CN118291285A - 一株用来发酵低甲醇高产香的苹果酒的酿酒酵母wfc-sc-071及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株用来发酵低甲醇高产香的苹果酒的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WFC‑SC‑071，已于2024年1月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.29597。本发明的酿酒酵母WFC‑SC‑071具有良好的发酵特性，糖利用率为91.6％。采用该菌株发酵的苹果酒中，甲醇产量低于200mg/L，挥发性化合物含量丰富，其中赋予苹果酒花香和果味的酯类含量为3146.89μg/L，是未发酵苹果汁的10倍。且在最佳条件下发酵生产苹果酒时，WFC‑SC‑071菌株表现出高的乙醇产量和糖利用率(0～48h)，苹果酒中高级醇含量约为商业菌株的2倍。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株用来发酵低甲醇高产香的苹果酒的酿酒酵母。
背景技术
随着我国人民消费水平的提高，苹果酒作为一种高品质的饮品逐渐备受欢迎。据统计，近年来苹果酒销售额年均增长超过15％，市场规模持续扩大。生产商家通过引入先进的酿造技术和精选上乘苹果，提高了苹果酒的品质水平。这种融合传统工艺和现代生活的趋势，使得苹果酒不仅是一种古老的饮品，更成为了契合时代潮流的文化体验。
我国苹果种植面积广阔，产量丰富，位居世界第一。然而，苹果加工产品单一，缺乏产业带动性。近年来，果酒产业迅速发展，果酒将成为酒类市场的生力军。因此，开发具有营养健康功能的苹果酒的前景非常可观。
苹果酒是一种以纯果汁为原料发酵的低度果酒，有一定的酒精度，还富含各种氨基酸、有机物、芳香物质及矿物质等在苹果中的主要营养物质。经常饮用苹果酒可以补充一定的营养物质，对人体健康有诸多益处。例如：苹果酒能够促进人体的新陈代谢，维持身体的酸碱平衡；还能活血通络，加快人体血液的流动，能够一定程度上缓解关节疼痛和腰腿疼痛。另外，苹果酒可以促进肠道蠕动，有减肥的功效。酿制苹果酒时，酵母菌种是一个非常重要的元素。菌株作为苹果酒的基础，决定了苹果酒的风味与质量。目前苹果酒行业主要问题在于缺乏专用菌株。另外，采用传统葡萄酒商业酵母发酵的苹果酒香气不足，影响消费者接受度。因此有一株具有潜力的苹果酒酵母是有必要的。
专利号CN106010868A开发了一种低醇苹果酒的制备方法，主要以鲜榨苹果汁为原料，通过在果汁中同时添加酿酒酵母和葡萄糖氧化酶酿造低醇苹果酒。专利号CN111876296A开发了一种酒花苹果酒的制备方法，主要是在苹果酒的酿造过程中分批加入酒花，可以使酒花和苹果酒充分混合，赋予苹果酒独特的酒花口味，使酒花与苹果酒完美结合。
目前，关于发酵苹果酒的菌株，还没有可以实现低甲醇高产香的菌株，公开号CN114717074A也只是开发了一种低糖的气泡苹果酒。苹果酒中甲醇含量是影响苹果酒质量的关键参数，其含量应严格控制在400mg/L以下。
发明内容
本发明的目的是克服现有发酵苹果酒存在的问题，提供一种用来发酵低甲醇高产香的苹果酒的酿酒酵母。
针对上述目的，本发明提供了一株用来发酵低甲醇高产香的苹果酒的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WFC-SC-071，已于2024年1月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.29597，其关键基因是ZNF1，ZNF1的核苷酸序列如下：
上述酿酒酵母WFC-SC-071的富集分离方法为：称取5g陕西西凤酒酒醅加入100mLYPD液体培养基中，于25～30℃、160～200r/min下培养24～30h。将富含酵母的培养液涂布在孟加拉红琼脂上，25～30℃下静置培养48h。挑选酵母单菌落，于孟加拉红琼脂平板上划线纯化，重复三次，获得酿酒酵母WFC-SC-071，于-80℃冻存。
本发明酿酒酵母WFC-SC-071菌落呈乳白色，一般为圆形或卵圆形，表面光滑且有光泽，边缘整齐。
本发明还提供了酿酒酵母WFC-SC-071在发酵生产苹果酒中的用途，具体使用方法包括如下步骤：
步骤1：制备苹果汁
挑选新鲜、成熟但不过熟，无农药残留的苹果，避免选择有瑕疵、腐烂或发霉的苹果。将挑选好的苹果清洗干净，去皮去核后切块，并将其浸泡在质量浓度为1‰的抗环血酸水溶液中，防止其氧化变色。将浸泡在抗环血酸水溶液中的苹果块捞出沥干，用榨汁机破碎获得苹果汁，煮沸20～40s杀菌。
2、平板活化
取冻存的酿酒酵母WFC-SC-071稀释涂布在YPD固体培养基平板上，将平板倒置于25～30℃培养箱中培养至长出菌落。
3、制备种子液
接步骤2平板上的一环菌于YPD液体培养基中，25～30℃培养24～30小时，然后于灭菌的离心管中，4℃下离心4～6分钟收集菌体，并用无菌水清洗。
4、发酵生产苹果酒
将步骤3清洗好的菌体接种于已杀菌的苹果汁中，置于25～30℃的恒温培养箱中进行发酵，发酵周期为5～10天。
上述步骤4中，优选已杀菌的苹果汁中菌体的接种量为105～107CFU/mL。
本发明的有益效果如下：
1、本发明酿酒酵母WFC-SC-071关键基因序列为ZNF1，ZNF1能激活参与葡萄糖代谢的关键基因。WFC-SC-071菌株发酵后的样本中ZNF1基因上调表达。ZNF1的上调表达加速了葡萄糖的消耗，并在高葡萄糖水平下增加了乙醇的产生。同时，ZNF1表达水平的提高激活了控制糖酵解最后步骤的丙酮酸激酶，导致丙酮酸积累。积累的丙酮酸激活丙酮酸脱羧酶和酒精脱氢酶，促进乙醇的生物合成。另外，ZNF1过表达菌株利用葡萄糖速度更快，导致生物量更高。总的来说，WFC-SC-071菌株中ZNF1的高度表达介导了糖酵解途径基因的上调表达，促进了乙醇和香气前体的生成。
2、本发明的酿酒酵母WFC-SC-071能够发酵甲醇含量更低、香气物质更丰富的苹果酒。苹果酒包含苹果与生物发酵所产生的双重营养成分，人体所需的氨基酸，以及苹果酒特有的果类酸；能够帮助人体代谢，维持平衡。苹果中还含有钙、镁等众多矿物质及微量元素氯，能帮助人体消化吸收，维持人的酸碱平衡，控制体内平衡。低甲醇高产香的苹果酒不仅能够保证苹果酒的纯正风味，同时也不会使得苹果中的营养物质被破坏。
3、本发明的酿酒酵母WFC-SC-071具有良好的发酵特性，糖利用率为91.6％，其发酵的苹果酒中，甲醇产量低于200mg/L，远低于国家标准(国标GB/T 15037-2006中规定甲醇含量≤400mg/L)，花香和果味的酯类含量为3146.89μg/L，是未发酵苹果汁的10倍。本发明低甲醇高产香的苹果酒，既推动了苹果酒的多样化，也潜在的满足了消费者需求差异，促进了苹果酒行业的发展。
附图说明
图1是酿酒酵母WFC-SC-071菌株的表观图和显微镜观察图。
图2是酿酒酵母和裂殖酵母组在发酵苹果酒过程中对糖的利用率。
图3是毕赤酵母组在发酵过程中对糖的利用率。
图4是8株酵母菌在发酵过程中对葡萄糖消耗率。
图5是8株酵母菌在发酵过程中甲醇的浓度。
图6是WFC-PK-045菌株在发酵过程中对乙醇耐受性。
图7是WFC-PB-047菌株在发酵过程中对乙醇耐受性。
图8是WFC-PB-051菌株在发酵过程中对乙醇耐受性。
图9是WFC-PB-054菌株在发酵过程中对乙醇耐受性。
图10是WFC-SP-048菌株在发酵过程中对乙醇耐受性。
图11是WFC-SC-014菌株在发酵过程中对乙醇耐受性。
图12是WFC-SC-071菌株在发酵过程中对乙醇耐受性。
图13是WFC-SC-072菌株在发酵过程中对乙醇耐受性。
图14是酿酒酵母和裂殖酵母组发酵苹果酒的感官描述性分析。
图15是毕赤酵母组发酵苹果酒的感官描述性分析。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
本实施例提供了一株用来发酵低甲醇高产香的苹果酒的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WFC-SC-071，已于2024年1月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.29597，其关键基因是ZNF1，ZNF1的核苷酸序列如下：
本实施例酿酒酵母WFC-SC-071的富集分离方法为：称取5g陕西西凤酒酒醅加入100mL YPD液体培养基(葡萄糖20g/L，酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，其余为水，在121℃下灭菌20分钟)中，于30℃、180r/min下培养24h。将富含酵母的培养液涂布在孟加拉红琼脂上，30℃下静置培养48h。挑选酵母单菌落，于孟加拉红琼脂平板上划线纯化，重复三次，获得酿酒酵母WFC-SC-071，并于-80℃冻存。
本实施例的酿酒酵母WFC-SC-071在YPD固体培养基(葡萄糖20g/L，酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，琼脂20g/L)上培养，菌落呈乳白色，显微镜下观察一般为圆形或卵圆形，表面光滑且有光泽，边缘整齐(如图1)。
实施例2
实施例1的酿酒酵母WFC-SC-071在发酵生产苹果酒中的应用，具体使用方法包括如下步骤：
步骤1：制备苹果汁
挑选新鲜、成熟但不过熟、无农药残留的苹果，将挑选好的苹果清洗干净，去皮去核后切块，并将其浸泡在质量浓度为1‰的抗环血酸水溶液中，防止其氧化变色；将浸泡在抗环血酸水溶液中的苹果块捞出沥干，用榨汁机破碎获得苹果汁，煮沸30s杀菌。
步骤2：平板活化
取冻存的酿酒酵母WFC-SC-071稀释涂布在YPD固体培养基平板上，将平板倒置于30℃培养箱中培养至长出菌落。
步骤3：制备种子液
接步骤2平板上的一环菌于50mL YPD液体培养基中，30℃、180r/min培养24h，然后于灭菌的离心管中，4℃、5000×g下离心5min收集菌体，并用无菌水清洗两次。
步骤4：发酵生产苹果酒
将步骤3清洗好的菌体接种于200mL已杀菌的苹果汁中，接种量为107CFU/mL，置于25℃的恒温培养箱中进行发酵，发酵周期为7天。
实施例3
在实施例2的步骤4中，将步骤3清洗好的菌体接种于200mL已杀菌的苹果汁中，接种量为107CFU/mL，置于30℃的恒温培养箱中进行发酵，发酵周期为5天。
实施例4
在实施例2的步骤4中，将步骤3清洗好的菌体接种于200mL已杀菌的苹果汁中，接种量为107CFU/mL，置于30℃的恒温培养箱中进行发酵，发酵周期为7天。
实施例5
在实施例2的步骤4中，将步骤3清洗好的菌体接种于200mL已杀菌的苹果汁中，接种量为107CFU/mL，置于30℃的恒温培养箱中进行发酵，发酵周期为10天。
为了获取本发明的酿酒酵母WFC-SC-071菌株，发明人进行了大量的实验室研究实验，具体实验如下：
将苹果在体积浓度为75％的乙醇水溶液中浸泡5min后，用无菌水冲洗2次，再在质量浓度为2％的次氯酸钠水溶液中浸泡5min，用无菌水洗涤4次，切成1cm3的正方块，得到苹果块。将5g苹果块和5g贵州茅台酒酒醅、5g陕西西凤酒酒醅分别加入100mL YPD液体培养基中，30℃、180r/min下培养24h。然后将获得的富含酵母的培养液涂布在孟加拉红琼脂上，30℃下静置培养48h。挑选酵母单菌落，于孟加拉红琼脂平板上划线纯化，重复2次。对纯化后的菌株进行编号，并于-80℃冻存，用于后续实验。
取冻存的酿酒酵母WFC-SC-071稀释涂布在YPD固体培养基平板上，将平板倒置于30℃培养箱中培养至长出菌落；接平板上的一环菌于50mL YPD液体培养基中，30℃、180r/min培养24h，然后于灭菌的离心管中，4℃、5000×g下离心5min收集菌体，并用无菌水清洗两次；然后将清洗好的菌体接种于200mL已杀菌的苹果汁中，接种量为107CFU/mL，置于25℃的恒温培养箱中进行发酵，发酵周期为7天，获得苹果酒。
招募志愿者对上述不同菌株发酵获得的苹果酒进行简单的感官测评并评分(1-10分)，去掉得分低的菌株。具体的评分表见表1。
表1评分指南
| 分数(0-10) | 甜度 | 酸度 | 香气 | 颜色 |
| 7-10 | 适宜 | 适宜 | 愉悦的 | 浅黄色 |
| 4-6 | 很甜 | 很酸 | 和谐的 | 黄褐色 |
| 1-3 | 非常甜 | 非常酸 | 酸臭味 | 褐黑色 |
从苹果果实、贵州茅台和陕西西凤酒醅中共富集分离得到了75株酵母(见表2)。根据感官评价的结果，选择了其中发酵的苹果酒香气协调、颜色适宜、质地均匀的编号为14、45、47、48、51、54、71、72的8株评分高的酵母菌株用于后续的鉴定与评价。
表2酿造的苹果酒的感官评价表
8株酵母通过28S rRNA进行鉴定，可以分为三组。第1组是编号为45、47、51、54的菌株，其与毕赤酵母亲缘关系密切，依次命名为WFC-PK-045、WFC-PB-047、WFC-PB-051和WFC-PB-054；第2组是编号为48的菌株，其与裂殖酵母亲缘关系密切，命名为WFC-SP-048；第3组是编号为14、71、72的菌株，其与酿酒酵母亲缘关系密切，依次命名为WFC-SC-014、WFC-SC-071和WFC-SC-072。其中，菌株WFC-PK-045、WFC-PB-047、WFC-SP-048和WFC-PB-051来自贵州茅台酒酒醅；菌株WFC-PB-054、WFC-SC-071和WFC-SC-072来自陕西西凤酒酒醅；菌株WFC-SC-014来自苹果。
进一步通过测定上述8株酵母的糖利用率、发酵苹果酒的甲醇产量、乙醇耐受性以及菌株的产香特性。比较菌株之间的差异，筛选各方面性能更好的菌株。具体试验和结果如下：
1、糖利用率
采用苯酚-硫酸法测定苹果酒的总糖含量；用1mL超纯水稀释100μL苹果汁，与1mL5％苯酚和5mL浓硫酸混合，于35℃水浴中静置30min；使用紫外-可见分光光度计在490nm波长下测量其吸光度；葡萄糖标准溶液作为参考溶液，标准线性方程为y＝0.0061x-0.0073，r2＝0.998。
综合图2、3、4的实验结果可见，来自陕西西凤酒酒醅的菌株WFC-SC-071和商业酵母菌株(Control)在最佳条件下发酵生产苹果酒时，WFC-SC-071菌株在0～48小时内表现出很高的糖利用率。
2、甲醇产量
蒸馏苹果酒，收集挥发性成分，过0.25μm滤膜，取1μL滤液注入GC-MS-FID，MS柱温箱起始温度设置为40℃，保持3min，以5℃/min的速率增加到100℃，再以20℃/min增加到200℃，并保持5min。FID温度设置为250℃。载气氨气的柱流速为1mL/min。每个样品重复测量三次。根据保留时间定性，通过外标法进行定量。
通过图5的实验结果可见，菌株WFC-SC-071和商业酵母菌株(Control)在最佳条件下发酵生产苹果酒时，WFC-SC-071菌株的甲醇产量低于200mg/L。
3、乙醇耐受性
在YPD肉汤培养基中分别加入0％(对照)、4％、8％、12％、16％和20％(v/v)的乙醇，将100μL含有1×106个细胞/mL的悬浮液加入到1mL上述YPD肉汤培养基中，并装入深96孔板培养。用酶标仪每8h测量一次YPD肉汤在600nm处吸光度值，无酵母YPD肉汤为空白对照。
如图6～13所示，菌株WFC-SC-014、WFC-SC-071、WFC-SC-072、WFC-PK-045、WFC-PB-047、WFC-SP-048、WFC-PB-051和WFC-PB-054在0％、4％、8％、12％、16％和20％(v/v)的乙醇存在下细胞的生长情况有所不同。除WFC-PK-045外，大多数毕赤酵母在12％的乙醇存在下仍能维持细胞生长，表明它们对乙醇具有一定的耐受性。所有酿酒酵母都能在12％的乙醇存在下维持细胞生长。
4、菌株产香特性评价
(1)定量描述性分析
10～16名(男女各半)评价人员提前接受苹果酒香气培训，熟悉苹果酒的八种香气属性：酸、甜、果味、酒精味、辛辣味、光滑感、干燥和稠密；取5mL苹果酒于20mL无菌杯中，随机数字标记，用0～9(0＝无，9＝非常强)评分。室温下对每个样品进行评价，并将每个香气属性的结果取平均值绘制雷达图。
采用定量描述性分析(QDA)对不同酵母发酵生产的苹果酒的香气特征进行了评价(见图14～15)。酸、甜、果味、酒精味、辛辣味、光滑感、干燥和稠密八种香气属性是苹果酒气味属性的代表。最小显著差异法(LSD)分析显示，“稠密”、“酸”、“辛辣味”和“果味”属性在酿酒酵母和裂殖酵母组差异显著，毕赤酵母组间“果味”属性也差异显著(P<0.05)。菌株WFC-SC-071、WFC-SC-072和WFC-PB-047发酵的苹果酒具有相似的香气轮廓，果味和酒精味得分较高，赋予苹果良好的香气特征。
(2)HS-SPME-GC-MS分析挥发性组分
取5mL苹果酒、2g氯化钠、10μL 3-辛醇(10mg/L，内标)和1个转子置于20mL顶空瓶中混匀，置于70℃的磁力搅拌器中平衡30min；吸附纤维插入样品顶空(液体表面上方约1cm)，吸附30min；注入GC进样口解吸3min，色谱分离采用DB-Wax柱；载气氦气的柱流速为1.5mL/min；质谱电子能为40Ev，质量扫描范围为m/z为30～450；柱温箱初始温度为40℃，保持6min，以4℃/min的速率增加到100℃，然后以10℃/min的速率增加到230℃。
香气和风味决定了苹果酒的质量。苹果酒中的香气化合物主要包括酯类、醇类、脂肪酸、乙酰、类萜烯类和其他微量成分。经酵母菌发酵后，苹果酒的香气轮廓得到了显著改善。结果见表3、表4和表5。
以中国名酒贵州茅台酒酒醅、陕西西凤酒酒醅以及成熟苹果果实为分离源，以期获得发酵性能优良，产香丰富的优势苹果酒酵母。WFC-SC-071菌株和商业酵母菌株(Control)发酵的苹果酒的香气化合物组成也有显著差异，WFC-SC-071菌株发酵的苹果酒中高级醇含量约为商业菌株的2倍。
表3 8株酵母发酵苹果酒中的酯类化合物
表4 8株酵母发酵苹果酒中的醇类化合物
表5 8株酵母发酵苹果酒中的酸类化合物
综合上述实验结果可见，从中国名酒贵州茅台酒酒醅、陕西西凤酒酒醅及苹果果实里分离到75株菌株，经感官分析，留下了8株评分高的菌株；综合分析这8株菌株发酵苹果酒的发酵特性与产香特性，菌株WFC-SC-071呈现出糖利用、耐受性以及产香性能都比较理想。因此，菌株WFC-SC-071可作为具有潜力的苹果酒发酵菌剂。
Claims (4)
1.一株用来发酵低甲醇高产香的苹果酒的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WFC-SC-071，已于2024年1月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCCNO.29597，其关键基因的核苷酸序列如下：
2.权利要求1所述的酿酒酵母WFC-SC-071在发酵生产苹果酒中的应用。
3.根据权利要求2所述的酿酒酵母WFC-SC-071在发酵生产苹果酒中的用途，其特征在于，具体使用方法包括如下步骤：
步骤1：制备苹果汁
挑选新鲜、成熟但不过熟、无农药残留的苹果，将挑选好的苹果清洗干净，去皮去核后切块，并将其浸泡在质量浓度为1‰的抗环血酸水溶液中，防止其氧化变色；将浸泡在抗环血酸水溶液中的苹果块捞出沥干，用榨汁机破碎获得苹果汁，煮沸20～40秒杀菌；
步骤2：平板活化
取冻存的酿酒酵母WFC-SC-071稀释涂布在YPD固体培养基平板上，将平板倒置于25～30℃培养箱中培养至长出菌落；
步骤3：制备种子液
接步骤2平板上的一环菌于YPD液体培养基中，25～30℃培养24～30小时，然后于灭菌的离心管中，4℃下离心4～6分钟收集菌体，并用无菌水清洗；
步骤4：发酵生产苹果酒
将步骤3清洗好的菌体接种于已杀菌的苹果汁中，在25～30℃下发酵5～10天，得到苹果酒。
4.根据权利要求3所述的酿酒酵母WFC-SC-071在发酵生产苹果酒中的用途，其特征在于，步骤4中，已杀菌的苹果汁中菌体的接种量为105～107CFU/mL。
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