CN118290413A

CN118290413A - 用于人血清白蛋白检测的近红外荧光探针及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN118290413A
Application number: CN202410462744.9A
Authority: CN
Inventors: 马素芳; 石浩翔; 刘�文; 张承武; 张怀萍; 万品妤; 李灵玉
Original assignee: Shanxi Medical University
Current assignee: Shanxi Medical University
Priority date: 2024-04-17
Filing date: 2024-04-17
Publication date: 2024-07-05
Anticipated expiration: 2044-04-17
Also published as: CN118290413B

Abstract

本发明公开了用于人血清白蛋白检测的近红外荧光探针，该探针能够实现对人血清白蛋白的高选择性和高灵敏检测，具有较好的抗光漂白性能、生物组织穿透力强、受生物背景干扰小，检测条件温和。本发明还公开了该探针的制备方法及应用，合成过程简单。该探针可用于体外溶液体系或细胞中人血清白蛋白的特异性检测，该探针的最佳激发波长和最佳发射波长分别为646nm和750nm，均属于近红外光区，且斯托克位移值大，具有较好的应用前景。

Description

用于人血清白蛋白检测的近红外荧光探针及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及化学生物材料技术领域，具体涉及用于人血清白蛋白检测的近红外荧光探针及其制备方法与应用。

背景技术

人血清白蛋白(HSA)，作为人血浆中含量最丰富的蛋白质，占血浆总蛋白质含量的50％～60％。HSA主要在肝脏中合成，是体内非常重要的营养物质之一，其在人体内发挥着非常重要的生理功能。HSA需要维持正常浓度以维持正常血浆渗透压，保证细胞外液、内液和组织液的交换，维持血浆正常的运转功能。此外，HSA对免疫球蛋白具有保护和稳定作用。

正常人血浆中HSA含量约为35-50g/L，HSA水平异常可作为某些疾病的早期体征，是血液常规检查的重要指标之一。高异常水平的HSA可增加血液粘度，引起心血管疾病、高血压、糖尿病、肾脏疾病等。在肝功能衰竭、肝硬化和慢性肝炎的患者中，血浆中HSA的浓度过低。由此可见，HSA的表达水平可以作为健康评估的重要指标之一，实时检测HSA的相对含量对相关疾病的检测、预防和术后干预具有重要意义。

目前，已经开发了各种分析方法用于检测血液、尿液和细胞提取物此外，中的HSA，包括蛋白质组学技术、免疫分析法、电化学方法和荧光探针法等。其中蛋白质组学技术、放射免疫分析法操作困难，设备复杂昂贵，无法快速提供实时检测结果。溴甲酚绿、溴甲酚紫、和白蛋白蓝580等染料结合HSA方法在临床上应用最为广泛。然而，上述操作繁琐，受外源性物质干扰大，导致检测误差大。而荧光探针法因其操作简便、灵敏度高、响应速度快、生物相容性良好等优点受到学者广泛关注。研究表明，荧光探针分子通过光色和荧光强度的变化，可有效用于复杂生物微环境中生物标志物的分析和实时成像监测，对深入探究微观世界分子间作用机制提供可能。迄今为止，已报道的用于检测HSA的荧光探针大多数灵敏度较低，且发射波长短，成像中受生物背景干扰大，且对生物组织损伤大，不适用于生物体内HSA的实时检测。因此，开发具有高灵敏度和选择性以监测复杂细胞环境中的HSA水平的荧光探针是很有必要的。

综上，构建一种灵敏度高、选择性强的近红外荧光探针是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供用于人血清白蛋白检测的近红外荧光探针，该探针能够实现对人血清白蛋白的高选择性和高灵敏检测，具有较好的抗光漂白性能、生物组织穿透力强、受生物背景干扰小，检测条件温和。

本发明还有另外一个目的是提供一种制备用于人血清白蛋白检测的近红外荧光探针的方法，其从可得的原料出发，通过一步反应实现新型近红外荧光探针的合成，合成过程简单。

本发明还有另外一个目的是提供该探针在体外溶液体系或细胞中人血清白蛋白的特异性检测的应用，该探针的最佳激发波长为和最佳发射波长分别为646nm和750nm，均属于近红外光区，且斯托克位移值大，具有较好的应用前景。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种用于人血清白蛋白检测的近红外荧光探针，其具有如下式(I)的结构：

本发明的目的还可以进一步由香草酸衍生物的制备方法来实现，该制备方法以如下式(II)和(III)化合物为原料，溶于有机溶剂中，反应、旋除溶剂、柱层析得到化合物(I)

优选的是，其中，有机溶剂为无水乙醇。

优选的是，其中，反应条件为：回流反应，反应时间为3～6h。

优选的是，其中，柱层析所用洗脱剂为二氯甲烷和甲醇。

优选的是，其中，反应时间为4h。

优选的是，其中，二氯甲烷和甲醇的体积比为50:1。

本发明的目的还可以进一步由近红外荧光探针在人血清白蛋白检测中的应用。

优选的是，其中，所述近红外荧光探针在溶液体系或细胞中人血清白蛋白的特异性检测。

优选的是，其中，所述近红外荧光探针与人血清白蛋白结合后的激发波长和发射波长分别为646nm和750nm。

本发明至少包括以下有益效果：

1、本发明的用于人血清白蛋白检测的近红外荧光探针能够实现对人血清白蛋白的高选择性和高灵敏检测，具有较好的抗光漂白性能、生物组织穿透力强、受生物背景干扰小，检测条件温和。

2、本发明的用于人血清白蛋白检测的近红外荧光探针的制备方法从可得的原料出发，通过一步反应实现新型近红外荧光探针的合成，合成过程简单。

3、本发明的探针可用于在体外溶液体系或细胞中人血清白蛋白的特异性检测，该探针的最佳激发波长为和最佳发射波长分别为646nm和750nm，均属于近红外光区，且斯托克位移值大，具有较好的应用前景。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明实施例1中化合物S1的¹H NMR谱图；

图2为本发明实施例1中化合物S1的¹³C NMR谱图；

图3为本发明实施例1中探针S1的HRMS谱图；

图4中(A)为本发明实施例1中探针S1与HSA作用前后的紫外-可见吸收光谱，(B)为探针S1与HSA作用前后的荧光光谱；

图5为本发明实施例1中探针S1与HSA作用前后受pH影响图；

图6为本发明实施例1中与不同浓度HSA作用后荧光随时间变化图；

图7中(A)为本发明实施例1中探针S1与不同浓度HSA作用后荧光变化图，(B)为本发明实施例1中探针S1与低浓度HAS的线性关系图；

图8为本发明实施例1中探针S1与不同干扰物作用后荧光变化图；

图9为本发明实施例1中探针S1的细胞成像图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

主要设备：紫外-可见分光光度计(UH-5300，日本日立公司)，荧光光谱仪(F-4700，日本日立公司)，循环水式真空泵(SHZ-D(Ⅲ)，上海勒顿实业公司)，电子天平(CP214，常州奥豪斯仪器)，恒温加热磁力搅拌器(DF-101S，杭州瑞佳精密科学仪器)，旋转蒸发器(RE-2000B，杭州瑞佳精密科学仪器)，循环冷却器(DL-400CE，郑州长城科工贸)，激光共聚焦显微镜(FV-3000，日本奥林巴斯)，实验室pH计(STARTER3100，常州奥豪斯仪器)。

主要化学试剂：二氯甲烷(CH₂Cl₂)(A.R.，天津市大茂化学试剂厂)，甲醇(A.R.，天津市大茂化学试剂厂)，二甲基亚砜(DMSO)(A.R.，天津市登峰化学试剂厂)，人血清白蛋白(HSA)(纯度：99.9％，Sigma(美国))，无水乙醇(A.R.，天津市致远化学试剂)，DMEM培养液(Solarbio(北京))，胎牛血清(FBS)(武汉普诺赛生命科技有限公司)，氢氧化钠(A.R.，天津市大茂化学试剂厂)。

实施例1

一种用于人血清白蛋白检测的近红外荧光探针，其具有如下式的结构：

具体合成路线如下：

具体合成步骤如下：

化合物1(3-乙基-1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-碘化铵，式(II)化合物)的合成步骤：向1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚(6.3g，30.0mmol)的乙腈(50mL)溶液中加入碘乙烷(9.6mL，120.0mmol)，反应液回流18小时。将反应液冷却至室温，旋蒸除去溶剂，再加入100mL乙酸乙酯，将析出的固体过滤并用乙酸乙酯洗涤，得到化合物8.76g，收率为80％。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ8.39(d,J＝8.3Hz,1H),8.33(d,J＝8.9Hz,1H),8.24(q,J＝8.0Hz,2H),7.82–7.78(m,1H),7.75–7.71(m,1H),4.69(q,J＝7.2Hz,2H),2.99(s,3H),1.78(s,6H),1.55(t,J＝7.2Hz,3H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ205.2,196.4,138.6,137.5,133.5,131.2,130.2,128.9,127.7,127.7,123.9,113.7,55.9,43.9,22.0,14.4,13.4.HR-MS：计算值C₁₇H₂₀N⁺，238.1596，测试结果为238.1629[M]⁺.

化合物2(5-(4-二乙氨基)苯基)噻吩-2-甲醛，式(III)化合物)的合成步骤：将4-溴-N,N-二乙基苯胺(359mg，1.58mmol)、Pd(PPh₃)₄(150mg，0.13mmol)、5-甲酰基-2-噻吩硼酸(200mg，1.28mmol)和碳酸钾(2M)水溶液(2.0mL)加入反应瓶中，加入甲苯(10.0mL)溶解原料。氮气保护下，反应液回流反应5小时。将反应液冷却至室温，用水(3×20mL)洗涤有机相，收集有机层用无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂，粗产品经硅胶层析纯化(二氯甲烷：石油醚(v:v)＝1:2)，得到化合物2为黄色固体(225mg，产率68％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ9.77(s,1H),7.90(d,J＝4.0Hz,1H),7.56(d,J＝8.0Hz,2H),7.44(d,J＝4.0Hz,1H),6.69(d,J＝8.0Hz,2H),3.38(d,J＝8.0Hz,4H),1.09(t,J＝8.0Hz,6H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ183.6,155.4,148.9,140.3,139.5,128.1,122.3,119.4,112.0,44.2,12.9.HR-MS：计算值C₁₅H₁₇NOS，260.1109，测试结果为260.1100[M+H]⁺.

荧光探针S1((E)-2(2-(5(4-二乙氨基)苯基)噻吩-2-烯基)-3-乙基-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-碘化铵)的合成步骤：将化合物1(200mg，0.55mmol)和化合物2(142mg，0.55mmol)溶于无水乙醇(15mL)，回流反应4小时。将反应液冷却至室温，旋蒸除去溶剂。粗产品经柱色谱(二氯甲烷:甲醇(v:v)＝50:1)分离得到深蓝色固体S1(用于人血清白蛋白检测的近红外荧光探针式(I)化合物)(116mg,产率35.0％)。

其中，化合物1的合成参考文献：Linjun Tang,Shubham Sharma and ShyamS.Pandey.Synthesis and Characterization of Newly Designed and HighlySolvatochromic Double Squaraine Dye for Sensitive and Selective Recognitiontowards Cu²⁺.Molecules.2022,27,6578-6594.https://doi.org/10.3390/molecules27196578.

化合物2的合成参考文献：Wei Fu,Chenxu Yan,Zhiqian Guo,Jingjing Zhang,Haiyan Zhang,He Tian,and Wei-Hong Zhu.Rational Design of Near-Infrared AIE-Active Probes:In Situ Mapping of Amyloid-#Plaques with Ultra-Sensitivity andHigh-Fidelity.J.Am.Chem.Soc.,2019.http://pubs.acs.org on January 11,2019.

化合物S1的¹H NMR谱如图1所示，¹H NMR(400MHz,CDCl₃+CD₃OD)δ8.49(d,J＝15.2Hz,1H),8.20(d,J＝8.4Hz,1H),8.08(d,J＝8.8Hz,1H),8.01(d,J＝8.0Hz,1H),7.83(d,J＝8.0Hz,1H),7.69-7.67(m,2H),7.66-7.55(m,3H),7.40(d,J＝4.4Hz,1H),6.82-6.68(m,3H),4.55(q,J＝7.2Hz,2H),3.42(q,J＝7.2Hz,4H),2.01(s,6H),1.58(t,J＝7.2Hz,3H),1.17(t,J＝6.8Hz,6H).

化合物S1的¹³C NMR谱如图2所示，¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ180.2,157.6,149.4,145.4,138.7,137.7,137.1,133.2,131.4,130.5,128.7,128.5,127.4,127.1,124.1,123.4,119.3,113.2,112.1,107.1.

化合物S1的HRMS谱如图3所示,计算为C₃₂H₃₅N₂S⁺，479.2512，测试结果为479.2527[M]⁺.

实施例2

实施例1制备的荧光探针S1对人血清白蛋白(HSA)的响应性：

将实施例1制备的荧光探针S1配制成DMSO母液(2mM)，取荧光探针S1母液10μL，加入HSA的PBS溶液(20mg/mL)300μL，用PBS稀释至待测液(2mL，S1探针浓度10μM，HSA浓度3mg/mL)，进行紫外-可见吸收光谱和荧光光谱测定。测定结果如图4所示，结果显示：探针本身的吸收峰位于720nm，且荧光强度很弱；当其与HSA结合后，吸收峰发生蓝移，同时探针位于750nm处的荧光强度明显增强，证明探针对HSA具有较好的响应性。

实施例3

实施例1制备的荧光探针S1的pH稳定性：

将实施例2制备的荧光探针S1母液(2mM)10μL与HAS的PBS溶液(20mg/mL)300μL混合后，分别用不同pH(4.0，5.0，6.0，7.0，7.4，8.0，9.0，10.0)的PBS稀释至待测液(2mL)，其中，S1探针浓度10μM，HSA浓度3mg/mL。分别对上述样品的荧光光谱进行测定，根据其在750nm处的荧光强度变化，评估不同pH环境对其荧光强度的影响，结果如图5所示。结果显示：在pH为4-10范围内，探针与HSA结合前后溶液的荧光强度几乎不受pH环境的影响，说明该探针具有较好的pH稳定性。

实施例4

实施例1制备的荧光探针S1响应HSA的时间依赖性：

将实施例2制备的荧光探针S1母液(2mM)10μL，分别加入含HSA的PBS溶液(20mg/mL)0、100、200、300μL，用PBS(pH＝7.4)将荧光探针S1定容至10μM，其中，HSA浓度分别定容为(0，1，2，3mg/mL)，立即测定其在750nm处的荧光发射光谱，并每隔20s测一次。结果如图6所示，结果显示：荧光探针S1与HSA响应速度非常快，在5s之内荧光强度达到最大值，而且随着时间的延长，荧光强度几乎未发生改变，说明该探针能够快速响应HSA，且具有较好的稳定性。

实施例5

将实施例2制备的荧光探针S1母液(2mM)10μL，分别加入HSA的PBS溶液(20mg/mL)0、2、4、6、8、10，12μL，用PBS(pH＝7.4)将荧光探针S1定容至10μM，其中，HSA浓度分别为(0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2mg/mL)，测定其在750nm处的荧光发射光谱。结果如图7所示，结果显示：随着HSA浓度的增加，荧光探针S1的荧光强度逐渐增加，表明荧光探针S1能够较好的响应HSA。而且在HSA较小浓度下，荧光探针S1相应HSA表现出较好的线性关系，HSA的检测极限为76ng/mL。

实施例6

荧光探针S1对不同活性物质的选择性：

将实施例2制备的荧光探针S1母液(2mM)10μL，分别加入含下列物质的溶液Ca²⁺，Fe³⁺，Mg²⁺，Zn²⁺，Cu²⁺，Cl^-，AcO^-，HCO₃ ^-，ClO^-，HSO₃ ^-，SO₃ ^2-，NO₂ ^-，NO₃ ^-，Cys，GSH，Hcy，H₂O₂，NO，¹O₂，.OH，Glu，Met，Pro，BSA，HSA(其中Cys定容至1mM，GSH定容至2mM，Hcy定容至100μM，其余离子或氨基酸均定容至200μM)，其中，荧光探针S1定容至10μM，定容所用溶剂为PBS(pH＝7.4)。测定其在750nm处的荧光发射光谱。根据其荧光强度，评估不同物质对荧光探针荧光强度的影响。结果如图8所示，其中，1.空白对照，2.Ca²⁺，3.Fe³⁺，4.Mg²⁺，5.Zn²⁺，6.Cu²⁺，7.Cl^-，8.AcO^-，9.HCO₃ ^-，10.ClO^-，11.HSO₃ ^-，12.SO₃ ^2-，13.NO₂ ^-，14.NO₃ ^-，15.Cys，16.GSH，17.H₂O₂,18.NO,19.¹O₂，20..OH，21.Glu，22.Met，23.Pro，24.Tyr，25.HAS。结果显示：本发明的荧光探针S1在750nm处对其他活性物质几乎不响应，只对HSA相应，证明探针对HSA具有高的灵敏度和选择性。

实施例7

荧光探针S1用于检测外源性HSA的细胞成像：

将BV2细胞接种至共聚焦培养皿中，待其贴壁后。将探针分成2组，一组加入含有探针的DMEM溶液(10％胎牛血清+1％双抗+89％基础培养基)，37℃共孵育30min；另一组加入含有探针的DMEM溶液，37℃共孵育30min后，再加入含有HSA(5mg/mL)的DMEM溶液继续共孵育1h。孵育结束后，将原有培养液吸出，PBS洗涤3次，并用多聚甲醛(4％)固定15min，使用激光共聚焦荧光显微镜进行成像。实验结果如图9所示，结果显示：只用荧光探针S1溶液孵育的细胞荧光很弱，而加入HSA后，荧光明显增强，证明该荧光探针S1可用于实时检测外源性的HSA。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims

1.一种用于人血清白蛋白检测的近红外荧光探针，其具有如下式(I)的结构：

2.一种如权利要求1所述的用于人血清白蛋白检测的近红外荧光探针的制备方法，其以如下式(II)和(III)化合物为原料，溶于有机溶剂中，反应、旋除溶剂、柱层析得到化合物(I)

3.如权利要求2所述的制备方法，其中，有机溶剂为无水乙醇。

4.如权利要求2所述的制备方法，其中，反应条件为：回流反应，反应时间为3～6h。

5.如权利要求2所述的制备方法，其中，柱层析所用洗脱剂为二氯甲烷和甲醇。

6.如权利要求4所述的制备方法，其中，反应时间为4h。

7.如权利要求5所述的制备方法，其中，二氯甲烷和甲醇的体积比为50:1。

8.如权利要求1所述的近红外荧光探针在人血清白蛋白检测中的应用。

9.如权利要求8的应用，其中，所述近红外荧光探针在溶液体系或细胞中人血清白蛋白的特异性检测。

10.如权利要求8的应用，其中，所述近红外荧光探针与人血清白蛋白结合后的激发波长和发射波长分别为646nm和750nm。