步骤（3）中的酶解液组合优选为：20～40mM MES+0.4～1.0M D-Mannitol+20～40mM KCl+10～20mM CaCl2·2H2O+0.10～0.50% BSA+7.5～10％纤维素酶Cellulase R10+3.75～5.0％离析酶 Macerozyme R10+1～3％果胶酶 Pectolyase。
上述方法中，步骤（3）中的酶解液pH优选5.7。
上述方法中，步骤（3）中的胚培苗酶解时间优选6 h；愈伤组织酶解时间优选4 h。
本发明还提供一种椰子内源的含有核定位信号的基因及应用。
本发明所述的椰子内源的含有核定位信号的基因CnGRF12如SEQ ID No.1所示的DNA序列。上述椰子CnGRF12基因表达序列来源于椰子（Cocos nucifera L.）。
本发明还提供了一种椰子融合蛋白表达载体，即含有所述的椰子CnGRF12基因。
具体的，所述融合蛋白表达载体为重组质粒pCnGRF12-mNeonGreen。
本发明还公开了一种克隆所述的CnGRF12基因的方法，包括如下步骤：
（1）提取椰子合子胚RNA并反转录合成cDNA。
（2）以公布的海南高种椰子基因组DNA为模板，设计如下含有可用于无缝克隆片段（下划线）CnGRF12序列的特异引物：
UBI-GRF12 F：
cagaaactaggccaccATGGCCGAGGAGCAAAACCC
GRF12-linker-Neon R：
TCCAGATCCTCCAGATCCAGAAGGTCCGGTTTTACAA
（3）使用KOD酶在20μl反应体系中进行PCR扩增；
（4）将扩增产物经琼脂糖电泳后根据目标条带大小切胶回收，即得含有843bp椰子CnGRF12基因DNA片段。
具体的，所述步骤（3）中，所述PCR扩增步骤的反应程序为：95℃预变性6min，95℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸5s，35个循环，72℃终延伸7min。
本发明还公开了一种构建所述的椰子融合蛋白转化载体的方法，包括如下步骤：
（a）用上述方法准备CnGRF12片段。
（b）设计如下含有可用于无缝克隆片段（下划线）UBQ启动子序列的特异引物：
p6-UBI F：
ACGACGGCCAGTGCCAAGCTgatagtttctgcagtgcagcg
UBI-GRF12 R：
CCATggtggcctagtttctgcagaagtaaca
（c）设计如下含有可用于无缝克隆片段（下划线）mNeonGreen荧光蛋白序列的特异引物：
GRF12-linker-Neon F：
GGATCTGGAGGATCTGGAatggtgagcaagggcgaggagg
Neon-p6 R：
GAGCTCGGTACCCGGGGATCttacttgtacagctcgtccatgcc
（d）用HindⅢ和BamHI双酶切pUN1301载体，回收12088bp载体骨架片段。
（e）采用无缝克隆方法将步骤（a）（b）（c）（d）中片段UBQ、CnGRF12、mNeonGreen、pUN1301连接获得含有椰子CnGRF12融合荧光蛋白的表达载体pCnGRF12-mNeonGreen。
将上述载体转化至大肠杆菌DH5α中扩繁获得高浓度质粒用于椰子原生质体亚细胞定位。
本发明首次在椰子中克隆获得含有核定位信号的椰子内源基因CnGRF12。
本发明首次将克隆的含有椰子内源核定位信号的基因CnGRF12连接mNeonGreen基因构成融合蛋白，通过瞬时转化椰子原生质体验证了该基因的亚细胞定位结果，为后续验证其它椰子目标基因的亚细胞定位结果提供一种快速有效的方法。
有益效果
本方法简单实用，分离材料易于获得；酶解方法简单，获得的原生质体数量多且活性高。本项技术将为在椰子原生质体中实现基因瞬时表达及蛋白的亚细胞定位重要技术支持。
附图说明
图1： pCnGRF12-mNeonGreen表达载体结构简图；
图2 ：pUBQ-NLS-mNeonGreen表达载体结构简图；
图3： 椰子愈伤组织分离原生质体；
图4： 椰子愈伤组织原生质体瞬时转化（GFP表达载体）；
图5： 椰子愈伤组织原生质体未转化对照；
图6： UBQ启动子驱动的GFP表达载体亚细胞定位结果；
图7 ：含有核定位信号的mNeonGreen荧光蛋白亚细胞定位结果；
图8 ：椰子CnGRF12-mNeonGreen融合蛋白亚细胞定位结果。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明作进一步详述，这些实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
实施例一
实验材料：椰子合子胚诱导的愈伤组织原生质体。
实施例中，酶解液的配方为：
将W5溶液、MMG溶液KOH调pH至5 .7，121℃灭菌20 min，4℃保存备用。
原生质体分离：
（1）取椰子合子胚诱导愈伤组织，在超净台内去除残留培养基，备用。
（2）将上述步骤中愈伤组织切成0.5-1 mm的细条备用。
（3）将步骤（2）中的愈伤组织细条转移至酶解液中、温度28℃、转速为60 rpm、黑暗条件下酶解6h，酶解液成分为：20mM MES+0.4M D-Mannitol+20mM KCl+10mM CaCl2·2H2O+0.10% BSA+7.5％纤维素酶 Cellulase R10+3.75％离析酶 Macerozyme R10+1％果胶酶Pectolyase，pH为5.7。（愈伤组织细胞壁较薄，酶解液中不添加果胶酶也可分离到质量较好的原生质体，酶解时间也可缩短至4-6小时。）
（4）用70μm孔径的无菌尼龙细胞筛过滤酶解液至新的50ml离心管中；用20ml的W5溶液冲洗剩余酶解物，过滤至同一50ml离心管中，150g离心5min，弃上清。
（5）用10 mL W5溶液洗涤，150 g离心2 min，弃上清。
（6）用1 mL W5重悬原生质体，将分离得到的愈伤组织原生质体进行镜检：原生质体圆润、饱满，没有不规则性状表明分离质量较好，吸取10ul用血球计数板置于光学显微镜下观察，根据不同计数板的计算方法统计原生质数量。
实施例2 椰子CnGFR12-mNeonGreen融合蛋白的载体构建
提取椰子合子胚RNA并反转录合成cDNA。
以公布的海南高种椰子基因组DNA为模板，设计如下含有可用于无缝克隆片段（下划线）CnGRF12序列的特异引物：
UBI-GRF12 F：
cagaaactaggccaccATGGCCGAGGAGCAAAACCC
GRF12-linker-Neon R：
TCCAGATCCTCCAGATCCAGAAGGTCCGGTTTTACAA
使用KOD酶在20μl反应体系中进行PCR扩增；
将扩增产物经琼脂糖电泳后根据目标条带大小切胶回收，即得含有843bp椰子CnGRF12基因DNA片段。
PCR扩增步骤的反应程序为：95℃预变性6min，95℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸5s，35个循环，72℃终延伸7min。
实施例3
本实施例提供一种构建所述的椰子融合蛋白转化载体的方法，包括如下步骤：
（a）用上述方法准备CnGRF12片段。
（b）设计如下含有可用于无缝克隆片段（下划线）UBQ启动子序列的特异引物：
p6-UBI F：
ACGACGGCCAGTGCCAAGCTgatagtttctgcagtgcagcg
UBI-GRF12 R：
CCATggtggcctagtttctgcagaagtaaca
（c）设计如下含有可用于无缝克隆片段（下划线）mNeonGreen荧光蛋白序列的特异引物：
GRF12-linker-Neon F：
GGATCTGGAGGATCTGGAatggtgagcaagggcgaggagg
Neon-p6 R：
GAGCTCGGTACCCGGGGATCttacttgtacagctcgtccatgcc
（d）用HindⅢ和BamHI双酶切pUN1301载体，回收12088bp载体骨架片段。
（e）采用无缝克隆方法将步骤（a）（b）（c）（d）中片段UBQ、CnGRF12、mNeonGreen、pUN1301连接获得含有椰子CnGRF12融合荧光蛋白的表达载体pCnGRF12-mNeonGreen，表达载体简图见附图1。
带有核定位信号荧光蛋白NLS-mNeonGreen的载体构建
（f）以含有UBQ启动子的质粒pUBQ-Ruby为模板，设计用于构建UBQ-NLS-mNeonGreen表达盒的特异引物，以克隆启动子片段：
p6-UBI F：
GAGCTCGGTACCCGGGGATCtgcagcgtgacccggtcgtg
UBI-NLS R：
ccatggtggcctgcagaagtaacaccaaacaacagg
使用KOD 酶（TOYOBO）在20μl反应体系中进行PCR扩增，具体反应程序为：95℃预变性6min，95℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸20s，35个循环，72℃终延伸7min。经琼脂糖电泳获取目标条带，回收后备用。
（g）以含有NLS核定位信号序列的质粒pYAO为模板，设计用于构建UBQ-NLS-mNeonGreen表达盒的特异引物，以克隆N端核定位信号片段：
UBI-NLS F：
acttctgcaggccaccatggactataaggaccac
NLS-mNeon R：
Tgctcaccatggctgctgggactccgtggata
使用KOD 酶（TOYOBO）在20μl反应体系中进行PCR扩增，具体反应程序为：95℃预变性6min，95℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸5s，35个循环，72℃终延伸7min。经琼脂糖电泳获取目标条带，回收后备用。
（h）以含有mNeonGreen基因的质粒为模板，设计用于构建UBQ-NLS-mNeonGreen表达盒的特异引物，以克隆荧光蛋白基因片段：
NLS-mNeon F：
cccagcagccatggtgagcaagggcgaggagg
mNeon-NLS R：
ccggccttttcttgtacagctcgtccatgcc
使用KOD 酶（TOYOBO）在20μl反应体系中进行PCR扩增，具体反应程序为：95℃预变性6min，95℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸10s，35个循环，72℃终延伸7min。经琼脂糖电泳获取目标条带，回收后备用。
（i）以含有NLS核定位信号序列的质粒pYAO为模板，设计用于构建UBQ-NLS-mNeonGreen表达盒的特异引物，以克隆C端核定位信号及终止子片段：
mNeon-NLS F：
Gctgtacaagaaaaggccggcggccacgaa
NLS-p6 R：
ACGACGGCCAGTGCCAAGCTactccccatgggaattcgta
使用KOD 酶（TOYOBO）在20μl反应体系中进行PCR扩增，具体反应程序为：95℃预变性6min，95℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸5s，35个循环，72℃终延伸7min。经琼脂糖电泳获取目标条带，回收后备用。
（j）用HindⅢ和BamHI双酶切pUN1301载体，回收12088bp载体骨架片段，经琼脂糖电泳获取目标条带，回收后备用。
（k）采用无缝克隆方法将制备好的片段（f）、（g）、（h）、（i）、（j）连接获得含有核定位信号NLS的表达载体pUBQ-NLS-mNeonGreen，载体表达结构见附图2。
将上述载体转化至大肠杆菌DH5α中扩繁获得高浓度质粒用于槟榔原生质体转化。
用椰子愈伤组织原生质体进行亚细胞定位，原生质体分离简要流程见图3。
以PEG4000为媒介，将带有35S驱动的绿色荧光蛋白GFP的质粒p6-mNeonGreen、pCnGRF12-mNeonGreen、pUBQ-NLS-mNeonGreen分别转化进入原生质体。转化体系如下：根据质粒浓度不同，调整质粒含量25 μg加入到圆底2ml离心管中，将100μL由MMG溶液溶解的原生质加入到含有质粒的试管中混匀，加入约125 μL浓度为40% 的PEG溶液，28℃放置10min，然后加入1.6ml的W5溶液以终止反应；150g离心2 min，去上清；再加入2 mL W5溶液悬浮原生质体，150g离心2 min，去上清以彻底去除PEG；再加入2 mL W5溶液悬浮原生质体，于28℃黑暗条件下平放培养16小时后，在荧光或激光共聚焦显微镜下观察。其中，强启动子35S驱动绿色荧光蛋白转化原生质体的大视野观察结果如图4；用于观察亚细胞定位结果的单个原生质体未转化对照结果如图5；强启动子UBQ驱动绿色荧光蛋白在原生质体内部都表达的结果如图6；带有核定位信号NLS的荧光蛋白定位在细胞核内的结果如图7；椰子CnGRF12-mNeonGreen融合蛋白的亚细胞定位结果是细胞核如图8。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种含有核定位信号的椰子基因CnGRF12，其特征在于，该基因的核酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.权利要求1所述的含有核定位信号的椰子基因CnGRF12在椰子原生质体亚细胞定位中的应用。
3.一种重组质粒pCnGRF12-mNeonGreen，其特征在于，含有所述的子基因CnGRF12。
4.一种含有mNeonGreen绿色荧光蛋白表达载体，其特征在于，该载体是通过将所述椰子基因CnGRF12与mNeonGreen基因连接后克隆至植物表达载体制备得到的融合蛋白表达载体p-CnGRF12-mNeonGreen。
5.根据权利要求4所述的含有mNeonGreen绿色荧光蛋白表达载体，其特征在于，植物表达载体为pUN1301。
6.一种克隆所述的CnGRF12基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）提取椰子合子胚RNA并反转录合成cDNA；
（2）以公布的海南高种椰子基因组DNA为模板，设计如下含有可用于无缝克隆片段（下划线）CnGRF12序列的特异引物：
UBI-GRF12 F：
cagaaactaggccaccATGGCCGAGGAGCAAAACCC
GRF12-linker-Neon R：
TCCAGATCCTCCAGATCCAGAAGGTCCGGTTTTACAA
（3）使用KOD酶在20μl反应体系中进行PCR扩增；
（4）将扩增产物经琼脂糖电泳后根据目标条带大小切胶回收，即得含有843bp椰子CnGRF12基因DNA片段。
7.一种构建含有mNeonGreen绿色荧光蛋白表达载体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（a）用权利要求6所述步骤准备CnGRF12片段；
（b）设计如下含有可用于无缝克隆片段（下划线）UBQ启动子序列的特异引物：
p6-UBI F：
ACGACGGCCAGTGCCAAGCTgatagtttctgcagtgcagcg
UBI-GRF12 R：
CCATggtggcctagtttctgcagaagtaaca
（c）设计如下含有可用于无缝克隆片段（下划线）mNeonGreen荧光蛋白序列的特异引物：
GRF12-linker-Neon F：
GGATCTGGAGGATCTGGAatggtgagcaagggcgaggagg
Neon-p6 R：
GAGCTCGGTACCCGGGGATCttacttgtacagctcgtccatgcc
（d）用HindⅢ和BamHI双酶切pUN1301载体，回收12088bp载体骨架片段；
（e）采用无缝克隆方法将步骤（a）（b）（c）（d）中片段UBQ、CnGRF12、mNeonGreen、pUN1301连接获得含有椰子CnGRF12融合荧光蛋白的表达载体pCnGRF12-mNeonGreen。
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| CN101855355A (zh) * | 2007-09-14 | 2010-10-06 | 巴斯夫植物科学有限公司 | 具有提高的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法 |
| US20150135362A1 (en) * | 2011-05-13 | 2015-05-14 | Monsanto Technology Llc | Plant regulatory elements and uses thereof |
-
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