CN118275703A - 检测抗淋巴细胞激活基因3抗体药物中和抗体的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及抗药性中和抗体分析。具体地，本申请涉及用于检测生物样品中抗淋巴细胞激活基因3(LAG‑3)抗体药物中和抗体的方法。
Description
技术领域
本申请属于生物化学领域，主要涉及用于检测抗淋巴细胞激活基因3 (LAG-3)抗体药物中和抗体的方法。
背景技术
淋巴细胞激活基因3 (Lymphocyte activation gene 3，LAG-3)已被证明在多种类型的细胞中表达，LAG-3分子可负向调节T细胞，在维持机体免疫系统稳态和促进肿瘤免疫逃逸方面扮演重要角色，LAG-3作为“免疫治疗2.0”中的热门靶点，已成为国内外药企研发的重要靶点。
对于LAG-3类药物中和活性抗体检测中，通常会面临两个挑战：靶点分子(LAG-3)的干扰和药物耐受性。LAG-3在多种实体瘤的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中高表达，且给药后，药物会与血液中可溶性的LAG-3结合，导致血液中游离的LAG-3水平迅速降低，进而引发内在负反馈机制导致LAG-3分泌增多，在中和活性抗体检测时，酸解会使样品中药物与靶点复合物打开，样品中出现较高水平的游离的LAG-3，而游离的游离的LAG-3会与反应体系中的药物结合，检测中易出现假阳性信号；同时待测样本中的残留药物可能与抗药抗体结合，从而使检测到的抗体含量降低，分析方法中可通过多种方法降低药物的干扰，但由于反应体系为中和活性抗体与靶蛋白LAG-3竞争性结合药物，一定水平的游离药物即会结合体系中的中和活性抗体，检测中易出现假阴性信号。
目前针对LAG-3靶点中和活性抗体分析方法面临的靶点干扰和耐药性问题，该类项目的免疫原性结果可能会出现由于靶点干扰引起的假阳性，同时也可能会出现由于药物耐受不够引起的假阴性，严重影响人们对现有结果的解读，无法为安全性及有效性评价提供数据支持。现有解决上述问题的技术方法一般用针对LAG-3的抗体去进行去干扰，使用酸解离、亲和免疫耗竭等去除药物干扰，但两者同时进行在一定程度上相互影响，很难在一个反应体系中同时满足既能去除靶点干扰又能去除药物干扰，还能满足方法灵敏度不受影响。
因此，开发新的用于检测抗淋巴细胞激活基因3 (LAG-3)抗体药物中和抗体的方法具有重要的意义。
发明内容
本申请提供了检测生物样品中抗淋巴细胞激活基因3 (LAG-3)抗体药物中和抗体的方法，所述方法包括：
(1) 使用包含生物素标记的LAG-3抗体药物的捕获试剂对所述生物样品中的抗LAG-3抗体药物中和抗体进行捕获；
(2) 对步骤(1)获得的捕获样品使用浓度为300mM，pH 2.0的醋酸进行酸解离；
(3) 使用特异性结合LAG-3的去干扰抗体对步骤(2)获得的酸解离样品进行去除LAG-3处理，其中所述特异性结合LAG-3的去干扰抗体与所述LAG-3抗体药物结合LAG-3的不同表位；
(4) 向步骤(3)获得的样品中加入包含带有可检测标记的LAG-3抗体药物的检测试剂，获得混合液；
(5) 将步骤(4)获得的混合液加入包被有生物素标记的LAG-3的固相载体中进行孵育；和
(6) 孵育结束后，检测可检测标记的信号强度。
在一些实施方案中，所述方法还包括在所述捕获前对所述生物样品进行酸处理的步骤。
在一些实施方案中，所述捕获包括向包被有生物素标记的LAG-3抗体药物的固相载体中加入体积比为1:15的中和试剂和酸处理后的生物样品。
在一些实施方案中，所述中和试剂是浓度为1M，pH 9.5的三羟甲基氨基甲烷溶液。
在一些实施方案中，所述可检测标记为金属标记物。
在一些实施方案中，所述金属标记物为钌标记物。
在一些实施方案中，所述信号强度为电化学发光强度。
在一些实施方案中，包被有生物素标记的LAG-3的固相载体为使用包含生物素标记的LAG-3的含1% BSA溶液进行包被的固相载体。
在一些实施方案中，所述生物样品为血浆或血清。
具体实施方式
针对现有技术的不足，本申请的发明人开发了新的对所述生物样品(例如血浆或血清)中的抗LAG-3抗体药物中和抗体进行检测的准确可靠和高灵敏度的方法。
作为具体的实例，本申请的检测方法可以基于MSD平台CLBA技术的ACE方法：
(1) 首先使用生物素标记的LAG-3抗体药物(Bio-药物)包被链霉亲和素(SA)-96孔酶标板，使药物牢固捕获在酶标板上，后将中和试剂及预处理(例如酸处理)后样品加入预先捕获试验药物且经封闭的酶标板中并室温振荡孵育过夜，确保样品中的抗淋巴细胞激活基因3 (LAG-3)抗体药物中和抗体(简称为NAb)与固相载体中的药物形成NAb-药物复合物，同时样品中的靶蛋白LAG-3与固相载体中的药物形成LAG-3-药物复合物。
(2) 洗板后加入酸解离液(例如浓度为300mM，pH 2.0的醋酸)进行NAb-药物、LAG-3-药物复合物解离，将中和试剂及上一步解离后样品加入预先捕获特异性结合LAG-3的去干扰抗体且经封闭的96-孔酶标板中并室温振荡孵育以去除样品中LAG-3的干扰，其中所述特异性结合LAG-3的去干扰抗体与所述LAG-3抗体药物结合LAG-3的不同表位。
(3) 取上清液与检测试剂(例如包含带有可检测标记的LAG-3抗体药物的检测试剂)混合于孵育板中进行振荡反应后，加入到经封闭且预先捕获生物素标记的LAG-3 (简称为Bio-LAG-3)的MSD微孔板中，室温振荡孵育，洗板后加入MSD Read Buffer T (2×)，于MESO QUICKPLEX SQ120上读取仪器信号；若样品中无中和活性抗体，体系中Bio-LAG-3则能与检测试剂充分结合，其在电化学发光检测仪器上读取的仪器响应值(ECLU)高，其对于阴性对照样品(至少10例代表性未给药个体血清的混合物)的信噪比越高，抑制率越低；若样品中含中和活性抗体，其ECLU值低，则其信噪比越低，抑制率越高。
除非另外指明，本申请的实施采用本领域常规的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学以及免疫学技术。
除非另外指明，本申请中所用的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。
为容易地理解本申请，首先定义本文中使用的某些术语。
如本文所述的“亲和捕获”是指基于抗体抗原特异性结合的原理进行的捕获，例如使用特异性抗原对抗体进行捕获。在本申请的一些实施方案中，酸处理后样品中的抗药物中和抗体在中性pH条件下与包被在微孔板上的药物(相当于抗原)结合，即实现对抗体的捕获。在本申请的一些实施方案中，所述药物为抗LAG-3抗体药物。在本申请的一些实施方案中，所述抗药物中和抗体为抗LAG-3抗体药物中和抗体。
如本文所述的“酸解离”是指通过酸化样品来将药物-抗药物中和抗体复合物离解成药物和抗药物中和抗体。酸解离的最大目的是使得原来已与药物结合的抗药物中和抗体可以被检测。在本申请的一些实施方案中，所述药物为抗LAG-3抗体药物。在本申请的一些实施方案中，所述抗药物中和抗体为抗LAG-3抗体药物中和抗体。
如本文所使用的术语“耐药性”是指生物样本中可能含有高浓度的游离药物，可以与检测试剂竞争结合抗药物中和抗体，进而干扰抗药物中和抗体检测，导致假阴性结果。
本申请提供了检测生物样品中抗淋巴细胞激活基因3 (LAG-3)抗体药物中和抗体的方法，所述方法包括：
(1) 使用包含生物素标记的LAG-3抗体药物的捕获试剂对所述生物样品中的抗LAG-3抗体药物中和抗体进行捕获；
(2) 对步骤(1)获得的捕获样品使用浓度为300mM，pH 2.0的醋酸进行酸解离；
(3) 使用特异性结合LAG-3的去干扰抗体对步骤(2)获得的酸解离样品进行去除LAG-3处理，其中所述特异性结合LAG-3的去干扰抗体与所述LAG-3抗体药物结合LAG-3的不同表位；
(4) 向步骤(3)获得的样品中加入包含带有可检测标记的LAG-3抗体药物的检测试剂，获得混合液；
(5) 将步骤(4)获得的混合液加入包被有生物素标记的LAG-3的固相载体中进行孵育；和
(6) 孵育结束后，检测可检测标记的信号强度。
在一些实施方案中，所述捕获为亲和捕获。
在一些实施方案中，所述方法还包括在所述捕获前对所述生物样品进行酸处理的步骤。在一些具体实施方案中，所述处理为使用浓度为300mM的醋酸(不调节pH)进行。在一些实施方案中，所述生物样品与浓度为300mM的醋酸的体积比为1:1-1:100，例如1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100，或上述任意两个比例值之间的范围。在一些实施方案中，所述生物样品与浓度为300mM的醋酸的体积比为1:1-1:75，例如1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75，或上述任意两个比例值之间的范围。在一些具体实施方案中，所述生物样品与浓度为300mM的醋酸的体积比为1:4。
在一些实施方案中，所述生物样品酸处理可以降低基质效应。在一些实施方案中，所述生物样品酸处理可以提高药物耐受性。在一些实施方案中，所述生物样品酸处理可以减少样品用量。
在一些实施方案中，使用生物素标记LAG-3抗体药物可以防止LAG-3抗体药物在样品进行酸解离时从固相载体上脱落。
在一些实施方案中，所述捕获需要在中性pH条件下进行。在一些实施方案中，在向固相载体中加入酸处理后的生物样品进行所述抗LAG-3抗体药物中和抗体的捕获之前，需要向固相载体中加入中和试剂。
在一些实施方案中，所述捕获包括向包被有生物素标记的LAG-3抗体药物的固相载体中加入体积比为1:15的中和试剂和酸处理后的生物样品。在一些实施方案中，所述捕获包括向包被有生物素标记的LAG-3抗体药物的固相载体中加入10μL中和试剂和150μL酸处理后的生物样品。
在一些实施方案中，所述中和试剂可以为能够使抗LAG-3抗体药物中和抗体与LAG-3抗体药物的结合过程呈中性pH的试剂。在一些实施方案中，所述中和试剂为浓度为1M，pH 9.5的三羟甲基氨基甲烷溶液。在一些实施方案中，加入中和试剂使得捕获在中性pH下进行，能够提高捕获效率，和/或提高抗LAG-3抗体药物中和抗体与LAG-3抗体药物的结合率。
在一些实施方案中，步骤(3)的去干扰处理需要在中性pH条件下进行。在一些实施方案中，在向固相载体中加入步骤(2)获得的酸解离样品进行去除LAG-3处理之前，需要向固相载体中加入中和试剂。在一些实施方案中，所述中和试剂可以为能够使特异性结合LAG-3的去干扰抗体与LAG-3结合过程呈中性pH的试剂。在一些实施方案中，所述中和试剂为浓度为1M，pH 9.5的三羟甲基氨基甲烷溶液。
在理解本申请核心发明的工作原理后可知，本申请的LAG-3抗体药物和特异性结合LAG-3的去干扰抗体并不局限于某一对具有特定序列结构或结合性质的抗体。事实上，适合的去干扰抗体可以根据待测试LAG-3抗体药物的不同而进行选择。去干扰抗体的使用原理是，使用去干扰抗体以去除样品中的游离LAG-3，但是同时去干扰抗体不能与样品中的抗LAG-3抗体药物中和抗体结合(因为中和抗体所针对的抗原是抗LAG-3的抗体药物，而去干扰抗体也是一种抗LAG-3的抗体，因此，去干扰抗体与中和抗体的结合会影响本申请的测定)。去干扰抗体与待测LAG-3抗体药物结合LAG-3的不同表位能够确保去干扰抗体不与中和抗体结合，因为中和抗体与待测LAG-3抗体药物的结合表位位于待测LAG-3抗体药物的可变区，在去干扰抗体与待测LAG-3抗体药物结合LAG-3的不同表位的情况下，二者的可变区是不同的，因此中和抗体不会结合去干扰抗体。针对同一抗原(例如本申请中的LAG-3)而言，鉴定结合表位不同的已知技术有多种，例如竞争结合测定、抗体-抗原复合物晶体结构分析等。在一些实施方案中，所述特异性结合LAG-3的去干扰抗体是LAG-3 (人)重组单克隆抗体。
在一些实施方案中，所述可检测标记为金属标记物，例如钌标记物。在一些实施方案中，使用钌(Ru)对所述LAG-3抗体药物进行标记，使得反应体系更加稳定。
在一些实施方案中，所述信号强度为电化学发光强度。在一些实施方案中，基于钌标记物的电化学发光法的一种示例性实例是MSD (Meso Scale Discovery)法，其使用包被有链霉亲和素的MSD板以及MSD Read Buffer T工作液进行电化学发光检测。在一些实施方案中，使用Meso Scale Discovery Inc.商售的读板机、程序和试剂盒进行电化学发光检测。
在一些实施方案中，包被有生物素标记的LAG-3的固相载体为使用包含生物素标记的LAG-3的含1% BSA的溶液(例如包含生物素标记的LAG-3的含1% BSA的1×PBS溶液)进行包被的固相载体。在一些实施方案中，使用包含生物素标记的LAG-3的含1% BSA的溶液(例如包含生物素标记的LAG-3的含1% BSA的1×PBS溶液)进行包被，包被效果好，复孔间CV较小，解决了响应值变异大问题。
在一些实施方案中，所述固相载体可以为微孔板，例如ELISA板、MSD板等。
在一些实施方案中，所述生物样品为血浆或血清。在一些实施方案中，所述生物样品为人血清。
在一些实施方案中，采用血清(例如人血清)将抗LAG-3抗体药物中和抗体稀释成不同浓度的待测生物样品，例如1-10ng/mL、1-20ng/mL、1-30ng/mL、1-40ng/mL、1-50ng/mL、1-60ng/mL、1-70ng/mL、1-80ng/mL、1-90ng/mL、1-100ng/mL、1-150ng/mL、1-200ng/mL、1-250ng/mL、1-300ng/mL、1-350ng/mL、1-400ng/mL、1-450ng/mL、1-500ng/mL、1-550ng/mL、1-600ng/mL、1-650ng/mL、1-700ng/mL、1-750ng/mL、1-800ng/mL、1-850ng/mL、1-900ng/mL、1-950ng/mL、1-1000ng/mL、1-2000ng/mL、1-3000ng/mL、1-4000ng/mL、1-5000ng/mL、1-6000ng/mL、1-7000ng/mL、1-8000ng/mL、1-9000ng/mL或1-10000ng/mL。在一些实施方案中，将采用血清(例如人血清)将抗LAG-3抗体药物中和抗体稀释成10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500或10000 ng/mL的待测生物样品。在一些具体实施方案中，将采用血清(例如人血清)将抗LAG-3抗体药物中和抗体稀释成100、250、500、1000、2000、4000或8000 ng/mL的待测生物样品。
在一些实施方案中，所述方法基于MSD平台CLBA技术的ACE方法，具有如下至少一种优点：
解决了内源性LAG-3的干扰；
解决了高剂量药物耐受性对抗LAG-3抗体药物中和抗体活性检测的影响；和
提高了方法灵敏度。
在一些实施方案中，所述方法的灵敏度为100ng/mL。
在一些实施方案中，在抗LAG-3抗体药物中和抗体浓度为500ng/mL时，可耐受的LAG-3抗体药物浓度可提高到100µg/mL。
应当理解，以上详细描述仅为了使本领域技术人员更清楚地了解本申请的内容，而并非意图在任何方面加以限制。本领域技术人员能够对所述实施方案进行各种改动和变化。
以下实施例仅用于说明而非限制本申请范围的目的。
实施例
将通过具体实例的方式更详细地描述本申请。提供以下实施例仅用于说明目的，且并不旨在以任何方式限制本申请。本领域技术人员将容易认识到各种非关键参数，这些参数可以被改变或修改以产生基本上相同的结果。
试剂来源：
本申请使用的LAG-3抗体药物为临床在研的抗体药物，下文以AD表示；特异性结合LAG-3的去干扰抗体为通过LAG-3结合表位鉴定筛选获得的与所述LAG-3抗体药物AD结合LAG-3的不同表位的商售抗体：Enzo Life的IgG1 κ型LAG-3 (人)重组单克隆抗体(L4-PL33)。
ELISA板1捕获试剂：生物素标记的LAG-3抗体药物(简称为Bio-AD)，按照生物素/LAG-3抗体药物AD标记比率20:1进行标记。
MSD板包被试剂：生物素标记的重组人LAG-3蛋白(简称为Bio-LAG-3)，厂家SinoBiological。
检测试剂工作液：Ru-LAG-3抗体药物(简称为Ru-AD)，按照钌元素/LAG-3抗体药物AD标记比率12:1进行标记。
检测生物样品中抗LAG-3抗体药物中和抗体的方法的具体实验步骤如下表所示：
灵敏度和耐药性中“%抑制”的计算公式如下所示：
其中，阴性对照样品为至少10例代表性未给药个体血清的混合物。
实验结果如表1-6所示。
表1. 采用Bio-AD与AD包被ELISA板的灵敏度数据比较结果
表2. 中和抗体浓度为0 ng/mL时，采用Bio-AD与AD包被ELISA板的耐药性数据比较结果
表3. 中和抗体浓度为500 ng/mL时，采用Bio-AD与AD包被ELISA板的耐药性数据比较结果
表1-3的数据显示：通过对比，使用AD直接包被ELISA板，亲和捕获样品后在进行酸解离时，有部分药物被解离下来，影响了正常实验体系，使中和抗体为0 ng/mL时的耐药性出现了异常，即随着药物浓度越高，实验体系出现了抑制，且在中和抗体为500 ng/mL加入一系列药物时，能耐受6.3 μg/mL药物，耐药性高点亦出现高抑制率的异常，这种情况严重干扰正常检测体系，且在中和抗体实验中常见，不容易解决。本实验使用Bio-AD包被在SA-ELISA板上，亲和捕获样品，进行酸解离，实验数据显示，中和抗体为0 ng/mL时的耐药性正常，中和抗体为500 ng/mL的耐药性正常，均未出现高浓度抑制现象，即证明在此实验体系下，即使有高达100 μg/mL的药物，依然不影响实验体系，同时方法灵敏度也进一步得到了提高，由500 ng/mL提升到100 ng/mL，其中%抑制的阈值范围为15%-20%。
表4. 不同亲和捕获加样体系的灵敏度数据总结表
表5. 不同亲和捕获加样体系的耐药性数据总结表
表4-表5的数据显示：在亲和捕获步骤中，使用10 μL 1M Trizma+150 μL酸处理后样品加样体系，其灵敏度好，能达到100 ng/mL，中和活性抗体在500 ng/mL时耐药性能达到100 μg/mL；而在其他加样体系中，其灵敏度和耐药性均差，且耐药性出现反向抑制现象，所以亲和捕获体系对实验有较大影响。
表6. 不同MSD板包被方案的变异系数(Coefficient of Variation，CV)比较结果
表6的数据显示：通过对比，使用1×CBS缓冲液或1×PBS缓冲液包被Bio-LAG-3，然后进行含3% BSA的1×PBS缓冲液封闭，其复孔CV较大，且变异大；先使用含3% BSA的1×PBS缓冲液封闭，后分别进行1×CBS缓冲液或1×PBS缓冲液包被生物素标记的LAG-3，其复孔CV小，变异小；直接使用含1% BSA的1×PBS缓冲液包被生物素标记的LAG-3，其复孔CV小，变异小。综上，使用含1% BSA的1×PBS缓冲液包被生物素标记的LAG-3，其复孔CV和变异均小，且不需要封闭步骤，缩短了实验时间和步骤，增加了实验的稳定性。
在本申请中提及和/或列出的所有专利、专利申请公开和非专利文献均通过引用整体并入本文中。上文对本申请的各项发明的示例性实施方案进行了描述，但是，在不脱离本申请的实质和范围的情况下，本领域技术人员能够对本申请描述的示例性实施方案进行修改或改进，由此得到的变形方案或等同方案也属于本申请的范围。
Claims (9)
1.检测生物样品中抗淋巴细胞激活基因3 (LAG-3)抗体药物中和抗体的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1) 使用包含生物素标记的LAG-3抗体药物的捕获试剂对所述生物样品中的抗LAG-3抗体药物中和抗体进行捕获；
(2) 对步骤(1)获得的捕获样品使用浓度为300mM，pH 2.0的醋酸进行酸解离；
(3) 使用特异性结合LAG-3的去干扰抗体对步骤(2)获得的酸解离样品进行去除LAG-3处理，其中所述特异性结合LAG-3的去干扰抗体与所述LAG-3抗体药物结合LAG-3的不同表位；
(4) 向步骤(3)获得的样品中加入包含带有可检测标记的LAG-3抗体药物的检测试剂，获得混合液；
(5) 将步骤(4)获得的混合液加入包被有生物素标记的LAG-3的固相载体中进行孵育；和
(6) 孵育结束后，检测可检测标记的信号强度。
2.如权利要求1所述的方法，其还包括在所述捕获前对所述生物样品进行酸处理的步骤。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述捕获包括向包被有生物素标记的LAG-3抗体药物的固相载体中加入体积比为1:15的中和试剂和酸处理后的生物样品。
4. 如权利要求3所述的方法，其中所述中和试剂是浓度为1M，pH 9.5的三羟甲基氨基甲烷溶液。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述可检测标记为金属标记物。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述金属标记物为钌标记物。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述信号强度为电化学发光强度。
8. 如权利要求1所述的方法，其中包被有生物素标记的LAG-3的固相载体为使用包含生物素标记的LAG-3的含1% BSA的溶液进行包被的固相载体。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述生物样品为血浆或血清。
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