CN118161544A - 一种金银花纳米囊泡的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物提取物技术领域，具体涉及一种金银花纳米囊泡的制备方法及其应用。本发明所提供的方法具体是先采用纤维素酶和果胶酶对金银花水溶液进行酶解，然后采用差速离心法对酶解液进行离心获得金银花纳米囊泡粗溶液，进一步采用海藻糖酸钠和焦磷酸四钾对获得的金银花纳米囊泡粗溶液进行修饰，再经超滤、超高速离心后制得金银花纳米囊泡。本发明的有益效果在于，对金银花外泌体于低温的条件下进行提取与修饰制成金银花纳米囊泡，所获得的纳米囊泡中蛋白质、micRNA等活性成分的含量较高，稳定性较好，此外，所制得的金银花纳米囊泡在缓解牙周炎上具有良好的效果。

Description

一种金银花纳米囊泡的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于植物提取物技术领域，具体涉及一种金银花纳米囊泡的制备方法及其应用。

背景技术

牙周炎是由局部失衡的牙菌斑生态系统引起的牙周支持组织的慢性炎症，若未能及时治疗可由牙龈向深层扩散到牙周膜、牙槽骨和牙骨质，其临床表现为牙龈出血、临床附着丧失、牙槽骨被吸收以及深牙周袋的形成，伴随着病症加重，牙齿会逐渐松动，甚至脱落。从全球整体情况来看，大约有11％的世界人口可能患有严重的牙周炎，影响到约7.43亿人。其中，慢性牙周炎的持续发展会导致牙龈肿胀，溃烂，甚至牙齿脱落，从而导致生活质量下降进而带来严重的心理负担。

目前，牙周炎始发期主要采用的治疗方式是龈上洁治、龈下刮治和根面平整等机械清创方式，可机械设备难以完全去除龈下生物膜和结石，因此无法有效控制炎症，另外，全身或局部应用抗生素虽有适度的辅助治疗作用，阻止牙周病原菌重新定植，但长期使用会有毒副作用，甚至产生抗药性，所以亟需更安全有效的产品来缓解牙周炎的发展。

金银花，又称“忍冬”，是一种具有悠久历史的常用中药。金银花性寒，味甘，入肺、心、胃经，具有清热解毒、抗炎、补虚疗风的功效，且现代研究证明，金银花中含有绿原酸、木犀草素苷等多种药理活性成分，对溶血性链球菌、金黄葡萄球菌等多种致病菌及上呼吸道感染致病病毒等有较强的抑制力，另外还可增强免疫力、抗早孕、护肝、抗肿瘤、消炎、解热、止血(凝血)、抑制肠道吸收胆固醇等，其临床用途非常广泛，可与其它药物配伍用于治疗呼吸道感染、菌痢、急性泌尿系统感染、高血压等40余种病症。

金银花所具有的良好抑菌、消炎的特性也使其成为制备改善口腔健康类产品的重要中药原料之一，如专利CN110151945A中提到了将含有金银花提取物的中药成分用于抗牙周炎的治疗中；专利CN102145077A中公开了一种含有金银花的急性牙周炎的口腔中药制剂。

上述的专利中均是直接对金银花进行提取，并将提取获得的金银花中主要活性成分作为相应功效产品的原料之一，但由于金银花中主要的活性成分如绿原酸，其是由咖啡酸与奎尼酸形成的酯，其分子结构中含有酯键、不饱和双键及多元酚等三个不稳定的部分，在常规的提取过程中，若是提取温度较高，往往会因为水解和分子内酯基迁移而发生异构化，造成活性成分的损失，若是提取温度较低，则绿原酸由于溶解性较小使得提取率较低。

近年来，诸多研究表明，与动物类似，植物也普遍具有分泌外泌体样纳米囊泡的能力，植物外泌体富含多类RNA、蛋白、脂质及小分子，在植物发育等生理过程中提供必要的细胞间通讯，此外，外泌体还可能是植物自我保护的第一道防线，在抗感染、跨物种交流中发挥重要作用。金银花纳米囊泡作为一种植物来源的细胞纳米囊泡，可以通过内吞或者与靶细胞直接接触进行膜融合释放活性物质进入生物循环并参与跨界通讯，与传统药物相比，具有发挥作用快、易被吸收、稳定和安全的特殊性能。

如专利CN112425703A中即公开了将金银花、蒲公英等植物外泌体与其他辅料相配合制备成一种用于改善口腔健康的产品，然而该专利中仅是采用了传统的差速离心法来获取所需的植物外泌体，事实上，采用传统方法获得的植物外泌体中蛋白及小RNA的含量并不高，并且所获得的植物外泌体的稳定性较差，从而限制了其功效的发挥。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种金银花纳米囊泡的制备方法及其在制备缓解牙周炎产品中的应用。

本发明所提供的一种金银花纳米囊泡的制备方法，包括以下步骤：

S1干金银花粉碎，加水混合均匀，获得金银花水溶液，采用纤维素酶和果胶酶对金银花水溶液进行酶解，获得金银花纳米囊泡酶解液；

S2采用差速离心法对S1中获得的金银花纳米囊泡酶解液进行处理，制得金银花纳米囊泡粗溶液；

S3采用海藻糖酸钠和焦磷酸四钾对S2中制得的金银花纳米囊泡粗溶液进行修饰，然后经超滤、超高速离心，磷酸盐缓冲溶液重悬，制得金银花纳米囊泡。

上述的方法中，优选的，S1中，采用超微粉碎机对干金银花进行超微粉碎处理。

优选的，S1中，干金银花与水的质量体积比为1g：(1～10)mL，混合时长为1～2h，混合温度为20～30℃。

更为优选的，S1中，干金银花与水的质量体积比为1g：5mL，混合时长1h，混合温度为25℃。

本发明以金银花作为纳米囊泡的主要制备原料，而金银花中主要的活性成分为绿原酸与木犀草素苷，这两种成分的热稳定性均较差，且除了上述两种主要的活性成分之外，金银花纳米囊泡中还含有诸多蛋白质以及核酸小RNA等成分，在较高的温度下这些成分均会因变性而失活，最终导致金银花纳米囊泡的活性受损甚至功能全部丧失。因此，本发明在整个金银花纳米囊泡的制备过程中均是于30℃以下的低温下进行操作，这一操作有利于更好地保持其中各种成分的生理活性，进而更好地发挥其功效。

优选的，S1中，所述的纤维素酶和果胶酶的重量之和占金银花水溶液重量的20～30％，纤维素酶与果胶酶的重量比为1：1～3，酶解的温度为20～30℃，酶解2～3h，使纤维素酶和果胶酶的最终占整体混合溶液重量的1～2.2％。

优选的，S1中，纤维素酶与果胶酶的重量比为1：1。

优选的，S2中，所述的差速离心法具体操作如下：将S1中获得的金银花纳米囊泡酶解液，先于500～800×g的离心力下离心10～20min，弃沉淀，获得第一次分离上清液；将获得的第一次分离上清液在1000～2500×g的离心力下离心20～40min，弃沉淀，获得第二次分离上清液；将所得第二次分离上清液在3000～5000×g的离心力下离心40～60min，弃沉淀，获得第三次分离上清液，制得金银花纳米囊泡粗溶液。

优选的，S3中，先将海藻糖酸钠与焦磷酸四钾溶于水制成复合溶液，复合溶液中，海藻糖酸钠与焦磷酸四钾的重量比为(1～3)：(1～3)，然后向S2中制得的金银花纳米囊泡粗溶液中加入海藻糖酸钠与焦磷酸四钾复合溶液并于0～20℃下修饰2～3h，其中，海藻糖酸钠与焦磷酸四钾复合溶液占金银花纳米囊泡粗溶液重量的10～20％，修饰结束后，海藻糖酸钠和焦磷酸四钾复合溶液占整体混合溶液重量分数的2～5％。

优选的，S3中采用海藻糖酸钠与焦磷酸四钾进行修饰时的温度为8～16℃。

本发明中采用海藻糖酸钠和焦磷酸四钾的混合物对金银花纳米囊泡进行修饰后，所获得的金银花纳米囊泡中的活性成分稳定性显著提高。

优选的，S3中，超滤时所采用的超滤膜的孔径为0.25～0.45μm。

优选的，S3中，超滤后于4℃在120000～180000×g的离心力下离心0.5～2h，取沉淀，用磷酸盐缓冲溶液进行重悬。

更为优选的，S3中，超滤后于4℃在150000×g的离心力下离心1h，取沉淀，用磷酸盐缓冲溶液进行重悬。

除此之外，采用上述的方法所制备的金银花纳米囊泡，以及该金银花纳米囊泡在制备缓解牙周炎产品中的应用，也是本发明所要重点保护的内容，特别是，金银花纳米囊泡可以抑制由牙龈卟啉单胞菌分离得到的脂多糖(LPS-PG)引起的人牙龈上皮细胞存活率下降的情况，有利于促进细胞增殖，此外其还可以有效抑制炎性因子的表达，减少骨吸收，保护牙周组织。

本发明的有益效果在于：

(1)提供了一种金银花纳米囊泡的制备方法，即先采用纤维素酶和果胶酶对温水处理后的金银花粉末进行处理后，利用差速离心法获得金银花纳米囊泡，最后采用海藻糖酸钠和焦磷酸四钾的混合物对所获得的金银花纳米囊泡进行修饰，成功制得了粒径为146.3nm，Zera电位为-8.25mV的金银花纳米囊泡，并且所获得的金银花纳米囊泡中蛋白质含量达6.98mg/mL，micRNA的含量达163.55ng/μL，对于治疗牙周炎有显著效果；

(2)本发明中借助海藻糖酸钠和焦磷酸四钾的特殊结构特点，采用海藻糖酸钠和焦磷酸四钾的混合物对金银花纳米囊泡进行修饰，显著提高了金银花纳米囊泡的稳定性；这是因为海藻糖酸钠是一种纯天然的糖原，能够在外泌体表面形成独特的保护膜；焦磷酸四钾有助于提高海藻糖酸钠的保水性，从而起到低温分离时的抗冻裂作用，海藻糖酸钠和焦磷酸四钾的协同修饰才能更好地减少分离和保存过程中纳米囊泡的损失，进而显著的提高了金银花纳米囊泡的稳定性；

并且，只有当海藻糖酸钠和焦磷酸四钾在一定的温度范围时，才能达到上述的效果，假若适当降低了海藻糖酸钠和焦磷酸四钾修饰时的温度，所获得的金银花纳米囊泡中蛋白及micRNA的含量均有所下降。

附图说明

图1为本发明实施例1中以金银花为原料制备金银花纳米囊泡的工艺流程图；

图2为本发明实施例1中制备的金银花纳米囊泡的粒子追踪分析仪粒径分析结果图；

图3为本发明实施例1中制备的金银花纳米囊泡的Zeta电位分析仪电位分析结果图；

图4为本发明实施例1中制备的金银花纳米囊泡透射电镜形态观察图；

图5为本发明试验例1中采用不同方法制备的金银花纳米囊泡对经牙龈卟啉单胞菌分离得到的脂多糖(LPS-PG)诱导后人牙龈上皮细胞存活率的影响情况；

图6为本发明试验例1中采用不同方法制备的金银花纳米囊泡的实验性牙周炎大鼠经纳米囊泡治疗后牙周探诊深度评分；

图7为本发明试验例1中采用不同方法制备的金银花纳米囊泡的实验性牙周炎大鼠经纳米囊泡治疗后牙龈指数评分；

图8为本发明试验例1中采用不同方法制备的金银花纳米囊泡的实验性牙周炎大鼠经纳米囊泡治疗后牙龈上皮炎性因子表达的改变情况；

图9为本发明试验例1中采用不同方法制备的金银花纳米囊泡的实验性牙周炎大鼠经纳米囊泡治疗后釉牙骨质界到牙槽骨嵴(CEJ-ABC)的距离。

具体实施方式

为了能使本领域技术人员更好的理解本发明，现结合具体实施方式对本发明进行更进一步的阐述。

实施例1

采用如附图1所示的工艺流程来制备金银花纳米囊泡，具体操作步骤如下：

S1，采用超微粉碎机将100g干金银花通过重压研磨的方式进行超微粉碎，粉碎颗粒至200目，然后加入500mL纯水，经过物料搅拌机加热升温至25℃，低速搅拌使物料分散均匀，保温搅拌1h，然后加入占金银花水溶液重量25％的纤维素酶和果胶酶，纤维素酶与果胶酶的重量比为1:1，于25℃下继续保温酶解3h，使纤维素酶和果胶酶在混合溶液中的最终重量分数为2％，得到金银花纳米囊泡酶解液；

S2，将S1中获得的金银花纳米囊泡酶解液，先于500×g的离心力下进行低速固液分离10min，获得第一次分离上清液，将获得的第一次分离上清液继续在1000×g的离心力下进行低速固液分离20min，获得第二次分离上清，将获得的第二次分离上清液继续在3000×g的离心力下低速固液分离40min，获得第三次分离上清，即制得金银花纳米囊泡粗溶液；

S3，先将海藻糖酸钠与焦磷酸四钾溶于水制成复合溶液，复合溶液中，海藻糖酸钠与焦磷酸四钾的重量比为2：1，然后向S2中获得的第三次分离上清液中加入混合溶液总重量10％的海藻糖酸钠和焦磷酸四钾混合溶液进行修饰，然后加热至16℃，保温搅拌2h，使海藻糖酸钠和焦磷酸四钾复合溶液最终占整体混合溶液的重量分数为3％，然后采用0.45μm孔径的超滤膜进行超滤，超滤后于4℃在150000×g的离心力下离心1h，弃去上清液，取沉淀，用磷酸盐缓冲溶液重悬，即制得稳定长效的金银花纳米囊泡。

采用本实施例的方法所制得金银花纳米囊泡的粒子追踪分析粒径的分析结果如附图2所示。

附图2的结果显示，所制得金银花纳米囊泡的平均粒径为146.3nm，符合植物纳米囊泡的粒径范围。

另外，对所制得金银花纳米囊泡的Zeta电位分析结果如附图3所示，附图3中，横坐标代表电位，纵坐标代表总计数，图中显示，金银花纳米囊泡的Zeta电位为-8.25mV。

同时，采用透射电镜对所制得金银花纳米囊泡进行表征，见附图4所示，显然，所获得的金银花纳米球泡呈圆形或者椭圆形，具有茶托样或凹半球样结构，立体结构清晰，且具有明显的膜。

实施例2

与实施例1不同的是，S3中，超滤时所采用的超滤膜的孔径为0.25μm，其余操作及条件均同实施例1。

实施例3

与实施例1不同的是，S3中，采用海藻糖酸钠和焦磷酸四钾对金银花纳米囊泡进行修饰时的温度为13℃，其余操作及条件均同实施例1。

实施例4

与实施例1不同的是，S3中，采用海藻糖酸钠和焦磷酸四钾对金银花纳米囊泡进行修饰时的温度为8℃，其余操作及条件均同实施例1。

实施例5

与实施例1不同的是，S3中，海藻糖酸钠和焦磷酸四钾溶液占混合溶液重量的20％，其余操作及条件均同实施例1。

对比例1

与实施例1不同的是，本对比例中采用沉淀法来制备金银花纳米囊泡，仅S3与实施例1有所区别，S3中的具体操作如下：

采用同实施例1中相同的方法对S2中制得的金银花纳米囊泡粗溶液进行修饰之后，加入等体积的聚乙二醇8000/NaCl，混匀后于4℃下过夜，然后在10000×g的离心力下离心1h，收集沉淀，用适量磷酸盐缓冲溶液进行重悬，制得金银花纳米囊泡。

对比例2

与实施例1不同的是，本对比例中采用超速离心法来制备金银花纳米囊泡，仅S3与实施例1有所区别，S3中的具体操作如下：

采用同实施例1中相同的方法对S2中制得的金银花纳米囊泡粗溶液进行修饰之后，直接用超速离心机在150000×g的离心力下于4℃下离心1h，收集沉淀，用适量磷酸盐缓冲溶液进行重悬，制得金银花纳米囊泡。

对比例3

与实施例1最大区别在于，S3中不添加海藻糖酸钠和焦磷酸四钾进行修饰，直接进行过滤，其它操作步骤及条件均同实施例1。

对比例4

与实施例1最大区别在于，S1中所加入的酶为木质素酶，木质素酶的添加重量占金银花水溶液重量的25％，其它操作步骤以及条件均同实施例1。

对比例5

与实施例1最大区别在于，S3中，采用海藻糖酸钠和焦磷酸四钾对金银花纳米囊泡的粗溶液进行修饰，修饰的温度为25℃，其它操作步骤以及条件均同实施例1。

对比例6

与实施例1最大区别在于，S3只添加海藻糖酸钠进行修饰，海藻酸钠溶液的重量占混合溶液总重量的10％，其它操作步骤及条件均同实施例1，其它操作步骤及条件均同实施例1。

对实施例1-5以及对比例1-6中所制备的金银花纳米囊泡的性能进行表征，采用Bradford法测定各实验组中金银花纳米囊泡产品的蛋白质浓度，用试剂盒测定micRNA的浓度，结果如下表1所示。

表1各实验组制备的金银花纳米囊泡中蛋白质及micRNA的浓度

根据上表数据可知，实施例1获得的金银花纳米囊泡中蛋白质的含量最高达到6.98mg/mL，micRNA的含量达163.55ng/μL，在各实施例中的效果最佳。

实施例2仅在实施例1的基础上调整了S3步骤中超滤所采用的超滤膜孔径，将超滤膜的孔径由0.45μm替换为0.25μm，结果所获得的金银花纳米囊泡中蛋白质以及micRNA的含量均有所降低，这可能是由于：金银花纳米囊泡的粒径在146nm左右，在同时通过0.25μm孔径时，会由于拥挤无法全部过滤通过，甚至使滤孔堵塞；而通过使用0.45μm滤膜，不仅使得几乎全部金银花滤膜通过，还能有效除菌且过滤了杂质。

实施例3-4中，在实施例1的基础上，适当降低了海藻糖酸钠和焦磷酸四钾修饰时的温度，所获得的金银花纳米囊泡中蛋白及micRNA的含量均有所下降；原因可能是：在适宜温度条件下，海藻糖酸钠和焦磷酸四钾可以很容易地形成保护膜，而在低温条件下形成保护膜速度较慢，在同一时间下，对金银花纳米囊泡的保护相对较少。

对比例1-2中采用沉淀法、超速离心法来制备金银花纳米囊泡，所获得的金银花纳米囊泡中活性成分如蛋白及micRNA的含量远低于各实施例中，并且得到的金银花纳米囊泡纯度低，杂质多。

上述的对比例3中，对获得的金银花纳米囊泡粗溶液不采用任何成分进行修饰，显然，纳米囊泡中的蛋白质及micRNA的含量较各实施例中显著降低，此外，对比例6中，仅采用海藻糖酸钠对金银花纳米囊泡粗溶液进行修饰，没有添加焦磷酸四钾，所获得的金银花纳米囊泡中蛋白及micRNA的含量较实施例1中采用两种成分进行修饰时均有显著降低，主要原因是，海藻糖酸钠作为一种纯天然的糖原，其能够在外泌体表面形成独特的保护膜；焦磷酸四钾虽只有单一的锁水作用，但能有助于提高海藻糖酸钠的保水性，从而起到低温分离时的抗冻裂作用，这也进一步证明了海藻糖酸钠和焦磷酸四钾的协同修饰才能更好地减少分离和保存过程中纳米囊泡的损失。

可见，本发明中采用海藻糖酸钠与焦磷酸四钾两种成分对金银花纳米囊泡进行修饰确实起到了良好的协同效果。

对比例4中采用木质酶素替换掉纤维素酶和果胶酶后所获得的金银花纳米囊泡中蛋白及micRNA的含量远低于各实施例，原因是植物细胞壁中主要含有的成分为纤维素和果胶，纤维素酶可以分解金银花细胞壁，果胶酶配合纤维素酶的使用，降解细胞壁中的果胶，可以高效的促进金银花纳米囊泡的溶出；而木质素酶只分解植物细胞壁中的木质素，不能高效促进金银花纳米囊泡的溶出。

对比例5中，采用海藻糖酸钠和焦磷酸四钾对金银花纳米囊泡粗溶液进行修饰时所采用的温度较高，其中的蛋白质及micRNA的含量明显减少，主要是由于较高的温度可以导致海藻糖分解，使得其中的micRNA更易受到氧化和水解等化学反应的影响而损失。

除了以上的实验之外，本发明针对步骤S3中的海藻糖酸钠和焦磷酸四钾的添加量以及二者的复配比例对最终所获得金银花纳米囊泡产品稳定性的影响也进行了相关的验证实验，具体实验如下。

对比例7

本对比例是在对比例3的基础上进行的筛选试验，即不采用任何成分对金银花纳米囊泡粗溶液进行修饰获得的金银花纳米囊泡粗溶液，其蛋白质浓度为1.12mg/mL，micRNA浓度为37.1ng/μL。

采用不同配比的海藻糖酸钠与焦磷酸四钾进行修饰，并对所获得金银花纳米囊泡溶液放置28d，分别测定放置后金银花纳米囊泡蛋白质浓度和micRNA浓度。结果如下表2所示。

表2海藻糖酸钠与焦磷酸四钾的不同配比下产品稳定性情况

对比例8

本对比例是在对比例3的基础上进行的筛选试验，即不采用任何成分对金银花纳米囊泡粗溶液进行修饰获得的金银花纳米囊泡粗溶液，其蛋白质浓度为1.12mg/mL，micRNA浓度为37.1ng/μL。

采用不同添加量的海藻糖酸钠与焦磷酸四钾进行修饰，并对所获得金银花纳米囊泡溶液放置28d，分别测定放置后金银花纳米囊泡蛋白质浓度和micRNA浓度。结果如下表3所示。

表3海藻糖酸钠与焦磷酸四钾的不同添加量下产品稳定性情况

对比例7-8中的实验数据表明，海藻糖酸钠与焦磷酸四钾的混合物的添加比例以及添加量均会对产品最终的稳定性有至关重要的影响，采用适当比例及添加量的两种成分对金银花纳米囊泡粗溶液进行修饰有利于产品的稳定性的保持。

试验例1

对本发明的实施例1-5以及对比例1-6中所制备的金银花纳米囊泡的性能进行验证具体实验操作如下：

1.1细胞实验

体外培养细胞后，将人牙龈上皮细胞分为空白组、建模组、实施例1-5组、对比例1-6组。先将细胞通过LPS-PG处理12h后，再加不同组别的样品孵育24h，用MTT法检测细胞存活率，结果见下表4以及附图5所示。

表4各实验组人牙龈上皮细胞的存活率

实验组	人牙龈上皮细胞存活率(％)
		空白组	100
建模组	68.35
		实施例1	138.53
实施例2	115.39
		实施例3	121.55
实施例4	126.67
		实施例5	115.33
对比例1	68.67
		对比例2	68.67
对比例3	75.33
		对比例4	72.14
对比例5	70.33
		对比例6	77.04

表4及附图5的MTT结果显示：实施例1-5细胞存活率明显高于对比例1-6，通过不同的提取方法，获得金银花纳米囊泡纯度也不同，显然，本发明的方法能够更有效地提高金银花纳米囊泡的浓度，减少杂质，提高了经LPS-PG诱导后的人牙龈上皮细胞的存活率。

1.2大鼠实验

选取6周龄的SD大鼠，进行随机分组，分别记录为空白组、牙周炎组、实施例1组、实施例2组、实施例3组、实施例4组、实施例5组、对比例1组、对比例2组、对比例3组、对比例4组、对比例5组和对比例6组。在大鼠上颌的第二颗磨牙周围埋入5-0医用丝线，结扎28天诱导牙周炎模型，在第14天，每天进行涂抹给药治疗，在上颌处分别处理：空白组涂抹20uL生理盐水、牙周炎组不给药、实施例1组、实施例2组、实施例3组、实施例4组、实施例5组、对比例1组、对比例2组、对比例3组、对比例4组、对比例5组和对比例6组分别涂抹20ug实施例1、实施例2组、实施例3组、对比例1组、对比例2组、对比例3组、对比例4组、对比例5组和对比例6组制得的用于治疗及缓解大鼠实验性牙周炎的金银花纳米囊泡。

第24天，麻醉大鼠后对大鼠牙周进行临床检查评分，检查结束后处死大鼠取大鼠牙龈上皮利用Elisa检测IL-6的含量，取左上颌骨测量CEJ-ABC的距离。

牙周探诊深度：用探针检测左侧上颌第二磨牙腭侧近中、腭侧中央、腭侧远中、颊侧近中、颊侧中央、颊侧远中，一共6个位点的牙周袋探诊深度。牙周探诊深度表观评分：0分表示探诊深度为1～2mm；1～3分表示探诊深度为3～5mm；4～5分表示探诊深度≥5mm。

牙龈指数评分：通过观察牙周探针轻划龈边缘后出现的表现，根据不同的牙龈表现(炎症、水肿、出血情况)进行评分。将其病变程度：0分健康牙龈；1分牙龈有轻微水肿表现，触之无出血；2分牙龈明显水肿，触之极易出血；3分牙龈有自发出血倾斜或溃疡表现。

测量CEJ-ABC的距离：摘取大鼠左侧上颌骨，用4％多聚甲醛固定。通过Micro-CT评估各组牙槽骨丢失情况，通过CTvox软件获得牙槽骨的三维图像。采用Image j软件对上颌第二磨牙颊近端、腭近端、颊远端和腭远端四个位置的釉牙骨质界与牙槽骨嵴交界处(CEJ-ABC)进行测量，然后计算CEJ-ABC距离进行统计分析。

ELISA试剂盒方法：按照试剂盒中说明书的操作进行检测即可。

采用不同方法制备的金银花纳米囊泡的实验性牙周炎大鼠经纳米囊泡治疗后临床症状指数评分情况见表5以及附图6-7；

采用不同方法制备的金银花纳米囊泡的实验性牙周炎大鼠经纳米囊泡治疗后牙龈上皮炎性因子表达的改变情况见下表6以及附图8；

采用不同方法制备的金银花纳米囊泡的实验性牙周炎大鼠经纳米囊泡治疗后釉牙骨质界到牙槽骨嵴(CEJ-ABC)的距离见下表7以及附图9。

表5大鼠牙周临床检查评分

上述的结果表明，实施例1-5相较于对比例1-6能更有效地缓解由结扎引起的牙周炎临床症状，减轻了牙龈出血、牙齿松动等典型的牙周炎症状，减缓了牙周炎的发展。

表6大鼠牙龈上皮中IL-6含量的变化情况

实验组	IL-6浓度(pg/mL)
		空白组	155.41
建模组	335.86
		实施例1	205.30
实施例2	234.76
		实施例3	232.52
实施例4	227.68
		实施例5	226.56
对比例1	203.38
		对比例2	325.59
对比例3	303.74
		对比例4	332.29
对比例5	312.51
		对比例6	301.71

上述的结果表明，实施例1-5相较于对比例1-6能更有效地减轻结扎引起的大鼠牙龈上皮内炎性因子的升高，更好的抑制了大鼠牙周炎引起的炎症。

表7大鼠左上颌骨CEJ-ABC距离的变化

实验组	CEJ-ABC距离(mm)
		空白组	0.45
建模组	1.07
		实施例1	0.58
实施例2	0.57
		实施例3	0.59
实施例4	0.60
		实施例5	0.60
对比例1	0.98
		对比例2	0.95
对比例3	0.95
		对比例4	1.02
对比例5	0.95
		对比例6	0.91

上述的结果表明，实施例1-5相较于对比例1-6能更有效地减弱由结扎引起的牙周炎大鼠牙槽骨丢失情况，减少骨流失，在牙周炎的治疗中具有骨保护作用。

Claims (8)

1.一种金银花纳米囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1干金银花粉碎，加水混合均匀，获得金银花水溶液，采用纤维素酶和果胶酶对金银花水溶液进行酶解，获得金银花纳米囊泡酶解液；

S2采用差速离心法对S1中获得的金银花纳米囊泡酶解液进行处理，制得金银花纳米囊泡粗溶液；

S3采用海藻糖酸钠和焦磷酸四钾对S2中制得的金银花纳米囊泡粗溶液进行修饰，然后经超滤、超高速离心，磷酸盐缓冲溶液重悬，制得金银花纳米囊泡。

2.如权利要求1所述的一种金银花纳米囊泡的制备方法，其特征在于，S1中，干金银花与水的质量体积比为1 g：（1~10） mL，混合时长1~2 h，混合温度为20~30℃。

3.如权利要求1所述的一种金银花纳米囊泡的制备方法，其特征在于，S1中，所述的纤维素酶和果胶酶的重量之和占金银花水溶液重量的20~30%，纤维素酶与果胶酶的重量比为1：（1~3），酶解的温度为20~30℃，酶解2~3 h，使纤维素酶和果胶酶最终占整体混合溶液重量的1~2.2%。

4.如权利要求1所述的一种金银花纳米囊泡的制备方法，其特征在于，S2中，所述的差速离心法，具体操作如下：将S1中获得的金银花纳米囊泡酶解液，先于500~800×g的离心力下离心10~20 min，弃沉淀，获得第一次分离上清液；将获得的第一次分离上清液在1000~2500×g的离心力下离心20~40min，弃沉淀，获得第二次分离上清液；将所得第二次分离上清液在3000~5000×g的离心力下离心40~60 min，弃沉淀，获得第三次分离上清液，制得金银花纳米囊泡粗溶液。

5.如权利要求1所述的一种金银花纳米囊泡的制备方法，其特征在于，S3中，先将海藻糖酸钠与焦磷酸四钾溶于水制成复合溶液，复合溶液中，海藻糖酸钠与焦磷酸四钾的重量比为（1~3）：（1~3），然后向S2中制得的金银花纳米囊泡粗溶液中加入海藻糖酸钠与焦磷酸四钾复合溶液并于0~20℃下修饰2~3 h，其中，海藻糖酸钠与焦磷酸四钾复合溶液占金银花纳米囊泡粗溶液重量的10~20%，修饰结束后，海藻糖酸钠和焦磷酸四钾复合溶液占整体混合溶液重量分数的2~5%。

6.如权利要求1所述的一种金银花纳米囊泡的制备方法，其特征在于，S3中，超滤时所采用超滤膜的孔径为0.25~0.45 μm。

7.如权利要求1所述的一种金银花纳米囊泡的制备方法，其特征在于，S3中，超滤后于4℃在120000~180000×g的离心力下离心0.5~2 h，取沉淀，用磷酸盐缓冲溶液进行重悬。

8.如权利要求1中所述的一种金银花纳米囊泡在制备缓解牙周炎产品中的应用。