CN118252918B - 斜带石斑鱼piscidin3及其合成多肽在制备抗鱼类病毒药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了斜带石斑鱼piscidin3及其合成多肽在制备抗鱼类病毒药物中的应用。本发明研究发现斜带石斑鱼piscidin3是一种具有抗病毒功能的抗菌肽，通过人工合成的斜带石斑鱼piscidin3成熟多肽具有抑制鱼类DNA和RNA病毒复制的特点，在低浓度下对鱼类虹彩病毒和/或神经坏死病毒的复制具有显著的抑制作用，可以应用于鱼类抗病毒药物的制备与研发。该抗菌肽的研究将对进一步研究和开发抗病功能基因制品具有重要的科学价值和应用价值。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体地，涉及斜带石斑鱼piscidin3及其合成多肽在制备抗鱼类病毒药物中的应用。
背景技术
斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）是我国南方地区及东南亚各国重要的海水养殖经济鱼类，营养价值高，深受广大海产消费者的青睐，水产海鲜市场需求量较大。然而随着养殖规模不断扩大，养殖密度增加，养殖环境的恶化以及抗疾病药物的滥用，石斑鱼病害日益严峻，造成石斑鱼养殖业的巨大经济损失，严重制约石斑鱼健康可持续发展。近年来频繁暴发和流行的虹彩病毒SGIV疾病和神经坏死病毒RGNNV是最严重的传染性病毒病原，已经在世界范围内对石斑鱼养殖造成了巨大的经济损失。目前对鱼类病害的防治，传统方式采用抗生素和化学药物，造成了药物残留、耐药性及环境污染等问题。为此，开展鱼类免疫抗病的基础研究及研制新型抗病基因工程产品已经成为当务之急。抗菌肽广泛存在于动物、植物和真菌中，参与多种生物学过程，具有多种生物学功能，如抗凋亡、抗病毒等，应用潜力很大。Piscidin家族是一类含有20～50个氨基酸残基的小分子多肽，α螺旋结构，富含阳离子，具有疏水性和两亲性，具有广谱的杀菌、抗肿瘤、抗病毒的活性。Piscidin广泛存在于硬骨鱼类（特别是鲈形目类），是一个值得特别关注的硬骨鱼类抗菌肽家族。目前已经在多种鱼类中发现piscidin基因存在多种亚型的现象，目前，已公开的Piscidin家族的小分子多肽对鱼类虹彩病毒和神经坏死病毒复制的抑制效果还有待提高，而斜带石斑鱼piscidin3在鱼类抗病毒方面的研究还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供斜带石斑鱼piscidin3及其合成多肽在制备抗鱼类病毒药物中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
本发明根据数据库中斜带石斑鱼piscidin3基因片段（SEQ ID No.2）确定其氨基酸片段（SEQ ID No.1），进一步根据氨基酸片段分析其成熟肽区域，然后通过人工合成的方法获得斜带石斑鱼piscidin3成熟多肽（SEQ ID No.3）。探究人工合成的斜带石斑鱼piscidin3成熟多肽对鱼类病毒的复制影响，结果发现人工合成的斜带石斑鱼piscidin3成熟多肽具有抑制鱼类DNA和RNA病毒复制的特点。
因此，本发明提供斜带石斑鱼piscidin3在制备抗鱼类病毒的药物中的应用，所述斜带石斑鱼piscidin3的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示：MKCTVVFLVLSMVVFMAEPGECIFGLLLHGAIHVGKLIHGLVRRHGEEQLDDLEQLDKRALDYNPGRPGFD。
进一步地，编码所述斜带石斑鱼piscidin3的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供斜带石斑鱼piscidin3合成多肽在制备抗鱼类病毒的药物中的应用，所述合成多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
进一步地，所述鱼类病毒为虹彩病毒和/或神经坏死病毒。
进一步地，所述鱼类病毒为石斑鱼虹彩病毒（SGIV）和/或赤点石斑鱼神经坏死病毒（RGNNV）。
本发明提供一种抗鱼类病毒的药物，含有氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的斜带石斑鱼piscidin3或氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的斜带石斑鱼piscidin3的合成多肽。
进一步地，药物中斜带石斑鱼piscidin3或斜带石斑鱼piscidin3的合成多肽的浓度为50～400μg/mL。
优选地，药物中斜带石斑鱼piscidin3或斜带石斑鱼piscidin3的合成多肽的浓度为50μg/mL。
进一步地，所述抗鱼类病毒的药物用于对鱼类虹彩病毒和/或神经坏死病毒的预防和/或治疗。
进一步地，还含有药学上可接受的辅料。
进一步地，所述药物的剂型为口服液、粉剂、注射剂和胶囊剂中的任意一种。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供斜带石斑鱼piscidin3及其合成多肽在制备抗鱼类病毒药物中的应用。本发明研究发现斜带石斑鱼piscidin3是一种具有抗病毒功能的抗菌肽，通过人工合成的斜带石斑鱼piscidin3成熟多肽具有抑制鱼类DNA和RNA病毒复制的特点，在低浓度下对鱼类虹彩病毒和/或神经坏死病毒的复制具有显著的抑制作用，可以应用于鱼类抗病毒药物的制备与研发。该抗菌肽的研究将对进一步研究和开发抗病功能基因制品具有重要的科学价值和应用价值。
附图说明
图1为人工合成斜带石斑鱼piscidin3成熟多肽质谱检测图。
图2为人工合成斜带石斑鱼piscidin3成熟多肽用HPLC高效液相色谱纯化图。
图3为斜带石斑鱼piscidin3成熟多肽对SGIV病毒复制的影响，主要检测了SGIV基因 ORF072的表达，对照组和实验组的显著性差异用one-way ANOVA分析，用*表示p<0.05，**表示p<0.01（N=3）。
图4为斜带石斑鱼piscidin3成熟多肽对RGNNV病毒复制的影响，主要检测了NNV病毒基因CP的表达，对照组和实验组的显著性差异用one-way ANOVA分析，用*表示p<0.05，**表示p<0.01（N=3）。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
新生牛血清、L15培养基、胰酶购自英淮捷基（上海）贸易有限公司；RNA提取试剂购自Promega公司，反转录酶和荧光定量pcr试剂购自Toyobo公司，其余试剂均为国产分析纯；PCR仪购自Eppendorf公司；生化培养箱购自上海博迅实业有限公司；台式高速离心机购自Beckman公司。抗生素及培养基等均为分子生物学以及基因工程实验室常用国产试剂。
所有引物合成和序列测定均由英潍捷基（上海）贸易有限公司完成。
实施例1 斜带石斑鱼piscidin3成熟多肽的人工合成
将斜带石斑鱼piscidin3的氨基酸序列（SEQ ID No.1）与其他物种的piscidin3氨基酸序列同源比对后，确定其成熟肽区域，然后通过化学合成的方法获得斜带石斑鱼piscidin3成熟多肽。其序列为：IFGLLLHGAIHVGKLIHGLV（SEQ ID No.3）。人工合成的多肽用质谱检测其质量（图1），用HPLC高效液相色谱纯化后（图2）。检测正确后的斜带石斑鱼piscidin3合成多肽被真空干燥为粉末后，分装为每管10mg的量，并用氮气作保护以防止合成多肽的氧化变性，储存于-80℃的超低温冰箱。
实施例2 斜带石斑鱼piscidin3对SGIV病毒复制的影响
（1）石斑鱼脾脏细胞（GS）的培养
石斑鱼GS和GB细胞株保存于液氮之中，在使用之前，从液氮中取出，并且将其转移到培养液中培养。培养的细胞生长到一定密度之后，进行传代。
（2）斜带石斑鱼piscidin3对病毒复制的影响
斜带石斑鱼piscidin3合成多肽在浓度为50～400 μg/mL时对细胞无明显毒性，因此本实施例采用浓度为50 μg/mL的斜带石斑鱼piscidin3合成多肽探究斜带石斑鱼piscidin3对SGIV病毒复制的影响，具体实验方法如下：
将GS细胞传至24孔板，每孔接种约1×105个细胞。16～24 h后，细胞长满单层。在病毒感染前，于28℃不含血清的细胞培养基L15中用合成多肽斜带石斑鱼piscidin3（50 μg/mL）预处理细胞1h，然后感染病毒SGIV，同时在24孔板的细胞并加入500 μL含10% FBS的培养基至终体积600μL。对照组加相同体积的无菌水，其他操作与实验组一致。在感染后24h，取感染后的细胞培养物，每个实验组和对照组分别收取三个重复孔，提取总RNA提取，检测病毒基因的表达。
斜带石斑鱼piscidin3的合成多肽对SGIV病毒复制的影响结果如图3所示，根据图示结果可知，合成多肽斜带石斑鱼piscidin3处理组的SGIV-ORF072基因的相对表达（Foldinduction）与对照组相比从0.65～0.7下降至0.2～0.25，可见，斜带石斑鱼piscidin3的合成多肽可显著抑制病毒SGIV的复制（p<0.01），具有较好的抗虹彩病毒（SGIV）活性。
实施例3 斜带石斑鱼piscidin3对RGNNV病毒复制的影响
（1）石斑鱼脾脏细胞（GS）的培养
石斑鱼GS和GB细胞株保存于液氮之中，在使用之前，从液氮中取出，并且将其转移到培养液中培养。培养的细胞生长到一定密度之后，进行传代。
（2）斜带石斑鱼piscidin3对病毒复制的影响
将GS细胞传至24孔板，每孔接种约1×105个细胞。16～24 h后，细胞长满单层。在病毒感染前，于28℃不含血清的细胞培养基L15中用合成多肽斜带石斑鱼piscidin3（50 μg/mL）预处理细胞1h，然后感染病毒RGNNV，同时在24孔板的细胞并加入500 μL含10% FBS的培养基至终体积600μL。对照组加相同体积的无菌水，其他操作与实验组一致。在感染后24h，取感染后的细胞培养物，每个实验组和对照组分别收取三个重复孔，提取总RNA提取，检测病毒基因的表达。
斜带石斑鱼piscidin3的合成多肽对RGNNV病毒复制的影响结果如图4所示，合成多肽斜带石斑鱼piscidin3处理组的RGNNV-CP基因的相对表达（Fold induction）与对照组相比从90～100下降至60～70，可见，斜带石斑鱼piscidin3的合成多肽可显著抑制病毒RGNNV的复制（p<0.05），具有抗神经坏死病毒（RGNNV）活性。
Claims (4)
1. 斜带石斑鱼piscidin3合成多肽在制备抗鱼类病毒的药物中的应用，其特征在于，所述合成多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；所述鱼类病毒为石斑鱼虹彩病毒和/或赤点石斑鱼神经坏死病毒。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述斜带石斑鱼piscidin3的合成多肽的浓度为50～400μg/mL。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物还含有药学上可接受的辅料。
4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物的剂型为口服液、粉剂、注射剂和胶囊剂中的任意一种。
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| Ze-rui Zhuang et al..Three new piscidins from orange-spotted grouper (Epinepheluscoioides): Phylogeny, expression and functional characterization.Fish & Shellfish Immunology.2017,第66卷摘要、第240页右栏最后1段、第242页的2.4和表2、第243页的3.1-第248页左栏第1段、第252页左栏第 3 段. * |
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