CN118159549A - 免疫调节剂 - Google Patents

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CN118159549A CN202280070362.0A CN202280070362A CN118159549A CN 118159549 A CN118159549 A CN 118159549A CN 202280070362 A CN202280070362 A CN 202280070362A CN 118159549 A CN118159549 A CN 118159549A
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张钟兴
汪涛
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Abstract

本公开文本提供了新型大环肽，其抑制PD‑1/PD‑L1和PD‑L1/CD80蛋白/蛋白相互作用，因此可用于改善各种疾病，包括癌症和感染性疾病。

Description

免疫调节剂
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年10月20日提交的美国临时申请号63/257862的优先权权益，将其通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本公开文本提供了与PD-L1结合并且能够抑制PD-L1与PD-1和CD80的相互作用的大环化合物。这些大环化合物展现出体外免疫调节功效，从而使它们成为治疗包括癌症和感染性疾病在内的各种疾病的治疗候选物。
背景技术
程序性死亡蛋白1(PD-1)是CD28受体家族的抑制性成员，所述受体家族还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1表达于激活的B细胞、T细胞和髓样细胞上。
PD-1蛋白是55kDa的I型跨膜蛋白，其是Ig基因超家族的一部分。PD-1含有近膜免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和远膜基于酪氨酸的开关基序。尽管在结构上与CTLA-4类似，但PD-1缺少MYPPY基序，所述基序对于CD80 CD86(B7-2)结合至关重要。已经鉴定出PD-1的两个配体，即PD-L1(B7-H1)和PD-L2(b7-DC)。已经表明在与表达PD-L1或PD-L2的细胞相互作用后，表达PD-1的T细胞的激活下调。PD-L1和PD-L2二者均是与PD-1结合但不与其他CD28家族成员结合的B7蛋白家族成员。PD-L1配体在多种人类癌症中是丰富的。PD-1与PD-L1之间的相互作用导致肿瘤浸润淋巴细胞的减少、T细胞受体介导的增殖的减少以及癌性细胞的免疫逃逸。免疫抑制可以通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用逆转，并且该效应当PD-1与PD-L2的相互作用也被阻断时是加性的。
还已经表明PD-L1可与CD80相互作用。已经表明表达免疫细胞上PD-L1/CD80的相互作用是抑制性相互作用。已经表明此相互作用的阻断可消除此抑制性相互作用。
当表达PD-1的T细胞接触表达其配体的细胞时，响应于抗原刺激的功能活性(包括增殖、细胞因子分泌和细胞毒性)降低。PD-1/PD-L1或PD-L2相互作用在感染或肿瘤的消退过程中或自我形成过程中下调免疫应答。慢性抗原刺激(如在肿瘤疾病或慢性感染过程中发生的慢性抗原刺激)产生这样的T细胞，其表达升高水平的PD-1并且在对慢性抗原的活性方面是功能失调的。这被称为“T细胞耗竭”。B细胞也展示出PD-1/PD配体抑制和“耗竭”。
已经表明使用针对PD-L1的抗体阻断PD-1/PD-L1连接可在许多系统中恢复和增强T细胞激活。患有晚期癌症的患者受益于使用针对PD-L1的单克隆抗体的疗法。肿瘤和慢性感染的临床前动物模型已经表明，单克隆抗体对PD-1/PD-L1途径的阻断可以增强免疫应答并导致肿瘤排斥或感染的控制。经由PD-1/PD-L1阻断的抗肿瘤免疫疗法可以增强对多种组织学上不同的肿瘤的治疗性免疫应答。
在患有慢性感染的系统中，对PD-1/PD-L1相互作用的干扰导致T细胞活性增强。在患有慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒感染的小鼠中，PD-L1的阻断导致病毒清除改善和免疫力恢复。感染HIV-1的人源化小鼠显示出针对病毒血症和CD4+T细胞的病毒性耗尽的增强的保护作用。通过针对PD-L1的单克隆抗体阻断PD-1/PD-L1可以使来自HIV患者的T细胞恢复体外抗原特异性功能。
还已经表明PD-L1/CD80相互作用的阻断可刺激免疫力。已经表明由PD-L1/CD80相互作用的阻断所产生的免疫刺激通过与进一步的PD-1/PD-L1或PD-1/PD-L2相互作用的阻断组合而增强。
假设免疫细胞表型的改变是脓毒性休克的重要因素。这些改变包括升高的PD-1和PD-L1水平。来自具有升高水平的PD-1和PD-L1的脓毒性休克患者的细胞展现出升高水平的T细胞凋亡。针对PD-L1的抗体可以降低免疫细胞凋亡的水平。此外，与野生型小鼠相比，缺乏PD-1表达的小鼠对脓毒性休克症状更具抵抗力。研究已经揭示，使用抗体阻断PD-L1的相互作用可以抑制不适当的免疫应答并且改善疾病体征。
除了增强对慢性抗原的免疫应答外，还已经表明PD-1/PD-L1途径的阻断可增强对疫苗接种(包括在慢性感染背景下的治疗性疫苗接种)的应答。
PD-1途径是源自慢性感染和肿瘤疾病过程中的慢性抗原刺激的T细胞耗竭中的关键抑制性分子。已经表明通过靶向PD-L1蛋白阻断PD-1/PD-L1相互作用可在体外和体内恢复抗原特异性T细胞免疫功能，包括在肿瘤或慢性感染环境中针对疫苗接种的增强的应答。因此，需要阻断PD-L1与PD-1或CD80的相互作用的药剂。
发明内容
本公开文本提供了大环化合物，其抑制PD-1/PD-L1和CD80/PD-L1蛋白/蛋白相互作用，因此可用于改善各种疾病，包括癌症和感染性疾病。
在其第一实施方案中，本公开文本提供了式(I)的化合物
或其药学上可接受的盐，其中：
A选自
其中：
表示与羰基的附接点，并且表示与氮原子的附接点；
n是0或1；
m是1或2；
u是0或1；
w是0、1或2；
Rx选自氢、氨基、羟基和甲基；
R14和R15独立地选自氢和甲基；
R16a选自氢和C1-C6烷基；
R16选自
-(C(R17a)2)2-X-R30、-(C(R17aR17))0-2-X’-R30、-(C(R17aR17)1-2C(O)NR16a)m’-X’-R30、
-C(R17a)2C(O)N(R16a)C(R17a)2-X’-R31、-(C(R17aR17))1-2C(O)N(R16a)C(R17a)2-X’-R31、
-C(R17a)2[C(O)N(R16a)C(R17a)2]w’-X-R31、-C(R17aR17)1-2[C(O)N(R16a)C(R17aR17)1-2]w’-X’-R31、
-(C(R17a)(R17)C(O)NR16a)n’-H和
-(C(R17a)(R17)C(O)NR16a)m’-C(R17a)(R17)-CO2H；
其中PEGq’间隔子能够插入R16的任何部分中(q’是PEG间隔子中的-(CH2CH2O)-单元的数量)；
其中w’是2或3；
n’是1-6；
m’是0-5；
q’是1-20；
X是1与172个原子之间的链，其中所述原子选自氮、碳和氧，并且其中所述链能够含有一、二、三或四个嵌入其中的选自-NHC(O)-、-NHC(O)NH-和-C(O)NH-的基团；并且其中所述链任选地被一至六个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2、-CH2C(O)NH2和-(CH2)1-2CO2H的基团取代；
X’是1与172个原子之间的链，其中所述原子选自碳和氧，并且其中所述链能够含有一、二、三或四个嵌入其中的选自-NHC(O)-、-NHC(O)NH-和-C(O)NH-的基团；并且其中所述链任选地被一至六个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2和-(CH2)1-2CO2H的基团取代，前提是X’不是未经取代的PEG；
X是1与172个原子之间的链，其中所述原子选自n：
碳和氧，并且其中所述链能够含有一、二、三或四个嵌入其中的选自-NHC(O)-、-NHC(O)NH-和-C(O)NH-的基团；并且其中所述链任选地被一至六个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2、-CH2C(O)NH2和-(CH2)CO2H的基团取代；
X’是1与172个原子之间的链，其中所述原子选自碳和氧，并且其中所述链能够含有一、二、三或四个嵌入其中的选自-NHC(O)-、-NHC(O)NH-和-C(O)NH-的基团；并且其中所述链任选地被一至六个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2和-CH2CO2H的基团取代，前提是X’不是未经取代的PEG；
R30选自-Y-B-COOH、-Y-B-SO3H、-Y-B-S(O)OH和-Y-B-P(O)(OH)2；
R31选自-Y-B-COOH、-Y-B-SO3H、-Y-B-S(O)OH和-Y-B-P(O)(OH)2；
每个R17a独立地选自氢、C1-C6烷基、-CH2OH、-CH2CO2H、-(CH2)2CO2H，
每个R17独立地选自氢、-CH3、(CH2)zN3、-(CH2)zNH2、-X-R31、-(CH2)zCO2H、-CH2OH、CH2C＝CH和-(CH2)z-三唑基-X-R35，其中z是1-6；
R35选自-Y-B-COOH、-Y-B-SO3H、-Y-B-S(O)OH和-Y-B-P(O)(OH)2；
B是5-6元芳基或杂芳基，所述杂芳基含有1-3个选自-O-、-S-和-N-的杂原子；
Y选自键、O、S或S(O)1-2；
Ra、Re、Rj和Rk各自独立地选自氢和甲基；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12和R13独立地选自天然氨基酸侧链和非天然氨基酸侧链或如下所述与对应的邻位R基团形成环；
Rb是甲基，或者Rb和R2与它们所附接的原子一起形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中每个环任选地被一至四个独立地选自氨基、氰基、甲基、卤代基和羟基的基团取代；
Rd是氢或甲基，或者Rd和R4与它们所附接的原子一起能够形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中每个环任选地被一至四个独立地选自氨基、氰基、甲基、卤代基、羟基和苯基的基团取代；
Rg是氢或甲基，或者Rg和R7与它们所附接的原子一起能够形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中每个环任选地被一至四个独立地选自以下的基团取代：氨基、任选地被卤代基取代的苄基、苄氧基、氰基、环己基、甲基、卤代基、羟基、任选地被甲氧基取代的异喹啉基氧基、任选地被卤代基取代的喹啉基氧基、和四唑基；并且其中所述吡咯烷和所述哌啶环任选地与环己基、苯基或吲哚基团稠合；并且
Rl是甲基，或者Rl和R12与它们所附接的原子一起形成选自氮杂环丁烷和吡咯烷的环；其中每个环任选地被一至四个独立地选自氨基、氰基、甲基、卤代基和羟基的基团取代。
在第一实施方案的第一方面，本公开文本提供了式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中A是
在第一实施方案的第二方面：
m是1
w是0；并且
R14、R15和R16a各自是氢。
在第一实施方案的第三方面：
R16选自-(C(R17a)2)2-X-R30、-(C(R17aR17))0-2-X’-R30和-(C(R17aR17)1-2C(O)NR16a)m’-X’-R30。
在第一实施方案的第四方面：
每个R17a选自氢、-CO2H和-CH2CO2H；
X是8与46个原子之间的链，其中所述原子选自碳和氧，并且其中所述链能够含有一、二或三个嵌入其中的-NHC(O)-、C(O)NH基团；并且其中所述链任选地被一或两个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2、-CH2C(O)NH2和-CH2CO2H的基团取代；并且
R30选自
Y选自键、O或S。
在第一实施方案的第五方面，本公开文本提供了式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
A是
m是1
w是0；
R14、R15和R16a各自是氢；并且
R16选自-C(R17a)2C(O)N(R16a)C(R17a)2-X’-R31和-(C(R17aR17))1-2C(O)N(R16a)C(R17a)2-X’-R31。
在第一实施方案的第六方面：
每个R17a选自氢、-CO2H和-CH2CO2H；
X’是8与48个原子之间的链，其中所述原子选自碳和氧，并且其中所述链能够含有一、二或三个嵌入其中的-NHC(O)-或-C(O)NH-基团；并且其中所述链任选地被一或两个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2、-CH2C(O)NH2和-CH2CO2H的基团取代；前提是X’不是未经取代的PEG；并且
R30选自
Y选自键、O或S。
在第一实施方案的第七方面，本公开文本提供了式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
A是
m是1
w是0；
R14、R15和R16a各自是氢；并且
R16选自-C(R17a)2[C(O)N(R16a)C(R17a)2]w’-X-R31和-C(R17aR17)1-2[C(O)N(R16a)C(R17aR17)1-2]w’-X’-R31。
在第一实施方案的第八方面：
每个R17a选自氢、-CO2H和-CH2CO2H；
X是8与48个原子之间的链，其中所述原子选自碳和氧，并且其中所述链能够含有一、二或三个嵌入其中的-NHC(O)-或-C(O)NH-基团；并且其中所述链任选地被一或两个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2、-CH2C(O)NH2和-CH2CO2H的基团取代；并且
R31选自
Y选自键、O或S。
在第一实施方案的第九方面，本公开文本提供了式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
A是
m是1
w是0；
R14、R15和R16a各自是氢；并且
R16是-(C(R17a)(R17)C(O)NR16a)n’-H。
在第一实施方案的第十方面：
每个R17a是氢；并且
每个R17选自氢、-CH3、(CH2)zN3、-(CH2)zNH2、-X-R31、
-(CH2)zCO2H、-CH2OH、CH2C＝CH和-(CH2)z-三唑基-X-R35；前提是至少一个R17不是氢、-CH3或-CH2OH；
z是1-4；
R31选自
Y选自键、O或S；
X是7与155个原子之间的链，其中所述原子选自碳和氧，并且其中所述链能够含有一、二或三个嵌入其中的-NHC(O)-或-C(O)NH-基团；并且其中所述链任选地被一或两个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2、-CH2C(O)NH2和-CH2CO2H的基团取代；并且
R35选自
Y选自键、O或S。
在第一实施方案的第十一方面，本公开文本提供了式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
A是
m是1；
w是0；
R14、R15和R16a各自是氢；并且
R16是-(CR17a)(R17)C(O)NR16a)m’-C(R17a)(R17)-CO2H。
在第一实施方案的第十二方面：
m’是1-3；
每个R17a是氢；
每个R17选自氢、-CH3、(CH2)zN3、-(CH2)zNH2、-X-R31、-(CH2)zCO2H、-CH2OH、CH2C＝CH、-(CH2)z-三唑基-X-R35；
z是1-4；
R31选自
Y选自键、O或S；
X是20与60个原子之间的链，其中所述原子选自碳和氧，并且其中所述链能够含有一、二或三个嵌入其中的-NHC(O)-、-C(O)NH-基团；并且其中所述链任选地被一或两个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2、-CH2C(O)NH2和-CH2CO2H的基团取代；并且
R35选自
Y选自键、O或S。
在第一实施方案的第十三方面，本公开文本提供了式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是苯基C1-C3烷基，其中所述苯基部分任选地被羟基、卤代基或甲氧基取代；R2是C1-C7烷基，或者R2和Rb与它们所附接的原子一起形成哌啶环；R3是NRxRy(C1-C7烷基)、NRuRv羰基C1-C3烷基或羰基C1-C3烷基；R4和Rd与它们所附接的原子一起形成吡咯烷环；R5是羟基C1-C3烷基、咪唑基C1-C3烷基或NRxRy(C1-C7烷基)；R6是羧基C1-C3烷基、NRuRv羰基C1-C3烷基、NRxRy(C1-C7烷基)或C1-C7烷基；R7和Rg与它们所附接的原子一起形成任选地被羟基取代的吡咯烷环；R8和R10是任选地被羧基C1-C3烷基取代的苯并噻吩基或吲哚基C1-C3烷基；R9是羟基C1-C3烷基、氨基C1-C4烷基或C1-C7烷基，R11是C1-C3烷氧基C1-C3烷基或C1-C7烷基；R12是C1-C7烷基或羟基C1-C3烷基；并且R13是C1-C7烷基、羧基C1-C3烷基或-(CH2)3NHC(NH)NH2。
在第一实施方案的第十四方面，本公开文本提供了式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
A是
m是1；
w是0；
R14和R15各自是氢；
R16a是氢或甲基；
Rd是甲基，或者Rd和R4与它们所附接的原子一起形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中每个环任选地被一或两个独立地选自氨基、氰基、甲基、卤代基、羟基和苯基的基团取代；
Rg是甲基，或者Rg和R7与它们所附接的原子一起形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中每个环任选地被一或两个独立地选自以下的基团取代：氨基、任选地被卤代基取代的苄基、苄氧基、氰基、环己基、甲基、卤代基、羟基、任选地被甲氧基取代的异喹啉基氧基、任选地被卤代基取代的喹啉基氧基、和四唑基；并且其中所述吡咯烷和所述哌啶环任选地与环己基、苯基或吲哚基稠合；并且
Rl是甲基，或者Rl和R12与它们所附接的原子一起形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中每个环任选地被的一或两个独立地选自氨基、氰基、甲基、卤代基和羟基的基团取代。
在第二实施方案中，本公开文本提供了式(II)的化合物
或其药学上可接受的盐，其中：
A选自
其中：
n是0或1；
R14和R15独立地选自氢和甲基；
R16a选自氢和C1-C6烷基；
R16选自
-(C(R17a)2)2-X-R30、-(C(R17aR17))0-2-X’-R30、-(C(R17aR17)1-2C(O)NR16a)m’-X’-R30、
-C(R17a)2C(O)N(R16a)C(R17a)2-X’-R31、-(C(R17aR17))1-2C(O)N(R16a)C(R17a)2-X’-R31、
-C(R17a)2[C(O)N(R16a)C(R17a)2]w’-X-R31、-C(R17aR17)1-2[C(O)N(R16a)C(R17aR17)1-2]w’-X’-R31、
-(C(R17a)(R17)C(O)NR16a)n’-H和
-(C(R17a)(R17)C(O)NR16a)m’-C(R17a)(R17)-CO2H；
其中PEGq’间隔子能够插入R16的任何部分中(q’是PEG间隔子中的-(CH2CH2O)-单元的数量)；
其中：
w’是2或3；
n’是1-6；
m’是0-5；
q’是1-20
X是1与172个原子之间的链，其中所述原子选自碳和氧，并且其中所述链能够含有一、二、三或四个嵌入其中的选自-NHC(O)-、-NHC(O)NH-和-C(O)NH的基团；并且其中所述链任选地被一至六个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2、-CH2C(O)NH2和-CH2CO2H的基团取代，
X’是1与172个原子之间的链，其中所述原子选自碳和氧，并且其中所述链能够含有一、二、三或四个嵌入其中的选自-NHC(O)-、-NHC(O)NH-和-C(O)NH的基团；并且其中所述链任选地被一至六个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2和-CH2CO2H的基团取代，前提是X’不是未经取代的PEG；
R30选自
R31选自
每个R17a独立地选自氢、C1-C6烷基、-CH2OH、-CH2CO2H、-(CH2)2CO2H，
每个R17独立地选自氢、-CH3、(CH2)zN3、-(CH2)zNH2、-X-R31、-(CH2)zCO2H、-CH2OH、CH2C＝CH和-(CH2)z-三唑基-X-R35，其中z是1-6并且R35选自
Y选自键、O、S或S(O)1-2；
Ra、Rf、Rj、Rk、Rl和Rm是氢；
Rb和Rc是甲基；
Rg选自氢和甲基；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12独立地选自天然氨基酸侧链和非天然氨基酸侧链或如下所述与对应的邻位R基团形成环；
Rd选自氢和甲基，或者Rd和R4与它们所附接的原子一起形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中每个环任选地被一至四个独立地选自氨基、氰基、甲基、卤代基、卤代甲基和羟基的基团取代；
Re选自氢和甲基，或者Re和R5与它们所附接的原子一起形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中每个环任选地被一至四个独立地选自氨基、氰基、甲基、卤代基、卤代甲基和羟基的基团取代；
Rh选自氢和甲基，或者Rh和R8与它们所附接的原子一起形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中每个环任选地被一至四个独立地选自氨基、氰基、甲基、卤代基、卤代甲基和羟基的基团取代；并且
Ri选自氢和甲基，或者Ri和R9与它们所附接的原子一起形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中每个环任选地被一至四个独立地选自氨基、氰基、甲基、卤代基、卤代甲基和羟基的基团取代。
在第二实施方案的第一方面，本公开文本提供了式(II)的化合物或其药学上可接受的盐，其中
A是
n是1；
R16是-(CR17a)(R17)C(O)NR16a)m’-C(R17a)(R17)-CO2H；
每个R16a是氢；
m’是2、3或4；
每个R17a是氢；
每个R17独立地选自氢、-(CH2)zNH2、-X-R31和-CH2C＝CH，
z是4；
X是26与155个原子之间的链，其中所述原子选自碳和氧，并且其中所述链能够含有一、二或三个嵌入其中的-NHC(O)-或-C(O)NH-基团；并且其中所述链任选地被一或两个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2、-CH2C(O)NH2和-CH2CO2H的基团取代；并且
R31选自
Y选自键、O或S。
在第三实施方案中，本公开文本提供了增强、刺激和/或增加有需要的受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(I)的化合物或其治疗上可接受的盐。在第三实施方案的第一方面，所述方法进一步包括在式(I)的化合物或其治疗上可接受的盐之前、之后或与其同时施用另外的药剂。在第二方面，所述另外的药剂是抗微生物剂、抗病毒剂、细胞毒性剂和/或免疫应答调节剂。
在第四实施方案中，本公开文本提供了抑制有需要的受试者的癌细胞的生长、增殖或转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(I)的化合物或其治疗上可接受的盐。在第四实施方案的第一方面，所述癌症选自黑色素瘤、肾细胞癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非鳞状NSCLC、结直肠癌、去势抵抗性前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肝细胞癌、胰腺癌、头颈部鳞状细胞癌、食道癌、胃肠道癌和乳腺癌以及血液恶性肿瘤。
在第五实施方案中，本公开文本提供了治疗有需要的受试者的感染性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(I)的化合物或其治疗上可接受的盐。在第五实施方案的第一方面，所述感染性疾病由病毒引起。在第二方面，所述病毒选自HIV、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、疱疹病毒和流感病毒。
在第六实施方案中，本公开文本提供了治疗有需要的受试者的脓毒性休克的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(I)的化合物或其治疗上可接受的盐。
在第七实施方案中，本公开文本提供了增强、刺激和/或增加有需要的受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(II)的化合物或其治疗上可接受的盐。在第七实施方案的第一方面，所述方法进一步包括在式(II)的化合物或其治疗上可接受的盐之前、之后或与其同时施用另外的药剂。在第二方面，所述另外的药剂是抗微生物剂、抗病毒剂、细胞毒性剂和/或免疫应答调节剂。在第三方面，所述另外的药剂是HDAC抑制剂。在第四实施方案中，所述另外的药剂是TLR7和/或TLR8激动剂或TLR 7/8双重激动剂。
在第八实施方案中，本公开文本提供了抑制有需要的受试者的癌细胞的生长、增殖或转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(II)的化合物或其治疗上可接受的盐。在第八实施方案的第一方面，所述癌症选自黑色素瘤、肾细胞癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非鳞状NSCLC、结直肠癌、去势抵抗性前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肝细胞癌、胰腺癌、头颈部鳞状细胞癌、食道癌、胃肠道癌和乳腺癌以及血液恶性肿瘤。
在第九实施方案中，本公开文本提供了治疗有需要的受试者的感染性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(II)的化合物或其治疗上可接受的盐。在第九实施方案的第一方面，所述感染性疾病由病毒引起。在第二方面，所述病毒选自HIV、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、疱疹病毒和流感病毒。
在第十实施方案中，本公开文本提供了治疗有需要的受试者的脓毒性休克的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(II)的化合物或其治疗上可接受的盐。
在其中R侧链是被甲基取代的环的一部分的式(I)的化合物中，应理解的是，甲基可以在环中的任何可取代的碳原子上，包括作为大环母结构的一部分的碳。
以下基团优选在每个R位置处。氨基酸可以是D-或L-立体化学并且可以如本公开文本中的其他地方所描述的被取代。
在式(I)的化合物中，优选的R1选自以下的侧链：苯丙氨酸、酪氨酸、3-噻吩-2-基、4-甲基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3-甲氧基苯基丙氨酰、异色氨酸、3-甲基苯丙氨酸、1-萘基丙氨酸、3,4-二氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、3,4-二甲氧基苯丙氨酸、3,4-二氯苯丙氨酸、4-二氟甲基苯丙氨酸、2-甲基苯丙氨酸、2-萘基丙氨酸、色氨酸、4-吡啶基、4-溴苯丙氨酸、3-吡啶基、4-三氟甲基苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、4-甲氧基苯丙氨酸、联苯丙氨酸和3-氯苯丙氨酸；和2,4-二氨基丁烷。
在其中R2不为环的一部分的式(I)的化合物中，优选的R2选自以下的侧链：丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸。
在式(I)的化合物中，优选的R3选自以下的侧链：天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、鸟氨酸(Orn)、赖氨酸、组氨酸、苏氨酸、亮氨酸、丙氨酸、Dap和Dab。
在其中R4不是环的一部分的式(I)的化合物中，优选的R4选自缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸和甘氨酸的侧链。
在式(I)的化合物中，优选的R5选自以下的侧链：组氨酸、天冬酰胺、Dap、Dap(COCH3)、丝氨酸、甘氨酸、Dab、Dab(COCH3)、丙氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸和3-噻唑基丙氨酸。
在式(I)的化合物中，优选的R6选自以下的侧链：亮氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、赖氨酸、3-环己烷、苏氨酸、鸟氨酸、Dab、丙氨酸、精氨酸和Orn(COCH3)。
在其中R7不是环的一部分的式(I)的化合物中，优选的R7选自以下的侧链：甘氨酸、Dab、丝氨酸、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、组氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丙氨酸和Dab(C(O)环丁烷)。
在式(I)的化合物中，优选的R8选自色氨酸和1,2-苯并异噻唑啉基丙氨酸的侧链。
在式(I)的化合物中，优选的R9选自以下的侧链：丝氨酸、组氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、Dab、苏氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酸、缬氨酸、Dap、精氨酸、天冬氨酸和酪氨酸。
在式(I)的化合物中，优选的R10选自以下的侧链：任选地经取代的色氨酸、苯并异噻唑基丙氨酸、1-萘基丙氨酸、甲硫氨酸。
在式(I)的化合物中，优选的R11选自以下的侧链：正亮氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、甲硫氨酸、乙氧基甲烷、丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸、苯基丙烷、谷氨酸、己烷和庚烷。
在其中R12不是环的一部分的式(I)的化合物中，优选的R12选自以下的侧链：正亮氨酸、丙氨酸、乙氧基甲烷、甲硫氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、甲氧基乙烷、亮氨酸、色氨酸、异亮氨酸、谷氨酸、己烷、庚烷和甘氨酸。
在式(I)的化合物中，优选的R13选自以下的侧链：精氨酸、鸟氨酸、丙氨酸、Dap、Dab、亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、赖氨酸、苏氨酸、环丙基甲烷、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、组氨酸和2-氨基丁烷。
在另一个实施方案中，本公开文本提供了选自第一方面的范围内例示的例子的化合物或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体。
在另一个实施方案中，提供了选自第一方面的范围内的化合物的任何子集列表的化合物。
在另一个实施方案中，提供了化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物或其药学上可接受的盐是
在另一方面，本公开文本提供了增强、刺激和/或增加有需要的受试者的免疫应答的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(I)或式(II)的化合物或其药学上可接受的盐。
在另一方面，本公开文本提供了阻断受试者的PD-L1与PD-1和/或CD80的相互作用的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(I)或式(II)的化合物或其药学上可接受的盐。
在另一方面，本公开文本提供了增强、刺激和/或增加有需要的受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(I)或式(II)的化合物或其药学上可接受的盐。在第二方面的第一实施方案中，所述方法进一步包括在式(I)的化合物、式(I)的化合物或其药学上可接受的盐之前、之后或与其同时施用另外的药剂。在第二实施方案中，所述另外的药剂选自抗微生物剂、抗病毒剂、细胞毒性剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR 7/8双重激动剂、HDAC抑制剂和免疫应答调节剂。
在另一方面，本公开文本提供了抑制有需要的受试者的癌细胞的生长、增殖或转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(I)或式(II)的化合物或其药学上可接受的盐。在第三方面的第一实施方案中，所述癌症选自黑色素瘤、肾细胞癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非鳞状NSCLC、结直肠癌、去势抵抗性前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肝细胞癌、胰腺癌、头颈部鳞状细胞癌、食道癌、胃肠道癌和乳腺癌以及血液恶性肿瘤。
在另一个方面，本公开文本提供了治疗有需要的受试者的感染性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(I)或式(II)的化合物或其药学上可接受的盐。在第四方面的第一实施方案中，所述感染性疾病由病毒引起。在第二实施方案中，所述病毒选自HIV、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、疱疹病毒和流感病毒。
在另一方面，本公开文本提供了治疗有需要的受试者的脓毒性休克的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(I)或式(II)的化合物或其药学上可接受的盐。
在另一方面，本公开文本提供了阻断受试者的PD-L1与PD-1和/或CD80的相互作用的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(I)或式(II)的化合物或其药学上可接受的盐。
具体实施方式
除非另外指示，否则具有不饱和化合价的任何原子均被假定为具有足以满足化合价的氢原子。
除非上下文另外规定，否则单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述”包括复数指示物。
如本文所用，术语“或”是逻辑析取(即，和/或)并不指示互斥析取，除非如用术语“或者”、“除非”、“可替代地”和类似作用的词语明确指示。
如本文所用，术语“烷基”是指含有例如从1至12个碳原子、从1至6个碳原子和从1至4个碳原子的支链和直链饱和脂族烃基二者。烷基的例子包括但不限于甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(例如，正丙基和异丙基)、丁基(例如，正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基)和戊基(例如，正戊基、异戊基、新戊基)、正己基、2-甲基戊基、2-乙基丁基、3-甲基戊基和4-甲基戊基。当数字出现在符号“C”之后的下标中时，下标更具体地定义了特定基团可能含有的碳原子的数目。例如，“C1-4烷基”表示具有一至四个碳原子的直链和支链烷基。
如本文所用，术语“环烷基”是指通过从饱和环碳原子上除去一个氢原子而由非芳族单环或多环烃分子衍生的基团。环烷基的代表性例子包括但不限于环丙基、环戊基和环己基。当数字出现在符号“C”之后的下标中时，下标更具体地定义了特定环烷基可能含有的碳原子的数目。例如，“C3-6环烷基”表示具有三至六个碳原子的环烷基。
术语“羟基烷基”包括被一个或多个羟基取代的支链和直链饱和烷基二者。例如，“羟基烷基”包括-CH2OH、-CH2CH2OH和C1-4羟基烷基。
如本文所用，术语“芳基”是指通过除去与一个或多个芳族环键合的一个氢而由含所述一个或多个芳族环的分子衍生的一组原子。芳基的代表性例子包括但不限于苯基和萘基。芳基环可以是未经取代的，或者在化合价允许的情况下可以含有一个或多个取代基。
如本文所用，术语“卤代基”和“卤素”是指F、Cl、Br或I。
本发明的芳族环含有0-3个选自-N-、-S-和-O-的杂原子。它们还包括如下定义的杂芳基。
术语“杂芳基”是指经取代和未经取代的芳族5或6元单环基团和9或10元双环基团，其在至少一个环中具有至少一个杂原子(O、S或N)，所述含有杂原子的环优选地具有1、2或3个独立地选自O、S和/或N的杂原子。含有杂原子的杂芳基的每个环可以含有一个或两个氧或硫原子和/或从一至四个氮原子，条件是每个环中的杂原子总数是四或更少，并且每个环具有至少一个碳原子。构成双环基团的稠环是芳族的，并且可以仅含有碳原子。氮和硫原子可以任选地被氧化，并且氮原子可以任选地被季铵化。双环杂芳基必须仅包括芳族环。杂芳基可以被附接在任何环的任何可用氮或碳原子上。杂芳基环系统可以是未经取代的，或者可以含有一个或多个取代基。
示例性的单环杂芳基包括吡咯基、吡唑基、吡唑啉基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、噻二唑基、异噻唑基、呋喃基、噻吩基、噁二唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基和三嗪基。
示例性的双环杂芳基包括吲哚基、苯并噻唑基、苯并二氧杂环戊烯基、苯并噁唑基、苯并噻吩基、喹啉基、四氢异喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并吡喃基、吲嗪基、苯并呋喃基、色酮基、香豆素基、苯并吡喃基、噌啉基、喹喔啉基、吲唑基和吡咯并吡啶基。
如本文所用，短语“或其药学上可接受的盐”是指至少一种化合物、或所述化合物的至少一种盐、或其组合。例如，“式(I)的化合物或其药学上可接受的盐”包括但不限于一种式(I)的化合物、两种式(I)的化合物、式(I)的化合物的药学上可接受的盐、式(I)的化合物和式(I)的化合物的一种或多种药学上可接受的盐、以及式(I)的化合物的两种或更多种药学上可接受的盐。
如本文所用的“不良事件”或“AE”是与医学治疗的使用相关的任何不利的并且通常是无意的、甚至是不希望的体征(包括异常的实验室发现)、症状或疾病。例如，不良事件可能与响应于治疗的免疫系统的激活或免疫系统细胞(例如，T细胞)的扩增相关。医学治疗可能具有一种或多种相关的AE，并且每种AE可能具有相同或不同级别的严重程度。对能够“改变不良事件”的方法的提及意指降低与不同治疗方案的使用相关的一种或多种AE的发生率和/或严重程度的治疗方案。
如本文所用，“过度增殖性疾病”是指细胞生长超过正常水平的病症。例如，过度增殖性疾病或障碍包括恶性疾病(例如，食道癌、结肠癌、胆管癌)和非恶性疾病(例如，动脉粥样硬化、良性增生和良性前列腺肥大)。
术语“免疫应答”是指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和可溶性大分子的作用，其导致对入侵的病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞的选择性损伤，破坏入侵的病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞，或从人体消除入侵的病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞，或者在自身免疫或病理炎症的情况下，导致对正常的人细胞或组织的选择性损伤、破坏正常的人细胞或组织、或从人体消除正常的人细胞或组织。
术语“程序性死亡蛋白配体1”、“程序性细胞死亡蛋白配体1”、“PD-L1”、“PDL1”、“hPD-L1”、“hPD-LI”和“B7-H1”可互换使用，并且包括人PD-L1的变体、同种型、物种同源物以及与PD-L1具有至少一个共同表位的类似物。完整的PD-L1序列可以在登录号NP_054862下找到。
术语“程序性死亡蛋白1”、“程序性细胞死亡蛋白1”、“蛋白质PD-1”、“PD-1”、“PD1”、“hPD-1”和“hPD-I”可互换使用，并且包括人PD-1的变体、同种型、物种同源物以及与PD-1具有至少一个共同表位的类似物。完整的PD-1序列可以在登录号U64863下找到。
术语“治疗”是指抑制疾病、障碍或病症，即阻止其发展；以及(iii)缓解疾病、障碍或病症，即引起疾病、障碍和/或病症和/或与疾病、障碍和/或病症相关的症状的消退。
本公开文本旨在包括本发明的化合物中存在的原子的所有同位素。同位素包括那些原子数相同但质量数不同的原子。通过一般举例而非限制的方式，氢的同位素包括氘和氚。碳的同位素包括13C和14C。本公开文本的同位素标记的化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与本文所述的方法类似的方法使用适当的同位素标记的试剂代替原本采用的非标记的试剂来制备。此类化合物可以具有多种潜在的用途，例如在测定生物活性时作为标准和试剂。在稳定同位素的情况下，此类化合物可以具有有利地改变生物学、药理学或药代动力学特性的潜力。
本文所述的主题的另一个方面是所公开的化合物作为放射性标记的配体用于开发配体结合测定或用于监测体内吸附、代谢、分布、受体结合或占据或化合物处置的用途。例如，本文所述的大环化合物可以使用放射性同位素制备，并且所得放射性标记的化合物可以用于开发结合测定或用于代谢研究。可替代地并且出于同样的目的，本文所述的大环化合物可以通过使用本领域技术人员已知的方法进行催化氚化而转化为放射性标记的形式。
通过使用本领域技术人员已知的方法添加放射性示踪剂，本公开文本的大环化合物也可以用作PET显像剂。
本领域普通技术人员知道氨基酸包括由以下通用结构表示的化合物：
其中R和R′是如本文所讨论的。除非另外指示，否则如本文所用的术语“氨基酸”(单独或作为另一个基团的一部分)包括但不限于连接到同一个碳(称为“α”碳)的氨基和羧基，其中R和/或R′可以是天然或非天然侧链，包括氢。“α”碳处的绝对“S”构型通常被称为“L”或“天然”构型。在“R”和“R′”(')取代基二者均等于氢的情况下，氨基酸是甘氨酸并且不是手性的。
在没有具体指定的情况下，本文所述的氨基酸可以是D-或L-立体化学并且可以如本公开文本的其他地方所述被取代。应当理解，当未指定立体化学时，本公开文本涵盖具有抑制PD-1与PD-L1和/或CD80和PD-L1之间的相互作用的能力的所有立体化学异构形式或其混合物。化合物的单独立体异构体可以从含有手性中心的可商购的起始材料合成制备，或者通过制备对映异构体产物的混合物，然后进行分离，如转化为非对映异构体的混合物，然后分离或重结晶、色谱技术或在手性色谱柱上的对映异构体的直接分离来制备。特定立体化学的起始化合物是可商购的，或者可以通过本领域已知的技术制备和拆分。
本公开文本的某些化合物可以以可分离的不同的稳定构象形式存在。由于围绕不对称单键的旋转受限(例如，由于空间位阻或环应变)导致的扭转不对称性可能允许不同构象异构体的分离。本公开文本包括这些化合物的每种构象异构体及其混合物。
本公开文本的某些化合物可以以互变异构体存在，所述互变异构体是由分子的质子转移至该分子内的不同原子的现象产生的化合物。术语“互变异构体”还指代平衡存在并且容易从一种异构体转化为另一种异构体的两种或更多种结构异构体中的一种。本文所述的化合物的所有互变异构体均被包括在本公开文本内。
本公开文本的药物化合物可以包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所需生物活性并且不赋予任何不希望的毒理作用的盐(参见例如，Berge,S.M等人,J.Pharm.Sci.,66:1-19(1977))。盐可以在本文所述的化合物的最终分离和纯化过程中获得，或者通过使化合物的游离碱官能团与合适的酸反应或通过使化合物的酸性基团与合适的碱反应来单独获得。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸(如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等)以及衍生自无毒有机酸(如脂族单羧酸和脂族二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等)的盐。碱加成盐包括衍生自碱土金属(如钠、钾、镁、钙等)以及衍生自无毒有机胺(如N,N′-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等)的盐。
本文所述的治疗剂的施用包括但不限于治疗有效量的治疗剂的施用。如本文所用的术语“治疗有效量”是指但不限于治疗通过施用包含本文所述的PD-1/PD-L1结合抑制剂的组合物可治疗的病症的治疗剂的量。该量是足以展现出可检测的治疗或改善效果的量。所述效果可以包括例如但不限于治疗本文列出的病症。对于受试者的精确有效量将取决于受试者的体型和健康状况、所治疗的病症的性质和程度、治疗医师的建议以及选择用于施用的治疗剂或治疗剂的组合。因此，预先指定确切的有效量是没有用的。
在另一个方面，本公开文本涉及使用本公开文本的大环化合物抑制受试者的肿瘤细胞生长的方法。如本文所证明，本公开文本的化合物能够与PD-L1结合、破坏PD-L1与PD-1之间的相互作用、与已知阻断与PD-1的相互作用的抗PD-1单克隆抗体竞争与PD-L1的结合、增强CMV特异性T细胞IFNγ分泌以及增强HIV特异性T细胞IFNγ分泌。因此，本公开文本的化合物可用于改变免疫应答、治疗疾病(如癌症或感染性疾病)、刺激保护性自身免疫应答或刺激抗原特异性免疫应答(例如，通过与目的抗原共施用PD-L1阻断化合物)。
药物组合物
在另一个方面，本公开文本提供了含有与药学上可接受的载体一起配制的本公开文本内所述的一种化合物或化合物组合的组合物，例如药物组合物。本公开文本的药物组合物也可以在组合疗法中施用，即与其他药剂组合施用。例如，组合疗法可以包括与至少一种其他抗炎剂或免疫抑制剂组合的大环化合物。可以在组合疗法中使用的治疗剂的例子在下文关于本公开文本的化合物的用途的部分中有更详细的描述。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。在一些实施方案中，载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。根据施用途径，可以将活性化合物包被在材料中以保护化合物免受可能使化合物失活的酸和其他天然条件的作用。
本公开文本的药物组合物还可以包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的例子包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
本公开文本的药物组合物可以使用本领域已知的多种方法中的一种或多种经由一种或多种施用途径来施用。如熟练技术人员将理解的，施用的途径和/或模式将根据期望的结果而变化。在一些实施方案中，本公开文本的大环化合物的施用途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用的短语“肠胃外施用”意指除肠内和外用施用外的施用方式(通常通过注射施用)，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
无菌可注射溶液可以通过以下方式来制备：将活性化合物以所需量掺入视需要具有上文所列举成分中的一种或组合的适当溶剂中，然后微过滤灭菌。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备分散液，所述无菌媒介物含有基本分散介质和来自上文所列举成分的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，一些制备方法为真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其由先前无菌过滤的溶液产生活性成分和任何另外的所需成分的粉末。
可以用于本公开文本的药物组合物中的合适的水性和非水性载体的例子包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射有机酯(如油酸乙酯)。可以例如通过使用包衣材料(如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。
这些组合物还可以含有辅助剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过上述灭菌程序以及通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等)两种方式来确保防止微生物的存在。还可能希望在组合物中包括等渗剂，如糖、氯化钠等。另外，可以通过包含延迟吸收的试剂(如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射药物形式的延长吸收。
药学上可接受的载体包括无菌水性溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。此类介质和试剂用于药学活性物质的用途是本领域已知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则考虑其在本公开文本的药物组合物中的用途。也可以将补充性活性化合物掺入组合物中。
在制造和储存条件下，治疗性组合物通常必须是无菌且稳定的。可以将组合物配制成溶液、微乳液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。可以例如通过使用包衣(如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。在许多情况下，希望在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸盐和明胶)来实现可注射组合物的延长吸收。
可替代地，本公开文本的化合物可以经由非肠胃外途径施用，所述非肠胃外途径如外用、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或外用施用。
本文考虑的任何药物组合物均可以例如经由任何可接受且合适的口服制剂口服递送。示例性口服制剂包括但不限于例如片剂、锭剂、糖锭剂、水性和油性混悬剂、可分散散剂或颗粒剂、乳剂、硬和软胶囊剂、液体胶囊剂、糖浆剂和酏剂。旨在用于口服施用的药物组合物可以根据本领域已知的用于制造旨在用于口服施用的药物组合物的任何方法来制备。为了提供药学上可口的制剂，根据本公开文本的药物组合物可以含有至少一种选自甜味剂、调味剂、着色剂、缓和剂、抗氧化剂和防腐剂的试剂。
片剂可以例如通过将至少一种式(I)的化合物和/或其至少一种药学上可接受的盐与适合于制造片剂的至少一种无毒的药学上可接受的赋形剂混合来制备。示例性赋形剂包括但不限于例如惰性稀释剂，例如像碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙和磷酸钠；制粒剂和崩解剂，例如像微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、玉米淀粉和海藻酸；粘合剂，例如像淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮和阿拉伯胶；以及润滑剂，例如像硬脂酸镁、硬脂酸和滑石。另外，片剂可以是未包衣的，或者通过已知技术包衣，以掩蔽尝起来令人不快的药物的不良味道，或延迟活性成分在胃肠道中的崩解和吸收，从而维持活性成分的作用持续更长时间。示例性水溶性味道掩蔽材料包括但不限于羟丙基甲基纤维素和羟丙基纤维素。示例性延时材料包括但不限于乙基纤维素和乙酸丁酸纤维素。
硬明胶胶囊剂可以例如通过将至少一种式(I)的化合物和/或其至少一种盐与至少一种惰性固体稀释剂(例如像碳酸钙、磷酸钙和高岭土)混合来制备。
软明胶胶囊剂可以例如通过将至少一种式(I)的化合物和/或其至少一种药学上可接受的盐与至少一种水溶性载体(例如像聚乙二醇)和至少一种油介质(例如像花生油、液体石蜡和橄榄油)混合来制备。
水性混悬剂可以例如通过将至少一种式(I)的化合物和/或其至少一种药学上可接受的盐与至少一种适合于制造水性混悬剂的赋形剂混合来制备，所述赋形剂包括但不限于例如助悬剂，例如像羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、海藻酸、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂，例如像天然存在的磷脂，例如卵磷脂；环氧烷与脂肪酸的缩合产物，例如像聚氧乙烯硬脂酸酯；环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物，例如像十七烷乙烯-氧基鲸蜡醇；环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，例如像聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯；以及环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如像聚乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。水性混悬剂还可以含有至少一种防腐剂，例如像对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸正丙酯；至少一种着色剂；至少一种调味剂；和/或至少一种甜味剂，包括但不限于例如蔗糖、糖精和阿斯巴甜。
油性混悬剂可以例如通过将至少一种式(I)的化合物和/或其至少一种药学上可接受的盐悬浮在植物油(例如像花生油、芝麻油和椰子油)或者悬浮在矿物油(例如像液体石蜡)中来制备。油性混悬剂还可以含有至少一种增稠剂，例如像蜂蜡、硬石蜡和十六醇。为了提供可口的油性混悬剂，可以将上文已经描述的至少一种甜味剂和/或至少一种调味剂添加到油性混悬剂中。油性混悬剂可以进一步含有至少一种防腐剂，包括但不限于例如抗氧化剂，例如像丁基化羟基茴香醚和α-生育酚。
可分散散剂和颗粒剂可以例如通过将至少一种式(I)的化合物和/或其至少一种药学上可接受的盐与至少一种分散剂和/或润湿剂、至少一种助悬剂和/或至少一种防腐剂混合来制备。合适的分散剂、润湿剂和助悬剂在上文已经有描述。示例性防腐剂包括但不限于例如抗氧化剂，例如抗坏血酸。另外，可分散散剂和颗粒剂还可以含有至少一种赋形剂，包括但不限于例如甜味剂、调味剂和着色剂。
至少一种式(I)的化合物和/或其至少一种药学上可接受的盐的乳剂可以例如制备为水包油乳剂。包含式(I)的化合物的乳剂的油相可以以已知方式由已知成分构成。油相可以通过但不限于例如植物油(例如像橄榄油和花生油)、矿物油(例如像液体石蜡)及其混合物来提供。虽然所述相可以仅包含乳化剂，但它可以包含至少一种乳化剂与脂肪或油或与脂肪和油二者的混合物。合适的乳化剂包括但不限于例如天然存在的磷脂，例如大豆卵磷脂；衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如像脱水山梨糖醇单油酸酯；以及偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如像聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。在一些实施方案中，亲水性乳化剂与亲脂性乳化剂一起被包括，所述亲脂性乳化剂充当稳定剂。有时还希望包括油和脂肪二者。一种或多种乳化剂与或不与一种或多种稳定剂一起构成所谓的乳化蜡，并且蜡与油和脂肪一起构成所谓的乳化软膏基质，其形成乳膏配制品的油性分散相。乳剂还可以含有甜味剂、调味剂、防腐剂和/或抗氧化剂。适合于在本公开文本的配制品中使用的乳化剂和乳剂稳定剂包括Tween 60、Span 80、十六十八醇、肉豆蔻醇、单硬脂酸甘油酯、十二烷基硫酸钠、单独或与蜡一起的二硬脂酸甘油酯或本领域熟知的其他材料。
可以将活性化合物与将保护化合物免于快速释放的载体一起制备，如控释配制品，包括植入物、透皮贴剂和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的可生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类配制品的许多方法已获得专利，或者通常是本领域技术人员已知的。参见例如，Robinson,J.R.编辑,Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,Marcel Dekker,Inc.,New York(1978)。
可以用本领域已知的医疗装置施用治疗性组合物。例如，在一个实施方案中，可以将本公开文本的治疗性组合物用无针皮下注射装置(如在美国专利号5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556中披露的装置)施用。可用于本公开文本的熟知的植入物和模块的例子包括：美国专利号4,487,603，其披露了用于以受控的速率分配药物的可植入微输注泵；美国专利号4,486,194，其披露了用于通过皮肤施用药物的治疗装置；美国专利号4,447,233，其披露了用于以精确的输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其披露了用于连续药物递送的可变流量可植入输注设备；美国专利号4,439,196，其披露了具有多室区室的渗透性药物递送系统；以及美国专利号4,475,196，其披露了渗透性药物递送系统。将这些专利通过引用并入本文。许多其他此类植入物、递送系统和模块是本领域技术人员已知的。
在某些实施方案中，可以配制本公开文本的化合物以确保适当的体内分布。例如，血脑屏障(BBB)排斥许多高度亲水性化合物。为了确保本公开文本的治疗性化合物穿过BBB(如果需要)，可以将它们配制在例如脂质体中。对于制造脂质体的方法，参见例如美国专利号4,522,811、5,374,548和5,399,331。脂质体可以包含选择性地转运到特定细胞或器官中从而增强靶向药物递送的一个或多个部分(参见例如，Ranade,V.V.,J.Clin.Pharmacol.,29:685(1989))。示例性的靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如Low等人的美国专利号5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.,153:1038(1988))；大环化合物(Bloeman,P.G.等人,FEBS Lett.,357:140(1995)；Owa is,M.等人,Antimicrob.Agents Chemother.,39:180(1995))；表面活性剂蛋白A受体(Br iscoe等人,Am.J.Physiol.,1233:134(1995))；p120(Schreier等人,J.Biol.Chem.,269:9090(1994))；还参见Keinanen,K.等人,FEBS Lett.,346:123(1994)；Killion,J.J.等人,Immunomethods4:273(1994)。
肽合成
本公开文本的大环肽可以通过本领域已知的方法产生，诸如它们可以化学合成、在无细胞体系中重组合成、在细胞内重组合成或者可以从生物来源中分离。本公开文本的大环肽的化学合成可以使用多种本领域公认的方法进行，所述方法包括逐步固相合成、通过肽片段的构象辅助再连接进行的半合成、克隆或合成肽段的酶连接以及化学连接。本文所述的合成大环肽及其类似物的优选方法是使用诸如以下文献中所描述的各种固相技术的化学合成：Chan,W.C.等人,编辑,Fmoc Solid Phase Synthesis,Oxford UniversityPress,Oxford(2000)；Barany,G.等人,The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,第2卷:"Special Methods in Peptide Synthesis,Part A",第3-284页,Gross,E.等人,编辑,Academic Press,New York(1980)；在Atherton,E.,Sheppard,R.C.Solid Phase PeptideSynthesis:A Practical Approach,IRL Press,Oxford,England(1989)；以及在Stewart,J.M.Young,J.D.Solid-Phase Peptide Synthesis,第2版,Pierce Chemical Co.,Rockford,IL(1984)。优选的策略基于用于暂时保护α-氨基的(9-芴基甲基氧基羰基)基团(Fmoc)与用于暂时保护氨基酸侧链的叔丁基(tBu)的组合(参见例如Atherton,E.等人,"The Fluorenylmethoxycarbonyl Amino Protecting Group",在The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,第9卷:"Special Methods in Peptide Synthesis,Part C",第1-38页,Undenfriend,S.等人,编辑,Academic Press,San Diego(1987)。
所述肽可以从肽的C末端开始，在不溶性聚合物支持物(也称为“树脂”)上以逐步方式合成。通过形成酰胺或酯键，将肽的C末端氨基酸附加到树脂，开始合成。这使得所得肽最终分别作为C末端酰胺或羧酸释放。
合成中使用的C末端氨基酸和所有其他氨基酸需要使它们的α-氨基和侧链官能团(如果存在的话)被差异地保护，使得α-氨基保护基团可以在合成过程中选择性地去除。氨基酸的偶联通过以下方式进行：激活羧基为活性酯，并且使其与附加到树脂的N末端氨基酸的未封闭α-氨基反应。重复α-氨基脱保护和偶联的序列，直到整个肽序列被组装。然后从树脂中释放出肽，伴随着侧链官能团的脱保护，这通常在存在适当的清除剂的情况下进行，以限制副反应。将所得肽最终通过反相HPLC纯化。
作为最终肽的前体所需的肽基树脂的合成利用了商业上可获得的交联聚苯乙烯聚合物树脂(Novabiochem,加利福尼亚州圣地亚哥；Applied Biosystems,加利福尼亚州福斯特市)。对于C末端甲酰胺，优选的固体支持物是：4-(2',4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)-苯氧乙酰基-对-甲基二苯甲基胺树脂(Rink酰胺MBHA树脂)；9-Fmoc-氨基-呫吨-3-基氧基-Merrifield树脂(Sieber酰胺树脂)；4-(9-Fmoc)氨基甲基-3,5-二甲氧基苯氧基)戊酰基氨基甲基-Merrifield树脂(PAL树脂)。第一个和随后的氨基酸的偶联可以分别使用由DIC/HOBt、HBTU/HOBt、BOP、PyBOP或由DIC/6-C1-HOBt、HCTU、DIC/HOAt或HATU生产的HOBt、6-Cl-HOBt或HOAt活性酯来完成。针对受保护的肽片段，优选的固体支持物是：2-氯三苯甲基氯树脂和9-Fmoc-氨基-呫吨-3-基氧基-Merrifield树脂(Sieber酰胺树脂)。通过使Fmoc保护的氨基酸与树脂在二氯甲烷和DIEA中反应，最佳地实现将第一个氨基酸加载到2-氯三苯甲基氯树脂上。如有必要，可以添加少量DMF以溶解氨基酸。
本文所述肽类似物的合成可以通过使用单通道或多通道肽合成器(如CEMLiberty Microwave合成器或Protein Technologies,Inc.Prelude(6通道)或Symphony(12通道)或Symphony X(24通道)合成器)来进行。
有用的Fmoc氨基酸衍生物在以下示出。
用于固相合成的受正交保护的氨基酸的例子
用于它们各自肽的肽基树脂前体可以使用任何标准程序进行切割和脱保护(参见例如，King,D.S.等人,Int.J.Peptide Protein Res.,36:255-266(1990))。所需的方法是在作为清除剂的TIS和作为二硫键还原剂的DTT或TCEP的存在下使用TFA。典型地，将肽基树脂在TFA/TIS/DTT(95:5:1至97:3:1，v:v:w；1-3mL/100mg肽基树脂)中在室温搅拌1.5-3小时。然后将用过的树脂过滤掉，并且将TFA溶液冷却并且添加Et2O溶液。通过离心并且倾析醚层(3x)收集沉淀物。将所得的粗肽直接重新溶解于DMF或DMSO或CH3CN/H2O中，用于通过制备型HPLC纯化或直接用于下一步骤。
具有所需纯度的肽可以通过使用制备型HPLC纯化获得，例如用Waters Model4000或Shimadzu Model LC-8A液相色谱。将粗肽溶液注射到YMC S5 ODS(20x100mm)柱中并且用线性梯度的在水中的MeCN洗脱，两者皆用0.1％TFA缓冲，使用14-20mL/min流速，并且通过在217或220nm下的UV吸光度监测流出物。纯化肽的结构可以通过电喷雾MS分析进行确认。
本文提到的非天然存在的氨基酸的列表在以下提供。
在实施例和本文别处使用以下缩写：
实施例0001-固相肽合成和肽的环化
使用全部或部分注明的本实施例中描述的程序合成表1中所示的大环肽方案1-用于硫醚大环肽的通用合成方法
固相肽合成(SPPS)和大环化的通用方案.
在Symphony肽合成器(Protein Technology Inc.，亚利桑那州图森)，Prelude肽合成器(Protein Technology Inc.，亚利桑那州图森)或Symphony X肽合成器(ProteinTechnology Inc.，亚利桑那州图森)上，当在N2缓流下混合时，将用Fmoc-Pra-OH(0.100mmol)预加载的氯三苯甲基树脂用CH2Cl2溶胀，然后用DMF溶胀。将溶剂排出并且使用以下方法偶联第一氨基酸：当每30秒用N2缓流混合时，通过用20％哌啶在DMF中的溶液洗涤树脂两次将Fmoc基团从树脂支持的构建单元中去除。将树脂用DMF洗涤五到六次。然后添加Fmoc-Gly-OH(0.2M溶液在DMF中)，然后偶联激活剂(即，HATU(Chem-Impex Int'l，0.4M溶液在DMF中)与碱(即，N-甲基吗啉(Aldrich，0.8M在DMF中)。将反应混合物通过氮气缓流搅动1-2h。将试剂从反应器皿中排出，并且将树脂用DMF洗涤五到六次。然后将所得的树脂支持的Fmoc保护的二肽依序脱保护，并且以重迭的方式与第三氨基酸等偶联以得到所需的树脂支持的产物。
通过将树脂在氮气缓流下用20％哌啶在DMF中的溶液洗涤两次将Fmoc基团从N末端去除。将树脂用DMF洗涤(5-6x)。向肽-树脂用氯乙酸酐(0.2M在DMF中)处理，然后用NMM(0.8M在DMF中)处理。重复该反应。在排出所有试剂和溶剂后，将树脂用DMF和DCM洗涤，并且然后干燥。
对从树脂上切割的肽等分试样进行LCMS分析(在室温用少量TFA/TIS/DTT(96:4:1)溶液处理分析量)，以确认所需线性序列的形成。
用TFA/TIS/DTT(96:4:1)溶液处理1.5h后，将肽从树脂上全面脱保护并且切割下来。将树脂通过过滤去除，用少量切割混合剂洗涤，并且将合并的滤液添加到冷Et2O中。将溶液在0℃冷却，以使肽沉淀出溶液。将浆液离心以沉淀固体并且将上清液倾析。添加新鲜Et2O并且将过程重复三次以洗涤固体。向空气干燥的固体中添加DIEA/DMF(1-3mL DIEA在40-45mL DMF中)或0.1M NH4HCO3/乙腈(1/1至3/1(v/v))的溶液，使得溶液的pH大于8。将溶液搅拌16-72h并且通过LCMS监测。将反应溶液通过制备型反相HPLC纯化以获得所需产物。
通用分析方案和合成方法
分析数据：
质谱：“ESI-MS(+)”表示在正离子模式下执行的电喷雾电离质谱；“ESI-MS(-)”表示在负离子模式下执行的电喷雾电离质谱；“ESI-HRMS(+)”表示在正离子模式下执行的高分辨率电喷雾电离质谱；“ESI-HRMS(-)”表示在负离子模式下执行的高分辨率电喷雾电离质谱。检测到的质量按照“m/z”单位名称报告。确切质量大于1000的化合物通常被检测为双电荷或三电荷离子。
将粗材料经由制备型LC/MS纯化。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。
分析型LC/MS条件A：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1x 50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含10mM乙酸铵)；流动相B：95:5的乙腈:水(含10mM乙酸铵)；温度：50℃；梯度：经3分钟0-100％B，然后在100％B下保持0.75分钟；流量：1.0mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件B：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1x 50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；流动相B：95:5的乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：经3分钟0-100％B，然后在100％B下保持0.75分钟；流量：1.0mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件C：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1x 50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含10mM乙酸铵)；流动相B：95:5的乙腈:水(含10mM乙酸铵)；温度：70℃；梯度：经3分钟0-100％B，然后在100％B下保持2.0分钟；流量：0.75mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件D：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1x 50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；流动相B：95:5的乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；温度：70℃；梯度：经3分钟0-100％B，然后在100％B下保持2.0分钟；流量：0.75mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件E：
柱：Kinetex XB C18，3.0x 75mm，2.6μm颗粒；流动相A：在水:乙腈(98:2)中的10mM甲酸铵；流动相B：在水:乙腈(02:98)中的10mM甲酸铵；梯度：经4分钟20％-100％B，然后在100％B下保持0.6分钟；流量：1.0mL/min；检测：在254nm下的UV。
分析型LC/MS条件F：
柱：Ascentis Express C18，2.1x 50mm，2.7μm颗粒；流动相A：在水:乙腈(95:5)中的10mM乙酸铵；流动相B：在水:乙腈(05:95)中的10mM乙酸铵，温度：50℃；梯度：经3分钟0-100％B；流量：1.0mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件G：
柱：X Bridge C18，4.6x 50mm，5μm颗粒；流动相A：在水中的0.1％TFA；流动相B：乙腈，温度：35℃；梯度：经4分钟5％-95％B；流量：4.0mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件H：
柱：X Bridge C18，4.6x 50mm，5μm颗粒；流动相A：10mM NH4OAc；流动相B：甲醇，温度：35℃；梯度：经4分钟5％-95％B；流量：4.0mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件I：
柱：X Bridge C18，4.6x 50mm，5μm颗粒；流动相A：10mM NH4OAc；流动相B：乙腈，温度：35℃；梯度：经4分钟5％-95％B；流量：4.0mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件J：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1x 50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；温度：70℃；梯度：经1.5分钟0-100％B，然后在100％B下保持2.0分钟；流量：0.75mL/min；检测：在254nm下的UV。
分析型LC/MS条件K：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1x 50mm，1.7μm颗粒；流动相A：100％水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：100％乙腈(含0.05％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：经1.0分钟2％-98％B，然后在98％B下保持1.0-1.5分钟；流量：0.80mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件L：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1x 50mm，1.7μm颗粒；缓冲液：10mM乙酸铵。流动相A：缓冲液”CH3CN(95/5)；流动相B：流动相B：缓冲液：ACN(5:95)；温度：50℃；梯度：经2.0分钟20％-98％B，然后在100％B下保持0.2分钟；流量：0.70mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件M：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，3.0x 50mm，1.7μm颗粒；流动相A：95％水和5％水(含0.1％三氟乙酸)；流动相B：95％乙腈和5％水(含0.1％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：经2.0分钟20％-100％B，然后在100％B下保持2.0-2.3分钟；流量：0.7mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件N：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1x 50mm，1.7μm颗粒；流动相A：100％水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：100％乙腈(含0.05％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：经5.0分钟2％-98％B，然后在98％B下保持5.0-5.5分钟；流量：0.80mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件O：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1x 50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：经2分钟2％-98％B，然后在98％B下保持0.5分钟；流量：0.8mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件P：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1x 50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：经3分钟0％-100％B，然后在100％B下保持0.5分钟；流量：1.0mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件Q：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1x 50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：经1分钟0％-100％B，然后在100％B下保持0.5分钟；流量：1.0mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件R：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1x 50mm，1.7μm颗粒；缓冲液：10mM乙酸铵。流动相A：缓冲液”CH3CN(95/5)；流动相B：流动相B：缓冲液:ACN(5:95)；温度：50℃；梯度：经1分钟0％-100％B，然后在100％B下保持0.5分钟；流量：1.0mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件S：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1x 50mm，1.7μm颗粒；流动相A：100％水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：100％乙腈(含0.05％三氟乙酸)；梯度：经1.6分钟2％-98％B，然后在98％B下保持0.2分钟；流量：0.80mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件T：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1x 50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：经2.6分钟2％-98％B，然后在98％B下保持0.4分钟；流量：0.8mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件U：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1x 50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含10mM乙酸铵)；流动相B：95:5的乙腈:水(含10mM乙酸铵)；梯度：经3分钟30％-100％B，然后在100％B下保持0.75分钟；流量：1.0mL/min；检测：在220nm下的UV。
通用程序：
Prelude方法：
所有操作都是在Prelude肽合成器(Protein Technologies)上自动化进行的。除非有说明，否则所有程序都是在安装有底部玻璃料的45mL聚丙烯反应器皿中进行的。反应器皿通过器皿的底部和顶部两者与Prelude肽合成器连接。可以通过器皿的顶部添加DMF和DCM，它们同样沿器皿的侧面向下洗涤。通过反应器皿的底部添加其余试剂，并且其向上穿过玻璃料接触树脂。经由反应器皿的底部去除全部溶液。“周期性搅动”描述了N2气体穿过底部玻璃料的短暂脉冲；所述脉冲持续大约5秒，并且每30秒发生一次。通常不使用超出制备起两周的氨基酸溶液。使用在制备7-14天内的HATU溶液。
Sieber酰胺树脂＝9-Fmoc-氨基呫吨-3-基氧基聚苯乙烯树脂，其中“3-基氧基”描述了与聚苯乙烯树脂连接的位置和类型。所用的树脂是具有Sieber接头(在氮处受Fmoc保护)的聚苯乙烯；100-200目，1％DVB，0.71mmol/g负载量。
Rink＝(2,4-二甲氧基苯基)(4-烷氧基苯基)甲胺，其中“4-烷氧基”描述了与聚苯乙烯树脂连接的位置和类型。使用的树脂是Merrifield聚合物(聚苯乙烯)，带有Rink接头(在氮处受Fmoc保护)；100-200目，1％DVB，0.56mmol/g负载量。
2-氯三苯甲基氯树脂(2-氯三苯基甲基氯树脂)，50-150目，1％DVB，1.54mmol/g负载量。Fmoc-甘氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂，200-400目，1％DVB，0.63mmol/g负载量。
PL-FMP树脂：(4-甲酰基-3-甲氧基苯氧基甲基)聚苯乙烯。
以下列出了使用的常用氨基酸，其中侧链保护基团在括号内指示。
Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(tBu)-OH；Fmoc-Bip-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Orn(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH以及它们对应的D-氨基酸。
“Prelude方法”的程序描述了在0.100mmol规模上进行的实验，其中所述规模由Sieber或Rink或2-氯三苯甲基或PL-FMP树脂的量决定。该规模对应于大约140mg上述Sieber酰胺树脂。通过根据规模的倍数调整所述体积，可以将所有程序从0.100mmol规模进行规模缩小或放大。在氨基酸偶联之前，所有肽合成序列都从树脂溶胀程序(下文称为“树脂溶胀程序”)开始。氨基酸与伯胺N末端的偶联使用以下描述的“单偶联程序”。氨基酸与仲胺N末端或与Arg(Pbf)-和D-Arg(Pbf)-的N末端偶联使用以下描述的“双偶联程序”。
树脂溶胀程序：
向45mL聚丙烯固相反应器皿中添加Sieber酰胺树脂(140mg，0.100mmol)。如下将树脂洗涤(溶胀)两次：通过器皿的顶部向反应器皿中添加DMF(5.0mL)，即“DMF顶洗”，此后将混合物周期性地搅动10分钟，之后通过玻璃料排出溶剂。
单偶联程序：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。将混合物周期性地搅动5.0分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。将混合物周期性地搅动5.0分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(6.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动1.0分钟，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氨基酸(0.2M在DMF中，5.0mL，10当量)、然后HATU(0.4M在DMF中，2.5mL，10当量)以及最后NMM(0.8M在DMF中，2.5mL，20当量)。将混合物周期性地搅动60-120分钟，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤四次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动1.0分钟，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
双偶联程序：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。将混合物周期性地搅动5.0分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。将混合物周期性地搅动5.0分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(6.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动1.0分钟，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氨基酸(0.2M在DMF中，5.0mL，10当量)、然后HATU(0.4M在DMF中，2.5mL，10当量)以及最后NMM(0.8M在DMF中，2.5mL，20当量)。将混合物周期性地搅动1-1.5小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤两次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动1.0分钟，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氨基酸(0.2M在DMF中，5.0mL，10当量)、然后HATU(0.4M在DMF中，2.5mL，10当量)以及最后NMM(0.8M在DMF中，2.5mL，20当量)。将混合物周期性地搅动1-1.5小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤四次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动1.0分钟，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
单偶联手动添加程序A：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。反应暂停。将反应器皿打开并且在器皿的底部保持与仪器附接的同时，使用移液管从器皿的顶部手动添加在DMF(1-2mL)中的非天然氨基酸(2-4当量)，然后将器皿关闭。恢复自动程序并且依序添加HATU(0.4M在DMF中，1.3mL，4当量)和NMM(1.3M在DMF中，1.0mL，8当量)。将混合物周期性地搅动2-3小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤五次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
单偶联手动添加程序B：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。反应暂停。将反应器皿打开并且在器皿的底部保持与仪器附接的同时，使用移液管从器皿的顶部手动添加在DMF(1-1.5mL)中的非天然氨基酸(2-4当量)，然后手动添加HATU(2-4当量，与非天然氨基酸相同的当量)，并且然后关闭器皿。恢复自动程序并且依序添加NMM(1.3M在DMF中，1.0mL，8当量)。将混合物周期性地搅动2-3小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤五次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
类肽装配(50μmol)程序：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动60秒，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加溴乙酸(0.4M在DMF中，2.0mL，16当量)，然后添加DIC(0.4M在DMF中，2.0mL，16当量)。将混合物周期性地搅动1小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤五次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加胺(0.4M在DMF中，2.0mL，16当量)。将混合物周期性地搅动1小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤五次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
氯乙酸酐偶联：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(6.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动一分钟，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氯乙酸酐溶液(0.4M在DMF中，5.0mL，20当量)，然后添加N-甲基吗啉(0.8M在DMF中，5.0mL，40当量)。将混合物周期性地搅动15分钟，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂洗涤两次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(6.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动一分钟，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氯乙酸酐溶液(0.4M在DMF中，5.0mL，20当量)，然后添加N-甲基吗啉(0.8M在DMF中，5.0mL，40当量)。将混合物周期性地搅动15分钟，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤五次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(6.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动一分钟，然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤四次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DCM(6.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动一分钟，然后通过玻璃料排出溶液。然后将树脂用氮气流干燥10分钟。将所得树脂直接用于下一步骤。
Symphony方法：
所有操作都是在12通道Symphony肽合成器(Protein Technologies)上自动化进行的。除非有说明，否则所有程序都是在安装有底部玻璃料的25mL聚丙烯反应器皿中进行的。将反应器皿通过器皿的底部和顶部两者与Symphony肽合成器连接。可以通过器皿的顶部添加DMF和DCM，它们同样沿器皿的侧面向下洗涤。通过反应器皿的底部添加其余试剂，并且其向上穿过玻璃料接触树脂。经由反应器皿的底部去除全部溶液。“周期性搅动”描述了N2气体穿过底部玻璃料的短暂脉冲；所述脉冲持续大约5秒，并且每30秒发生一次。通常不使用超出制备起两周的氨基酸溶液。使用在制备7-14天内HATU溶液。
Sieber酰胺树脂＝9-Fmoc-氨基呫吨-3-基氧基聚苯乙烯树脂，其中“3-基氧基”描述了与聚苯乙烯树脂连接的位置和类型。所用的树脂是具有Sieber接头(在氮处受Fmoc保护)的聚苯乙烯；100-200目，1％DVB，0.71mmol/g负载量。
Rink＝(2,4-二甲氧基苯基)(4-烷氧基苯基)甲胺，其中“4-烷氧基”描述了与聚苯乙烯树脂连接的位置和类型。使用的树脂是Merrifield聚合物(聚苯乙烯)，带有Rink接头(在氮处受Fmoc保护)；100-200目，1％DVB，0.56mmol/g负载量。
2-氯三苯甲基氯树脂(2-氯三苯基甲基氯树脂)，50-150目，1％DVB，1.54mmol/g负载量。
PL-FMP树脂：(4-甲酰基-3-甲氧基苯氧基甲基)聚苯乙烯。
Fmoc-甘氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂，200-400目，1％DVB，0.63mmol/g负载量。
以下列出了使用的常用氨基酸，其中侧链保护基团在括号内指示：
Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(tBu)-OH；Fmoc-Bip-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Al a-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Orn(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH以及它们对应的D-氨基酸。
“Symphony方法”的程序描述了在0.05mmol规模上进行的实验，其中所述规模由与树脂结合的Sieber或Rink或氯三苯甲基接头或PL-FMP的量决定。该规模对应于大约70mg上述Sieber树脂。通过根据规模的倍数调整所述体积，可以将所有程序从0.05mmol规模进行规模放大。
在氨基酸偶联之前，所有肽合成序列都从树脂溶胀程序(下文称为“树脂溶胀程序”)开始。氨基酸与伯胺N末端的偶联使用以下描述的“单偶联程序”。氨基酸与仲胺N末端或与Arg(Pbf)-和D-Arg(Pbf)-的N末端偶联使用以下描述的“双偶联程序”。
树脂溶胀程序：
向25mL聚丙烯固相反应器皿中添加树脂(0.05mmol)。如下将树脂洗涤(溶胀)：向反应器皿中添加DMF(2.0-3.0mL，1-2次)，此后将混合物周期性地搅动10分钟，之后通过玻璃料排出溶剂。有时如下将树脂洗涤(溶胀)：向反应器皿中添加CH2Cl2(3-5mL，2次)，其中将混合物周期性地搅动30min并且通过玻璃料排出溶剂。然后添加DMF(2.0-3.0mL，1-6次)，此后将混合物周期性地搅动2-10分钟，之后通过玻璃料排出溶剂。
单偶联程序：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加DMF(2.5-3.75mL)三次，此后将混合物搅动30秒，之后每次通过玻璃料排出溶剂。向树脂中添加哌啶:DMF(20:80v/v，3.0-3.75mL)。将混合物周期性地搅动5.0分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，3.0-3.75mL)。将混合物周期性地搅动5.0分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。有时第三次进行脱保护步骤。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，向器皿中添加DMF(2.5-3.75mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，之后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氨基酸(0.2M在DMF中，2.0-2.5mL，8-10当量)，然后添加HATU(0.4M在DMF中，1.0-1.25mL，8-10当量)，并且最后添加NMM(0.8M在DMF中，1.0-1.25mL，20当量)。将混合物周期性地搅动30-120分钟，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，添加DMF(2.5-3.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，之后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
单偶联手动添加程序：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加DMF(3.0-3.75mL)三次，此后将混合物搅动30秒，之后每次通过玻璃料排出溶剂。向树脂中添加哌啶:DMF(20:80v/v，3.0-3.75mL)。将混合物周期性地搅动5.0分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，3.0-3.75mL)。将混合物周期性地搅动5.0分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。将混合物周期性地搅动5.0分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，向器皿中添加DMF(3.0-3.75mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，之后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加预混合的氨基酸(2.0-5.0当量)和HATU(0.4M在DMF中，2.0-5.0当量)，然后添加NMM(0.8M在DMF中，4.0-10.0当量)，并且氨基酸、HATU和NMM的摩尔比为1:1:2。将混合物周期性地搅动2-6小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤四次：对于每次洗涤，添加DMF(3.75mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
双偶联程序：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加DMF(2.5-3.75mL)三次，此后将混合物搅动30秒，之后每次通过玻璃料排出溶剂。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，3.0-3.75mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，3.0-3.75mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，添加DMF(3.0-3.75mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，之后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氨基酸(0.2M在DMF中，2.0-2.5mL，8-10当量)，然后添加HATU(0.4M在DMF中，1.0-1.25mL，10当量)，并且最后添加NMM(0.8M在DMF中，1.0-1.25mL，16-20当量)。将混合物周期性地搅动1小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。将树脂用DMF(3.0-3.75mL)洗涤两次并且将所得混合物周期性地搅动30秒，之后每次通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氨基酸(0.2M在DMF中，2.0-2.5mL，8-10当量)，然后添加HATU(0.4M在DMF中，1.0-1.25mL，8-10当量)，并且最后添加NMM(0.8M在DMF中，1.0-1.25mL，16-20当量)。将混合物周期性地搅动1-2小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，添加DMF(3.0-3.75mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，之后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
类肽装配(50μmol)程序：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，3.75mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，3.75mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，向器皿中添加DMF(3.75mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，之后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加溴乙酸(0.4M在DMF中，2.5mL，10当量)，然后添加DIC(0.4M在DMF中，2.5mL，10当量)。将混合物周期性地搅动60min，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤两次：对于每次洗涤，向器皿中添加DMF(3.75mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，之后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加胺(0.4M在DMF中，2.5mL，10当量)，将混合物周期性地搅动60min，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤五次：对于每次洗涤，向器皿中添加DMF(3.75mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，之后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
氯乙酸酐偶联：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加DMF(3.0-3.75mL)三次，此后将混合物搅动30秒，之后每次通过玻璃料排出溶剂。向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，3.0-3.75mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，3.0-3.75mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(3.0-3.75mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氯乙酸酐溶液(0.4M在DMF中，3.0-3.75mL，30当量)，然后添加NMM(0.8M在DMF中，2.5mL，40当量)。将混合物周期性地搅动15分钟，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂洗涤一次：通过器皿顶部添加DMF(5.0-6.25mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氯乙酸酐溶液(0.4M在DMF中，3.75mL，30当量)，然后添加NMM(0.8M在DMF中，2.5mL，40当量)。将混合物周期性地搅动15分钟，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(2.5mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤四次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DCM(2.5mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂使用氮气流干燥10min，之后直接用于下一步骤。
Symphony X方法：
所有操作都是在Symphony X肽合成器(Protein Technologies)上自动化进行的。除非有说明，否则所有程序都是在安装有底部玻璃料的45mL聚丙烯反应器皿中进行的。反应器皿通过器皿的底部和顶部两者与Symphony X肽合成器连接。可以通过器皿的顶部添加DMF和DCM，它们同样沿器皿的侧面向下洗涤。通过反应器皿的底部添加其余试剂，并且其向上穿过玻璃料接触树脂。经由反应器皿的底部去除全部溶液。“周期性搅动”描述了N2气体穿过底部玻璃料的短暂脉冲；所述脉冲持续大约5秒，并且每30秒发生一次。“单发(singleshot)”添加模式描述了包含在单发falcon管(通常是小于5mL的任何体积)中的所有溶液的添加。通常不使用超出制备起两周的氨基酸溶液。使用在制备14天内的HATU溶液。
Sieber酰胺树脂＝9-Fmoc-氨基呫吨-3-基氧基聚苯乙烯树脂，其中“3-基氧基”描述了与聚苯乙烯树脂连接的位置和类型。所用的树脂是具有Sieber接头(在氮处受Fmoc保护)的聚苯乙烯；100-200目，1％DVB，0.71mmol/g负载量。
Rink＝(2,4-二甲氧基苯基)(4-烷氧基苯基)甲胺，其中“4-烷氧基”描述了与聚苯乙烯树脂连接的位置和类型。使用的树脂是Merrifield聚合物(聚苯乙烯)，带有Rink接头(在氮处受Fmoc保护)；100-200目，1％DVB，0.56mmol/g负载量。
2-氯三苯甲基氯树脂(2-氯三苯基甲基氯树脂)，50-150目，1％DVB，1.54mmol/g负载量。Fmoc-甘氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂，200-400目，1％DVB，0.63mmol/g负载量。
PL-FMP树脂：(4-甲酰基-3-甲氧基苯氧基甲基)聚苯乙烯。
以下列出了使用的常用氨基酸，其中侧链保护基团在括号内指示：Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(tBu)-OH；Fmoc-Bip-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Orn(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH以及它们对应的D-氨基酸。
“Symphony X方法”的程序描述了在0.050mmol规模上进行的实验，其中所述规模由与树脂结合的Sieber或Rink或2-氯三苯甲基或PL-FMP的量决定。该规模对应于大约70mg上述Sieber酰胺树脂。通过根据规模的倍数调整所述体积，可以将所有程序的规模放大超过或小于0.050mmol规模。在氨基酸偶联之前，所有肽合成序列都从树脂溶胀程序(下文称为“树脂溶胀程序”)开始。氨基酸与伯胺N末端的偶联使用以下描述的“单偶联程序”。使用以下描述的“双偶联程序”或“单偶联2小时程序”将氨基酸与仲胺N末端或与Arg(Pbf)-和D-Arg(Pbf)-或D-Leu的N末端偶联。除非另有说明，否则自动合成的最后一步是乙酰基装配，如“氯乙酰基酸酐装配”中所述。所有合成都用描述为“标准最终冲洗和干燥程序”的最终的冲洗和干燥步骤结束。
树脂溶胀程序：
向45mL聚丙烯固相反应器皿中添加Sieber酰胺树脂(70mg，0.050mmol)。如下将树脂洗涤(溶胀)三次：通过器皿的顶部向反应器皿中添加DMF(5.0mL)“DMF顶洗”，此后将混合物周期性地搅动3分钟，之后通过玻璃料排出溶剂。
单偶联程序：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氨基酸(0.2M在DMF中，2.0mL，8当量)、然后HATU(0.4M在DMF中，1.0mL，8当量)以及最后NMM(0.8M在DMF中，1.0mL，16当量)。将混合物周期性地搅动1-2小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤五次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
单偶联4等效程序：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氨基酸(0.2M在DMF中，1.0mL，4当量)，然后HATU(0.2M在DMF中，1.0mL，4当量)，并且最后NMM(0.8M在DMF中，1.0mL，16当量)。将混合物周期性地搅动1-2小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤五次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
双偶联程序：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氨基酸(0.2M在DMF中，2.0mL，8当量)、然后HATU(0.4M在DMF中，1.0mL，8当量)以及最后NMM(0.8M在DMF中，1.0mL，16当量)。将混合物周期性地搅动1小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤两次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氨基酸(0.2M在DMF中，2.0mL，8当量)、然后HATU(0.4M在DMF中，1.0mL，8当量)以及最后NMM(0.8M在DMF中，1.0mL，16当量)。将混合物周期性地搅动1-2小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤五次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
双偶联4等效程序：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氨基酸(0.2M在DMF中，1.0mL，4当量)，然后HATU(0.2M在DMF中，1.0mL，4当量)，并且最后NMM(0.8M在DMF中，1.0mL，16当量)。将混合物周期性地搅动1小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤两次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氨基酸(0.2M在DMF中，1.0mL，4当量)，然后HATU(0.2M在DMF中，1.0mL，4当量)，并且最后NMM(0.8M在DMF中，1.0mL，16当量)。将混合物周期性地搅动1-2小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤五次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
单偶联手动添加程序A：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。反应暂停。将反应器皿打开并且在器皿的底部保持与仪器附接的同时，使用移液管从器皿的顶部手动添加在DMF(1-1.5mL)中的非天然氨基酸(2-4当量)，然后将器皿关闭。恢复自动程序并且依序添加HATU(0.4M在DMF中，1.0mL，8当量)和NMM(0.8M在DMF中，1.0mL，16当量)。将混合物周期性地搅动2--3小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤五次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
单偶联手动添加程序B：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。反应暂停。将反应器皿打开并且在器皿的底部保持与仪器附接的同时，使用移液管从器皿的顶部手动添加在DMF(1-1.5mL)中的非天然氨基酸(2-4当量)，然后手动添加HATU(2-4当量，与非天然氨基酸相同的当量)，然后关闭器皿。恢复自动程序并且依序添加NMM(0.8M在DMF中，1.0mL，16当量)。将混合物周期性地搅动2-3小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤五次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
单偶联手动添加程序C：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。反应暂停。将反应器皿打开并且在器皿的底部保持与仪器附接的同时，使用移液管从器皿的顶部手动添加在含有HATU(相对于非天然氨基酸等摩尔量)和NMM(4-8当量)的DMF(1-1.5mL)中的非天然氨基酸(2-4当量)。恢复自动程序并且将混合物周期性地搅动2-3小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤五次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
单偶联手动添加程序D：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。反应暂停。将反应器皿打开并且在器皿的底部保持与仪器附接的同时，使用移液管从器皿的顶部手动添加在含有DIC(相对于非天然氨基酸等摩尔量)和HOAt(相对于非天然氨基酸等摩尔量)的DMF(1-1.5mL)中的非天然氨基酸(2-4当量)。恢复自动程序并且将混合物周期性地搅动2-3小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤五次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
类肽装配(50μmol)程序：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，3.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，3.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(3.0mL)，并将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加溴乙酸(0.4M在DMF中，1.0mL，8当量)，然后添加DIC(0.4M在DMF中，1.0mL，8当量)。将混合物周期性地搅动1小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤两次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(4.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加胺(0.4M在DMF中，2.0mL，16当量)。将混合物周期性地搅动1小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤五次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(3.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
氯乙酸酐偶联：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，3.0mL)。将混合物周期性地搅动3.5或5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，3.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(3.0mL)，并将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氯乙酸酐溶液(0.4M在DMF中，2.5mL，20当量)，然后添加N-甲基吗啉(0.8M在DMF中，2.0mL，32当量)。将混合物周期性地搅动15分钟，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂洗涤两次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(3.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动1.0分钟，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氯乙酸酐溶液(0.4M在DMF中，2.5mL，20当量)，然后添加N-甲基吗啉(0.8M在DMF中，2.0mL，32当量)。将混合物周期性地搅动15分钟，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤五次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(3.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动1.0分钟，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
最终冲洗和干燥程序：
如下将来自先前步骤的树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DCM(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。然后将树脂使用氮气流干燥10分钟。将所得树脂直接用于下一步骤。
通用脱保护、环化、N-甲基化、点击、铃木程序：
全面脱保护方法A：
除非有说明，否则所有操作都手动进行。“全面脱保护方法”的程序描述了在0.050mmol规模上进行的实验，其中所述规模由Sieber或Rink或Wang或氯三苯甲基树脂或PL-FMP树脂的量决定。通过根据规模的倍数调整所述体积，可以将所述程序的规模放大超过0.05mmol规模。在50mL Falcon管中添加树脂和2.0-5.0mL切割混合剂(TFA:TIS:DTT，v/v/w＝95:5:1)。用于每个单独线性肽的切割混合剂的体积可以是可变的。总体上，肽侧链中存在的保护基团数量越多，就需要越大体积的切割混合剂。将混合物在室温振荡1-2小时，通常约1.5小时。向悬浮液中添加35-50mL冷乙醚。将混合物剧烈混合，此后沉淀出大量白色固体。将混合物离心3-5分钟，然后将溶液从固体倾析并且丢弃。将固体悬浮在Et2O(30-40mL)中，然后将混合物离心3-5分钟；并且将溶液从固体倾析并且丢弃。最后一次，将固体悬浮在Et2O(30-40mL)中；将混合物离心3-5分钟；并且在氮气流下和/或在室真空下干燥后，将溶液从固体倾析并且丢弃，以得到呈白色至灰白色固体的粗肽连同切割的树脂。在同一天使用粗品用于环化步骤。
全面脱保护方法B：
除非有说明，否则所有操作都手动进行。“全面脱保护方法”的程序描述了在0.050mmol规模上进行的实验，其中所述规模由Sieber或Rink或Wang或氯三苯甲基树脂或PL-FMP树脂的量决定。通过根据规模的倍数调整所述体积，可以将所述程序的规模放大超过0.05mmol规模。在30ml bio-rad poly-prep色谱柱中添加树脂和2.0-5.0mL切割混合剂(TFA:TIS:H2O:DTT，v/v/w＝94:3:3:1)。用于每个单独线性肽的切割混合剂的体积可以是可变的。总体上，肽侧链中存在的保护基团数量越多，就需要越大体积的切割混合剂。将混合物在室温振荡1-2小时，通常约1.5小时。将酸性溶液排除到40mL冷乙醚中并且将树脂用0.5mL TFA溶液洗涤两次。将混合物离心3-5分钟，然后将溶液从固体倾析并且丢弃。将固体悬浮在Et2O(35mL)中，然后将混合物离心3-5分钟；并且将溶液从固体中倾析出并且丢弃。最后一次，将固体悬浮在Et2O(35mL)中；将混合物离心3-5分钟；并且在氮气流下和/或在室真空下干燥后，将溶液从固体倾析并且丢弃，以得到呈白色至灰白色固体的粗肽。在同一天使用粗品用于环化步骤。
环化方法A：
除非有说明，否则所有操作都手动进行。“环化方法A”的程序描述了在0.05mmol规模上进行的实验，其中所述规模由用于产生肽的Sieber或Rink或氯三苯甲基或Wang或PL-FMP树脂的量决定。此规模不基于对所述程序中使用的肽量的直接确定。通过根据规模的倍数调整所述体积，可以将所述程序的规模放大超过0.05mmol规模。将来自全面脱保护的粗肽固体在室温溶解在50mL离心管中的DMF(30-45mL)中，并且向溶液中添加DIEA(1.0-2.0mL)并且使以上反应混合物的pH值为8。然后允许将溶液在室温振荡几个小时或过夜或经2-3天。将反应溶液在speedvac或genevac EZ-2上浓缩至干，并且然后将粗残余物溶解在DMF或DMF/DMSO(2mL)中。过滤后，使该溶液经受单化合物反相HPLC纯化，以得到所希望的环肽。
环化方法B：
除非有说明，否则所有操作都手动进行。“环化方法B”的程序描述了在0.05mmol规模上进行的实验，其中所述规模由用于产生肽的Sieber或Rink或氯三苯甲基或Wang或PL-FMP树脂的量决定。此规模不基于对所述程序中使用的肽量的直接确定。通过根据规模的倍数调整所述体积，可以将所述程序的规模放大超过0.05mmol规模。将在50mL离心管中的粗肽固体溶解在CH3CN/0.1M碳酸氢铵水溶液(1:1，v/v，30-45mL)中。然后允许将溶液在室温振荡几个小时。通过pH纸和LCMS检查反应溶液，并且可以通过添加0.1M碳酸氢铵水溶液(5-10mL)将pH调整至超过8。在基于LCMS上线性肽的消失的反应完成后，将反应在speedvac或genevac EZ-2上浓缩至干。向所得残余物中装入CH3CN:H2O(2:3，v/v，30mL)，并且在speedvac或genevac EZ-2上浓缩至干。重复该程序(通常2次)。然后将所得粗固体溶解在DMF或DMF/DMSO或CH3CN/H2O/甲酸中。在过滤后，使溶液经受单化合物反相HPLC纯化，以得到所希望的环肽。
在树脂上的N-甲基化方法A。
向在Bio-Rad管中的树脂(50μmol)中添加CH2Cl2(2mL)并且在室温振荡5min。添加2-硝基苯-1-磺酰氯(44.3mg，200μmol，4当量)，然后添加2,4,6-三甲基吡啶(0.040mL，300μmol，6当量)。将反应在室温振荡2h。将溶剂排出并且将树脂用CH2Cl2(5mL x 3)、DMF(5mL x3)以及然后THF(5mL x 3)冲洗。向树脂中添加THF(1mL)。添加三苯基膦(65.6mg，250μmol，5当量)、甲醇(0.020mL，500μmol，10当量)和偶氮二甲酸二乙酯或DIAD(0.040mL，250μmol，5当量)。将混合物在室温振荡2-16h。将反应重复。添加三苯基膦(65.6mg，250μmol，5当量)、甲醇(0.020mL，500μmol，10当量)和偶氮二甲酸二乙酯或DIAD(0.040mL，250μmol，5当量)。将混合物在室温振荡1-16h。将溶剂排出，并且将树脂用THF(5mL x 3)和CHCl3(5mL x 3)洗涤。将树脂空气干燥并且直接用于下一步骤。将树脂在DMF(2mL)中振荡。添加2-巯基乙醇(39.1mg，500μmol)，然后添加DBU(0.038mL，250μmol，5当量)。将反应振荡1.5h。将溶剂排出。将树脂用DMF(4x)洗涤。空气干燥并且直接用于下一步骤。
在树脂上的N-甲基化方法B(Turner,R.A.等人,Org.Lett.,15(19):5012-5015(2013))。
除非有说明，否则所有的操作都是手动进行的。“在树脂上的N-甲基化方法A”的程序描述了在0.100mmol规模上进行的实验，其中所述规模由用于产生所述肽的与树脂结合的Sieber或Rink接头的量决定。此规模不基于对所述程序中使用的肽量的直接确定。通过根据规模的倍数调整所述体积，可以将所述程序的规模放大超过0.10mmol规模。将树脂转染到25mL有玻璃料的注射筒中。向树脂中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。将混合物振荡3min，并且然后将溶液通过玻璃料排出。将树脂用DMF(4.0mL)洗涤3次。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物振荡3min，并且然后将溶液通过玻璃料排出。将树脂相继用DMF(4.0mL)洗涤三次和DCM(4.0mL)洗涤三次。将树脂悬浮在DMF(2.0mL)和三氟乙酸乙酯(0.119ml，1.00mmol)、l,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(0.181ml，1.20mmol)中。将混合物放置在振荡仪上60min。将溶液通过玻璃料排出。将树脂相继用DMF(4.0mL)洗涤三次和DCM(4.0mL)洗涤三次。将树脂用干THF(2.0mL)洗涤三次，以去除任何残留的水。在烘干的4.0mL小瓶中添加THF(1.0mL)和三苯基膦(131mg，0.500mmol)和干分子筛(20mg)。将溶液转移到树脂并且缓慢添加偶氮二甲酸二异丙酯(0.097mL，0.5mmol)。将树脂搅拌15min。将溶液通过玻璃料排出并且将树脂用干THF(2.0mL)洗涤三次以去除任何残留的水。在烘干的4.0mL小瓶中添加THF(1.0mL)、三苯基膦(131mg，0.50mmol)和干4A分子筛(20mg)。将溶液转移到树脂并且缓慢添加偶氮二甲酸二异丙酯(0.097mL，0.5mmol)。将树脂搅拌15min。将溶液通过玻璃料排出。将树脂相继用DMF(4.0mL)洗涤三次和DCM(4.0mL)洗涤三次。将树脂悬浮在乙醇(1.0mL)和THF(1.0mL)中，并且添加硼氢化钠(37.8mg，1.000mmol)。将混合物搅拌30min并且排出。将树脂相继用DMF(4.0mL)洗涤三次和DCM(4.0mL)洗涤三次。
在树脂上的N-烷基化程序方法A：
将对应于烷基化基团的乙醇(0.046g，1.000mmol)、三苯基膦(0.131g，0.500mmol)和DIAD(0.097mL，0.500mmol)在3mL THF中的溶液添加到硝基苯磺酸化树脂(0.186g，0.100mmol)中，并且将反应混合物在室温搅拌16小时。将树脂用THF(5mL)洗涤三次，并且将以上程序重复1-3次。通过用50μL TIS在1mL TFA中的溶液处理1.5小时的少量树脂样品的TFA微切割来监测反应进程。
在树脂上的N-烷基化程序方法B：
将硝基苯磺酸化树脂(0.100mmol)用N-甲基吡咯烷酮(NMP)(3mL)洗涤三次。将NMP(3mL)、烷基溴(20当量，2.000mmol)和DBU(20当量，0.301mL，2.000mmol)的溶液添加到树脂中，并且将反应混合物在室温搅拌16小时。将树脂用NMP(3mL)洗涤并且将以上程序再重复一次。通过用50μL TIS在1mL TFA中的溶液处理1.5小时的少量树脂样品的TFA微切割来监测反应进程。
N-硝基苯磺酸酯形成程序：
将可力丁(collidine)(10当量)在DCM(2mL)中的溶液添加到树脂中，然后添加Nos-Cl(8当量)在DCM(1mL)中的溶液。将反应混合物在室温搅拌16小时。将树脂用DCM(4mL)洗涤三次和DMF(4mL)洗涤三次。将交替的DCM和DMF洗涤重复三次，然后是最后一组四个DCM洗涤(4mL)。
N-硝基苯磺酸酯去除程序：
使用用DMF(3mL)的三次洗涤和用NMP(3mL)的三次洗涤，将树脂(0.100mmol)溶胀。将NMP(3mL)、DBU(0.075mL，0.500mmol)和2-巯基乙醇(0.071mL，1.000mmol)的溶液添加到树脂中并且将反应混合物在室温搅拌5分钟。在过滤并且用NMP(3mL)洗涤后，将树脂用NMP(3mL)、DBU(0.075mL，0.500mmol)和2-巯基乙醇(0.071mL，1.000mmol)的溶液在室温重新处理5分钟。将树脂用NMP(3mL)洗涤三次，用DMF(4mL)洗涤四次并且用DCM(4mL)洗涤四次，并且放回到Symphony反应器皿中用于在Symphony肽合成器上完成序列装配。
在PL-FMP树脂上预加载胺的通用程序：
将PL-FMP树脂(Novabiochem，1.00mmol/g取代物)在室温用DMF(20mL/mmol)溶胀。将溶剂排出并且添加10ml DMF，然后将胺(2.5mmol)和乙酸(0.3mL)添加到反应器皿中。在10min搅动后，添加三乙酰氧基硼氢化钠(2.5mmol)。允许将反应搅动过夜。将树脂用DMF(1x)、THF/H2O/AcOH(6:3:1)(2x)、DMF(2x)、DCM(3x)洗涤并且干燥。可以通过以下方法检查所得的预加载有胺的PL-FMP树脂：取100mg上述树脂并且使其在室温与在DCM(2mL)中的苯甲酰氯(5当量)和DIEA(10当量)反应0.5h。将树脂用DMF(2x)、MeOH(1x)和DCM(3x)洗涤。然后将样品用40％TFA/DCM切割(1h)。收集产物并且通过HPLC和MS分析。将收集的样品干燥并且确定重量以计算树脂负载量。
在Cl-三苯甲基树脂上预加载Fmoc-氨基酸的通用程序：
向装备有玻璃料的玻璃反应器皿中添加50-150目2-氯-氯三苯甲基树脂(1.54meq/克，1.94克，3.0mmol)，以在DCM(5mL)中溶胀5分钟。将酸(3.00mmol，1.0当量)在DCM(5mL)中的溶液添加到树脂中，然后是DIEA(2.61ml，15.00mmol，5.0当量)。将反应在室温振荡60分钟。添加DIEA(0.5mL)和甲醇(3mL)，并且将反应振荡另外15分钟。将反应溶液通过玻璃料过滤并且将树脂用DCM(4x 5mL)、DMF(4x 5mL)、DCM(4x 5mL)、乙醚(4x 5mL)冲洗，并且使用氮气流干燥。如下可以确定树脂负载量：
将树脂样品(13.1mg)用20％哌啶/DMF(v/v，2.0mL)伴随振荡处理10分钟。将1mL该溶液转移到25.0mL容量瓶中并且用甲醇稀释至总体积25.0mL。将20％哌啶/DMF(v/v，1.0mL)的空白溶液用甲醇在容量瓶中稀释到25.0mL。将UV设置为301nm。将吸光度用空白溶液归零，然后读取样品溶液，得到1.9411的吸光度。测量树脂的负载量为0.6736mmol/g((1.9411/20mg)x 6.94＝0.6736)。
在树脂上的点击反应方法A：
该程序描述了在0.050mmol规模上进行的实验。通过根据规模的倍数调整所述体积，可以将其规模放大超过或小于0.050mmol规模。将含有炔烃的树脂(各50μmol)转移到Bio-Rad管中并且用DCM(2x 5mL x 5min)并且然后用DMF(2x 5mL x 5min)溶胀。在200ml瓶中装入30倍体积的以下物质：抗坏血酸(维生素C，0.026g，0.150mmol)、双(2,2,6,6-四甲基-3,5-庚二酮酸)铜(II)(10.75mg，0.025mmol)、DMF(1.5mL)、2,6-二甲基吡啶(0.058mL，0.50mmol)和THF(1.5mL)，然后是DIEA(0.087ml，0.50mmol)和用于实施例的对应叠氮化物(1.0-2.0当量)。将混合物搅拌直到每种物质都在溶液中。将以上Bio-Rad管中的DMF排出，并且将以上点击溶液(各3mL)添加到每个Bio-Rad管中。将管在定轨摇床上振荡过夜。将溶液通过玻璃料排出。将树脂用DMF(3x 2mL)和DCM(3x 2mL)洗涤。
在树脂上的点击反应方法B：
该程序描述了在0.050mmol规模上进行的实验。通过根据规模的倍数调整所述体积，可以将其规模放大超过或小于0.050mmol规模。将含有炔烃的树脂(各50μmol)转移到Bio-Rad管中并且用DCM(2x 5mL x 5min)并且然后用DMF(2 5mL x 5min)溶胀。在单独的瓶中，将氮气鼓泡到4.0mL DMSO中持续15min。向DMSO中添加碘化亚铜(9.52mg，0.050mmol，1.0当量)(超声处理)、二甲基吡啶(58μL，0.500mmol，10.0当量)和DIEA(87uL，0.050mmol，10.0当量)。将溶液用氮气再次吹扫。将DCM通过玻璃料排出。在单独的小瓶中，将抗坏血酸(8.8mg，0.050mmol，1.0当量)溶解到水(600uL)中。将氮气鼓泡通过溶液10min。将偶联配偶体分布在管(0.050mmol至0.10mmol，1.0至2.0当量)中，然后是DMSO铜和碱溶液并且最后是抗坏血酸水溶液。在溶液顶部覆盖氮气覆盖层并且加盖。将管放到旋转式混合器上16小时。将溶液通过玻璃料排出。将树脂用DMF(3x 2mL)和DCM(3x 2mL)洗涤。
在树脂上的铃木反应程序：
在Bio Rad管中放置50umol含有4-溴-苯丙氨酸侧链的N末端受Fmoc保护的线性多肽的干Rink树脂。将树脂用DMF(2x 5mL)溶胀。向其中添加对甲苯基硼酸(0.017g，0.125mmol)的DMF溶液(2mL)、磷酸钾(0.2mL，0.400mmol)，然后是催化剂[1,1'-双(二叔丁基膦)二茂铁]二氯钯(II)[PdCl2(dtbpf)](3.26mg，5.00μmol)。将管在室温振荡过夜。将溶液排出并且将树脂用DMF(5x 3mL)洗涤，然后用替代的DCM(2x 3mL)、然后DMF(2x 3mL)以及然后DCM(5x 3mL)洗涤。将少量树脂样品在室温使用在1ml TFA中的235μL TIS微切割1h。将剩余的树脂用于肽偶联或N末端的氯乙酸加帽的下一步骤。
溶液相点击反应方法A：
向20ml闪烁瓶中添加100倍所需量的抗坏血酸钠((R)-2-((S)-1,2-二羟基乙基)-4-羟基-5-氧代-2,5-二氢呋喃-3-醇酸钠)和五水合硫酸铜(II)(CuSO4:抗坏血酸钠摩尔比：1:3至1:5)。将反应用水稀释。将该溶液在室温振荡1-10min。将所得的微黄色浆液添加到相应的反应中。
向含有炔烃和叠氮化物(1.0-2.0当量)的小瓶中添加所需量的以上铜溶液(CuSO4：0.3-1.0当量的炔烃)。将混合物在室温振荡1-3h并且通过LC/MS监测进程。如果需要，可以添加额外量的叠氮化物或铜溶液以驱使三唑形成。完成后，将混合物用CH3CN:NH4CO3水溶液(v/v 1:1)稀释，过滤并且在同一天经由反相HPLC纯化来纯化。
溶液相点击反应方法B：
通过将干1:2至1:3mol比率的五水合硫酸铜(II)和抗坏血酸钠稀释至相对于五水合硫酸铜0.1-0.3M的浓度来制备CuSO4和抗坏血酸钠的储备溶液。向肽炔烃在DMF中的溶液(0.05-0.1M)中添加实施例中使用的对应叠氮化物(1.0-2.0当量)，然后添加以上新鲜制备的铜水溶液(0.03-1.0当量)。将混合物在室温搅拌并且通过LCMS监测。如果需要，可以添加额外量的叠氮化物或铜溶液以驱使三唑形成。完全转化后，将混合物稀释，过滤并且同一天通过反相HPLC纯化。
通用纯化程序：
将粗材料使用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在一定百分比的B下保持0分钟，然后经20-30分钟从该百分比线性增加至更高百分比的B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20-40mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。如果基于正交分析数据发现材料不纯，则将材料用以下条件经由制备型LC/MS进一步纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5的乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在一定百分比的B下保持0分钟，然后经20-30分钟从起始百分比的B线性增加，然后在100％B下保持0分钟；流速：20-40mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。确定产物的产率和纯度。
可替代地，基于初始分析数据，将粗材料使用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5的乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在一定百分比的B下保持0分钟，然后经20分钟从起始百分比的B线性增加，然后在100％B下保持0分钟；流速：40mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。如果基于正交分析数据发现材料不纯，则将材料使用以下条件经由制备型LC/MS进一步纯化：柱：XBridge C18，200mmx19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含0.05％乙酸铵)；流动相B：95:5的乙腈:水(含0.05％乙酸铵)；梯度：在一定百分比的B下保持0分钟，然后经20分钟从起始百分比的B线性增加，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。确定产物的产率和纯度。
非天然氨基酸合成：
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-3-(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-1H-吲哚-3-基)丙酸的制备
方案：
步骤1：
向(S)-苄基2-(((苄氧基)羰基)氨基)-3-(1H-吲哚-3-基)丙酸酯(25.0g，58.3mmol)和碳酸铯(20.9g，64.2mmol)在DMF(200mL)中的0℃溶液中添加2-溴乙酸叔丁酯(9.36mL，64.2mmol)。允许将溶液缓慢加温至室温伴随搅拌18h。将反应混合物倒入冰水:1NHCl水溶液(1:1)中，并且然后用EtOAc萃取。将有机层用盐水洗涤，收集，经MgSO4干燥，过滤，并且然后在真空中浓缩。使所得固体经受快速色谱(330g柱，经20柱体积0-50％EtOAc:Hex)，以得到呈白色固体的(S)-苄基2-(((苄氧基)羰基)氨基)-3-(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-1H-吲哚-3-基)丙酸酯(29.6g，93％)。
步骤2：
将H2在室温缓慢鼓泡通过(S)-苄基2-(((苄氧基)羰基)氨基)-3-(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-1H-吲哚-3-基)丙酸酯(29.6g，54.5mmol)和Pd-C(1.45g，1.36mmol)在MeOH(200mL)中的混合物10min。然后在通过LCMS监测转化的同时，将混合物在H2的正压下搅拌。48h后，将反应混合物通过硅藻土过滤并且蒸发，以得到粗(S)-2-氨基-3-(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-1H-吲哚-3-基)丙酸(17.0g)，将其不经另外的纯化带到步骤三。
步骤3：
向(S)-2-氨基-3-(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-1H-吲哚-3-基)丙酸(5.17g，16.2mmol)和碳酸氢钠(6.8g，81mmol)在丙酮:水(50.0mL:100mL)中的溶液中添加(9H-芴-9-基)甲基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(5.48g，16.2mmol)。将混合物搅拌过夜，此后LCMS分析指示完成转化。通缓慢添加1N HCl水溶液将剧烈搅拌的混合物酸化。酸化后，将混合物用DCM(150mL)稀释，并且然后将分离的有机相用水洗涤，然后用盐水洗涤。将有机层收集，经硫酸钠干燥并且在真空下浓缩，以得到粗产物。将粗材料经由硅胶色谱(330g柱，20％-80％EtOAc:Hex，超过20柱25体积)纯化，以得到呈白色泡沫的(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-1H-吲哚-3-基)丙酸(7.26g，83％)。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ7.80(d,J＝7.6Hz,2H),7.67-7.60(m,2H),7.39(t,J＝7.5Hz,2H),7.32-7.22(m,3H),7.18(td,J＝7.6,0.9Hz,1H),7.08(td,J＝7.5,0.9Hz,1H),7.04(s,1H),4.54(dd,J＝8.4,4.9Hz,1H),4.36-4.23(m,2H),4.23-4.14(m,1H),30 3.43-3.35(m,2H),3.25-3.09(m,1H),1.55-1.38(m,9H)。ESI-MS(+)m/z＝541.3(M+H)。
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(4-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙氧基)苯基)丙酸的制备
方案：
步骤1：
向(S)-苄基2-(((苄氧基)羰基)氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯(70g，173mmol)和K2CO3(35.8g，259mmol)在DMF(350mL)中的冷却搅拌溶液中逐滴添加叔丁基-2-溴乙酸酯(30.6mL，207mmol)并且将所得的混合物在室温搅拌过夜。将反应混合物用10％盐水溶液(1000mL)稀释并且用乙酸乙酯(2x 250mL)萃取。将合并的有机层用水(500mL)、饱和盐水溶液(500mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并且浓缩，以得到无色胶状物。将粗化合物通过快速柱色谱纯化(使用在石油醚中的20％乙酸乙酯作为洗脱液)，以得到白色固体(78g，85％)。
步骤2：
将(S)-苄基2-(((苄氧基)羰基)氨基)-3-(4-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙氧基)苯基)丙酸酯(73g，140mmol)溶解在MeOH(3000mL)中并且用氮气吹扫5min。向上述经吹扫的混合物中添加Pd/C(18g，16.91mmol)并且在3kg的氢气压力下搅拌15小时。将反应混合物通过硅藻土床过滤并且用甲醇(1000mL)洗涤。将滤液在真空下浓缩，以得到白色固体(36g，87％)。
步骤3：
向(S)-2-氨基-3-(4-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙氧基)苯基)丙酸(38g，129mmol)和碳酸氢钠(43.2g，515mmol)在水(440mL)中的搅拌溶液中逐滴添加溶解在二噁烷(440mL)中的Fmoc-OSu(43.4g，129mmol)，并且将所得混合物在室温搅拌过夜。将反应混合物用1.5NHCl(200mL)和水(500mL)稀释，并且用乙酸乙酯(2x 250mL)萃取。将合并的有机层用水(250mL)、饱和盐水溶液(250mL)洗涤，并且经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩，以得到淡黄色胶状物。将粗化合物通过柱色谱(使用在氯仿中的6％MeOH作为洗脱液)纯化，以得到淡绿色胶状物。将胶状物用石油醚进一步研磨，以得到灰白色固体(45g，67％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.86-12.58(m,1H),7.88(d,J＝7.5Hz,2H),7.73-7.61(m,3H),7.58-7.47(m,1H),7.44-7.27(m,4H),7.18(d,J＝8.5Hz,2H),6.79(d,J＝8.5Hz,2H),4.57(s,2H),4.25-4.10(m,4H),3.34(br s,3H),3.02(dd,J＝13.8,4.3Hz,1H),2.81(dd,J＝14.1,10.5Hz,1H),1.41(s,9H)。
接头/尾合成：
12-{4-[(叔丁氧基)羰基]苯氧基}十二烷酸(COOH-(CH2)11-O-对苯基-COOtBu)的制备
步骤1.将12-溴十二烷酸(6g，21.49mmol)在MeOH(35mL)和甲苯(100mL)中在室温搅拌。添加原甲酸三甲酯(20mL)，然后添加Amberlyst 15(1.4g)。将混合物在58℃搅拌16-24h。冷却后，将反应过滤以去除树脂，并且将树脂用CH2Cl2(2x)洗涤。将混合物蒸发至干。通过LCMS(分析条件N，保留时间＝4.31，293(M+H))，残余物基本上是纯12-溴十二烷酸甲酯，并且将其直接带到下一步骤。
步骤2.将K2CO3(2.0g，14.42mmol)添加到12-溴十二烷酸甲酯(2.12g,7.21mmol)和4-羟基苯甲酸叔丁酯(1.4g,7.21mmol)在MeCN(7mL)中的溶液中。将反应加热至85℃，持续24h。冷却后，将固体经由过滤去除。将滤液用EtOAc和H2O稀释，并且将有机层用MgSO4干燥，浓缩以给出残余物，将其按原样使用。LCMS(分析条件N：407.3(M+H)，保留时间＝4.94min)。重复相同规模的反应(3x)以给出7.56g呈白色固体的4-((12-甲氧基-12-氧代十二烷基)氧基)苯甲酸叔丁酯。Method N:re Method N:re
步骤3.将4-((12-甲氧基-12-氧代十二烷基)氧基)苯甲酸叔丁酯(8.78g，21.6mmol)溶解在THF(50mL)中并且添加1N NaOH(25.9mL，25.9mmol)。将微浑浊的反应在室温搅拌过夜并且变得澄清。将反应搅拌过夜。添加1N HCl(30mL)，然后进行EtOAc萃取(2x)。将有机层用H2O、盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并且浓缩至干以给出呈白色固体的12-{4-[(叔丁氧基)羰基]苯氧基}十二烷酸(7.0g，17.83mmol，83％产率)。分析条件N：保留时间4.39min，m/z[M+H]+393.3。
根据先前描述的相同程序制备以下化合物。
14-{4-[(叔丁氧基)羰基]苯氧基}十四烷酸(COOH-(CH2)13-O-对苯基-COOtBu)的制备
步骤1.遵循与12-溴十二烷酸甲酯相同的程序，获得呈白色固体的4-((14-羟基十四烷基)氧基)苯甲酸叔丁酯(6g，96％)。分析条件N：保留时间＝4.95min，m/z[M+H]+407.4。
步骤2.将4-((14-羟基十四烷基)氧基)苯甲酸叔丁酯(6g，14.76mmol)溶解在DMF(40mL)中。在0℃，分批添加重铬酸吡啶盐(19.43g，51.6mmol)。将反应从0℃搅拌至室温过夜。LCMS显示主要为所希望的酸，伴有少量的起始酸和中间体醛。添加DMF(10mL)和另外的1当量的PDC。将混合物在室温再搅拌一天。将反应通过硅藻土垫过滤，用EtOAc冲洗。将滤液用饱和柠檬酸、水、盐水洗涤，并且经MgSO4干燥，过滤并浓缩。在处理过程中，部分混合物丢失。将残余物加载到120g硅胶柱上，通过己烷/EtOAc纯化(出来约20％-40％EtOAc，级分37-59)。浓缩以给出14-{4-[(叔丁氧基)羰基]苯氧基}十四烷酸(3.4g，8.08mmol，54.8％产率)。分析条件N：保留时间＝4.76min，m/z[M+H]+421。
16-{4-[(叔丁氧基)羰基]苯氧基}十六烷酸(COOH-(CH2)15-O-对苯基-COOtBu)的制备
步骤1.遵循与12-溴十二烷酸甲酯相同的程序，获得4-((16-羟基十六烷基)氧基)苯甲酸叔丁酯(26.2g，98％产率)。
步骤2.向1000ml单颈圆底烧瓶中装入1,2-二氯乙烷(520mL)、4-((16-羟基十六烷基)氧基)苯甲酸叔丁酯(32.0g，73.6mmol)。在溶液变澄清的情况下搅拌溶液。在O2气氛下，向其中依序加入硝酸铁(III)九水合物(3.21g，7.95mmol)、TEMPO(1.277g，8.17mmol)、氯化钾(0.576g，7.73mmol)。将烧瓶封闭，用O2气球搅拌过夜。将反应物料通过硅藻土床过滤，并将所述床用CHCl3洗涤，蒸发以获得黄色固体。将粗材料与石油醚溶液(150mL)一起搅拌10min，过滤并且在真空下干燥，以获得浅黄色固体(27.9g，产率81％)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)d 11.95(br.s.,1H),7.83(d,J＝8.4Hz,2H),6.99(d,J＝8.8Hz,2H),4.02(t,J＝6.4Hz,2H),2.18(t,J＝7.2Hz,2H),1.71(m,2H),1.54–1.23(m,35H)ppm。分析条件E，保留时间＝3.086min，m/z[M-H]-447.4。
10-(4-磺基苯氧基)癸酸(COOH-(CH2)9-O-对苯基-SO3H)的制备
步骤1.向40ml小瓶中添加4-羟基苯磺酸钠(1.479g，7.54mmol)和DMSO(10mL)以及搅拌棒。将混合物在室温搅拌直至其变澄清。将K2CO3(1.269g，22.63mmol)作为一份添加，然后添加10-溴癸酸甲酯(2g，7.54mmol)。将混合物在50℃-55℃搅拌过夜。冷却后，将反应过滤，并且将沉淀物用DMF冲洗多次，然后用水冲洗多次。将沉淀物风干以给出2.3g呈白色固体的4-((10-甲氧基-10-氧代癸基)氧基)苯磺酸。MS m/z[M-H]-357.4。
步骤2.向4-((10-甲氧基-10-氧代癸基)氧基)苯磺酸(2.3g，6.42mmol)中添加15mL的THF。向所得白色浆液中添加1N NaOH(9.62ml，9.62mmol)。反应变澄清。将反应在室温搅拌并且出现白色沉淀物。1h之后，LCMS显示主要为水解产物，伴有少量的甲酯起始材料。将反应混合物继续搅拌6h。收集白色沉淀物(1.4g)。将滤液浓缩并且用3N HCl酸化，在室温搅拌2h，并且然后过滤。将1.4g白色沉淀物也用3N HCl处理，在室温搅拌3h，过滤并且用H2O(3x)冲洗。将合并的白色沉淀物风干，以给出10-(4-磺基苯氧基)癸酸(1.65g，产率74.7％)。分析条件N：保留时间＝0.94min，m/z[M+H]+345.2。
R-S(O)0-2-Ph-COOH的制备
溴-烷基-酸与巯基苯甲酸或巯基苯甲酸酯反应的通用程序：
程序A：将溴十二烷酸(1当量)和巯基苯甲酸(1当量)在THF和iPr2NEt的溶液中混合。THF和iPr2NEt的比率可以在10:1至1:1之间变化。将混合物在室温搅拌1小时至7天。去除溶剂之后，将残余物按原样使用。
程序B：将溴十二烷酸酯(1当量)和巯基苯甲酸(1当量)在THF和iPr2NEt的溶液中混合。THF和iPr2NEt的比率可以在10:1至1:1之间变化。将混合物在室温搅拌1小时至7天。去除溶剂之后，将残余物溶解在THF或二噁烷或DMF或MeOH中，添加NaOH(1-20当量，1N溶液在水中)。将混合物在室温搅拌1小时至7天。去除溶剂之后，将残余物按原样使用。
分析数据：
S原子氧化成亚砜和砜的通用程序：
将mCPBA或H2O2(1-5当量)添加到硫醇衍生物(1当量)在CH2Cl2中的溶液中。在室温搅拌1小时至7天之后，将二硫化钠(sodium bisulfide)(5-10当量)添加到溶液中。使用过氧化物25测试条来确认多余的过氧化物被中和。去除溶剂之后，将残余物通过制备型HPLC纯化。
分析数据：
R-S(O)0-2-Ph-SO3H的制备
溴-烷基-酸与巯基苯磺酸反应的通用程序：
程序A：将溴十二烷酸(1当量)和巯基苯磺酸(1当量)在THF和iPr2NEt的溶液中混合。THF和iPr2NEt的比率可以在10:1至1:1之间变化。将混合物在室温搅拌1小时至7天。去除溶剂之后，将残余物按原样使用。
程序B：将溴十二烷酸酯(1当量)和巯基苯磺酸(1当量)在THF和iPr2NEt的溶液中混合。THF和iPr2NEt的比率可以在10:1至1:1之间变化。将混合物在室温搅拌1小时至7天。去除溶剂之后，将残余物溶解在THF或二噁烷或DMF或MeOH中，添加NaOH(1-20当量，1N溶液在水中)。将混合物在室温搅拌1小时至7天。去除溶剂之后，将残余物按原样使用。
S原子氧化成亚砜和砜的通用程序：
将mCPBA或H2O2(1-5当量)添加到硫醇衍生物(1当量)在CH2Cl2中的溶液中。在室温搅拌1小时至7天之后，将二硫化钠(5-10当量)添加到溶液中。使用过氧化物25测试条来确认多余的过氧化物被中和。去除溶剂之后，将残余物通过制备型HPLC纯化。
步骤1.将Fmoc-Glu-OtBu(0.935g，2.197mmol)和PFTU(0.941g，2.197mmol)的混合物用DMF(10mL)稀释。在氮气下搅拌的同时，经由注射筒缓慢添加DIEA(0.768ml，4.39mmol)。将混合物搅拌2h。LCMS表明形成了活化酯。添加20-叠氮基-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十烷-1-胺(0.7g，1.998mmol)。将反应在室温搅拌过夜。添加1N HCl并且将混合物用EtOAc(2x)萃取。将有机层用H2O、盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩。将残余物通过正相ISCO纯化，其中用100％-90％DCM/MeOH洗脱，以给出呈无色油状物的(S)-25-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-1-叠氮基-22-氧代-3,6,9,12,15,18-六氧杂-21-氮杂二十六烷-26-酸(0.87g，62.1％)。分析条件T，保留时间＝1.39min，m/z[M+H]+702.3。
步骤2.将氯三苯甲基树脂(3.1g，4.96mmol)用DCM(5x)洗涤，并且然后用DCM(20mL)稀释。然后向该溶液中添加(S)-25-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-1-叠氮基-22-氧代-3,6,9,12,15,18-六氧杂-21-氮杂二十六烷-26-酸(0.87g，1.240mmol)，然后添加DIEA(1.732mL，9.92mmol)。反应立即变成葡萄色。允许将反应在室温振荡过夜。然后将树脂用20mL的9:1甲醇/DIEA溶液稀释并且快速过滤并用DCM(3x)和DMF(3x)洗涤。将树脂用2x 20％哌啶/DMF处理以脱保护Fmoc基团(每次10min)。排出哌啶溶液之后，在按原样用于下一步骤之前，将变成橙黄色的树脂用DMF(6x)洗涤并且储存在4℃。
步骤3.将上述树脂(0.6mmol)用DMF(3x)溶胀。添加在DMF(10mL)中的10-(4-(叔丁氧基羰基)苯氧基)癸酸，即COOH-(CH2)9-O-对苯基-COOtBu(0.328g，0.900mmol)，然后添加HATU(2.250mL，0.4M，0.900mmol)溶液和N-甲基吗啉(0.330mL，3.00mmol)。将反应振荡过夜。将其排出，用DMF(5x)洗涤，然后用DCM(5x)洗涤。将树脂干燥并且向树脂中添加HFIP/DCM(1:4)(20mL)，持续1h。重复进行所述处理。将合并的滤液浓缩以给出呈浅褐色薄膜的(2S)-4-[(20-叠氮基-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十烷-1-基)氨基甲酰基]-2-(10-{4-[(叔丁氧基)羰基]苯氧基}癸酰胺基)丁酸(250mg，0.303mmol，50.4％产率)。分析条件N：保留时间＝3.54min，m/z[M+H]+826.6。
步骤1.向使用“在Cl-三苯甲基树脂上预加载Fmoc-氨基酸的通用程序”获得的在氯三苯甲基树脂上的树脂NH2-Glu(烯丙基)-OH(1.5mmol)中添加在DMF(5mL)中的16-(叔丁氧基)-16-氧代十六烷酸，即COOH-(CH2)11-O-对苯基-COOtBu(0.925g，2.70mmol)，然后添加在DMF和N-甲基吗啉(0.990ml，9.00mmol)中的HATU(6.75ml，2.70mmol，0.4M)。将反应在室温振荡过夜。将溶液排出并且将树脂用DMF(5x)洗涤，然后用CH2Cl2(5x)洗涤。将树脂干燥过夜。将少量树脂使用HFIP/DCM(1:4)微切割20min，以给出所希望的产物。分析条件N：保留时间＝4.32min，m/z[M+H]512。
步骤2.然后将树脂(1.5mmol)用CH2Cl2(3x)冲洗，并且在氮气流下将Pd(PPh3)4(0.06当量)和苯硅烷(1.294mL，10.50mmol)的CH2Cl2(20mL)溶液添加到树脂中。将反应在室温振荡1h。将溶剂排出并且重复进行所述反应。将溶剂排出，并且将树脂用CH2Cl2(5x)、MeOH(3x)和DMF(5x)洗涤。
步骤3.将来自步骤2的树脂(1.5mmol)在DMF中溶胀20min并且排出。向树脂中添加35-叠氮基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一氧杂三十五烷-1-胺(1.284g，2.250mmol)、HATU(0.4M，6.75mL，2.70mmol)和DIEA(1.834mL，10.50mmol)的DMF(5mL)溶液。添加5mL DMF以帮助将溶液转移至反应器中。将反应在室温振荡过夜，排出，用DMF(5x)和DCM(3x)冲洗。在室温用CH2Cl2/HFIP(4:1)(50mL x 3x1h)切割树脂。将滤液合并并且浓缩，并且在真空下干燥以给出呈浅棕色粘稠材料的粗品(S)-1-叠氮基-40-(12-(4-(叔丁氧基羰基)苯氧基)十二酰胺基)-37-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一氧杂-36-氮杂四十一烷-41-酸(1.55g)，其直接用于下一步骤在树脂上的点击反应。分析条件N：保留时间3.89min，m/z[M+H]+1074.6。
DDE-Lys(Pg9-Pg9-γGlu-C10-O-Ph-COOtBu)树脂的制备
步骤1.将TFA(0.188ml，2.443mmol)添加到2-(1-羟基亚乙基)-5,5-二甲基环己烷-1,3-二酮(4.45g，24.43mmol)和N6-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-赖氨酸(6g，16.29mmol)在乙醇(80mL)中的搅拌溶液中。将非均质混合物在83℃加热20h，并且溶液仍然不澄清。LCMS显示显著量的起始胺发生转化。添加50mL的EtOH。在85℃再加热一天。LCMS仍然看到少量的起始材料胺。将反应冷却至室温，然后在旋转蒸发仪上在真空中浓缩，与甲苯共沸三次。将粗材料在正相硅胶ISCO(120g柱)上纯化以给出呈白色泡沫状固体的N6-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N2-(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环亚己基)乙基)-L-赖氨酸(7.5g，14.08mmol，86％产率)，其用于树脂加载步骤。分析条件Q：保留时间＝1.08min，m/z[M+H]+533.6。
步骤2.将氯三苯甲基树脂(56.32mmol，负载量1.43mmol/g)用DCM(5x)洗涤，并且然后用DCM(150mL)稀释。然后向该溶液中添加N6-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N2-(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环亚己基)乙基)-L-赖氨酸(7.5g，14.08mmol)，然后添加DIEA(17.22mL，99mmol)。允许将反应在室温振荡过夜。然后将树脂用90mL的9:1的甲醇/DIEA溶液稀释并且振荡5-10min。将树脂过滤并用且DCM(5x)和DMF(3x)洗涤，然后用Et2O(2x)洗涤并且干燥(负载量约0.3mmol/g，20mmol)。将一小部分树脂使用CH2Cl2/HFIP(4:1)在室温切割30min。LCMS显示形成了所希望的N6-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N2-(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环亚己基)乙基)-L-赖氨酸。分析条件Q：保留时间1.07min。m/z[M+H]+553.6。
步骤3和4.将在DMF中的3-氧代-2,7,10-三氧杂-4-氮杂十二烷-12-酸(2.60g，6.75mmol)、HATU(0.4M，16.88mL，6.75mmol)，并且然后N-甲基吗啉(2.078ml，18.90mmol)添加到上述树脂(2.7mmol)中。将反应振荡过夜。将溶液排出。将树脂用DMF(6x)洗涤并且干燥。将树脂用20％哌啶/DMF处理并且振荡(2x15min)。将溶液排出。将树脂用DMF(6x)洗涤。重复进行所述反应以进行偶联和脱保护步骤。将所得树脂分成两批次并且进行下一步骤。在去除最后的Fmoc基团之前，少量树脂被切割(HFLP/CH2Cl2＝1:4)。LCMS显示一个主峰对应于所希望的(2S)-2-{[1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环亚己基)乙基]氨基}-6-(2-{2-[2-(2-{2-[2-({[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰胺基)乙氧基]乙氧基}乙酰胺基)己酸。分析条件Q：保留时间＝0.98min，m/z[M+H]+823。
步骤5.将上述树脂(约1.35mmol)在DMF中溶胀20min。将溶液排出。向树脂中添加(S)-4-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(1.723g，4.05mmol)、HATU(0.4M，10.13mL，4.05mmol)在DMF中的DMF(15mL)溶液，并且然后添加N-甲基吗啉(0.891mL，8.10mmol)。将反应振荡4h。将溶液排出。将树脂用DMF(6x)洗涤。然后将树脂用20％哌啶/DMF处理并且振荡(2x15min)。将溶液排出。将树脂用DMF(5x)洗涤。将树脂分成两批次并且进行下一步骤。
步骤6.将上述树脂(约0.9mmol)在DMF中溶胀20min。将溶液排出。向树脂中添加10-(4-(叔丁氧基羰基)苯氧基)癸酸(0.492g，1.350mmol)的DMF(10mL)溶液、HATU(0.4M，3.38mL，1.35mmol)的DMF溶液，并且然后添加N-甲基吗啉(0.495mL，4.50mmol)。将反应振荡过夜。将溶液排出。将树脂用DMF(6x)、CH2Cl2(6x)洗涤。少量树脂被切割(HFLP/CH2Cl2＝1:4)。LCMS显示一个主峰对应于所希望的(2S)-6-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(4S)-5-(叔丁氧基)-4-(10-{4-[(叔丁氧基)羰基]苯氧基}癸酰胺基)-5-氧代戊酰胺基]乙氧基}乙氧基)乙酰胺基]乙氧基}乙氧基)乙酰胺基]-2-{[1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环亚己基)乙基]氨基}己酸(0.9mmol，负载量约0.4mmol/g)。分析条件Q：保留时间＝3.89min，m/z[M+H]+1133。
NHFmoc-Peg3-gGlu-gGlu-C10-O-对苯基-COOtBu树脂的制备
步骤1.将使用“在Cl-三苯甲基树脂上预加载Fmoc-氨基酸的通用程序”获得的在氯三苯甲基树脂上的树脂NH2-Glu(烯丙基)-OH(5mmol)在DMF中溶胀20min。将溶液排出。向树脂中添加(R)-4-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(3.83g，9.00mmol)、HATU的DMF(15mL)溶液，并且然后添加N-甲基吗啉(1.979mL，18.00mmol)。将反应振荡过夜。将溶液排出。将树脂用DMF(6x)洗涤。然后将树脂用20％哌啶/DMF处理(2x15min)。将溶液排出，并且将树脂用DMF(6x)洗涤，直接用于下一步骤。
步骤2.将上述树脂(1.5mmol)在DMF中溶胀20min。将溶液排出。向树脂中添加10-(4-(叔丁氧基羰基)苯氧基)癸酸(0.984g，2.70mmol)、HATU的DMF(30mL)溶液，并且然后添加N-甲基吗啉。将反应振荡过夜。将溶液排出。将树脂用DMF(6x)洗涤，然后用CH2Cl2(6x)洗涤，并且干燥。
步骤3.将上述树脂(1.5)用CH2Cl2(3x)冲洗，并且将Pd(PPh3)4(0.06当量)和苯硅烷的CH2Cl2(20mL)溶液添加到树脂中。将反应在室温振荡1h。将溶液排出并且重复进行所述反应。将溶液排出，并且将树脂用CH2Cl2(5x)、MeOH(3x)和DMF(5x)洗涤。将一小部分树脂使用CH2Cl2/HFIP(4:1)在室温切割30min。LCMS显示形成了所希望的((S)-5-(叔丁氧基)-4-(10-(4-(叔丁氧基羰基)苯氧基)癸酰胺基)-5-氧代戊酰基)-L-谷氨酸。分析条件N：保留时间3.73min。m/z[M+H]+679。
步骤4.将上述树脂(1.5mmol)在DMF中溶胀20min并且排出。向树脂中添加(9H-芴-9-基)甲基(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)氨基甲酸酯盐酸盐(2.51g，5.25mmol)、HATU(13.13mL，5.25mmol)和DIEA(2.62mL，15.00mmol)的DMF(5mL)溶液。添加另外的5mL DMF以帮助将溶液转移至反应器中。将反应在室温振荡过夜。将溶液排出。将树脂用DMF(6x)、CH2Cl2(6x)、Et2O(2x)洗涤，并且然后干燥以给出所述树脂(1.9g，1.4mmol，针对SPPS的负载量约为0.5-0.6mmol/g)。
将少量的树脂用CH2Cl2/HFIP(4:1)切割20min。LCMS显示形成了所希望的(S)-22-((S)-5-(叔丁氧基)-4-(10-(4-(叔丁氧基羰基)苯氧基)癸酰胺基)-5-氧代戊酰胺基)-1-(9H-芴-9-基)-3,19-二氧代-2,8,11,14-四氧杂-4,18-二氮杂二十三烷-23-酸。分析条件N：保留时间4.43min。m/z[M+H]+1104。
步骤1.将氯三苯甲基树脂(1.98g，6.34mmol)用DCM(5x)洗涤，并且然后用DCM(50mL)稀释。然后向该溶液中添加Dde-L-Dab(Fmoc)-OH(1.0g，1.982mmol)，然后添加DIEA(2.77mL，15.85mmol)。允许将反应振荡1h。然后将树脂用20ml的9:1甲醇/胡宁氏碱溶液稀释并且快速过滤并用DCM(3x)和DMF(3x)洗涤。用2％肼/DMF进行三重处理而去除Dde。用DMF(5x)和DCM(5x)洗涤。将树脂干燥并按原样使用(Dde脱保护前的负载量为0.5mmol/g，脱保护后变为0.545)。按原样使用。
步骤2.将上述树脂(150mg，0.075mmol)用DMF(5x)洗涤，并且然后用DMF(5mL)稀释。然后向该溶液中添加12-(4-(叔丁氧基羰基)苯氧基)十二烷酸(44.2mg，0.113mmol)和HATU(42.8mg，0.113mmol)在DMF(5mL)中的溶液，然后添加N-甲基吗啉(0.033mL，0.300mmol)。允许将反应振荡16h。将其用DMF(5x)洗涤并且干燥。将等分试样用20％HFIPA/DCM切割以给出所希望的(S)-4-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-2-(12-(4-(叔丁氧基羰基)苯氧基)十二酰胺基)丁酸。分析条件N：保留时间＝2.445min，m/z[M-H]-713.3。
SO3H-Ph-O-C12-CONH-Dab(Fmoc)-OH氯三苯甲基树脂的制备
将上述在步骤1中的树脂(250mg，0.125mmol)用DMF(5x)洗涤，并且然后用DMF(5mL)稀释。然后向该溶液中添加12-((4-磺基苯基)硫代)十二烷酸(72.9mg，0.188mmol)和HATU(71.3mg，0.188mmol)在DMF(5mL)中的溶液，然后添加N-甲基吗啉(0.055mL，0.500mmol)。允许将反应振荡16h。将其用DMF(5x)洗涤并且干燥。将等分试样用20％HFIP/DCM切割以给出所希望的(S)-4-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-2-(12-((4-磺基苯基)硫代)十二酰胺基)丁酸。分析条件N：保留时间＝1.557min，m/z[M+H]+711.1。
Fmoc-NH-(PEG)n-N3的制备
Fmoc-NH-(PEG)3-N3
向2-(2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-胺(329.5mg，1.510mmol，1当量)在1:1的乙腈:水(5.03mL，0.3M)中的溶液立即添加Fmoc-OSu(535mg，1.585mmol)。搅拌反应并且通过LCMS监测。在室温大约4h后，通过LCMS确认产物形成。将其在真空中浓缩，并且粗材料无需进一步纯化即可使用。分析条件K：保留时间＝1.02min；ESI-MS(+)m/z[M+Na]+:463.3。
遵循以上针对Fmoc-NH-(PEG)3-N3描述的程序制备以下化合物。
Fmoc-NH-(PEG)5-N3
分析条件K：保留时间＝1.01min；ESI-MS(+)m/z[M+H]+:529.3。
Fmoc-NH-(PEG)6-N3
分析条件K：保留时间＝1.00min；ESI-MS(+)m/z[M+H]+:573.3。
Fmoc-NH-(PEG)9-N3
分析条件K：保留时间＝0.99min；ESI-MS(+)m/z[M+H]+:705.4。
Fmoc-NH-(PEG)11-N3
分析条件P：保留时间＝2.07min；ESI-MS(+)m/z[M+H]+:793.2。
三唑-PEG功能化树脂的制备
例子Dde-Atriaz(PEG3-NH-Fmoc)-Cl-Trt树脂
Dde-Pra-Cl-Trt树脂的制备：在固相反应器中，将Fmoc-Pra-Cl-Trt树脂(8.04g；4.82mmol)在DMF中溶胀10min，并且然后排出。将其用在DMF中的20％哌啶(3x100mLx10min)处理，每次处理之后用DMF洗涤，并且最终处理之后彻底洗涤。添加2-Ac-双甲酮(60.3ml，24.12mmol)的DMF溶液，然后向树脂中添加N-甲基吗啉(30.2ml，24.12mmol)并且将器皿在室温振荡过夜。将溶液排出，并且用DMF和DCM彻底洗涤树脂，在真空中干燥并且用作具有标称负载量为0.6mmol/g的Dde-Pra-Cl-Trt树脂。
Dde-Ala(3-三唑-PEG3-NHFmoc)-Cl-Trt树脂的制备：将上述Dde-Pra-Cl-Trt树脂(2.313g，1.388mmol)在固相反应器中用DCM溶胀10min，并且然后排出。制备Cu(I)Br和抗坏血酸在DMSO(0.02M)中的1:1摩尔比储备溶液，并且用氮气鼓泡进行脱气10min。将N3-PEG3-NHFmoc(0.795g，1.804mmol)添加到树脂中，使用最少量的DMSO以促进转移。然后添加Cu/抗坏血酸(55mL)、DIEA(2.424ml，13.88mmol)和2,6-二甲基吡啶(1.617ml，13.88mmol)的DMSO储备溶液。将混合物用氮气吹扫并加盖。将其在室温搅拌3h，然后排出。将树脂用50mL体积的DMF、在DMF中的2x 0.1M吡咯并二硫代氨基甲酸铵溶液、DMF和最终DCM洗涤，直到溶液的棕色/黄色消失并且树脂呈黄色。将其在真空中干燥过夜。用5％TFA:DCM切割一小部分树脂，以通过LCMS确认所希望的点击产物。这是在没有进一步分析的情况下进行的。分析条件O：保留时间＝1.45min；ESI-MS(+)m/z[M+H]+:718.4。
遵循以上针对Dde-Atriaz(PEG3-NH-Fmoc)-Cl-Trt树脂描述的程序制备以下树脂。
Dde-Atriaz(PEG5-NH-Fmoc)-Cl-Trt树脂
分析条件O：保留时间＝1.46min；ESI-MS(+)m/z[M+H]+:806.3。
Dde-Atriaz(PEG6-NH-Fmoc)-Cl-Trt树脂
分析条件O：保留时间＝1.46min；ESI-MS(+)m/z[M+H]+:850.3。
Dde-Atriaz(PEG9-NH-Fmoc)-Cl-Trt树脂
分析条件O：保留时间＝1.46min；ESI-MS(+)m/z[M+H]+:982.4。
Dde-Atriaz(PEG11-NH-Fmoc)-Cl-Trt
分析条件O：保留时间＝1.46min；ESI-MS(+)m/z[M+H]+:1070.4。
Dde-Atriaz[PEG11-NH-Asp(OtBu)-Fmoc]-Cl-Trt树脂
分析条件O：保留时间＝1.57min；ESI-MS(+)m/z[M+H]+:1241.6。
Dde-Atriaz[PEG11-NH-Glu(OtBu)-Fmoc]-Cl-Trt(树脂A)
分析条件O：保留时间＝1.60min；ESI-MS(+)m/z[M+H]+:1255.9。
(S)-40-氨基-1-叠氮基-37-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一氧杂-36-氮杂四十一烷-41-酸的制备：
步骤1：将1-(叔丁基)5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)(叔丁氧基羰基)-L-谷氨酸酯(2g)和35-叠氮基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一氧杂三十五烷-1-胺(2.85g)在THF(50mL)中的混合物在室温搅拌24h。在真空下去除溶剂之后，将残余物按原样使用。MS(M+H)+计算值856.5；MS(M+H)+观察值856.3。
步骤2：将来自步骤1的(S)-1-叠氮基-40-((叔丁氧基羰基)氨基)-37-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一氧杂-36-氮杂四十一烷-41-酸叔丁酯(400mg)添加到在二噁烷中的4N HCl(10mL)中。将反应在室温进行24h。在真空下去除溶剂之后，向残余物中加入苯(10mL)，然后浓缩。将该程序重复一次以给出残余物，将其溶解在20mL的THF中。将溶液按原样使用。MS(M+H)+计算值700.4；MS(M+H)+观察值700.3。用于制备W3的结构的通用程序：
步骤1：将W1(1当量)和2,2,2-三氟乙酸全氟苯酯(1-1.5当量)在THF或二噁烷或DME和iPr2NEt(体积比为3:1至1:1)的混合溶液中的混合物在室温搅拌16至120小时。将溶液按原样使用。
步骤2：将(S)-40-氨基-1-叠氮基-37-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一氧杂-36-氮杂四十一烷-41-酸(1当量)添加到来自步骤1的溶液(含有1当量的中间体W2)中。将混合物在室温搅拌16至120小时。在真空下去除溶剂之后，将残余物通过制备型HPLC纯化以给出W3。
`向W3-Ph-O10-001(80mg)在CH2Cl2(1.5mL)中的溶液中添加。将混合物在室温搅拌4小时。在减压下去除所有溶剂以给出(S)-1-叠氮基-40-(10-(4-羧基苯氧基)癸酰胺基)-37-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一氧杂-36-氮杂四十一烷-41-酸，即W3-Ph-O10-002(60mg)。MS(M+H)+计算值990.6；MS(M+H)+观察值990.6。
W3-Ph-O12-002的制备：
将W3-Ph-O12-002经由与W3-Ph-O10-002相同的程序制备，使用W3-Ph-O12-001作为起始材料。MS(M+H)+计算值1018.6；MS(M+H)+观察值1018.3。
W3-Ph-O10-004的制备：
将W3-Ph-O10-003(20mg)溶解在THF(2mL)/水(1mL)中。向溶液中添加氢氧化钠(0.6mL，1N)。将混合物在室温搅拌16小时。将混合物用0.1N HCl中和至pH 5。在减压下去除所有溶剂以给出(S)-1-叠氮基-40-(4-((9-羧基壬基)氧基)苯甲酰胺基)-37-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一氧杂-36-氮杂四十一烷-41-酸，即W3-Ph-O10-004(15mg)。MS(M+H)+计算值990.6；MS(M+H)+观察值990.5。
用于制备W3的结构的通用程序：
步骤1：将W1(1当量)和2,2,2-三氟乙酸全氟苯酯(1-1.5当量)在THF或二噁烷或DME和iPr2NEt(体积比为3:1至1:1)的混合溶液中的混合物在室温搅拌16至120小时。将溶液按原样使用。
步骤2：将(S)-40-氨基-1-叠氮基-37-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一氧杂-36-氮杂四十一烷-41-酸(1当量)添加到来自步骤1的溶液(含有1当量的中间体W2)中。将混合物在室温搅拌16至120小时。在真空下去除溶剂之后，将残余物通过制备型HPLC纯化以给出W3。
炔烃中间体合成
以下是用于溶液相合成的Pra中间体的详细例子。
INT-1001的制备
遵循针对实施例0001的制备描述的由以下通用程序构成的通用合成序列来制备INT-1001。向45mL聚丙烯固相反应器皿中添加在100μmol规模上的预加载有Fmoc-Pra-OH的2-氯三苯甲基树脂，并且将反应器皿放置在Symphony X肽合成器上。然后依序进行以下程序：
遵循“Symphony X树脂溶胀程序”；
用Fmoc-Cys(Trt)-OH遵循“Symphony X单偶联程序”；
用Fmoc-Leu-OH遵循“Symphony X单偶联程序”；
用Fmoc-N-Me-Nle-OH遵循“Symphony X单偶联程序”；
用Fmoc-N-Me-Nle-OH遵循“Symphony双偶联程序”；
用Fmoc-Trp(1-CH2COOtBu)-OH遵循“Symphony双偶联程序”；
用Fmoc-Dab(Boc)-OH遵循“Symphony X单偶联程序”；
用Fmoc-Trp(Boc)-OH遵循“Symphony X单偶联程序”；
用Fmoc-Hyp(OtBu)-OH遵循“Symphony X单偶联程序”；
用Fmoc-Leu-OH遵循“Symphony X单偶联程序”；
用Fmoc-Dap(Boc)-OH遵循“Symphony X单偶联程序”；
用Fmoc-Pro-OH遵循“Symphony X单偶联程序”；
用Fmoc-Asn(Trt)-OH遵循“Symphony双偶联程序”；
用Fmoc-N-Me-Ala-OH遵循“Symphony X单偶联程序”；
用Fmoc-Tyr(OtBu)-OH遵循“Symphony双偶联程序”；
遵循“Symphony X氯乙酸酐偶联程序”；
可替代地，将“Symphony X 4当量单偶联程序”或“Symphony X 4当量双偶联程序”用于肽延长的每个步骤；
可替代地，在Prelude肽合成器上组合以上线性序列，由以下通用程序构成：“Prelude树脂溶胀程序”、“Prelude单偶联程序”或“Prelude双偶联程序”(其中，4-5当量氨基酸和90-120min偶联时间用于每个偶联反应)以及“Prelude氯乙酸酐偶联程序”。
遵循“全面脱保护方法A”；
遵循“环化方法A”。
将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在20％B下保持0分钟，经25分钟20％-60％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。将材料用以下条件经由制备型LC/MS进一步纯化：柱：XBridge C18，200mm x30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5的乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在17％B下保持0分钟，经20分钟17％-57％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：40mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为25.4mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为100％。
分析条件A：保留时间＝1.58min；ESI-MS(+)m/z[M+H]1+:1926.25。
分析条件B：保留时间＝1.69min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:963.98。
根据如INT-1001中描述的相似程序和上述通用程序合成以下炔烃化合物。
INT-1002的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成顺序，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1002。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在14％B下保持0分钟，经20分钟14％-54％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。将材料用以下条件经由制备型LC/MS进一步纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5的乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在16％B下保持0分钟，经20分钟16％-56％B，然后在100％B下保持4分钟；流速：40mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为3.1mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为100％。
分析条件A：保留时间＝1.55min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:1021.2。
INT-1003的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1003。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5的乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在25％B下保持0分钟，经20分钟25％-65％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。将材料用以下条件经由制备型LC/MS进一步纯化：柱：XBridgeC18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在30％B下保持0分钟，经20分钟30％-70％B，然后在100％B下保持2分钟；流速：40mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为11.6mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为97％。
分析条件B：保留时间＝1.99min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:1069.4。
INT-1004的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1004。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5的乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在26％B下保持0分钟，经25分钟26％-66％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为11.2mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为92.8％。
分析条件B：保留时间＝1.81，2.02min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:1077。
INT-1005的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1005。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5的乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在25％B下保持0分钟，经20分钟25％-65％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为22.4mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为100％。
分析条件A：保留时间＝1.87min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:1084.4。
INT-1006的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1006。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含10mM乙酸铵)；流动相B：95:5的乙腈:水(含10mM乙酸铵)；梯度：在25％B下保持0分钟，经20分钟25％-65％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为18.9mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为100％。
分析条件A：保留时间＝1.71min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:1084。
INT-1007的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1007。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5的乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在23％B下保持0分钟，经20分钟23％-63％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为26.8mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为99％。
分析条件B：保留时间＝2.23min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:1077.2。
INT-1008的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1008。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5的乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在23％B下保持0分钟，经20分钟23％-63％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为24.9mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为96.9％。
分析条件B：保留时间＝2.25min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:1077.4。
INT-1009的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1009。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在38％B下保持0分钟，经20分钟38％-78％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为36.5mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为100％。
分析条件B：保留时间＝2.21min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:1055.4。
INT-1010的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1010。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5的乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在26％B下保持0分钟，经20分钟26％-66％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为26.3mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为100％。
分析条件A：保留时间＝1.92min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:1055.3。
INT-1011的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1011。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5的乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在24％B下保持0分钟，经20分钟24％-64％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为17.7mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为96.9％。
分析条件B：保留时间＝2.13min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:1055.8。
INT-1012的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1012。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在38％B下保持0分钟，经25分钟38％-78％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为16.1mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为98.9％。
分析条件B：保留时间＝2.18min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:1020.1。
INT-1013的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1013。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在19％B下保持0分钟，经20分钟19％-59％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为20.2mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为96.3％。
分析条件A：保留时间＝1.53min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:1006.2。
INT-1014的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1014。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在14％B下保持0分钟，经20分钟14％-54％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。将材料用以下条件经由制备型LC/MS进一步纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5的乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在14％B下保持0分钟，经20分钟14％-54％B，然后在100％B下保持2分钟；流速：40mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为10.7mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为100％。
分析条件A：保留时间＝1.5min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:1014。
INT-1015的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1015。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在14％B下保持0分钟，经20分钟14％-54％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。将材料用以下条件经由制备型LC/MS进一步纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5的乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在16％B下保持0分钟，经20分钟16％-56％B，然后在100％B下保持2分钟；流速：35mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为9.1mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为100％。
分析条件A：保留时间＝1.55min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:1021.1。
INT-1016的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1016。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在19％B下保持0分钟，经20分钟19％-59％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为38.6mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为93％。
分析条件A：保留时间＝1.53min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:1028.4。
INT-1017的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1017。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在19％B下保持0分钟，经20分钟19％-59％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为38.3mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为90％。
分析条件A：保留时间＝1.52min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:1028。
INT-1018的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1018。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在19％B下保持0分钟，经20分钟19％-59％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为22.7mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为92.6％。
分析条件A：保留时间＝1.43min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:1021.4。
INT-1019的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1019。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在20％B下保持0分钟，经20分钟20％-60％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为23.6mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为91.2％。
分析条件B：保留时间＝1.59min；ESI-MS(+)m/z[M+3H]3+:681。
INT-1020的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1020。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在21％B下保持0分钟，经20分钟21％-61％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为31.1mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为98.1％。
分析条件B：保留时间＝1.63min；ESI-MS(+)m/z[M+H]+:1997.3。
INT-1021的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1021。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在20％B下保持0分钟，经20分钟20％-60％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。将材料用以下条件经由制备型LC/MS进一步纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5的乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在15％B下保持0分钟，经20分钟15％-55％B，然后在100％B下保持2分钟；流速：40mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为12mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为100％。
分析条件B：保留时间＝1.62min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:999.3。
INT-1022的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1022。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在21％B下保持0分钟，经20分钟21％-61％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。将材料用以下条件经由制备型LC/MS进一步纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5的乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在18％B下保持0分钟，经20分钟18％-58％B，然后在100％B下保持2分钟；流速：40mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为11mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为98.3％。
分析条件A：保留时间＝1.59min；ESI-MS(+)m/z[M+H]+:1996.9。
INT-1023的制备
根据先前描述的合成序列(参见方案1)，使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1023的线性序列。将线性序列(方案1中的树脂A)切割并且使用“全面脱保护方法A”全面脱保护，并且使用“环化方法A”依序环化。将粗品通过反相HPLC纯化。产物的产量为30.4mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为95.1％。
分析条件A：保留时间＝1.53min；ESI-MS(+)m/z[M+H]+:1983.8。
最终化合物合成
以下是经由溶液相点击反应合成的最终化合物的详细例子。
遵循通用程序“溶液相点击方法A”合成化合物。向(S)-2-(2-((6S,9S,12S,18R,21S,24S,27S,30S,33S,36S,38aS,40R,44S,47S,49aS)-36-((1H-吲哚-3-基)甲基)-6-(2-氨基-2-氧代乙基)-33-(2-氨基乙基)-47-(氨基甲基)-24,27-二丁基-30-((1-(羧甲基)-1H-吲哚-3-基)甲基)-40-羟基-12-(4-羟基苄基)-21,44-二异丁基-9,10,25,28-四甲基-5,8,11,14,20,23,26,29,32,35,38,43,46,49-十四氧代四十六氢-1H,5H-二吡咯并[2,1-g1:2',1'-x][1]硫杂[4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43]十四氮杂环四十五烷-18-甲酰胺基)乙酰胺基)戊-4-炔酸(INT-1023，15mg，7.56μmol)和(S)-1-叠氮基-40-(10-(4-羧基苯氧基)癸酰胺基)-37-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一氧杂-36-氮杂四十一烷-41-酸(11.23mg，0.011mmol)在DMF(1mL)中的溶液中添加在水(0.2mL)中的(R)-5-((S)-1,2-二羟基乙基)-4-羟基-2-氧代-2,5-二氢呋喃-3-醇酸钠(3.00mg，0.015mmol)和五水硫酸铜(II)(2.83mg，0.011mmol)。将混合物在室温搅拌2h。使混合物进行单化合物纯化。
将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；流动相B：95:5的乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；梯度：在23％B下保持0分钟，经30分钟23％-53％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。
产物的产量为3.1mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为95％。
分析条件A：保留时间＝1.56min；ESI-MS(+)m/z[M+3H]3+:991.60。
分析条件B：保留时间＝1.73min；ESI-MS(+)m/z[M+3H]3+:991.80。
从INT-1023的线性序列开始，使用“在树脂上的点击反应方法A”与(S)-4-叠氮基-2-(14-磺基十四碳酰胺基)丁酸，然后使用“全面脱保护方法A”和“环化方法A”，在42μmol规模上制备实施例1002。
在0.042mmol规模上对结合树脂的加帽线性肽A进行点击化学：将在Bio Rad管中的树脂A用DCM(3x 5mL)洗涤并且然后用DMF(4x 5mL)洗涤。向树脂中添加以下溶液：双(2,2,6,6-四甲基-3,5-庚二酮酸)铜(II)(9.12mg，0.021mmol)、维生素C(0.022g，0.127mmol)、(0.049mL，0.424mmol)、DIEA(0.074mL，0.424mmol)、THF(1.5mL)和DMF(1.5mL)。将上述溶液添加到(S)-1-叠氮基-25-(10-(4-(叔丁氧基羰基)苯氧基)癸酰胺基)-22-氧代-3,6,9,12,15,18-六氧杂-21-氮杂二十六烷-26-酸(0.035g，0.042mmol)的已称重小瓶中。将所得溶液添加到树脂中。将管加盖并且在振荡台上振荡过夜。将溶液排出并且将树脂用DMF(6x 5ml)洗涤并且然后用DCM(3x 5mL)洗涤。将树脂用95％TFA、2.5％TIS和2.5％DTT(5mL)处理并且在室温振荡1h。将溶液排出到50mL Falcon管中，所述Falcon管含有35mL冷却的Et2O。将所得的白色沉淀物通过离心(3x 4min x 300RPM)收集，弃去醚层。将沉淀在室温空气干燥1小时。将其溶解在DMF(30mL)中并且添加DIEA(1mL)。将反应混合物在室温振荡6h。将反应在Genevac上浓缩。将所得的样品溶解在2ml DMF中并使其进行纯化。
将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在15％B下保持0分钟，经20分钟15％-55％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。将材料用以下条件经由制备型LC/MS进一步纯化：柱：XBridge C18，200mmx19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5的乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在15％B下保持0分钟，经20分钟15％-55％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为2.9mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为100％。
分析条件A：保留时间＝1.53min；ESI-MS(+)m/z[M+3H]3+:918.30。
分析条件B：保留时间＝1.81min；ESI-MS(+)m/z[M+3H]3+:918.20。
遵循实施例1002的程序，使用“在树脂上的点击反应方法A”使INT-1023(树脂A)的线性序列与N3-Peg11-γGlu-C12-O-对苯基-COOtBu反应，在51μmol规模上制备实施例1003。
将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5的乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在18％B下保持0分钟，经20分钟18％-58％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。将材料用以下条件经由制备型LC/MS进一步纯化：柱：XBridge C18，200mmx19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5的乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在18％B下保持0分钟，经20分钟18％-58％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所希望的产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为1.7mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为100％。
分析条件A：保留时间＝1.62min；ESI-MS(+)m/z[M+3H]3+:1001.20。
分析条件B：保留时间＝1.93min；ESI-MS(+)m/z[M+3H]3+:1001.20。
遵循与实施例1001相似的程序，获得实施例1004-1006。
将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；流动相B：95:5的乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；梯度：在20％B下保持0分钟，经20分钟20％-50％B，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。
产物的产量为1.1mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为82％。使用分析型LC/MS确定最终纯度。
分析条件A：保留时间＝1.55min；ESI-MS(+)m/z[M+3H]3+:1009.10。
分析条件B：保留时间＝1.63min；ESI-MS(+)m/z[M+3H]3+:1009.10。
将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95的乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；流动相B：95:5的乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；梯度：在29％B下保持0分钟，经30分钟29％-59％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。
产物的产量为1.2mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为95％。
分析条件A：保留时间＝1.65min；ESI-MS(+)m/z[M+3H]3+:1005.60。
分析条件B：保留时间＝1.9min；ESI-MS(+)m/z[M+3H]3+:1005.30。
将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含10mM乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含10mM乙酸铵)；梯度：在15％B下保持0分钟，经30分钟15％-45％B，然后在100％B下保持5分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。
产物的产量为2.7mg，并且通过LCMS分析，其估计纯度为95％。
分析条件A：保留时间＝1.6min；ESI-MS(+)m/z[M+3H]3+:1006.40。
分析条件B：保留时间＝1.84min；ESI-MS(+)m/z[M+3H]3+:1006.40。
293T-hPD-L1细胞结合高内涵筛选测定(CBA)。
藻红蛋白(PE)与人PD-1-Ig的Ig表位标签共价连接并且将荧光标记的PD-1-Ig用于与稳定过表达人PD-L1(293T-hPD-L1)的人胚胎肾细胞系(293T)的结合研究。简言之，将2x103个293T-hPD-L1细胞接种到在20μl补充有10％胎牛血清的DMEM中的384孔板中，并且过夜培养。将125nl化合物添加到细胞中，然后添加5μl PE标记的PD-1-Ig(0.5nM最终)，在补充有10％胎牛血清的DMEM中稀释，然后在37℃孵育1h。将细胞在100μldPBS中洗涤3次，然后在室温用30μl在dPBS(含10μg/ml Hoechst 33342)中的4％多聚甲醛固定30min。将细胞在100μl dPBS中洗涤3次，然后最后添加15μl dPBS。收集数据并且使用Cell Insight NXTHigh Content Imager和相关软件处理。
表1列出了在293T-hPD-L1细胞结合高内涵筛选测定中测量的本公开文本的代表性实施例的IC50值。
表1
NA–不可用
对于本领域技术人员来说将清楚的是，本公开文本并不限于前述说明性实施例，并且本公开文本可以在不背离本公开文本的基本属性的情况下体现为其他具体形式。因此，希望所述实施例在所有方面均被视为说明性的而非限制性的，参考所附的权利要求而不是前述实施例，并且因此落入权利要求的等同内容的含义和范围内的所有变化均旨在包含在其中。
式(I)的化合物具有作为PD-1/PD-L1相互作用的抑制剂的活性，因此可以用于治疗与PD-1/PD-L1相互作用相关的疾病或缺陷。经由抑制PD-1/PD-L1相互作用，本公开文本的化合物可以用于治疗感染性疾病(如HIV、脓毒性休克、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎或丁型肝炎)和癌症。
应领会，具体实施方式部分而不是发明内容和摘要部分旨在用于解释权利要求。发明内容和摘要部分可以阐述如诸位发明人所设想的本公开文本的一个或多个但不是所有的示例性实施方案，因此并不旨在以任何方式限制本公开文本和所附的权利要求。
上文已经借助于说明特定功能的实现及其关系的功能构造模块描述了本公开文本。为了描述方便，本文已经任意定义了这些功能构造模块的边界。只要适当执行特定功能及其关系，就可以定义替代边界。
具体实施方案的前述描述将如此充分地揭示本公开文本的一般性质，使得其他人可以通过应用本领域技术范围内的知识，在无需过度实验并且不脱离本公开文本一般概念的情况下容易地修改和/或调整此类具体实施方案用于各种应用。因此，基于本文给出的传授内容和指导，此类调整和修改旨在包含在所公开的实施方案的等效方案的含义和范围内。应理解，本文中的措辞或术语是出于描述而非限制的目的，因此本说明书的术语或措辞将由本领域技术人员根据传授内容和指导来解释。
本公开文本的广度和范围不应当由任何上述示例性实施方案来限制，而应当仅根据以下权利要求及其等效物来定义。

Claims (19)

1.一种式(I)的化合物
或其药学上可接受的盐，其中：
A选自
其中：
表示与羰基的附接点，并且表示与氮原子的附接点；
n是0或1；
m是1或2；
u是0或1；
w是0、1或2；
Rx选自氢、氨基、羟基和甲基；
R14和R15独立地选自氢和甲基；
R16a选自氢和C1-C6烷基；
R16选自
-(C(R17a)2)2-X-R30、-(C(R17aR17))0-2-X’-R30、-(C(R17aR17)1-2C(O)NR16a)m’-X’-R30、
-C(R17a)2C(O)N(R16a)C(R17a)2-X’-R31、-(C(R17aR17))1-2C(O)N(R16a)C(R17a)2-X’-R31、-C(R17a)2[C(O)N(R16a)C(R17a)2]w’-X-R31、-C(R17aR17)1-2[C(O)N(R16a)C(R17aR17)1-2]w’-X’-R31、
-(C(R17a)(R17)C(O)NR16a)n’-H和
-(C(R17a)(R17)C(O)NR16a)m’-C(R17a)(R17)-CO2H；
其中PEGq’间隔子能够插入R16的任何部分中(q’是PEG间隔子中的-(CH2CH2O)-单元的数量)；
其中w’是2或3；
n’是1-6；
m’是0-5；
q’是1-20；
X是1与172个原子之间的链，其中所述原子选自氮、碳和氧，并且其中所述链能够含有一、二、三或四个嵌入其中的选自-NHC(O)-、-NHC(O)NH-和-C(O)NH-的基团；并且其中所述链任选地被一至六个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2、-CH2C(O)NH2和-(CH2)1-2CO2H的基团取代；
X’是1与172个原子之间的链，其中所述原子选自碳和氧，并且其中所述链能够含有一、二、三或四个嵌入其中的选自-NHC(O)-、-NHC(O)NH-和-C(O)NH-的基团；并且其中所述链任选地被一至六个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2和-(CH2)1-2CO2H的基团取代，前提是X’不是未经取代的PEG；
R30选自-Y-B-COOH、-Y-B-SO3H、-Y-B-S(O)OH和-Y-B-P(O)(OH)2；
R31选自-Y-B-COOH、-Y-B-SO3H、-Y-B-S(O)OH和-Y-B-P(O)(OH)2；
每个R17a独立地选自氢、C1-C6烷基、-CH2OH、-CH2CO2H、-(CH2)2CO2H，
每个R17独立地选自氢、-CH3、(CH2)zN3、-(CH2)zNH2、-X-R31、-(CH2)zCO2H、-CH2OH、CH2C＝CH和-(CH2)z-三唑基-X-R35，其中z是1-6；
R35选自-Y-B-COOH、-Y-B-SO3H、-Y-B-S(O)OH和-Y-B-P(O)(OH)2；
B是5-6元芳基或杂芳基，所述杂芳基含有1-3个选自-O-、-S-和-N-的杂原子；
Y选自键、O、S或S(O)1-2；
Ra、Re、Rj和Rk各自独立地选自氢和甲基；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12和R13独立地选自天然氨基酸侧链和非天然氨基酸侧链或如下所述与对应的邻位R基团形成环；
Rb是甲基，或者Rb和R2与它们所附接的原子一起形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中每个环任选地被一至四个独立地选自氨基、氰基、甲基、卤代基和羟基的基团取代；
Rd是氢或甲基，或者Rd和R4与它们所附接的原子一起能够形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中每个环任选地被一至四个独立地选自氨基、氰基、甲基、卤代基、羟基和苯基的基团取代；
Rg是氢或甲基，或者Rg和R7与它们所附接的原子一起能够形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中每个环任选地被一至四个独立地选自以下的基团取代：氨基、任选地被卤代基取代的苄基、苄氧基、氰基、环己基、甲基、卤代基、羟基、任选地被甲氧基取代的异喹啉基氧基、任选地被卤代基取代的喹啉基氧基、和四唑基；并且其中所述吡咯烷和所述哌啶环任选地与环己基、苯基或吲哚基团稠合；并且
Rl是甲基，或者Rl和R12与它们所附接的原子一起形成选自氮杂环丁烷和吡咯烷的环；其中每个环任选地被一至四个独立地选自氨基、氰基、甲基、卤代基和羟基的基团取代。
2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，
其中A是
m是1；
w是0；并且
R14、R15和R16a各自是氢。
3.根据权利要求2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中
R16选自-(C(R17a)2)2-X-R30、-(C(R17aR17))0-2-X’-R30和-(C(R17aR17)1-2C(O)NR16a)m’-X’-R30，
每个R17a选自氢、-CO2H和-CH2CO2H；
X是8与46个原子之间的链，其中所述原子选自碳和氧，并且其中所述链能够含有一、二或三个嵌入其中的-NHC(O)-、C(O)NH基团；并且其中所述链任选地被一或两个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2、-CH2C(O)NH2和-CH2CO2H的基团取代；并且
R30选自
Y选自键、O或S。
4.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中
A是
m是1；
w是0；
R14、R15和R16a各自是氢；
R16选自-C(R17a)2C(O)N(R16a)C(R17a)2-X’-R31和-(C(R17aR17))1-2C(O)N(R16a)C(R17a)2-X’-R31，
每个R17a选自氢、-CO2H和-CH2CO2H；
X’是8与48个原子之间的链，其中所述原子选自碳和氧，并且其中所述链能够含有一、二或三个嵌入其中的-NHC(O)-或-C(O)NH-基团；并且其中所述链任选地被一或两个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2、-CH2C(O)NH2和-CH2CO2H的基团取代；前提是X’不是未经取代的PEG；并且
R30选自
Y选自键、O或S。
5.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中A是
m是1；
w是0；
R14、R15和R16a各自是氢；
R16选自-C(R17a)2[C(O)N(R16a)C(R17a)2]w’-X-R31和-C(R17aR17)1-2[C(O)N(R16a)C(R17aR17)1-2]w’-X’-R31，
每个R17a选自氢、-CO2H和-CH2CO2H；
X是8与48个原子之间的链，其中所述原子选自碳和氧，并且其中所述链能够含有一、二或三个嵌入其中的-NHC(O)-或-C(O)NH-基团；并且其中所述链任选地被一或两个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2、-CH2C(O)NH2和-CH2CO2H的基团取代；并且
R31选自
Y选自键、O或S。
6.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中A是
m是1；
w是0；
R14、R15和R16a各自是氢；并且
R16是-(C(R17a)(R17)C(O)NR16a)n’-H，
每个R17a是氢；并且
每个R17选自氢、-CH3、(CH2)zN3、-(CH2)zNH2、-X-R31、-(CH2)zCO2H、-CH2OH、CH2C＝CH和-(CH2)z-三唑基-X-R35；前提是至少一个R17不是氢、-CH3或-CH2OH；
z是1-4；
R31选自
X是7与155个原子之间的链，其中所述原子选自碳和氧，并且其中所述链能够含有一、二或三个嵌入其中的-NHC(O)-或-C(O)NH-基团；并且其中所述链任选地被一或两个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2、-CH2C(O)NH2和-CH2CO2H的基团取代；并且
R35选自
Y选自键、O或S。
7.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中
A是
m是1；
w是0；
R14、R15和R16a各自是氢；
R16是-(CR17a)(R17)C(O)NR16a)m’-C(R17a)(R17)-CO2H；
m’是1-3；
每个R17a是氢；
每个R17选自氢、-CH3、(CH2)zN3、-(CH2)zNH2、-X-R31、-(CH2)zCO2H、-CH2OH、CH2C＝CH、-(CH2)z-三唑基-X-R35和
前提是至少一个R17不是氢、-CH3或-CH2OH；
z是1-4；
R31选自
Y选自键、O或S；
X是20与60个原子之间的链，其中所述原子选自碳和氧，并且其中所述链能够含有一、二或三个嵌入其中的-NHC(O)-、-C(O)NH-基团；并且其中所述链任选地被一或两个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2、-CH2C(O)NH2和-CH2CO2H的基团取代；并且
R35选自
Y选自键、O或S。
8.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中
R1是苯基C1-C3烷基，其中所述苯基部分任选地被羟基、卤代基或甲氧基取代；
R2是C1-C7烷基，或者R2和Rb与它们所附接的原子一起形成哌啶环；
R3是NRxRy(C1-C7烷基)、NRuRv羰基C1-C3烷基或羧基C1-C3烷基；
R4和Rd与它们所附接的原子一起形成吡咯烷环；
R5是羟基C1-C3烷基、咪唑基C1-C3烷基或NRxRy(C1-C7烷基)；
R6是羧基C1-C3烷基、NRuRv羰基C1-C3烷基、NRxRy(C1-C7烷基)或C1-C7烷基；
R7和Rg与它们所附接的原子一起形成任选地被羟基取代的吡咯烷环；
R8和R10是任选地被羧基C1-C3烷基取代的苯并噻吩基或吲哚基C1-C3烷基；
R9是羟基C1-C3烷基、氨基C1-C4烷基或C1-C7烷基，
R11是C1-C3烷氧基C1-C3烷基或C1-C7烷基；
R12是C1-C7烷基或羟基C1-C3烷基；并且
R13是C1-C7烷基、羧基C1-C3烷基或-(CH2)3NHC(NH)NH2。
9.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中
A是
m是1；
w是0；
R14和R15各自是氢；
R16a是氢或甲基；
Rd是甲基，或者Rd和R4与它们所附接的原子一起形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中每个环任选地被一或两个独立地选自氨基、氰基、甲基、卤代基、羟基和苯基的基团取代；
Rg是甲基，或者Rg和R7与它们所附接的原子一起形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中每个环任选地被一或两个独立地选自以下的基团取代：氨基、任选地被卤代基取代的苄基、苄氧基、氰基、环己基、甲基、卤代基、羟基、任选地被甲氧基取代的异喹啉基氧基、任选地被卤代基取代的喹啉基氧基、和四唑基；并且其中所述吡咯烷和所述哌啶环任选地与环己基、苯基或吲哚基稠合；并且
Rl是甲基，或者Rl和R12与它们所附接的原子一起形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中每个环任选地被一或两个独立地选自氨基、氰基、甲基、卤代基和羟基的基团取代。
10.一种化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物或其药学上可接受的盐是
11.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至10中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐、以及药学上可接受的载体。
12.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求10所述的化合物或其药学上可接受的盐、以及药学上可接受的载体。
13.一种增强、刺激和/或增加有需要的受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1所述的化合物或其治疗上可接受的盐。
14.一种抑制有需要的受试者的癌细胞的生长、增殖或转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1所述的化合物或其治疗上可接受的盐。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述癌症选自黑色素瘤、肾细胞癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非鳞状NSCLC、结直肠癌、去势抵抗性前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肝细胞癌、胰腺癌、头颈部鳞状细胞癌、食道癌、胃肠道癌和乳腺癌以及血液恶性肿瘤。
16.一种治疗有需要的受试者的感染性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1所述的化合物或其治疗上可接受的盐。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述感染性疾病由病毒引起。
18.一种治疗有需要的受试者的脓毒性休克的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1所述的化合物或其治疗上可接受的盐。
19.一种阻断受试者的PD-L1与PD-1和/或CD80的相互作用的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1所述的化合物或其治疗上可接受的盐。
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