CN118272295A - 一种脐带间充质干细胞的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的一种脐带间充质干细胞的培养方法，属于脐带间充质干细胞技术领域，包括以下步骤：步骤一、准备培养瓶、镊子、剪刀，并对器材进行消毒处理；步骤二、取出所需的耗材整齐排列在物料推车上，对耗材进行消毒，本发明将脐带的夹痕和除去，这样可以减少坏死细胞对充值干细胞的培养造成影响，利用人血清和各类生长因子配置成完全培养基来对充质干细胞进行培养，这样为充质干细胞的生长提供了有效地环境，完全培养基先通过加热至68～70℃，并保持此温度30min以后急速冷却到4～5℃进行消毒，这样既能够较为完全地杀灭完全培养基A中的细菌，同时又不会破坏其内部的其他生长因子效用，本发明所述培养方法操作简单、安全有效。
Description
技术领域
本发明涉及脐带间充质干细胞技术领域，具体讲是一种脐带间充质干细胞的培养方法。
背景技术
间充质干细胞(MSC,mesenchymalstemcells)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，目前，主要从脂肪、骨髓、脐带、胎盘组织中提取间充质干细胞。间充质干细胞连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，为临床治疗各种疾病，如神经系统疾病、肾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤等的治疗提供了新的途径。脐带间充质干细胞(UCMSCs)是存在于脐带华尔通胶(Wharton'sjelly)和血管周围组织中的一种干细胞。来源于脐带的间充质干细胞，取材方便，来源丰富，易于采集和运输，生物学特性稳定，免疫原性低，无异体排斥反应，成本低，对捐献者无损害及不涉及伦理问题等优势，使其成为未来干细胞在医疗应用上具有巨大潜力的理想选择。
现有的技术中还存在以下不足之处：
(1)现有技术中，间充质干细胞的培养步骤都比较的复杂，而且在培养的过程中很容易有细菌进入，从而就会严重影响间充质干细胞的良好生长。
(2)目前脐带间充质肝细胞的原代分离的方法主要有酶解法及组织块培养法。酶解法中使用到的胶原酶等来源可能涉及动物来源，且价格昂贵，对细胞损伤较大。而组织块培养法细胞爬出的时间较长，原代培养时间过长使得细胞容易长老，细胞纯度不够，容易受到脐带中其他细胞的污染。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脐带间充质干细胞的培养方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
本发明的技术方案是：包括以下步骤：
步骤一、准备培养瓶、镊子、剪刀，并对器材进行消毒处理；
步骤二、取出所需的耗材整齐排列在物料推车上，对耗材进行消毒，将其放入已清洁的生物安全柜中，取出完全培养基，放置在物料推车上待其恢复至室温；
步骤三、取脐带去除最外层膜及静脉跟动脉，切除双侧带夹痕及淤血的部分，剥离脐静脉内膜，将剩余组织切成小块，用含双抗的PBS缓冲液充分冲洗脐带外周以及脐静脉内腔；
步骤四、向脐带采集瓶中倒入75％医用酒精，浸没脐带，对脐带消毒灭菌；
步骤五、对脱离人体的脐带间充质干细胞进行制备，剪碎后用无菌止血钳从脐带采集瓶中取出脐带并加入完全培养基，于37℃，5％CO2静止培养，期间补加完全培养基；
步骤六、取S5中的溶液50ml移至培养瓶中，放置到37摄氏度的环境下进行培育，同时控制空气的浓度为95％二氧化碳浓度为5％；
步骤七、待组织块有细胞爬出后去掉组织块，清洗后加入完全培养基，待细胞集落成片生长后，传代培养；
步骤八、在温度为37摄氏度下消化35-45min，每隔6-8min进行震荡一次，对细胞进行分离，静置6-8min，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中，进行离心处理，结束后加入3-4ml的细胞生长液；
步骤九、进行营养液的配置，采用去离子水、FBS、细胞因子混合而成，将混合好的营养液移至培养瓶中；
步骤十、当细胞达70％～80％融合时，以含1.25g/L胰蛋白酶和1g/L乙二胺四乙酸的消化液消化后，以(2.5～5.0)×103/cm2密度接种传代培养，计为第一代细胞。
进一步的，在对脐带进行剪碎时，保证组织块的体积为0.8-1立方毫米。
进一步的，所述完全培养基，包括含体积分数为1％～3％人血清、35～45％MCDB201、7～13μg/L血小板衍生生长因子、8～12μg/L碱性成纤维细胞生长因子、5～15μg/L表皮生长因子的DF12培养基。
进一步的，所述完全培养基在使用前，先通过加热至68～70℃，并保持此温度30min以后急速冷却到4～5℃进行消毒，待完全培养基消毒完毕后，向其内部加入碳酸氢钠溶液，调节完全培养基A的pH为7.2～7.4。
进一步的，用移液管吸取剩余组织块匀浆均匀加T75培养瓶中接种，接种量为0.8-1mL/瓶，摇匀，将摇匀后的T75培养瓶放入CO2培养箱37.0℃、5.0％CO2浓度条件下进行培养。
进一步的，在进行消毒处理时包括以下步骤：A1、将器材放入到蒸汽高压锅中，使高压锅的温度控制为65-70摄氏度，时间为5-8min；A2、将温度上升到90-100摄氏度，时间为3-4min；A3、将温度上升到122-128摄氏度，时间为15-20min。
进一步的，将离心管置于离心机上，控制离心机的转速为1000r/min，离心的时间为8-10min，去除上清液；加入平衡盐酸溶液8ml，冲散细胞，再离心一次，去除上清液。
本发明通过改进在此提供一种脐带间充质干细胞的培养方法，与现有技术相比，具有如下改进及优点：
本发明将脐带的夹痕和除去，这样可以减少坏死细胞对充值干细胞的培养造成影响，利用人血清和各类生长因子配置成完全培养基来对充质干细胞进行培养，这样为充质干细胞的生长提供了有效地环境，完全培养基先通过加热至68～70℃，并保持此温度30min以后急速冷却到4～5℃进行消毒，这样既能够较为完全地杀灭完全培养基A中的细菌，同时又不会破坏其内部的其他生长因子效用，本发明所述培养方法操作简单、安全有效，本发明所述脐带间充质干细胞的培养方法原代时间短，增殖后获得细胞更多，细胞活力和增殖能力强，培养至P15代后仍然保持良好的增殖能力，且能很好保持脐带间充质干细胞的形态和良好的干细胞特性，适用于脐带间充质干细胞的大量培养，避免由于浸泡于液相所导致的细菌、霉菌等病原体、DNA、RNA等的交互污染。也可避免因所用管盖泄漏引起的对其他存储脐带间充质干细胞的污染，使存储的脐带间充质干细胞的安全性和将来的临床研究应用得以保证。同时节省存储空间，进而降低成本，通过对脐带进行消毒、加入培养液、进行离心处理，同时保证了干细胞的培养的生长环境，有利于提高干细胞的存活分裂，保证了干细胞的培养效果。
具体实施方式
下面将对本发明进行详细说明，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明通过改进在此提供一种脐带间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：
步骤一、准备培养瓶、镊子、剪刀，并对器材进行消毒处理；
步骤二、取出所需的耗材整齐排列在物料推车上，对耗材进行消毒，将其放入已清洁的生物安全柜中，取出完全培养基，放置在物料推车上待其恢复至室温；
步骤三、取脐带去除最外层膜及静脉跟动脉，切除双侧带夹痕及淤血的部分，剥离脐静脉内膜，将剩余组织切成小块，用含双抗的PBS缓冲液充分冲洗脐带外周以及脐静脉内腔；
步骤四、向脐带采集瓶中倒入75％医用酒精，浸没脐带，对脐带消毒灭菌；
步骤五、对脱离人体的脐带间充质干细胞进行制备，剪碎后用无菌止血钳从脐带采集瓶中取出脐带并加入完全培养基，于37℃，5％CO2静止培养，期间补加完全培养基；
步骤六、取S5中的溶液50ml移至培养瓶中，放置到37摄氏度的环境下进行培育，同时控制空气的浓度为95％二氧化碳浓度为5％；
步骤七、待组织块有细胞爬出后去掉组织块，清洗后加入完全培养基，待细胞集落成片生长后，传代培养；
步骤八、在温度为37摄氏度下消化35-45min，每隔6-8min进行震荡一次，对细胞进行分离，静置6-8min，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中，进行离心处理，结束后加入3-4ml的细胞生长液；
步骤九、进行营养液的配置，采用去离子水、FBS、细胞因子混合而成，将混合好的营养液移至培养瓶中；
步骤十、当细胞达70％～80％融合时，以含1.25g/L胰蛋白酶和1g/L乙二胺四乙酸的消化液消化后，以(2.5～5.0)×103/cm2密度接种传代培养，计为第一代细胞。
在对脐带进行剪碎时，保证组织块的体积为0.8-1立方毫米。
完全培养基，包括含体积分数为1％～3％人血清、35～45％MCDB201、7～13μg/L血小板衍生生长因子、8～12μg/L碱性成纤维细胞生长因子、5～15μg/L表皮生长因子的DF12培养基。
完全培养基在使用前，先通过加热至68～70℃，并保持此温度30min以后急速冷却到4～5℃进行消毒，待完全培养基消毒完毕后，向其内部加入碳酸氢钠溶液，调节完全培养基A的pH为7.2～7.4。
用移液管吸取剩余组织块匀浆均匀加T75培养瓶中接种，接种量为0.8-1mL/瓶，摇匀，将摇匀后的T75培养瓶放入CO2培养箱37.0℃、5.0％CO2浓度条件下进行培养。
在进行消毒处理时包括以下步骤：A1、将器材放入到蒸汽高压锅中，使高压锅的温度控制为65-70摄氏度，时间为5-8min；A2、将温度上升到90-100摄氏度，时间为3-4min；A3、将温度上升到122-128摄氏度，时间为15-20min。
将离心管置于离心机上，控制离心机的转速为1000r/min，离心的时间为8-10min，去除上清液；加入平衡盐酸溶液8ml，冲散细胞，再离心一次，去除上清液。
工作原理：准备培养瓶、镊子、剪刀，并对器材进行消毒处理，取出所需的耗材整齐排列在物料推车上，对耗材进行消毒，将其放入已清洁的生物安全柜中，取出完全培养基，放置在物料推车上待其恢复至室温，取脐带去除最外层膜及静脉跟动脉，切除双侧带夹痕及淤血的部分，剥离脐静脉内膜，将剩余组织切成小块，用含双抗的PBS缓冲液充分冲洗脐带外周以及脐静脉内腔，向脐带采集瓶中倒入75％医用酒精，浸没脐带，对脐带消毒灭菌，对脱离人体的脐带间充质干细胞进行制备，剪碎后用无菌止血钳从脐带采集瓶中取出脐带并加入完全培养基，于37℃，5％CO2静止培养，期间补加完全培养基，取S5中的溶液50ml移至培养瓶中，放置到37摄氏度的环境下进行培育，同时控制空气的浓度为95％二氧化碳浓度为5％，待组织块有细胞爬出后去掉组织块，清洗后加入完全培养基，待细胞集落成片生长后，传代培养，在温度为37摄氏度下消化35-45min，每隔6-8min进行震荡一次，对细胞进行分离，静置6-8min，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中，进行离心处理，结束后加入3-4ml的细胞生长液，进行营养液的配置，采用去离子水、FBS、细胞因子混合而成，将混合好的营养液移至培养瓶中，当细胞达70％～80％融合时，以含1.25g/L胰蛋白酶和1g/L乙二胺四乙酸的消化液消化后，以(2.5～5.0)×103/cm2密度接种传代培养，计为第一代细胞。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (7)
1.一种脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、准备培养瓶、镊子、剪刀，并对器材进行消毒处理；
步骤二、取出所需的耗材整齐排列在物料推车上，对耗材进行消毒，将其放入已清洁的生物安全柜中，取出完全培养基，放置在物料推车上待其恢复至室温；
步骤三、取脐带去除最外层膜及静脉跟动脉，切除双侧带夹痕及淤血的部分，剥离脐静脉内膜，将剩余组织切成小块，用含双抗的PBS缓冲液充分冲洗脐带外周以及脐静脉内腔；
步骤四、向脐带采集瓶中倒入75％医用酒精，浸没脐带，对脐带消毒灭菌；
步骤五、对脱离人体的脐带间充质干细胞进行制备，剪碎后用无菌止血钳从脐带采集瓶中取出脐带并加入完全培养基，于37℃，5％CO2静止培养，期间补加完全培养基；
步骤六、取S5中的溶液50ml移至培养瓶中，放置到37摄氏度的环境下进行培育，同时控制空气的浓度为95％二氧化碳浓度为5％；
步骤七、待组织块有细胞爬出后去掉组织块，清洗后加入完全培养基，待细胞集落成片生长后，传代培养；
步骤八、在温度为37摄氏度下消化35-45min，每隔6-8min进行震荡一次，对细胞进行分离，静置6-8min，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中，进行离心处理，结束后加入3-4ml的细胞生长液；
步骤九、进行营养液的配置，采用去离子水、FBS、细胞因子混合而成，将混合好的营养液移至培养瓶中；
步骤十、当细胞达70％～80％融合时，以含1.25g/L胰蛋白酶和1g/L乙二胺四乙酸的消化液消化后，以(2.5～5.0)×103/cm2密度接种传代培养，计为第一代细胞。
2.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于：在对脐带进行剪碎时，保证组织块的体积为0.8-1立方毫米。
3.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于：所述完全培养基，包括含体积分数为1％～3％人血清、35～45％MCDB201、7～13μg/L血小板衍生生长因子、8～12μg/L碱性成纤维细胞生长因子、5～15μg/L表皮生长因子的DF12培养基。
4.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于：所述完全培养基在使用前，先通过加热至68～70℃，并保持此温度30min以后急速冷却到4～5℃进行消毒，待完全培养基消毒完毕后，向其内部加入碳酸氢钠溶液，调节完全培养基A的pH为7.2～7.4。
5.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于：用移液管吸取剩余组织块匀浆均匀加T75培养瓶中接种，接种量为0.8-1mL/瓶，摇匀，将摇匀后的T75培养瓶放入CO2培养箱37.0℃、5.0％CO2浓度条件下进行培养。
6.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于：在进行消毒处理时包括以下步骤：A1、将器材放入到蒸汽高压锅中，使高压锅的温度控制为65-70摄氏度，时间为5-8min；A2、将温度上升到90-100摄氏度，时间为3-4min；A3、将温度上升到122-128摄氏度，时间为15-20min。
7.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于：将离心管置于离心机上，控制离心机的转速为1000r/min，离心的时间为8-10min，去除上清液；加入平衡盐酸溶液8ml，冲散细胞，再离心一次，去除上清液。
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