CN117157306A - 免疫调节剂 - Google Patents

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CN117157306A CN202280023007.8A CN202280023007A CN117157306A CN 117157306 A CN117157306 A CN 117157306A CN 202280023007 A CN202280023007 A CN 202280023007A CN 117157306 A CN117157306 A CN 117157306A
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张云惠
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Abstract

本公开文本提供了新型大环肽，其抑制PD‑1/PD‑L1和PD‑L1/CD80蛋白/蛋白相互作用，因此可用于改善各种疾病，包括癌症和感染性疾病。

Description

免疫调节剂
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年3月24日提交的美国临时申请号63/165,455的优先权，将所述申请通过引用以其整体并入。
电子递交的序列表的引用
与本申请一起提交的ASCII文本文件(名称：3338_281PC01_Seqlisting_ST25；大小：5,923字节；以及创建日期：2022年3月23日)中电子提交的序列表的内容通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本公开文本提供了与PD-L1结合并且能够抑制PD-L1与PD-1和CD80的相互作用的大环化合物。这些大环化合物展现出体外免疫调节功效，从而使它们成为治疗包括癌症和感染性疾病在内的各种疾病的治疗候选物。
背景技术
程序性死亡蛋白1(PD-1)是CD28受体家族的抑制性成员，所述受体家族还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1表达于激活的B细胞、T细胞和髓样细胞上。
PD-1蛋白是55kDa的I型跨膜蛋白，其是Ig基因超家族的一部分。PD-1含有近膜免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和远膜基于酪氨酸的开关基序。尽管在结构上与CTLA-4类似，但PD-1缺少MYPPY基序，所述基序对于CD80 CD86(B7-2)结合至关重要。已经鉴定出PD-1的两个配体，即PD-L1(B7-H1)和PD-L2(b7-DC)。已经表明在与表达PD-L1或PD-L2的细胞相互作用后，表达PD-1的T细胞的激活下调。PD-L1和PD-L2二者均是与PD-1结合但不与其他CD28家族成员结合的B7蛋白家族成员。PD-L1配体在多种人类癌症中是丰富的。PD-1与PD-L1之间的相互作用导致肿瘤浸润淋巴细胞的减少、T细胞受体介导的增殖的减少以及癌性细胞的免疫逃逸。免疫抑制可以通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用逆转，并且在PD-1与PD-L2的相互作用也被阻断时效应是加性的。
还已经表明PD-L1可与CD80相互作用。已经表明表达免疫细胞上PD-L1/CD80的相互作用是抑制性相互作用。已经表明此相互作用的阻断可消除此抑制性相互作用。
当表达PD-1的T细胞接触表达其配体的细胞时，响应于抗原刺激的功能活性(包括增殖、细胞因子分泌和细胞毒性)降低。PD-1/PD-L1或PD-L2相互作用在感染或肿瘤的消退过程中或自我形成过程中下调免疫应答。慢性抗原刺激(诸如在肿瘤疾病或慢性感染过程中发生的慢性抗原刺激)产生这样的T细胞，其表达升高水平的PD-1并且在对慢性抗原的活性方面是功能失调的。这被称为“T细胞耗竭”。B细胞也展示出PD-1/PD配体抑制和“耗竭”。
已经表明使用针对PD-L1的抗体阻断PD-1/PD-L1连接可在许多系统中恢复和增强T细胞激活。患有晚期癌症的患者受益于用针对PD-L1的单克隆抗体的疗法。肿瘤和慢性感染的临床前动物模型已经表明，单克隆抗体对PD-1/PD-L1途径的阻断可以增强免疫应答并且导致肿瘤排斥或感染的控制。经由PD-1/PD-L1阻断的抗肿瘤免疫疗法可以增强对多种组织学上不同的肿瘤的治疗性免疫应答。
在患有慢性感染的系统中，对PD-1/PD-L1相互作用的干扰导致T细胞活性增强。在患有慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒感染的小鼠中，PD-L1的阻断导致病毒清除改善和免疫力恢复。感染HIV-1的人源化小鼠显示出针对病毒血症和CD4+T细胞的病毒性耗尽的增强的保护作用。通过针对PD-L1的单克隆抗体阻断PD-1/PD-L1可以使来自HIV患者的T细胞恢复体外抗原特异性功能。
还已经表明PD-L1/CD80相互作用的阻断可刺激免疫力。已经表明由PD-L1/CD80相互作用的阻断所产生的免疫刺激通过与进一步的PD-1/PD-L1或PD-1/PD-L2相互作用的阻断组合而增强。
假设免疫细胞表型的改变是脓毒性休克的重要因素。这些改变包括升高的PD-1和PD-L1水平。来自具有升高水平的PD-1和PD-L1的脓毒性休克患者的细胞展现出升高水平的T细胞的细胞凋亡。针对PD-L1的抗体可以降低免疫细胞的细胞凋亡的水平。此外，与野生型小鼠相比，缺乏PD-1表达的小鼠对脓毒性休克症状更具抵抗力。研究已经揭示，使用抗体阻断PD-L1的相互作用可以抑制不适当的免疫应答并且改善疾病体征。
除了增强对慢性抗原的免疫应答外，还已经表明PD-1/PD-L1途径的阻断可增强对疫苗接种(包括在慢性感染背景下的治疗性疫苗接种)的应答。
PD-1途径是源自慢性感染和肿瘤疾病过程中的慢性抗原刺激的T细胞耗竭中的关键抑制性分子。已经表明通过靶向PD-L1蛋白阻断PD-1/PD-L1相互作用可在体外和体内恢复抗原特异性T细胞免疫功能，包括在肿瘤或慢性感染环境中针对疫苗接种的增强的应答。因此，需要阻断PD-L1与PD-1或CD80的相互作用的药剂。
发明内容
本公开文本提供了大环化合物，其抑制PD-1/PD-L1和CD80/PD-L1蛋白/蛋白相互作用，因此可用于改善各种疾病，包括癌症和感染性疾病。
在其第一实施方案中，本公开文本提供了一种式(I)的化合物
或其药学上可接受的盐，其中：
A选自
其中：
表示与羰基的附接点，并且/>表示与氮原子的附接点；
n是0或1；
m是1或2；
u是0或1；
w是0、1或2；
Rx选自氢、氨基、羟基和甲基；
R14和R15独立地选自氢和甲基；
R16a选自氢和C1-C6烷基；
R16选自
-(C(R17a)2)2-X-R30、-(C(R17aR17))0-2-X'-R30、-(C(R17aR17)1-2C(O)NR16a)m'-X'-R30、
-C(R17a)2C(O)N(R16a)C(R17a)2-X'-R31、-(C(R17aR17))1-2C(O)N(R16a)C(R17a)2-X'-R31、
-C(R17a)2[C(O)N(R16a)C(R17a)2]w'-X-R31、-C(R17aR17)1-2[C(O)N(R16a)C(R17aR17)1-2]w'-X'-R31、
-(C(R17a)(R17)C(O)NR16a)n'-H；以及
-(C(R17a)(R17)C(O)NR16a)m'-C(R17a)(R17)-CO2H；
其中PEGq'间隔子可以插入R16的任何部分中(q'是PEG间隔子中的-(CH2CH2O)-单元的数量)；
其中w'是2或3；
n'是1-6；
m'是0-5；
q'是1-20
X是1与172个原子之间的链，其中所述原子选自氮、碳和氧，并且其中所述链可以含有一、二、三或四个嵌入其中的选自-NHC(O)-、-NHC(O)NH-和-C(O)NH-的基团；并且其中所述链任选地被一至六个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2、-CH2C(O)NH2和-(CH2)1-2CO2H的基团取代；
X'是1与172个原子之间的链，其中所述原子选自碳和氧，并且其中所述链可以含有一、二、三或四个嵌入其中的选自-NHC(O)-、-NHC(O)NH-和-C(O)NH-的基团；并且其中所述链任选地被一至六个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2和-(CH2)1-2CO2H的基团取代，前提是X'不是未经取代的PEG；
R30选自-SO3H、-S(O)OH和-P(O)(OH)2；
R31选自-S(O)2OH、-S(O)OH和-P(O)(OH)2；
每个R17a独立地选自氢、C1-C6烷基、-CH2OH、-CH2CO2H、-(CH2)2CO2H，
每个R17独立地选自氢、-CH3、(CH2)zN3、-(CH2)zNH2、-X-R31、-(CH2)zCO2H、-CH2OH、CH2C＝CH和-(CH2)z-三唑基-X-R35，其中z是1-6并且R35选自-SO3H、-S(O)OH和-P(O)(OH)2；前提是至少一个R17不是氢、-CH3或-CH2OH；
前提是存在R30、R31或R35中的至少一个；
Ra、Re、Rj和Rk各自独立地选自氢和甲基；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12和R13独立地选自天然氨基酸侧链和非天然氨基酸侧链或如下所述与对应的邻位R基团形成环；
Rb是甲基，或者Rb和R2与它们所附接的原子一起形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中每个环任选地被的一至四个独立地选自氨基、氰基、甲基、卤代基和羟基的基团取代；
Rd是氢或甲基，或者Rd和R4与它们所附接的原子一起能够形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中每个环任选地被一至四个独立地选自氨基、氰基、甲基、卤代基、羟基和苯基的基团取代；
Rg是氢或甲基，或者Rg和R7与它们所附接的原子一起能够形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中每个环任选地被一至四个独立地选自以下的基团取代：氨基、任选地被卤代基取代的苄基、苄氧基、氰基、环己基、甲基、卤代基、羟基、任选地被甲氧基取代的异喹啉基氧基、任选地被卤代基取代的喹啉基氧基、和四唑基；并且其中所述吡咯烷和所述哌啶环任选地与环己基、苯基或吲哚基团稠合；并且
Rl是甲基，或者Rl和R12与它们所附接的原子一起形成选自氮杂环丁烷和吡咯烷的环，其中每个环任选地被一至四个独立地选自氨基、氰基、甲基、卤代基和羟基的基团取代。
在第一实施方案的第一方面，本公开文本提供了式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中A是
在第一实施方案的第二方面：
m是1并且w是0；并且
R14、R15和R16a各自是氢。
在第一实施方案的第三方面：
R16选自-(C(R17a)2)2-X-R30、-(C(R17aR17))0-2-X'-R30和-(C(R17aR17)1-2C(O)NR16a)m'-X'-R30，
在第一实施方案的第四方面：
每个R17a选自氢、-CO2H和-CH2CO2H；
X是8与46个原子之间的链，其中所述原子选自碳和氧，并且其中所述链可以含有一、二或三个嵌入其中的-NHC(O)-、C(O)NH基团；并且其中所述链任选地被一或两个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2、-CH2C(O)NH2和-CH2CO2H的基团取代；并且
R30选自-SO3H和-P(O)(OH)2；
在第一实施方案的第五方面，本公开文本提供了式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
A是
m和w是1；
R14、R15和R16a各自是氢；并且
R16选自-C(R17a)2C(O)N(R16a)C(R17a)2-X'-R31和-(C(R17aR17))1-2C(O)N(R16a)C(R17a)2-X'-R31，
在第一实施方案的第六方面：
每个R17a选自氢、-CO2H和-CH2CO2H；
X'是8与48个原子之间的链，其中所述原子选自碳和氧，并且其中所述链可以含有一、二或三个嵌入其中的-NHC(O)-或-C(O)NH-基团；并且其中所述链任选地被一或两个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2、-CH2C(O)NH2和-CH2CO2H的基团取代；前提是X'不是未经取代的PEG；并且
R30选自-SO3H和-P(O)(OH)2。
在第一实施方案的第七方面，本公开文本提供了式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
A是
m是1并且w是0；
R14、R15和R16a各自是氢；并且
R16选自-C(R17a)2[C(O)N(R16a)C(R17a)2]w'-X-R31和-C(R17aR17)1-2[C(O)N(R16a)C(R17aR17)1-2]w'-X'-R31，
在第一实施方案的第八方面：
每个R17a选自氢、-CO2H和-CH2CO2H；
X是8与48个原子之间的链，其中所述原子选自碳和氧，并且其中所述链可以含有一、二或三个嵌入其中的-NHC(O)-或-C(O)NH-基团；并且其中所述链任选地被一或两个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2、-CH2C(O)NH2和-CH2CO2H的基团取代；并且R31选自-SO3H和-P(O)(OH)2。
在第一实施方案的第九方面，本公开文本提供了式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
A是
m是1并且w是0；
R14、R15和R16a各自是氢；并且
R16是-(C(R17a)(R17)C(O)NR16a)n'-H，
在第一实施方案的第十方面：
每个R17a是氢；并且
每个R17选自氢、-CH3、(CH2)zN3、-(CH2)zNH2、-X-R31、-(CH2)zCO2H、-CH2OH、CH2C＝CH和-(CH2)z-三唑基-X-R35；前提是至少一个R17不是氢、-CH3或-CH2OH，并且前提是存在至少一个R31或R35；
z是1-4；
R31选自-SO3H和-P(O)(OH)2；
X是7与155个原子之间的链，其中所述原子选自碳和氧，并且其中所述链可以含有一、二或三个嵌入其中的-NHC(O)-或-C(O)NH-基团；并且其中所述链任选地被一或两个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2、-CH2C(O)NH2和-CH2CO2H的基团取代；并且R35选自-SO3H和-P(O)(OH)2。
在第一实施方案的第十一方面，本公开文本提供了式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
A是
m是1并且w是0；
R14、R15和R16a各自是氢；并且
R16是-(CR17a)(R17)C(O)NR16a)m'-C(R17a)(R17)-CO2H。
在第一实施方案的第十二方面：
m'是0-3；
每个R17a是氢；
每个R17选自氢、-CH3、(CH2)zN3、-(CH2)zNH2、-X-R31、-(CH2)zCO2H、-CH2OH、CH2C＝CH和-(CH2)z-三唑基-X-R35；前提是至少一个R17不是氢、-CH3或-CH2OH，并且前提是存在至少一个R31或R35；
z是1-4；
R31选自-SO3H和-P(O)(OH)2；
X是10与60个原子之间的链，其中所述原子选自碳和氧，并且其中所述链可以含有一、二或三个嵌入其中的-NHC(O)-、-C(O)NH-基团；并且其中所述链任选地被一或两个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2、-CH2C(O)NH2和-CH2CO2H的基团取代；并且R35选自-SO3H和-P(O)(OH)2。
在第一实施方案的第十三方面，本公开文本提供了式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是苯基C1-C3烷基，其中苯基部分任选地被羟基、卤代基或甲氧基取代；R2是C1-C7烷基，或者R2和Rb与它们所附接的原子一起形成哌啶环；R3是NRxRy(C1-C7烷基)、NRuRv羰基C1-C3烷基或羰基C1-C3烷基；R4和Rd与它们所附接的原子一起形成吡咯烷环；R5是羟基C1-C3烷基、咪唑基C1-C3烷基或NRxRy(C1-C7烷基)；R6是羧基C1-C3烷基、NRuRv羰基C1-C3烷基、NRxRy(C1-C7烷基)或C1-C7烷基；R7和Rg与它们所附接的原子一起形成任选地被羟基取代的吡咯烷环；R8和R10是任选地被羧基C1-C3烷基取代的苯并噻吩基或吲哚基C1-C3烷基；R9是羟基C1-C3烷基、氨基C1-C4烷基或C1-C7烷基，R11是C1-C3烷氧基C1-C3烷基或C1-C7烷基；R12是C1-C7烷基或羟基C1-C3烷基；并且R13是C1-C7烷基、羧基C1-C3烷基或-(CH2)3NHC(NH)NH2。
在第一实施方案的第十四方面，本公开文本提供了式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
A是
m是1并且w是0；
R14和R15各自是氢；
R16a是氢或甲基；
Rd是甲基，或者Rd和R4与它们所附接的原子一起形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中每个环任选地被一或两个独立地选自氨基、氰基、甲基、卤代基、羟基和苯基的基团取代；并且
Rg是甲基，或者Rg和R7与它们所附接的原子一起形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中每个环任选地被一或两个独立地选自以下的基团取代：氨基、任选地被卤代基取代的苄基、苄氧基、氰基、环己基、甲基、卤代基、羟基、任选地被甲氧基取代的异喹啉基氧基、任选地被卤代基取代的喹啉基氧基、和四唑基；并且其中所述吡咯烷和所述哌啶环任选地与环己基、苯基或吲哚基稠合。
在第二实施方案中，本公开文本提供了一种式(II)的化合物
或其药学上可接受的盐，其中：
A选自
其中：
n是0或1；
R14和R15独立地选自氢和甲基；
R16a选自氢和C1-C6烷基；
R16选自
-(C(R17a)2)2-X-R30、-(C(R17aR17))0-2-X'-R30、-(C(R17aR17)1-2C(O)NR16a)m'-X'-R30、
-C(R17a)2C(O)N(R16a)C(R17a)2-X'-R31、-(C(R17aR17))1-2C(O)N(R16a)C(R17a)2-X'-R31、
-C(R17a)2[C(O)N(R16a)C(R17a)2]w'-X-R31、-C(R17aR17)1-2[C(O)N(R16a)C(R17aR17)1-2]w'-X'-R31、
-(C(R17a)(R17)C(O)NR16a)n'-H；和
-(C(R17a)(R17)C(O)NR16a)m'-C(R17a)(R17)-CO2H；
其中PEGq'间隔子可以插入R16的任何部分中(q'是PEG间隔子中的-(CH2CH2O)-单元的数量)；
其中：
w'是2或3；
n'是1-6；
m'是0-5；
q'是1-20
X是在1与172个原子之间的链，其中所述原子选自碳和氧，并且其中所述链可以含有一、二、三或四个嵌入其中的选自-NHC(O)-、-NHC(O)NH-和-C(O)NH的基团；并且其中所述链任选地被一至六个基独立地选自-CO2H、-C(O)NH2、-CH2C(O)NH2和-CH2CO2H的团取代；
X'是在1与172个原子之间的链，其中所述原子选自碳和氧并且其中所述链可以含有一、二、三或四个嵌入其中的选自-NHC(O)-、-NHC(O)NH-和-C(O)NH的基团；并且其中所述链任选地被一至六个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2和-CH2CO2H的基团取代，前提是X'不是未经取代的PEG；
R30选自-SO3H、-S(O)OH和-P(O)(OH)2；
R31是-SO3H、-S(O)OH和-P(O)(OH)2；
每个R17a独立地选自氢、C1-C6烷基、-CH2OH、-CH2CO2H、-(CH2)2CO2H，
每个R17独立地选自氢、-CH3、(CH2)zN3、-(CH2)zNH2、-X-R31、-(CH2)zCO2H、-CH2OH、CH2C＝CH和-(CH2)z-三唑基-X-R35，其中z是1-6并且R35选自-S(O)2OH、-S(O)OH和-P(O)(OH)2；
前提条件是至少一个R17不是氢、-CH3或-CH2OH；
前提是存在R30、R31或R35中的至少一个；Ra、Rf、Rj、Rk、Rl和Rm是氢；
Rb和Rc是甲基；
Rg选自氢和甲基；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12独立地选自天然氨基酸侧链和非天然氨基酸侧链或如下所述与对应的邻位R基团形成环；
Rd选自氢和甲基，或者Rd和R4与它们所附接的原子一起形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中每个环任选地被一至四个独立地选自氨基、氰基、甲基、卤代基、卤代甲基和羟基的基团取代；
Re选自氢和甲基，或者Re和R5与它们所附接的原子一起形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中每个环任选地被一至四个独立地选自氨基、氰基、甲基、卤代基、卤代甲基和羟基的基团取代；
Rh选自氢和甲基，或者Rh和R8与它们所附接的原子一起形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中每个环任选地被一至四个独立地选自氨基、氰基、甲基、卤代基、卤代甲基和羟基的基团取代；并且
Ri选自氢和甲基，或者Ri和R9与它们所附接的原子一起，选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中每个环任选地被一至四个独立地选自氨基、氰基、甲基、卤代基、卤代甲基和羟基的基团取代。
在第二实施方案的第一方面，本公开文本提供了一种式(II)的化合物或其药学上可接受的盐，其中
A是
n是0；
R16是-(CR17a)(R17)C(O)NR16a)m'-C(R17a)(R17)-CO2H；
每个R16a是氢；
m'是2、3或4；
每个R17a是氢；
每个R17独立地选自氢、-(CH2)zNH2、-X-R31和-CH2C＝CH，
z是4；
X是26与155个原子之间的链，其中所述原子选自碳和氧，并且其中所述链可以含有一、二或三个嵌入其中的-NHC(O)-或-C(O)NH-基团；并且其中所述链任选地被一或两个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2、-CH2C(O)NH2和-CH2CO2H的基团取代；并且R31是-S(O)2OH和-P(O)(OH)2。
在第三实施方案中，本公开文本提供了增强、刺激和/或增加有需要的受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。在第三实施方案的第一方面，所述方法进一步包括在式(I)的化合物或其药学上可接受的盐之前、之后或与其同时施用另外的药剂。在第二方面，所述另外的药剂是抗微生物剂、抗病毒剂、细胞毒性剂和/或免疫应答调节剂。
在第四实施方案中，本公开文本提供了一种抑制有需要的受试者的癌细胞的生长、增殖或转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。在第四实施方案的第一方面，所述癌症选自黑色素瘤、肾细胞癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非鳞状NSCLC、结直肠癌、去势抵抗性前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肝细胞癌、胰腺癌、头颈部鳞状细胞癌、食道癌、胃肠道癌和乳腺癌以及血液恶性肿瘤。
在第五实施方案中，本公开文本提供了一种用于治疗有需要的受试者的感染性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。在第五实施方案的第一方面，所述感染性疾病由病毒引起。在第二方面，所述病毒选自HIV、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、疱疹病毒和流感病毒。
在第六实施方案中，本公开文本提供了一种用于治疗有需要的受试者的脓毒性休克的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。
在第七实施方案中，本公开文本提供了增强、刺激和/或增加有需要的受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(II)的化合物或其药学上可接受的盐。在第七实施方案的第一方面，所述方法进一步包括在式(II)的化合物或其药学上可接受的盐之前、之后或与其同时施用另外的药剂。在第二方面，所述另外的药剂是抗微生物剂、抗病毒剂、细胞毒性剂和/或免疫应答调节剂。在第三方面，所述另外的药剂是HDAC抑制剂。在第四实施方案中，所述另外的药剂是TLR7和/或TLR8激动剂。在另一个实施方案中，所述另外的药剂是STING、NLRP3或DGK剂。
在第八实施方案中，本公开文本提供了一种抑制有需要的受试者的癌细胞的生长、增殖或转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(II)的化合物或其药学上可接受的盐。在第八实施方案的第一方面，所述癌症选自黑色素瘤、肾细胞癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非鳞状NSCLC、结直肠癌、去势抵抗性前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肝细胞癌、胰腺癌、头颈部鳞状细胞癌、食道癌、胃肠道癌和乳腺癌以及血液恶性肿瘤。
在第九实施方案中，本公开文本提供了一种用于治疗有需要的受试者的感染性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(II)的化合物或其药学上可接受的盐。在第九实施方案的第一方面，所述感染性疾病由病毒引起。在第二方面，所述病毒选自HIV、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、疱疹病毒和流感病毒。
在第十实施方案中，本公开文本提供了一种用于治疗有需要的受试者的脓毒性休克的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(II)的化合物或其药学上可接受的盐。
在其中R侧链是被甲基取代的环的一部分的式(I)的化合物中，应理解的是，甲基可以在环中的任何可取代的碳原子上，包括作为大环母结构的一部分的碳。
以下基团优选在每个R位置处。氨基酸可以是D-或L-立体化学并且可以如本公开文本中的其他地方所描述的被取代。
在式(I)的化合物中，优选的R1选自以下的侧链：苯丙氨酸、酪氨酸、3-噻吩-2-基、4-甲基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3-甲氧基苯基丙氨酰、异色氨酸、3-甲基苯丙氨酸、1-萘基丙氨酸、3,4-二氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、3,4-二甲氧基苯丙氨酸、3,4-二氯苯丙氨酸、4-二氟甲基苯丙氨酸、2-甲基苯丙氨酸、2-萘基丙氨酸、色氨酸、4-吡啶基、4-溴苯丙氨酸、3-吡啶基、4-三氟甲基苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、4-甲氧基苯丙氨酸、联苯丙氨酸和3-氯苯丙氨酸；和2,4-二氨基丁烷。
在其中R2不为环的一部分的式(I)的化合物中，优选的R2选自以下的侧链：丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸。
在式(I)的化合物中，优选的R3选自以下的侧链：天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、鸟氨酸(Orn)、赖氨酸、组氨酸、苏氨酸、亮氨酸、丙氨酸、Dap和Dab。
在式(I)的化合物中，其中R4不是环的一部分，优选的R4选自缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸和甘氨酸的侧链。
在式(I)的化合物中，优选的R5选自以下的侧链：组氨酸、天冬酰胺、Dap、Dap(COCH3)、丝氨酸、甘氨酸、Dab、Dab(COCH3)、丙氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸和3-噻唑基丙氨酸。
在式(I)的化合物中，优选的R6选自以下的侧链：亮氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、赖氨酸、3-环己烷、苏氨酸、鸟氨酸、Dab、丙氨酸、精氨酸和Orn(COCH3)。
在式(I)的化合物中，其中R7不是环的一部分，优选的R7选自以下的侧链：甘氨酸、Dab、丝氨酸、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、组氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丙氨酸和Dab(C(O)环丁烷)。
在式(I)的化合物中，优选的R8选自色氨酸和1,2-苯丙异噻唑啉基丙氨酸的侧链。
在式(I)的化合物中，优选的R9选自以下的侧链：丝氨酸、组氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、Dab、苏氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酸、缬氨酸、Dap、精氨酸、天冬氨酸和酪氨酸。
在式(I)的化合物中，优选的R10选自以下的侧链：任选地经取代的色氨酸、苯并异噻唑基丙氨酸、1-萘基丙氨酸、甲硫氨酸。
在式(I)的化合物中，优选的R11选自以下的侧链：正亮氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、甲硫氨酸、乙氧基甲烷、丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸、苯基丙烷、谷氨酸、己烷和庚烷。
在式(I)的化合物中，其中R12不是环的一部分，优选的R12选自以下的侧链：正亮氨酸、丙氨酸、乙氧基甲烷、甲硫氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、甲氧基乙烷、亮氨酸、色氨酸、异亮氨酸、谷氨酸、己烷、庚烷和甘氨酸。
在式(I)的化合物中，优选的R13选自以下的侧链：精氨酸、鸟氨酸、丙氨酸、Dap、Dab、亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、赖氨酸、苏氨酸、环丙基甲烷、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、组氨酸和2-氨基丁烷。
在另一个实施方案中，本公开文本提供了选自第一方面的范围内例示的例子的化合物，或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体。
在另一个实施方案中，提供了一种选自第一方面的范围内的化合物的任何子集列表的化合物。
在另一个实施方案中，提供了一种化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物或其药学上可接受的盐是
/>
/>
/>
/>
/>
在另一方面，本公开文本提供了一种增强、刺激和/或增加有需要的受试者的免疫应答的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(I)或式(II)的化合物或其药学上可接受的盐。
在另一方面，本公开文本提供了一种阻断受试者的PD-L1与PD-1和/或CD80的相互作用的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(I)或式(II)的化合物或其药学上可接受的盐。
在另一方面，本公开文本提供了一种增强、刺激和/或增加有需要的受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(I)或式(II)的化合物或其药学上可接受的盐。在第二方面的第一实施方案中，所述方法进一步包括在式(I)的化合物、式(I))的化合物或其药学上可接受的盐之前、之后或与之同时施用另外的药剂。在第二实施方案中，所述另外的药剂选自抗微生物剂、抗病毒剂、细胞毒性剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、HDAC抑制剂、STING、NLRP3或DGK剂和免疫应答调节剂。
在另一方面，本公开文本提供了一种抑制有需要的受试者的癌细胞的生长、增殖或转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(I)或式(II)的化合物或其药学上可接受的盐。在第三方面的第一实施方案中，所述癌症选自黑色素瘤、肾细胞癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非鳞状NSCLC、结直肠癌、去势抵抗性前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肝细胞癌、胰腺癌、头颈部鳞状细胞癌、食道癌、胃肠道癌和乳腺癌以及血液恶性肿瘤。
在另一方面，本公开文本提供了一种治疗有需要的受试者的感染性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(I)或式(II)的化合物或其药学上可接受的盐。在第四方面的第一实施方案中，所述感染性疾病是由病毒引起的。在第二实施方案中，所述病毒选自HIV、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、疱疹病毒和流感病毒。
在另一方面，本公开文本提供了一种治疗有需要的受试者的脓毒性休克的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(I)或式(II)的化合物或其药学上可接受的盐。
在另一方面，本公开文本提供了一种阻断受试者的PD-L1与PD-1和/或CD80的相互作用的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的式(I)或式(II)的化合物或其药学上可接受的盐。
具体实施方式
除非另外指示，否则具有不饱和化合价的任何原子均被假定为具有足以满足化合价的氢原子。
除非上下文另外规定，否则单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述”包括复数指示物。
如本文所用，术语“或”是逻辑析取(即，和/或)并不指示互斥析取，除非如用术语“或者”、“除非”、“可替代地”和类似作用的词语明确指示。
如本文所用，术语“烷基”是指含有例如1至12个碳原子、1至6个碳原子和1至4个碳原子的支链和直链饱和脂族烃基二者。烷基的例子包括但不限于甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(例如，正丙基和异丙基)、丁基(例如，正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基)和戊基(例如，正戊基、异戊基、新戊基)、正己基、2-甲基戊基、2-乙基丁基、3-甲基戊基和4-甲基戊基。当数字出现在符号“C”之后的下标中时，下标更具体地定义了特定基团可能含有的碳原子的数目。例如，“C1-4烷基”表示具有一至四个碳原子的直链和支链烷基。
如本文所用，术语“环烷基”是指通过从饱和环碳原子上除去一个氢原子而由非芳族单环或多环烃分子衍生的基团。环烷基的代表性例子包括但不限于环丙基、环戊基和环己基。当数字出现在符号“C”之后的下标中时，下标更具体地定义了特定环烷基可能含有的碳原子的数目。例如，“C3-6环烷基”表示具有三至六个碳原子的环烷基。
术语“羟基烷基”包括被一个或多个羟基取代的支链和直链饱和烷基二者。例如，“羟基烷基”包括-CH2OH、-CH2CH2OH和C1-4羟基烷基。
如本文所用，术语“芳基”是指通过除去与一个或多个芳族环键合的一个氢而由含所述一个或多个芳族环的分子衍生的一组原子。芳基的代表性例子包括但不限于苯基和萘基。芳基环可以是未经取代的，或者在化合价允许的情况下可以含有一个或多个取代基。
如本文所用，术语“卤代基”和“卤素”是指F、Cl、Br或I。
本发明的芳族环含有0-3个选自-N-、-S-和-O-的杂原子。它们还包括如下定义的杂芳基。
术语“杂芳基”是指经取代和未经取代的芳族5或6元单环基团和9或10元双环基团，其在至少一个环中具有至少一个杂原子(O、S或N)，所述含有杂原子的环优选地具有1、2或3个独立地选自O、S和/或N的杂原子。含有杂原子的杂芳基的每个环可以含有一个或两个氧或硫原子和/或一至四个氮原子，条件是每个环中的杂原子总数是四或更少，并且每个环具有至少一个碳原子。构成双环基团的稠环是芳族的，并且可以仅含有碳原子。氮和硫原子可以任选地是氧化的，并且氮原子可以任选地是季铵化的。双环杂芳基必须仅包括芳族环。杂芳基可以附接在任何环的任何可用的氮或碳原子上。杂芳基环系统可以是未经取代的，或者可以含有一个或多个取代基。
示例性的单环杂芳基包括吡咯基、吡唑基、吡唑啉基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、噻二唑基、异噻唑基、呋喃基、噻吩基、噁二唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基和三嗪基。
示例性的双环杂芳基包括吲哚基、苯并噻唑基、苯并二氧杂环戊烯基、苯并噁唑基、苯并噻吩基、喹啉基、四氢异喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并吡喃基、吲嗪基、苯并呋喃基、色酮基、香豆素基、苯并吡喃基、噌啉基、喹喔啉基、吲唑基和吡咯并吡啶基。
如本文所用，短语“或其药学上可接受的盐”是指至少一种化合物、或所述化合物的至少一种盐、或其组合。例如，“式(I)的化合物或其药学上可接受的盐”包括但不限于一种式(I)的化合物、两种式(I)的化合物、式(I)的化合物的药学上可接受的盐、式(I)的化合物和式(I)的化合物的一种或多种药学上可接受的盐、以及式(I)的化合物的两种或更多种药学上可接受的盐。
如本文所用的“不良事件”或“AE”是与医学治疗的使用相关的任何不利的并且通常是无意的、甚至是不希望的体征(包括异常的实验室发现)、症状或疾病。例如，不良事件可能与响应于治疗的免疫系统的激活或免疫系统细胞(例如，T细胞)的扩增相关。医学治疗可能具有一种或多种相关的AE，并且每种AE可能具有相同或不同水平的严重程度。对能够“改变不良事件”的方法的提及意指降低与不同治疗方案的使用相关的一种或多种AE的发生率和/或严重性的治疗方案。
如本文所用，“过度增殖性疾病”是指细胞生长超过正常水平的病症。例如，过度增殖性疾病或障碍包括恶性疾病(例如，食道癌、结肠癌、胆管癌)和非恶性疾病(例如，动脉粥样硬化、良性增生和良性前列腺肥大)。
术语“免疫应答”是指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和可溶性大分子的作用，其导致对入侵的病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞的选择性损伤，破坏入侵的病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞，或从人体消除入侵的病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞，或者在自身免疫或病理炎症的情况下，导致对正常的人细胞或组织的选择性损伤、破坏正常的人细胞或组织、或从人体消除正常的人细胞或组织。
术语“程序性死亡配体1”、“细胞程序性死亡配体1”、“PD-L1”、“PDL1”、“hPD-L1”、“hPD-LI”和“B7-H1”可互换使用，并且包括人PD-L1的变体、同种型、物种同源物以及与PD-L1具有至少一个共同表位的类似物。完整的PD-L1序列可以在登录号NP_054862下找到。
术语“程序性死亡蛋白1”、“细胞程序性死亡蛋白1”、“蛋白质PD-1”、“PD-1”、“PD1”、“hPD-1”和“hPD-I”可互换使用，并且包括人PD-1的变体、同种型、物种同源物以及与PD-1具有至少一个共同表位的类似物。完整的PD-1序列可以在登录号U64863下找到。
术语“治疗”是指抑制疾病、障碍或病症，即阻止其发展；以及(iii)缓解疾病、障碍或病症，即引起疾病、障碍和/或病症和/或与疾病、障碍和/或病症相关的症状的消退。
本公开文本旨在包括本发明的化合物中存在的原子的所有同位素。同位素包括那些具有相同原子序数但质量数不同的原子。通过一般举例而非限制的方式，氢的同位素包括氘和氚。碳的同位素包括13C和14C。本公开文本的同位素标记的化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与本文所述的方法类似的方法使用适当的同位素标记的试剂代替原本采用的非标记的试剂来制备。此类化合物可以具有多种潜在的用途，例如在确定生物活性时作为标准和试剂。在稳定同位素的情况下，此类化合物可以具有有利地改变生物学、药理学或药代动力学特性的潜力。
本文所述的主题的另一方面是所公开的化合物作为放射性标记的配体用于开发配体结合测定或用于监测体内吸附、代谢、分布、受体结合或占据或化合物处置的用途。例如，本文所述的大环化合物可以使用放射性同位素制备，并且所得放射性标记的化合物可以用于开发结合测定或用于代谢研究。可替代地并且出于同样的目的，本文所述的大环化合物可以通过使用本领域技术人员已知的方法进行催化氚化而转化为放射性标记的形式。
通过使用本领域技术人员已知的方法添加放射性示踪物，本公开文本的大环化合物也可以用作PET显像剂。
本领域普通技术人员知道氨基酸包括由以下通用结构表示的化合物：
其中R和R'是如本文所讨论的。除非另外指示，否则如本文所用的术语“氨基酸”(单独或作为另一个基团的一部分)包括但不限于连接到同一个碳(称为“α”碳)的氨基和羧基，其中R和/或R'可以是天然或非天然侧链，包括氢。“α”碳处的绝对“S”构型通常被称为“L”或“天然”构型。在“R”和“R'”(')取代基二者均等于氢的情况下，氨基酸是甘氨酸并且不是手性的。
在没有具体指定的情况下，本文所述的氨基酸可以是D-或L-立体化学并且可以如本公开文本的其他地方所述被取代。应当理解，当未指定立体化学时，本公开文本涵盖具有抑制PD-1与PD-L1和/或CD80和PD-L1之间的相互作用的能力的所有立体化学异构形式或其混合物。化合物的单独立体异构体可以从含有手性中心的可商购的起始材料合成制备，或者通过制备对映异构体产物的混合物，然后进行分离，诸如转化为非对映异构体的混合物，然后分离或重结晶、色谱技术或在手性色谱柱上的对映异构体的直接分离来制备。特定立体化学的起始化合物是可商购的，或者可以通过本领域已知的技术制备和拆分。
本公开文本的某些化合物可以以可分离的不同的稳定构象形式存在。由于围绕不对称单键的旋转受限(例如，由于空间位阻或环应变)导致的扭转不对称性可能允许不同构象异构体的分离。本公开文本包括这些化合物的每种构象异构体及其混合物。
本公开文本的某些化合物可以以互变异构体存在，所述互变异构体是由分子的质子转移至该分子内的不同原子的现象产生的化合物。术语“互变异构体”还指代平衡存在并且容易从一种异构体转化为另一种异构体的两种或更多种结构异构体中的一种。本文所述的化合物的所有互变异构体均被包括在本公开文本内。
本公开文本的药物化合物可以包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所需生物活性并且不赋予任何不需要的毒理作用的盐(参见例如，Berge,S.M.等人,J.Pharm.Sci.,66:1-19(1977))。盐可以在本文所述的化合物的最终分离和纯化过程中获得，或者通过使化合物的游离碱官能团与合适的酸反应或通过使化合物的酸性基团与合适的碱反应来单独获得。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸(诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等)以及衍生自无毒有机酸(诸如脂族单羧酸和脂族二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等)的盐。碱加成盐包括衍生自碱土金属(诸如钠、钾、镁、钙等)以及衍生自无毒有机胺(诸如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等)的盐。
本文所述的治疗剂的施用包括但不限于治疗有效量的治疗剂的施用。如本文所用的术语“治疗有效量”是指但不限于治疗通过施用包含本文所述的PD-1/PD-L1结合抑制剂的组合物可治疗的病症的治疗剂的量。该量是足以展现出可检测的治疗或改善效果的量。所述效果可以包括例如但不限于治疗本文列出的病症。对于受试者的精确有效量将取决于受试者的体型和健康状况、所治疗的病症的性质和程度、治疗医师的建议以及选择用于施用的治疗剂或治疗剂的组合。因此，预先指定确切的有效量是没有用的。
在另一方面，本公开文本涉及使用本公开文本的大环化合物抑制受试者的肿瘤细胞生长的方法。如本文所证明，本公开文本的化合物能够与PD-L1结合、破坏PD-L1与PD-1之间的相互作用、与已知阻断与PD-1的相互作用的抗PD-1单克隆抗体竞争与PD-L1的结合、增强CMV特异性T细胞IFNγ分泌以及增强HIV特异性T细胞IFNγ分泌。因此，本公开文本的化合物可用于改变免疫应答、治疗疾病(诸如癌症或感染性疾病)、刺激保护性自身免疫应答或刺激抗原特异性免疫应答(例如，通过与目的抗原共施用PD-L1阻断化合物)。
药物组合物
在另一方面，本公开文本提供了含有与药学上可接受的载体一起配制的本公开文本内所述的一种化合物或化合物组合的组合物，例如药物组合物。本公开文本的药物组合物也可以在组合疗法中施用，即与其他药剂组合施用。例如，组合疗法可以包括与至少一种其他抗炎剂或免疫抑制剂组合的大环化合物。可以在组合疗法中使用的治疗剂的例子在下文关于本公开文本的化合物的用途的部分中有更详细的描述。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。在一些实施方案中，载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。根据施用途径，可以将活性化合物包被在材料中以保护化合物免受可能使化合物失活的酸和其他天然条件的作用。
本公开文本的药物组合物还可以包含药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的例子包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
本公开文本的药物组合物可以使用本领域已知的多种方法中的一种或多种经由一种或多种施用途径来施用。如熟练技术人员将理解的，施用的途径和/或模式将根据所希望的结果而变化。在一些实施方案中，本公开文本的大环化合物的施用途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用的短语“肠胃外施用”意指除肠内和外用施用外的施用方式(通常通过注射施用)，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
无菌可注射溶液可以通过以下方式来制备：将活性化合物以所需量掺入视需要具有上文所列举成分中的一种或组合的适当溶剂中，然后微过滤灭菌。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备分散液，所述无菌媒介物含有基本分散介质和来自上文所列举成分的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，一些制备方法为真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其由先前无菌过滤的溶液产生活性成分和任何另外的所需成分的粉末。
可以用于本公开文本的药物组合物中的合适的水性和非水性载体的例子包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(诸如橄榄油)和可注射有机酯(诸如油酸乙酯)。可以例如通过使用包衣材料(诸如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。
这些组合物还可以含有佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过上述灭菌程序以及通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等)两种方式来确保防止微生物的存在。还可能希望在组合物中包括等渗剂，诸如糖、氯化钠等。另外，可以通过包含延迟吸收的试剂(诸如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射药物形式的延长吸收。
药学上可接受的载体包括无菌水性溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。此类介质和试剂用于药学活性物质的用途是本领域已知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则考虑其在本公开文本的药物组合物中的用途。也可以将补充性活性化合物掺入组合物中。
在制造和储存条件下，治疗性组合物典型地必须是无菌且稳定的。可以将组合物配制成溶液、微乳剂、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。可以例如通过使用包衣(诸如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。在许多情况下，希望在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸盐和明胶)来实现可注射组合物的延长吸收。
可替代地，本公开文本的化合物可以经由非肠胃外途径施用，所述非肠胃外途径诸如外用、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或外用施用。
本文考虑的任何药物组合物均可以例如经由任何可接受且合适的口服制剂口服递送。示例性口服制剂包括但不限于例如片剂、锭剂、糖锭剂、水性和油性混悬剂、可分散散剂或颗粒剂、乳剂、硬和软胶囊剂、液体胶囊剂、糖浆剂和酏剂。旨在用于口服施用的药物组合物可以根据本领域已知的用于制造旨在用于口服施用的药物组合物的任何方法来制备。为了提供药学上可口的制剂，根据本公开文本的药物组合物可以含有至少一种选自甜味剂、调味剂、着色剂、缓和剂、抗氧化剂和防腐剂的试剂。
片剂可以例如通过将至少一种式(I)的化合物和/或其至少一种药学上可接受的盐与适合于制造片剂的至少一种无毒的药学上可接受的赋形剂混合来制备。示例性赋形剂包括但不限于例如惰性稀释剂，例如像碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙和磷酸钠；制粒剂和崩解剂，例如像微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、玉米淀粉和海藻酸；粘合剂，例如像淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮和阿拉伯胶；以及润滑剂，例如像硬脂酸镁、硬脂酸和滑石。另外，片剂可以是未包衣的，或者通过已知技术包衣，以掩蔽尝起来令人不快的药物的不良味道，或延迟活性成分在胃肠道中的崩解和吸收，从而维持活性成分的作用持续更长时间。示例性水溶性味道掩蔽材料包括但不限于羟丙基甲基纤维素和羟丙基纤维素。示例性延时材料包括但不限于乙基纤维素和乙酸丁酸纤维素。
硬明胶胶囊剂可以例如通过将至少一种式(I)的化合物和/或其至少一种盐与至少一种惰性固体稀释剂(例如像碳酸钙、磷酸钙和高岭土)混合来制备。
软明胶胶囊剂可以例如通过将至少一种式(I)的化合物和/或其至少一种药学上可接受的盐与至少一种水溶性载体(例如像聚乙二醇)和至少一种油介质(例如像花生油、液体石蜡和橄榄油)混合来制备。
水性混悬剂可以例如通过将至少一种式(I)的化合物和/或其至少一种药学上可接受的盐与至少一种适合于制造水性混悬剂的赋形剂混合来制备，所述赋形剂包括但不限于例如助悬剂，例如像羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、海藻酸、聚乙烯吡咯烷酮、黄芪胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂，例如像天然存在的磷脂，例如卵磷脂；环氧烷与脂肪酸的缩合产物，例如像聚氧乙烯硬脂酸酯；环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物，例如像十七烷乙烯-氧基鲸蜡醇；环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，例如像聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯；以及环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如像聚乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。水性混悬剂还可以含有至少一种防腐剂，例如像对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸正丙酯；至少一种着色剂；至少一种调味剂；和/或至少一种甜味剂，包括但不限于例如蔗糖、糖精和阿斯巴甜。
油性混悬剂可以例如通过将至少一种式(I)的化合物和/或其至少一种药学上可接受的盐悬浮在植物油(例如像花生油、芝麻油和椰子油)或者悬浮在矿物油(例如像液体石蜡)中来制备。油性混悬剂还可以含有至少一种增稠剂，例如像蜂蜡、硬石蜡和鲸蜡醇。为了提供可口的油性混悬剂，可以将上文已经描述的至少一种甜味剂和/或至少一种调味剂添加到油性混悬剂中。油性混悬剂可以进一步含有至少一种防腐剂，包括但不限于例如抗氧化剂，例如像丁基化羟基茴香醚和α-生育酚。
可分散散剂和颗粒剂可以例如通过将至少一种式(I)的化合物和/或其至少一种药学上可接受的盐与至少一种分散剂和/或润湿剂、至少一种助悬剂和/或至少一种防腐剂混合来制备。合适的分散剂、润湿剂和助悬剂在上文已经有描述。示例性防腐剂包括但不限于例如抗氧化剂，例如抗坏血酸。另外，可分散散剂和颗粒剂还可以含有至少一种赋形剂，包括但不限于例如甜味剂、调味剂和着色剂。
至少一种式(I)的化合物和/或其至少一种药学上可接受的盐的乳剂可以例如制备为水包油乳剂。包含式(I)的化合物的乳剂的油相可以以已知方式由已知成分构成。油相可以通过但不限于例如植物油(例如像橄榄油和花生油)、矿物油(例如像液体石蜡)及其混合物来提供。虽然所述相可以仅包含乳化剂，但它可以包含至少一种乳化剂与脂肪或油或与脂肪和油二者的混合物。合适的乳化剂包括但不限于例如天然存在的磷脂，例如大豆卵磷脂；衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如像脱水山梨糖醇单油酸酯；以及偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如像聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。在一些实施方案中，亲水性乳化剂与亲脂性乳化剂一起被包括，所述亲脂性乳化剂充当稳定剂。有时还希望包括油和脂肪二者。一种或多种乳化剂与或不与一种或多种稳定剂一起构成所谓的乳化蜡，并且蜡与油和脂肪一起构成所谓的乳化软膏基质，其形成乳膏配制品的油性分散相。乳剂还可以含有甜味剂、调味剂、防腐剂和/或抗氧化剂。适合于在本公开文本的配制品中使用的乳化剂和乳剂稳定剂包括Tween 60、Span 80、十六十八醇、肉豆蔻醇、单硬脂酸甘油酯、月桂基硫酸钠、单独或与蜡一起的二硬脂酸甘油酯或本领域熟知的其他材料。
可以将活性化合物与将保护化合物免于快速释放的载体一起制备，诸如控释配制品，包括植入物、透皮贴剂和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的可生物相容的聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类配制品的许多方法已获得专利，或者通常是本领域技术人员已知的。参见例如，Robinson,J.R.编辑,Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,Marcel Dekker,Inc.,New York(1978)。
可以用本领域已知的医疗装置施用治疗性组合物。例如，在一个实施方案中，可以将本公开文本的治疗性组合物用无针皮下注射装置(诸如在美国专利号5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556中披露的装置)施用。可用于本公开文本的熟知的植入物和模块的例子包括：美国专利号4,487,603，其披露了用于以受控的速率分配药物的可植入微输注泵；美国专利号4,486,194，其披露了用于通过皮肤施用药物的治疗装置；美国专利号4,447,233，其披露了用于以精确的输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其披露了用于连续药物递送的可变流量可植入输注设备；美国专利号4,439,196，其披露了具有多室区室的渗透性药物递送系统；以及美国专利号4,475,196，其披露了渗透性药物递送系统。将这些专利通过引用并入本文。许多其他此类植入物、递送系统和模块是本领域技术人员已知的。
在某些实施方案中，可以配制本公开文本的化合物以确保适当的体内分布。例如，血脑屏障(BBB)排斥许多高度亲水性化合物。为了确保本公开文本的治疗性化合物穿过BBB(如果需要)，可以将它们配制在例如脂质体中。对于制造脂质体的方法，参见例如美国专利号4,522,811、5,374,548和5,399,331。脂质体可以包含选择性地转运到特定细胞或器官中从而增强靶向药物递送的一个或多个部分(参见例如，Ranade,V.V.,J.Clin.Pharmacol.,29:685(1989))。示例性靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如，Low等人的美国专利号5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.,153:1038(1988))；大环化合物(Bloeman,P.G.等人,FEBS Lett.,357:140(1995)；Owais,M.等人,Antimicrob.Agents Chemother.,39:180(1995))；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等人,Am.J.Physiol.,1233:134(1995))；p120(Schreier等人,J.Biol.Chem.,269:9090(1994))；还参见Keinanen,K.等人,FEBS Lett.,346:123(1994)；Killion,J.J.等人,Immunomethods4:273(1994)。
1.肽合成
本公开文本的大环肽可以通过本领域已知的方法产生，诸如它们可以化学合成、在无细胞体系中重组合成、在细胞内重组合成或者可以从生物来源中分离。本公开文本的大环肽的化学合成可以使用多种本领域公认的方法进行，所述方法包括逐步固相合成、通过肽片段的构象辅助再连接进行的半合成、克隆或合成肽段的酶连接以及化学连接。本文所述的合成大环肽及其类似物的优选方法是使用诸如以下文献中所描述的各种固相技术的化学合成：Chan,W.C.等人,编辑,Fmoc Solid Phase Synthesis,Oxford UniversityPress,Oxford(2000)；Barany,G.等人,The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,第2卷:"Special Methods in Peptide Synthesis,Part A",第3-284页,Gross,E.等人,编辑,Academic Press,New York(1980)；在Atherton,E.,Sheppard,R.C.Solid Phase PeptideSynthesis:A Practical Approach,IRL Press,Oxford,England(1989)；以及在Stewart,J.M.Young,J.D.Solid-Phase Peptide Synthesis,第2版,Pierce Chemical Co.,Rockford,IL(1984)。优选的策略基于用于暂时保护α-氨基的(9-芴基甲基氧基羰基)基团(Fmoc)与用于暂时保护氨基酸侧链的叔丁基(tBu)的组合(参见例如Atherton,E.等人,"The Fluorenylmethoxycarbonyl Amino Protecting Group",在The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,第9卷:"Special Methods in Peptide Synthesis,Part C",第1-38页,Undenfriend,S.等人,编辑,Academic Press,San Diego(1987)。
所述肽可以从肽的C末端开始，在不溶性聚合物支持物(也称为“树脂”)上以逐步方式合成。通过形成酰胺或酯键，将肽的C末端氨基酸附加到树脂，开始合成。这使得所得肽最终分别作为C末端酰胺或羧酸释放。
合成中使用的C末端氨基酸和所有其他氨基酸需要使它们的α-氨基和侧链官能团(如果存在的话)被差异地保护，使得α-氨基保护基团可以在合成过程中选择性地去除。氨基酸的偶联通过以下方式进行：激活羧基为活性酯，并且使其与附加到树脂的N末端氨基酸的未封闭α-氨基反应。重复α-氨基去保护和偶联的序列，直到整个肽序列被组装。然后从树脂中释放出肽，伴随着侧链官能团的去保护，这通常在存在适当的清除剂的情况下进行，以限制副反应。将所得肽最终通过反相HPLC纯化。
作为最终肽的前体所需的肽基树脂的合成利用了商业上可获得的交联聚苯乙烯聚合物树脂(Novabiochem,加利福尼亚州圣地亚哥；Applied Biosystems,加利福尼亚州福斯特市)。对于C末端甲酰胺，优选的固体支持物是：4-(2',4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)-苯氧乙酰基-对-甲基二苯甲基胺树脂(Rink酰胺MBHA树脂)；9-Fmoc-氨基-呫吨-3-基氧基-Merrifield树脂(Sieber酰胺树脂)；4-(9-Fmoc)氨基甲基-3,5-二甲氧基苯氧基)戊酰基氨基甲基-Merrifield树脂(PAL树脂)。第一个和随后的氨基酸的偶联可以分别使用由DIC/HOBt、HBTU/HOBt、BOP、PyBOP或由DIC/6-C1-HOBt、HCTU、DIC/HOAt或HATU生产的HOBt、6-Cl-HOBt或HOAt活性酯来完成。针对受保护的肽片段，优选的固体支持物是：2-氯三苯甲基氯树脂和9-Fmoc-氨基-呫吨-3-基氧基-Merrifield树脂(Sieber酰胺树脂)。通过使Fmoc保护的氨基酸与树脂在二氯甲烷和DIEA中反应，最佳地实现将第一个氨基酸加载到2-氯三苯甲基氯树脂上。如有必要，可以添加少量DMF以溶解氨基酸。
本文所述肽类似物的合成可以通过使用单通道或多通道肽合成器(诸如CEMLiberty Microwave合成器，或Protein Technologies,Inc.Prelude(6通道)或Symphony(12通道)或Symphony X(24通道)来进行。
有用的Fmoc氨基酸衍生物在以下示出。
用于固相合成的受正交保护的氨基酸的例子
用于它们各自肽的肽基树脂前体可以使用任何标准程序进行切割和去保护(参见例如，King,D.S.等人,Int.J.Peptide Protein Res.,36:255-266(1990))。所需的方法是在作为清除剂的TIS和作为二硫还原剂的DTT或TCEP的存在下使用TFA。典型地，将肽基树脂在TFA/TIS/DTT(95:5:1至97:3:1，v:v:w；1-3mL/100mg肽基树脂)中在室温下搅拌1.5-3小时。然后将用过的树脂过滤掉，并且将TFA溶液冷却并且添加Et2O溶液。通过离心并且倾析醚层(3x)收集沉淀物。将所得的粗肽直接重新溶解于DMF或DMSO或CH3CN/H2O中，用于通过制备型HPLC纯化或直接用于下一步骤。
具有所需纯度的肽可以通过使用制备型HPLC纯化获得，例如用Waters Model4000或Shimadzu Model LC-8A液相色谱。将粗肽溶液注射到YMC S5 ODS(20x100mm)柱中并且用线性梯度的在水中的MeCN洗脱，两者皆用0.1％ TFA缓冲，使用14-20mL/min流速，并且通过在217或220nm下的UV吸光度监测流出物。纯化肽的结构可以通过电喷雾MS分析确认。
本文提到的非天然存在的氨基酸的列表在以下提供。
在实施例和本文别处使用以下缩写：
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实施例0001-固相肽合成和肽的环化
使用全部或部分注明的本实施例中描述的程序合成表1中所示的大环肽方案1-用于硫醚大环肽的通用合成方法
固相肽合成(SPPS)和大环化的通用方案.
在Symphony肽合成器(Protein Technology Inc.亚利桑那州图森)，Prelude肽合成器(Protein Technology Inc.亚利桑那州图森)或Symphony X肽合成器(ProteinTechnology Inc.亚利桑那州图森)上，当在N2缓流下混合时，将用Fmoc-Pra-OH(0.100mmol)预加载的氯三苯甲基树脂用CH2Cl2溶胀，然后用DMF溶胀。将溶剂排出并且使用以下方法偶联第一氨基酸：当每30秒用N2缓流混合时，通过用20％哌啶在DMF中的溶液洗涤树脂两次来将Fmoc基团从树脂支持的构建单元中去除。将树脂用DMF洗涤五到六次。然后添加Fmoc-Gly-OH(0.2M溶液在DMF中)，然后偶联激活剂(即，HATU(Chem-Impex Int'l，0.4M溶液在DMF中)与碱(即，N-甲基吗啉(Aldrich，0.8M在DMF中)。将反应混合物通过氮气缓流搅动1-2h。将试剂从反应器皿中排出，并且将树脂用DMF洗涤五到六次。然后将所得的树脂支持的Fmoc保护的二肽依序去保护，并且以重迭的方式与第三氨基酸等偶联以得到所需的树脂支持的产物。
通过将树脂在氮气缓流下用20％哌啶在DMF中的溶液洗涤两次将Fmoc基团从N末端去除。将树脂用DMF洗涤(5-6x)。向肽-树脂用氯乙酸酐(0.2M在DMF中)处理，然后用NMM(0.8M在DMF中)处理。重复该反应。在排出所有试剂和溶剂后，将树脂用DMF和DCM洗涤，并且然后干燥。
对从树脂上切割的肽等分试样进行LCMS分析(在室温下用少量TFA/TIS/DTT(96:4:1)溶液处理分析量)，以确认所需线性序列的形成。
将肽全面去保护并且在用TFA/TIS/DTT(96:4:1)溶液处理1.5h后从树脂上切割。通过过滤去除树脂，用少量切割混合剂洗涤，并且将合并的滤液添加到冷Et2O中。将溶液在0℃下冷却，以使肽沉淀出溶液。将浆液离心以沉淀固体并且将上清液倾析。添加新鲜Et2O并且将过程重复三次以洗涤固体。向空气干燥的固体中添加DIEA/DMF(1-3mL DIEA在40-45mL DMF中)或0.1M NH4HCO3/乙腈(1/1至3/1(v/v))的溶液，使得溶液的pH大于8。将溶液搅拌16-72h并且通过LCMS监测。将反应溶液通过制备型反相HPLC纯化以获得所需产物。
通用分析方案和合成方法
分析数据：
质谱：“ESI-MS(+)”表示在正离子模式下执行的电喷雾电离质谱；“ESI-MS(-)”表示在负离子模式下执行的电喷雾电离质谱；“ESI-HRMS(+)”表示在正离子模式下执行的高分辨率电喷雾电离质谱；“ESI-HRMS(-)”表示在负离子模式下执行的高分辨率电喷雾电离质谱。检测到的质量按照“m/z”单位名称报告。确切质量大于1000的化合物通常被检测为双电荷或三电荷离子。
将粗材料经由制备型LC/MS纯化。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。
分析型LC/MS条件A：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1x50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含10mM乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含10mM乙酸铵)；温度：50℃；梯度：0-100％ B经3分钟，然后在100％ B下保持0.75分钟；流量：1.0mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件B：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1x50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：0-100％B经3分钟，然后在100％ B下保持0.75分钟；流量：1.0mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件C：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1x50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含10mM乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含10mM乙酸铵)；温度：70℃；梯度：0-100％ B经3分钟，然后在100％ B下保持2.0分钟；流量：0.75mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件D：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1x50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；温度：70℃；梯度：0-100％B经3分钟，然后在100％ B下保持2.0分钟；流量：0.75mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件E：
柱：Kinetex XB C18，3.0x75mm，2.6μm颗粒；流动相A：在水:乙腈(98:2)中的10mM甲酸铵；流动相B：在水:乙腈(02:98)中的10mM甲酸铵；梯度：20％-100％B经4分钟，然后在100％ B下保持0.6分钟；流量：1.0mL/min；检测：在254nm下的UV。
分析型LC/MS条件F：
柱：Ascentis Express C18，2.1x50mm，2.7μm颗粒；流动相A：在水:乙腈(95:5)中的10mM乙酸铵；流动相B：在水:乙腈(05:95)中的10mM乙酸铵，温度：50℃；梯度：0-100％ B经3分钟；流量：1.0mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件G：
柱：X Bridge C18，4.6x50mm，5μm颗粒；流动相A：在水中的0.1％ TFA；流动相B：乙腈，温度：35℃；梯度：5％-95％ B经4分钟；流量：4.0mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件H：
柱：X Bridge C18，4.6x50mm，5μm颗粒；流动相A：10mM NH4OAc；流动相B：甲醇，温度：35℃；梯度：5％-95％ B经4分钟；流量：4.0mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件I：
柱：X Bridge C18，4.6x50mm，5μm颗粒；流动相A：10mM NH4OAc；流动相B：乙腈，温度：35℃；梯度：5％-95％ B经4分钟；流量：4.0mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件J：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1x50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；温度：70℃；梯度：0-100％ B经1.5分钟，然后在100％ B下保持2.0分钟；流量：0.75mL/min；检测：在254nm下的UV。
分析型LC/MS条件K：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1x50mm，1.7μm颗粒；流动相A：100％水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：100％乙腈(含0.05％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：2％-98％ B经1.0分钟，然后在98％ B下保持1.0-1.5分钟；流量：0.80mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件L：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1x50mm，1.7μm颗粒；缓冲液：10mM乙酸铵。流动相A：缓冲液”CH3CN(95/5)；流动相B：流动相B：缓冲液：ACN(5:95)；温度：50℃；梯度：20％-98％ B经2.0分钟，然后在100％ B下保持0.2分钟；流量：0.70mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件M：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，3.0x50mm，1.7μm颗粒；流动相A：95％水和5％水(含0.1％三氟乙酸)；流动相B：95％乙腈和5％水(含0.1％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：20％-100％ B经2.0分钟，然后在100％ B下保持2.0-2.3分钟；流量：0.7mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件N：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1x50mm，1.7μm颗粒；流动相A：100％水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：100％乙腈(含0.05％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：2％-98％ B经5.0分钟，然后在98％ B下保持5.0-5.5分钟；流量：0.80mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件O：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1x50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：2％-98％ B经2分钟，然后在98％ B下保持0.5分钟；流量：0.8mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件P：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1x50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：0％-100％ B经3分钟，然后在100％ B下保持0.5分钟；流量：1.0mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件Q：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1x50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：0％-100％ B经1分钟，然后在100％ B下保持0.5分钟；流量：1.0mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件R：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1x50mm，1.7μm颗粒；缓冲液：10mM乙酸铵。流动相A：缓冲液”CH3CN(95/5)；流动相B：流动相B：缓冲液:ACN(5:95)；温度：50℃；梯度：0％-100％ B经1分钟，然后在100％ B下保持0.5分钟；流量：1.0mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件S：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1x50mm，1.7μm颗粒；流动相A：100％水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：100％乙腈(含0.05％三氟乙酸)；梯度：2％-98％ B经1.6分钟，然后在98％ B下保持0.2分钟；流量：0.80mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件T：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1x50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：2％-98％ B经2.6分钟，然后在98％ B下保持0.4分钟；流量：0.8mL/min；检测：在220nm下的UV。
分析型LC/MS条件U：
柱：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1x50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含10mM乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含10mM乙酸铵)；梯度：30％-100％ B经3分钟，然后在100％ B下保持0.75分钟；流量：1.0mL/min；检测：在220nm下的UV。
通用程序：
Prelude方法：
所有操作都是在Prelude肽合成器(Protein Technologies)上自动化进行的。除非有说明，否则所有程序都是在安装有底部玻璃料的45mL聚丙烯反应器皿中进行的。反应器皿通过器皿的底部和顶部两者与Prelude肽合成器连接。可以通过器皿的顶部添加DMF和DCM，它们同样沿器皿的侧面向下洗涤。通过反应器皿的底部添加其余试剂，并且其向上穿过玻璃料接触树脂。经由反应器皿的底部去除全部溶液。“周期性搅动”描述了N2气体穿过底部玻璃料的短暂脉冲；所述脉冲持续大约5秒，并且每30秒发生一次。通常不使用超出制备起两周的氨基酸溶液。使用在制备7-14天内的HATU溶液。
Sieber酰胺树脂＝9-Fmoc-氨基呫吨-3-基氧基聚苯乙烯树脂，其中“3-基氧基”描述了与聚苯乙烯树脂连接的位置和类型。所用的树脂是具有Sieber接头(在氮处受Fmoc保护)的聚苯乙烯；100-200目，1％ DVB，0.71mmol/g负载量。
Rink＝(2,4-二甲氧基苯基)(4-烷氧基苯基)甲胺，其中“4-烷氧基”描述了与聚苯乙烯树脂连接的位置和类型。使用的树脂是Merrifield聚合物(聚苯乙烯)，带有Rink接头(在氮处受Fmoc保护)；100-200目，1％ DVB，0.56mmol/g负载量。
2-氯三苯甲基氯树脂(2-氯三苯基甲基氯树脂)，50-150目，1％ DVB，1.54mmol/g负载量。Fmoc-甘氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂，200-400目，1％ DVB，0.63mmol/g负载量。
PL-FMP树脂：(4-甲酰基-3-甲氧基苯氧基甲基)聚苯乙烯。
以下列出了使用的常用氨基酸，其中侧链保护基团在括号内指示。
Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(tBu)-OH；Fmoc-Bip-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Orn(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH以及它们对应的D-氨基酸。
“Prelude方法”的程序描述了在0.100mmol规模上进行的实验，其中所述规模由Sieber或Rink或2-氯三苯甲基或PL-FMP树脂的量决定。该规模对应于大约140mg上述Sieber酰胺树脂。通过根据规模的倍数调整所述体积，可以将所有程序从0.100mmol规模进行规模缩小或放大。在氨基酸偶联之前，所有肽合成序列都从树脂溶胀程序(下文称为“树脂溶胀程序”)开始。氨基酸与伯胺N末端的偶联使用以下描述的“单偶联程序”。氨基酸与仲胺N末端或与Arg(Pbf)-和D-Arg(Pbf)-的N末端偶联使用以下描述的“双偶联程序”。
树脂溶胀程序：
向45mL聚丙烯固相反应器皿中添加Sieber酰胺树脂(140mg，0.100mmol)。如下将树脂洗涤(溶胀)两次：通过器皿的顶部向反应器皿中添加DMF(5.0mL)，即“DMF顶洗”，此后将混合物周期性地搅动10分钟，之后通过玻璃料排出溶剂。
单偶联程序：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。将混合物周期性地搅动5.0分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。将混合物周期性地搅动5.0分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(6.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动1.0分钟，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氨基酸(0.2M在DMF中，5.0mL，10当量)、然后HATU(0.4M在DMF中，2.5mL，10当量)以及最后NMM(0.8M在DMF中，2.5mL，20当量)。将混合物周期性地搅动60-120分钟，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤四次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动1.0分钟，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
双偶联程序：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。将混合物周期性地搅动5.0分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。将混合物周期性地搅动5.0分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(6.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动1.0分钟，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氨基酸(0.2M在DMF中，5.0mL，10当量)、然后HATU(0.4M在DMF中，2.5mL，10当量)以及最后NMM(0.8M在DMF中，2.5mL，20当量)。将混合物周期性地搅动1-1.5小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤两次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动1.0分钟，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氨基酸(0.2M在DMF中，5.0mL，10当量)、然后HATU(0.4M在DMF中，2.5mL，10当量)以及最后NMM(0.8M在DMF中，2.5mL，20当量)。将混合物周期性地搅动1-1.5小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤四次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动1.0分钟，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
单偶联手动添加程序A：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。反应暂停。将反应器皿打开并且在器皿的底部保持与仪器附接的同时，使用移液管从器皿的顶部手动添加在DMF(1-2mL)中的非天然氨基酸(2-4当量)，然后将器皿关闭。恢复自动程序并且依序添加HATU(0.4M在DMF中，1.3mL，4当量)和NMM(1.3M在DMF中，1.0mL，8当量)。将混合物周期性地搅动2-3小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤五次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
单偶联手动添加程序B：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。反应暂停。将反应器皿打开并且在器皿的底部保持与仪器附接的同时，使用移液管从器皿的顶部手动添加在DMF(1-1.5mL)中的非天然氨基酸(2-4当量)，然后手动添加HATU(2-4当量，与非天然氨基酸相同的当量)，并且然后关闭器皿。恢复自动程序并且依序添加NMM(1.3M在DMF中，1.0mL，8当量)。将混合物周期性地搅动2-3小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤五次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
类肽装配(50μmol)程序：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动60秒，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加溴乙酸(0.4M在DMF中，2.0mL，16当量)，然后添加DIC(0.4M在DMF中，2.0mL，16当量)。将混合物周期性地搅动1小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤五次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加胺(0.4M在DMF中，2.0mL，16当量)。将混合物周期性地搅动1小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤五次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
氯乙酸酐偶联：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(6.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动一分钟，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氯乙酸酐溶液(0.4M在DMF中，5.0mL，20当量)，然后添加N-甲基吗啉(0.8M在DMF中，5.0mL，40当量)。将混合物周期性地搅动15分钟，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂洗涤两次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(6.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动一分钟，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氯乙酸酐溶液(0.4M在DMF中，5.0mL，20当量)，然后添加N-甲基吗啉(0.8M在DMF中，5.0mL，40当量)。将混合物周期性地搅动15分钟，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤五次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(6.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动一分钟，然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤四次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DCM(6.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动一分钟，然后通过玻璃料排出溶液。然后将树脂用氮气流干燥10分钟。将所得树脂直接用于下一步骤。
Symphony方法：
所有操作都是在12通道Symphony肽合成器(Protein Technologies)上自动化进行的。除非有说明，否则所有程序都是在安装有底部玻璃料的25mL聚丙烯反应器皿中进行的。将反应器皿通过器皿的底部和顶部两者与Symphony肽合成器连接。可以通过器皿的顶部添加DMF和DCM，它们同样沿器皿的侧面向下洗涤。通过反应器皿的底部添加其余试剂，并且其向上穿过玻璃料接触树脂。经由反应器皿的底部去除全部溶液。“周期性搅动”描述了N2气体穿过底部玻璃料的短暂脉冲；所述脉冲持续大约5秒，并且每30秒发生一次。通常不使用超出制备起两周的氨基酸溶液。使用在制备7-14天内HATU溶液。
Sieber酰胺树脂＝9-Fmoc-氨基呫吨-3-基氧基聚苯乙烯树脂，其中“3-基氧基”描述了与聚苯乙烯树脂连接的位置和类型。所用的树脂是具有Sieber接头(在氮处受Fmoc保护)的聚苯乙烯；100-200目，1％ DVB，0.71mmol/g负载量。
Rink＝(2,4-二甲氧基苯基)(4-烷氧基苯基)甲胺，其中“4-烷氧基”描述了与聚苯乙烯树脂连接的位置和类型。使用的树脂是Merrifield聚合物(聚苯乙烯)，带有Rink接头(在氮处受Fmoc保护)；100-200目，1％ DVB，0.56mmol/g负载量。
2-氯三苯甲基氯树脂(2-氯三苯基甲基氯树脂)，50-150目，1％ DVB，1.54mmol/g负载量。
PL-FMP树脂：(4-甲酰基-3-甲氧基苯氧基甲基)聚苯乙烯。
Fmoc-甘氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂，200-400目，1％ DVB，0.63mmol/g负载量。
以下列出了使用的常用氨基酸，其中侧链保护基团在括号内指示：
Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(tBu)-OH；Fmoc-Bip-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Orn(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH以及它们对应的D-氨基酸。
“Symphony方法”的程序描述了在0.05mmol规模上进行的实验，其中所述规模由与树脂结合的Sieber或Rink或氯三苯甲基接头或PL-FMP的量决定。该规模对应于大约70mg上述Sieber树脂。通过根据规模的倍数调整所述体积，可以将所有程序从0.05mmol规模进行规模放大。
在氨基酸偶联之前，所有肽合成序列都从树脂溶胀程序(下文称为“树脂溶胀程序”)开始。氨基酸与伯胺N末端的偶联使用以下描述的“单偶联程序”。氨基酸与仲胺N末端或与Arg(Pbf)-和D-Arg(Pbf)-的N末端偶联使用以下描述的“双偶联程序”。
树脂溶胀程序：
向25mL聚丙烯固相反应器皿中添加树脂(0.05mmol)。如下将树脂洗涤(溶胀)：向反应器皿中添加DMF(2.0-3.0mL，1-2次)，此后将混合物周期性地搅动10分钟，之后通过玻璃料排出溶剂。有时如下将树脂洗涤(溶胀)：向反应器皿中添加CH2Cl2(3-5mL，2次)，其中将混合物周期性地搅动30min并且通过玻璃料排出溶剂。然后添加DMF(2.0-3.0mL，1-6次)，此后将混合物周期性地搅动2-10分钟，之后通过玻璃料排出溶剂。
单偶联程序：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加DMF(2.5-3.75mL)三次，此后将混合物搅动30秒，之后每次通过玻璃料排出溶剂。向树脂中添加哌啶:DMF(20:80v/v，3.0-3.75mL)。将混合物周期性地搅动5.0分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，3.0-3.75mL)。将混合物周期性地搅动5.0分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。有时进行去保护步骤第三次。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，向器皿中添加DMF(2.5-3.75mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，之后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氨基酸(0.2M在DMF中，2.0-2.5mL，8-10当量)，然后添加HATU(0.4M在DMF中，1.0-1.25mL，8-10当量)，并且最后添加NMM(0.8M在DMF中，1.0-1.25mL，20当量)。将混合物周期性地搅动30-120分钟，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，添加DMF(2.5-3.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，之后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
单偶联手动添加程序：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加DMF(3.0-3.75mL)三次，此后将混合物搅动30秒，之后每次通过玻璃料排出溶剂。向树脂中添加哌啶:DMF(20:80v/v，3.0-3.75mL)。将混合物周期性地搅动5.0分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，3.0-3.75mL)。将混合物周期性地搅动5.0分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。将混合物周期性地搅动5.0分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，向器皿中添加DMF(3.0-3.75mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，之后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加预混合的氨基酸(2.0-5.0当量)和HATU(0.4M在DMF中，2.0-5.0当量)，然后添加NMM(0.8M在DMF中，4.0-10.0当量)，并且氨基酸、HATU和NMM的摩尔比为1:1:2。将混合物周期性地搅动2-6小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤四次：对于每次洗涤，向器皿中添加DMF(3.75mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，之后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
双偶联程序：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加DMF(2.5-3.75mL)三次，此后将混合物搅动30秒，之后每次通过玻璃料排出溶剂。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，3.0-3.75mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，3.0-3.75mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，添加DMF(3.0-3.75mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，之后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氨基酸(0.2M在DMF中，2.0-2.5mL，8-10当量)，然后添加HATU(0.4M在DMF中，1.0-1.25mL，10当量)，并且最后添加NMM(0.8M在DMF中，1.0-1.25mL，16-20当量)。将混合物周期性地搅动1小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。将树脂用DMF(3.0-3.75mL)洗涤两次并且将所得混合物周期性地搅动30秒，之后每次通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氨基酸(0.2M在DMF中，2.0-2.5mL，8-10当量)，然后添加HATU(0.4M在DMF中，1.0-1.25mL，8-10当量)，并且最后添加NMM(0.8M在DMF中，1.0-1.25mL，16-20当量)。将混合物周期性地搅动1-2小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，添加DMF(3.0-3.75mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，之后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
类肽装配(50μmol)程序：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，3.75mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，3.75mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，向器皿中添加DMF(3.75mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，之后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加溴乙酸(0.4M在DMF中，2.5mL，10当量)，然后添加DIC(0.4M在DMF中，2.5mL，10当量)。将混合物周期性地搅动60min，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤两次：对于每次洗涤，向器皿中添加DMF(3.75mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，之后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加胺(0.4M在DMF中，2.5mL，10当量)，将混合物周期性地搅动60min，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤五次：对于每次洗涤，向器皿中添加DMF(3.75mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，之后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
氯乙酸酐偶联：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加DMF(3.0-3.75mL)三次，此后将混合物搅动30秒，之后每次通过玻璃料排出溶剂。向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，3.0-3.75mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，3.0-3.75mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(3.0-3.75mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氯乙酸酐溶液(0.4M在DMF中，3.0-3.75mL，30当量)，然后添加NMM(0.8M在DMF中，2.5mL，40当量)。将混合物周期性地搅动15分钟，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂洗涤一次：通过器皿顶部添加DMF(5.0-6.25mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氯乙酸酐溶液(0.4M在DMF中，3.75mL，30当量)，然后添加NMM(0.8M在DMF中，2.5mL，40当量)。将混合物周期性地搅动15分钟，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(2.5mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤四次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DCM(2.5mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂使用氮气流干燥10min，之后直接用于下一步骤。
Symphony X方法：
所有操作都是在Symphony X肽合成器(Protein Technologies)上自动化进行的。除非有说明，否则所有程序都是在安装有底部玻璃料的45mL聚丙烯反应器皿中进行的。反应器皿通过器皿的底部和顶部两者与Symphony X肽合成器连接。可以通过器皿的顶部添加DMF和DCM，它们同样沿器皿的侧面向下洗涤。通过反应器皿的底部添加其余试剂，并且其向上穿过玻璃料接触树脂。经由反应器皿的底部去除全部溶液。“周期性搅动”描述了N2气体穿过底部玻璃料的短暂脉冲；所述脉冲持续大约5秒，并且每30秒发生一次。“单发(singleshot)”添加模式描述了包含在单发falcon管(通常是小于5mL的任何体积)中的所有溶液的添加。通常不使用超出制备起两周的氨基酸溶液。使用在制备14天内的HATU溶液。
Sieber酰胺树脂＝9-Fmoc-氨基呫吨-3-基氧基聚苯乙烯树脂，其中“3-基氧基”描述了与聚苯乙烯树脂连接的位置和类型。所用的树脂是具有Sieber接头(在氮处受Fmoc保护)的聚苯乙烯；100-200目，1％ DVB，0.71mmol/g负载量。
Rink＝(2,4-二甲氧基苯基)(4-烷氧基苯基)甲胺，其中“4-烷氧基”描述了与聚苯乙烯树脂连接的位置和类型。使用的树脂是Merrifield聚合物(聚苯乙烯)，带有Rink接头(在氮处受Fmoc保护)；100-200目，1％ DVB，0.56mmol/g负载量。
2-氯三苯甲基氯树脂(2-氯三苯基甲基氯树脂)，50-150目，1％ DVB，1.54mmol/g负载量。Fmoc-甘氨酸-2-氯三苯甲基氯树脂，200-400目，1％ DVB，0.63mmol/g负载量。
PL-FMP树脂：(4-甲酰基-3-甲氧基苯氧基甲基)聚苯乙烯。
以下列出了使用的常用氨基酸，其中侧链保护基团在括号内指示：
Fmoc-Ala-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Asn(Trt)-OH；Fmoc-Asp(tBu)-OH；Fmoc-Bip-OH；Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Dab(Boc)-OH；Fmoc-Dap(Boc)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-His(Trt)-OH；Fmoc-Hyp(tBu)-OH；Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Lys(Boc)-OH；Fmoc-Nle-OH；Fmoc-Met-OH；Fmoc-[N-Me]Ala-OH；Fmoc-[N-Me]Nle-OH；Fmoc-Orn(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Sar-OH；Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Thr(tBu)-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-Val-OH以及它们对应的D-氨基酸。
“Symphony X方法”的程序描述了在0.050mmol规模上进行的实验，其中所述规模由与树脂结合的Sieber或Rink或2-氯三苯甲基或PL-FMP的量决定。该规模对应于大约70mg上述Sieber酰胺树脂。通过根据规模的倍数调整所述体积，可以将所有程序的规模放大超过或小于0.050mmol规模。在氨基酸偶联之前，所有肽合成序列都从树脂溶胀程序(下文称为“树脂溶胀程序”)开始。氨基酸与伯胺N末端的偶联使用以下描述的“单偶联程序”。使用以下描述的“双偶联程序”或“单偶联2小时程序”将氨基酸与仲胺N末端或与Arg(Pbf)-和D-Arg(Pbf)-或D-Leu的N末端偶联。除非另有说明，否则自动合成的最后一步是乙酰基装配，如“氯乙酰基酸酐装配”中所述。所有合成都用描述为“标准最终冲洗和干燥程序”的最终的冲洗和干燥步骤结束。
树脂溶胀程序：
向45mL聚丙烯固相反应器皿中添加Sieber酰胺树脂(70mg，0.050mmol)。如下将树脂洗涤(溶胀)三次：通过器皿的顶部向反应器皿中添加DMF(5.0mL)“DMF顶洗”，此后将混合物周期性地搅动3分钟，之后通过玻璃料排出溶剂。
单偶联程序：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氨基酸(0.2M在DMF中，2.0mL，8当量)、然后HATU(0.4M在DMF中，1.0mL，8当量)以及最后NMM(0.8M在DMF中，1.0mL，16当量)。将混合物周期性地搅动1-2小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤五次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
单偶联4当量程序：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氨基酸(0.2M在DMF中，1.0mL，4当量)，然后HATU(0.2M在DMF中，1.0mL，4当量)，并且最后NMM(0.8M在DMF中，1.0mL，16当量)。将混合物周期性地搅动1-2小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤五次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
双偶联程序：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氨基酸(0.2M在DMF中，2.0mL，8当量)、然后HATU(0.4M在DMF中，1.0mL，8当量)以及最后NMM(0.8M在DMF中，1.0mL，16当量)。将混合物周期性地搅动1小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤两次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氨基酸(0.2M在DMF中，2.0mL，8当量)、然后HATU(0.4M在DMF中，1.0mL，8当量)以及最后NMM(0.8M在DMF中，1.0mL，16当量)。将混合物周期性地搅动1-2小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤五次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
双偶联4当量程序：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氨基酸(0.2M在DMF中，1.0mL，4当量)，然后HATU(0.2M在DMF中，1.0mL，4当量)，并且最后NMM(0.8M在DMF中，1.0mL，16当量)。将混合物周期性地搅动1小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤两次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氨基酸(0.2M在DMF中，1.0mL，4当量)，然后HATU(0.2M在DMF中，1.0mL，4当量)，并且最后NMM(0.8M在DMF中，1.0mL，16当量)。将混合物周期性地搅动1-2小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤五次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
单偶联手动添加程序A：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。反应暂停。将反应器皿打开并且在器皿的底部保持与仪器附接的同时，使用移液管从器皿的顶部手动添加在DMF(1-1.5mL)中的非天然氨基酸(2-4当量)，然后将器皿关闭。恢复自动程序并且依序添加HATU(0.4M在DMF中，1.0mL，8当量)和NMM(0.8M在DMF中，1.0mL，16当量)。将混合物周期性地搅动2-3小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤五次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
单偶联手动添加程序B：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。反应暂停。将反应器皿打开并且在器皿的底部保持与仪器附接的同时，使用移液管从器皿的顶部手动添加在DMF(1-1.5mL)中的非天然氨基酸(2-4当量)，然后手动添加HATU(2-4当量，与非天然氨基酸相同的当量)，然后关闭器皿。恢复自动程序并且依序添加NMM(0.8M在DMF中，1.0mL，16当量)。将混合物周期性地搅动2-3小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤五次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
单偶联手动添加程序C：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。反应暂停。将反应器皿打开并且在器皿的底部保持与仪器附接的同时，使用移液管从器皿的顶部手动添加在含有HATU(相对于非天然氨基酸等摩尔量)和NMM(4-8当量)的DMF(1-1.5mL)中的非天然氨基酸(2-4当量)。恢复自动程序并且将混合物周期性地搅动2-3小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤五次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
单偶联手动添加程序D：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。反应暂停。将反应器皿打开并且在器皿的底部保持与仪器附接的同时，使用移液管从器皿的顶部手动添加在含有DIC(相对于非天然氨基酸等摩尔量)和HOAt(相对于非天然氨基酸等摩尔量)的DMF(1-1.5mL)中的非天然氨基酸(2-4当量)。恢复自动程序并且将混合物周期性地搅动2-3小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤五次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
类肽装配(50μmol)程序：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，3.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，3.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(3.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加溴乙酸(0.4M在DMF中，1.0mL，8当量)，然后添加DIC(0.4M在DMF中，1.0mL，8当量)。将混合物周期性地搅动1小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤两次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(4.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加胺(0.4M在DMF中，2.0mL，16当量)。将混合物周期性地搅动1小时，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤五次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(3.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
氯乙酸酐偶联：
向来自先前步骤的含有树脂的反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，3.0mL)。将混合物周期性地搅动3.5或5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，3.0mL)。将混合物周期性地搅动5分钟，并且然后通过玻璃料排出溶液。如下将树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(3.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氯乙酸酐溶液(0.4M在DMF中，2.5mL，20当量)，然后添加N-甲基吗啉(0.8M在DMF中，2.0mL，32当量)。将混合物周期性地搅动15分钟，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂洗涤两次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(3.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动1.0分钟，然后通过玻璃料排出溶液。向反应器皿中添加氯乙酸酐溶液(0.4M在DMF中，2.5mL，20当量)，然后添加N-甲基吗啉(0.8M在DMF中，2.0mL，32当量)。将混合物周期性地搅动15分钟，然后通过玻璃料排出反应溶液。如下将树脂相继洗涤五次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DMF(3.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动1.0分钟，然后通过玻璃料排出溶液。将所得树脂直接用于下一步骤。
最终冲洗和干燥程序：
如下将来自先前步骤的树脂相继洗涤六次：对于每次洗涤，通过器皿顶部添加DCM(5.0mL)，并且将所得混合物周期性地搅动30秒，然后通过玻璃料排出溶液。然后将树脂使用氮气流干燥10分钟。将所得树脂直接用于下一步骤。
通用去保护、环化、N-甲基化、点击、铃木程序：
全面去保护方法A：
除非有说明，否则所有操作都手动进行。“全面去保护方法”的程序描述了在0.050mmol规模上进行的实验，其中所述规模由Sieber或Rink或Wang或氯三苯甲基树脂或PL-FMP树脂的量决定。通过根据规模的倍数调整所述体积，可以将所述程序的规模放大超过0.05mmol规模。在50mL Falcon管中添加树脂和2.0-5.0mL切割混合剂(TFA:TIS:DTT，v/v/w＝95:5:1)。用于每个单独线性肽的切割混合剂的体积可以是可变的。总体上，肽侧链中存在的保护基团数量越多，就需要越大体积的切割混合剂。将混合物在室温下振荡1-2小时，通常约1.5小时。向悬浮液中添加35-50mL冷乙醚。将混合物剧烈混合，此后沉淀出大量白色固体。将混合物离心3-5分钟，然后将溶液从固体倾析并且丢弃。将固体悬浮在Et2O(30-40mL)中，然后将混合物离心3-5分钟；并且将溶液从固体倾析并且丢弃。最后一次，将固体悬浮在Et2O(30-40mL)中；将混合物离心3-5分钟；并且在氮气流下和/或在室真空下干燥后，将溶液从固体倾析并且丢弃，以得到呈白色至灰白色固体的粗肽连同切割的树脂。在同一天使用粗品用于环化步骤。
全面去保护方法B：
除非有说明，否则所有操作都手动进行。“全面去保护方法”的程序描述了在0.050mmol规模上进行的实验，其中所述规模由Sieber或Rink或Wang或氯三苯甲基树脂或PL-FMP树脂的量决定。通过根据规模的倍数调整所述体积，可以将所述程序的规模放大超过0.05mmol规模。在30ml bio-rad poly-prep色谱柱中添加树脂和2.0-5.0mL切割混合剂(TFA:TIS:H2O:DTT，v/v/w＝94:3:3:1)。用于每个单独线性肽的切割混合剂的体积可以是可变的。总体上，肽侧链中存在的保护基团数量越多，就需要越大体积的切割混合剂。将混合物在室温下振荡1-2小时，通常约1.5小时。将酸性溶液排除到40mL冷乙醚中并且将树脂用0.5mL TFA溶液洗涤两次。将混合物离心3-5分钟，然后将溶液从固体倾析并且丢弃。将固体悬浮在Et2O(35mL)中，然后将混合物离心3-5分钟；并且将溶液从固体中倾析出并且丢弃。最后一次，将固体悬浮在Et2O(35mL)中；将混合物离心3-5分钟；并且在氮气流下和/或在室真空下干燥后，将溶液从固体倾析并且丢弃，以得到呈白色至灰白色固体的粗肽。在同一天使用粗品用于环化步骤。
环化方法A：
除非有说明，否则所有操作都手动进行。“环化方法A”的程序描述了在0.05mmol规模上进行的实验，其中所述规模由用于产生肽的Sieber或Rink或氯三苯甲基或Wang或PL-FMP树脂的量决定。此规模不基于对所述程序中使用的肽量的直接确定。通过根据规模的倍数调整所述体积，可以将所述程序的规模放大超过0.05mmol规模。将来自全面去保护的粗肽固体在室温下溶解在50mL离心管中的DMF(30-45mL)中，并且向溶液中添加DIEA(1.0-2.0mL)并且使以上反应混合物的pH值为8。然后允许将溶液在室温下振荡几个小时或过夜或经2-3天。将反应溶液在speedvac或genevac EZ-2上浓缩至干，并且然后将粗残余物溶解在DMF或DMF/DMSO(2mL)中。过滤后，使该溶液经受单化合物反相HPLC纯化，以得到所需的环肽。
环化方法B：
除非有说明，否则所有操作都手动进行。“环化方法B”的程序描述了在0.05mmol规模上进行的实验，其中所述规模由用于产生肽的Sieber或Rink或氯三苯甲基或Wang或PL-FMP树脂的量决定。此规模不基于对所述程序中使用的肽量的直接确定。通过根据规模的倍数调整所述体积，可以将所述程序的规模放大超过0.05mmol规模。将在50mL离心管中的粗肽固体溶解在CH3CN/0.1M碳酸氢铵水溶液(1:1，v/v，30-45mL)中。然后允许将溶液在室温下振荡几个小时。通过pH纸和LCMS检查反应溶液，并且可以通过添加0.1M碳酸氢铵水溶液(5-10mL)将pH调整至超过8。在基于LCMS上线性肽的消失的反应完成后，将反应在speedvac或genevac EZ-2上浓缩至干。向所得残余物中装入CH3CN:H2O(2:3，v/v，30mL)，并且在speedvac或genevac EZ-2上浓缩至干。重复该程序(通常2次)。然后将所得粗固体溶解在DMF或DMF/DMSO或CH3CN/H2O/甲酸中。在过滤后，使溶液经受单化合物反相HPLC纯化，以得到所需的环肽。
在树脂上的N-甲基化方法A.
向在Bio-Rad管中的树脂(50μmol)中添加CH2Cl2(2mL)并且在室温下振荡5min。添加2-硝基苯-1-磺酰氯(44.3mg，200μmol，4当量)，然后添加2,4,6-三甲基吡啶(0.040mL，300μmol，6当量)。将反应在室温下振荡2h。将溶剂排出并且将树脂用CH2Cl2(5mL x 3)、DMF(5mL x 3)以及然后THF(5mL x 3)冲洗。向树脂中添加THF(1mL)。添加三苯基膦(65.6mg，250μmol，5当量)、甲醇(0.020mL，500μmol，10当量)和偶氮二甲酸二乙酯或DIAD(0.040mL，250μmol，5当量)。将混合物在室温下振荡2-16h。重复反应。添加三苯基膦(65.6mg，250μmol，5当量)、甲醇(0.020mL，500μmol，10当量)和偶氮二甲酸二乙酯或DIAD(0.040mL，250μmol，5当量)。将混合物在室温下振荡1-16h。将溶剂排出，并且将树脂用THF(5mL x 3)和CHCl3(5mL x 3)洗涤。将树脂空气干燥并且直接用于下一步骤。将树脂在DMF(2mL)中振荡。添加2-巯基乙醇(39.1mg，500μmol)，然后添加DBU(0.038mL，250μmol，5当量)。将反应振荡1.5h。将溶剂排出。将树脂用DMF(4x)洗涤。空气干燥并且直接用于下一步骤。
在树脂上的N-甲基化方法B(Turner,R.A.等人,Org.Lett.,15(19):5012-5015(2013)).
除非有说明，否则所有的操作都是手动进行的。“在树脂上的N-甲基化方法A”的程序描述了在0.100mmol规模上进行的实验，其中所述规模由用于产生所述肽的与树脂结合的Sieber或Rink接头的量决定。此规模不基于对所述程序中使用的肽量的直接确定。通过根据规模的倍数调整所述体积，可以将所述程序的规模放大超过0.10mmol规模。将树脂转染到25mL有玻璃料的注射筒中。向树脂中添加哌啶:DMF(20:80v/v，5.0mL)。将混合物振荡3min，并且然后将溶液通过玻璃料排出。将树脂用DMF(4.0mL)洗涤3次。向反应器皿中添加哌啶:DMF(20:80v/v，4.0mL)。将混合物振荡3min，并且然后将溶液通过玻璃料排出。将树脂相继用DMF(4.0mL)洗涤三次和DCM(4.0mL)洗涤三次。将树脂悬浮在DMF(2.0mL)和三氟乙酸乙酯(0.119ml，1.00mmol)、l,8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯(0.181ml，1.20mmol)中。将混合物放置在振荡仪上60min。将溶液通过玻璃料排出。将树脂相继用DMF(4.0mL)洗涤三次和DCM(4.0mL)洗涤三次。将树脂用干THF(2.0mL)洗涤三次，以去除任何残留的水。在烘干的4.0mL小瓶中添加THF(1.0mL)和三苯基膦(131mg，0.500mmol)和干分子筛(20mg)。将溶液转移到树脂并且缓慢添加偶氮二甲酸二异丙酯(0.097mL，0.5mmol)。将树脂搅拌15min。将溶液通过玻璃料排出并且将树脂用干THF(2.0mL)洗涤三次以去除任何残留的水。在烘干的4.0mL小瓶中添加THF(1.0mL)、三苯基膦(131mg，0.50mmol)和干4A分子筛(20mg)。将溶液转移到树脂并且缓慢添加偶氮二甲酸二异丙酯(0.097mL，0.5mmol)。将树脂搅拌15min。将溶液通过玻璃料排出。将树脂相继用DMF(4.0mL)洗涤三次和DCM(4.0mL)洗涤三次。将树脂悬浮在乙醇(1.0mL)和THF(1.0mL)中，并且添加硼氢化钠(37.8mg，1.000mmol)。将混合物搅拌30min并且排出。将树脂相继用DMF(4.0mL)洗涤三次和DCM(4.0mL)洗涤三次。
在树脂上的N-烷基化程序方法A：
将对应于烷基化基团的乙醇(0.046g，1.000mmol)、三苯基膦(0.131g，0.500mmol)和DIAD(0.097mL，0.500mmol)在3mL THF中的溶液添加到硝基苯磺酸化树脂(0.186g，0.100mmol)中，并且将反应混合物在室温下搅拌16小时。将树脂用THF(5mL)洗涤三次，并且将以上程序重复1-3次。通过用50μL TIS在1mL TFA中的溶液处理1.5小时的少量树脂样品的TFA微切割来监测反应进程。
在树脂上的N-烷基化程序方法B：
将硝基苯磺酸化树脂(0.100mmol)用N-甲基吡咯烷酮(NMP)(3mL)洗涤三次。将NMP(3mL)、烷基溴(20当量，2.000mmol)和DBU(20当量，0.301mL，2.000mmol)的溶液添加到树脂中，并且将反应混合物在室温下搅拌16小时。将树脂用NMP(3mL)洗涤并且将以上程序再重复一次。通过用50μL TIS在1mL TFA中的溶液处理1.5小时的少量树脂样品的TFA微切割来监测反应进程。
N-硝基苯磺酸酯形成程序：
将可力丁(collidine)(10当量)在DCM(2mL)中的溶液添加到树脂中，然后添加Nos-Cl(8当量)在DCM(1mL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌16小时。将树脂用DCM(4mL)洗涤三次和DMF(4mL)洗涤三次。将交替的DCM和DMF洗涤重复三次，然后是最后一组四个DCM洗涤(4mL)。
N-硝基苯磺酸酯去除程序：
使用用DMF(3mL)的三次洗涤和用NMP(3mL)的三次洗涤，将树脂(0.100mmol)溶胀。将NMP(3mL)、DBU(0.075mL，0.500mmol)和2-巯基乙醇(0.071mL，1.000mmol)的溶液添加到树脂中并且将反应混合物在室温下搅拌5分钟。在过滤并且用NMP(3mL)洗涤后，将树脂用NMP(3mL)、DBU(0.075mL，0.500mmol)和2-巯基乙醇(0.071mL，1.000mmol)的溶液在室温下重处理5分钟。将树脂用NMP(3mL)洗涤三次，用DMF(4mL)洗涤四次并且用DCM(4mL)洗涤四次，并且放回到Symphony反应器皿中用于在Symphony肽合成器上完成序列装配。
在PL-FMP树脂上预加载胺的通用程序：
将PL-FMP树脂(Novabiochem，1.00mmol/g取代物)在室温下用DMF(20mL/mmol)溶胀。将溶剂排出并且添加10ml DMF，然后将胺(2.5mmol)和乙酸(0.3mL)添加到反应器皿中。在10min搅动后，添加三乙酰氧基硼氢化钠(2.5mmol)。允许将反应搅动过夜。将树脂用DMF(1x)、THF/H2O/AcOH(6:3:1)(2x)、DMF(2x)、DCM(3x)洗涤并且干燥。可以通过以下方法检查所得的预加载有胺的PL-FMP树脂：取100mg上述树脂并且使其在室温下与在DCM(2mL)中的苯甲酰氯(5当量)和DIEA(10当量)反应0.5h。将树脂用DMF(2x)、MeOH(1x)和DCM(3x)洗涤。然后将样品用40％ TFA/DCM(1h)切割。收集产物并且通过HPLC和MS分析。将收集的样品干燥并且确定重量以计算树脂负载量。
在Cl-三苯甲基树脂上预加载Fmoc-氨基酸的通用程序：
向装备有玻璃料的玻璃反应器皿中添加50-150目2-氯-氯三苯甲基树脂(1.54meq/克，1.94克，3.0mmol)，以在DCM(5mL)中溶胀5分钟。将酸(3.00mmol，1.0当量)在DCM(5mL)中的溶液添加到树脂中，然后是DIEA(2.61ml，15.00mmol，5.0当量)。将反应在室温下振荡60分钟。添加DIEA(0.5mL)和甲醇(3mL)，并且将反应振荡另外15分钟。将反应溶液通过玻璃料过滤并且将树脂用DCM(4x5mL)、DMF(4x5mL)、DCM(4x5mL)、乙醚(4x5mL)冲洗，并且使用氮气流干燥。如下可以确定树脂负载量：
将树脂样品(13.1mg)用20％哌啶/DMF(v/v，2.0mL)伴随振荡处理10分钟。将1mL该溶液转移到25.0mL容量瓶中并且用甲醇稀释至总体积25.0mL。将20％哌啶/DMF(v/v，1.0mL)的空白溶液用甲醇在容量瓶中稀释到25.0mL。将UV设置为301nm。将吸光度用空白溶液归零，然后读取样品溶液，得到1.9411的吸光度。测量树脂的负载量为0.6736mmol/g((1.9411/20mg)x6.94＝0.6736)。
在树脂上的点击反应方法A：
该程序描述了在0.050mmol规模上进行的实验。通过根据规模的倍数调整所述体积，可以将其规模放大超过或小于0.050mmol规模。将含有炔烃的树脂(各50μmol)转移到Bio-Rad管中并且用DCM(2x5mL x 5min)并且然后用DMF(2x5mL x 5min)溶胀。在200ml瓶中装入30倍体积的以下物质：抗坏血酸(维生素C，0.026g，0.150mmol)、双(2,2,6,6-四甲基-3,5-庚二酮酸)铜(II)(10.75mg，0.025mmol)、DMF(1.5mL)、2,6-二甲基吡啶(0.058mL，0.50mmol)和THF(1.5mL)，然后是DIEA(0.087ml，0.50mmol)和用于实施例的对应叠氮化物(1.0-2.0当量)。将混合物搅拌直到每种物质都在溶液中。将以上Bio-Rad管中的DMF排出，并且将以上点击溶液(各3mL)添加到每个Bio-Rad管中。将管在定轨摇床上振荡过夜。将溶液通过玻璃料排出。将树脂用DMF(3x2mL)和DCM(3x2mL)洗涤。
在树脂上的点击反应方法B：
该程序描述了在0.050mmol规模上进行的实验。通过根据规模的倍数调整所述体积，可以将其规模放大超过或小于0.050mmol规模。将含有炔烃的树脂(各50μmol)转移到Bio-Rad管中并且用DCM(2x5mL x 5min)并且然后用DMF(2 5mL x 5min)溶胀。在单独的瓶中，将氮气鼓泡到4.0mL DMSO中持续15min。向DMSO中添加碘化亚铜(9.52mg，0.050mmol，1.0当量)(超声处理)、二甲基吡啶(58μL，0.500mmol，10.0当量)和DIEA(87uL，0.050mmol，10.0当量)。将溶液用氮气再次吹扫。将DCM通过玻璃料排出。在单独的小瓶中，将抗坏血酸(8.8mg，0.050mmol，1.0当量)溶解到水(600uL)中。将氮气鼓泡通过溶液10min。将偶联配偶体分布在管(0.050mmol至0.10mmol，1.0至2.0当量)中，然后是DMSO铜和碱溶液并且最后是抗坏血酸水溶液。在溶液顶部覆盖氮气覆盖层并且加盖。将管放到旋转式混合器上16小时。将溶液通过玻璃料排出。将树脂用DMF(3x2mL)和DCM(3x2mL)洗涤。
在树脂上的铃木反应程序：
在Bio Rad管中放置50umol含有4-溴-苯丙氨酸侧链的N末端受Fmoc保护的线性多肽的干Rink树脂。将树脂用DMF(2x5mL)溶胀。向其中添加对甲苯基硼酸(0.017g，0.125mmol)的DMF溶液(2mL)、磷酸钾(0.2mL，0.400mmol)，然后是催化剂[1,1'-双(二叔丁基膦)二茂铁]二氯钯(II)[PdCl2(dtbpf)](3.26mg，5.00μmol)。将管在室温下振荡过夜。将溶液排出并且将树脂用DMF(5x3mL)洗涤，然后用替代的DCM(2x3mL)、然后DMF(2x3mL)以及然后DCM(5x3mL)洗涤。将少量树脂样品在室温下使用在1ml TFA中的235μL TIS微切割1h。将剩余的树脂用于肽偶联或N末端的氯乙酸加帽的下一步骤。
溶液相点击反应方法A：
向20ml闪烁瓶中添加100倍所需量的抗坏血酸钠((R)-2-((S)-1,2-二羟基乙基)-4-羟基-5-氧代-2,5-二氢呋喃-3-醇酸钠)和五水合硫酸铜(II)(CuSO4:抗坏血酸钠摩尔比：1:3至1:5)。将反应用水稀释。将该溶液在室温下振荡1-10min。将所得的微黄色浆液添加到相应的反应中。
向含有炔烃和叠氮化物(1.0-2.0当量)的小瓶中添加所需量的以上铜溶液(CuSO4：0.3-1.0当量的炔烃)。将混合物在室温下振荡1-3h并且通过LC/MS监测进程。如果需要，可以添加额外量的叠氮化物或铜溶液以驱使三唑形成。完成后，将混合物用CH3CN:NH4CO3水溶液(v/v 1:1)稀释，过滤并且在同一天经由反相HPLC纯化来纯化。
溶液相点击反应方法B：
通过将干1:2至1:3摩尔比的五水合硫酸铜(II)和抗坏血酸钠稀释至相对于五水合硫酸铜0.1-0.3M的浓度来制备CuSO4和抗坏血酸钠的储备溶液。向肽炔烃在DMF中的溶液(0.05-0.1M)中添加实施例中使用的对应叠氮化物(1.0-2.0当量)，然后添加以上新鲜制备的铜水溶液(0.03-1.0当量)。将混合物在室温下搅拌并且通过LCMS监测。如果需要，可以添加额外量的叠氮化物或铜溶液以驱使三唑形成。完全转化后，将混合物稀释，过滤并且同一天通过反相HPLC纯化。
通用纯化程序：
将粗材料使用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在一定百分比的B下保持0分钟，然后从该百分比线性增加至更高百分比的B经20-30分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：20-40mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。如果基于正交分析数据材料不纯，则将材料用以下条件经由制备型LC/MS进一步纯化：柱：XBridge C18，200mm x30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在一定百分比的B下保持0分钟，然后从起始百分比的B线性增加经20-30分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：20-40mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。确定产物的产率和纯度。
可替代地，基于初始分析数据，将粗材料使用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在一定百分比的B下保持0分钟，然后从起始百分比的B线性增加经20分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：40mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。如果基于正交分析数据材料不纯，将材料使用以下条件经由制备型LC/MS进一步纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在一定百分比的B下保持0分钟，然后从该百分比线性增加至更高百分比的B经20分钟，然后在100％B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS和UV信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。确定产物的产率和纯度。
非天然氨基酸合成：
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-3-(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-1H-吲哚-3-基)丙酸的制备
方案：
步骤1：
向(S)-苄基2-(((苄氧基)羰基)氨基)-3-(1H-吲哚-3-基)丙酸酯(25.0g，58.3mmol)和碳酸铯(20.9g，64.2mmol)在DMF(200mL)中的0℃溶液中添加2-溴乙酸叔丁酯(9.36mL，64.2mmol)。允许将溶液缓慢加温至室温伴随搅拌18h。将反应混合物倒入冰水:1NHCl水溶液(1:1)中，并且然后用EtOAc萃取。将有机层用盐水洗涤，收集，经MgSO4干燥，过滤，并且然后在真空中浓缩。使所得固体经受快速色谱(330g柱，0-50％EtOAc:Hex，超过20柱体积)，以得到呈白色固体的(S)-苄基2-(((苄氧基)羰基)氨基)-3-(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-1H-吲哚-3-基)丙酸酯(29.6g，93％)。
步骤2：
将H2在室温下缓慢鼓泡通过(S)-苄基2-(((苄氧基)羰基)氨基)-3-(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-1H-吲哚-3-基)丙酸酯(29.6g，54.5mmol)和Pd-C(1.45g，1.36mmol)在MeOH(200mL)中的混合物10min。然后在通过LCMS监测转化的同时，将混合物在H2的正压下搅拌。48h后，将反应混合物通过硅藻土过滤并且蒸发，以得到粗(S)-2-氨基-3-(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-1H-吲哚-3-基)丙酸(17.0g)，将其不经另外的纯化带到步骤三。
步骤3：
向(S)-2-氨基-3-(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-1H-吲哚-3-基)丙酸(5.17g，16.2mmol)和碳酸氢钠(6.8g，81mmol)在丙酮:水(50.0mL:100mL)中的溶液中添加(9H-芴-9-基)甲基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(5.48g，16.2mmol)。将混合物搅拌过夜，此后LCMS分析指示完成转化。通缓慢添加1N HCl水溶液将剧烈搅拌的混合物酸化。酸化后，将混合物用DCM(150mL)稀释，并且然后将分离的有机相用水洗涤，然后用盐水洗涤。将有机层收集，经硫酸钠干燥并且在真空下浓缩，以得到粗产物。将粗材料经由硅胶色谱(330g柱，20％-80％ EtOAc:Hex，超过20柱25体积)纯化，以得到呈白色泡沫的(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(1-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-1H-吲哚-3-基)丙酸(7.26g，83％)。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ7.80(d,J＝7.6Hz,2H),7.67-7.60(m,2H),7.39(t,J＝7.5Hz,2H),7.32-7.22(m,3H),7.18(td,J＝7.6,0.9Hz,1H),7.08(td,J＝7.5,0.9Hz,1H),7.04(s,1H),4.54(dd,J＝8.4,4.9Hz,1H),4.36-4.23(m,2H),4.23-4.14(m,1H),30 3.43-3.35(m,2H),3.25-3.09(m,1H),1.55-1.38(m,9H)。ESI-MS(+)m/z＝541.3(M+H)。
(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(4-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙氧基)苯基)丙酸的制备
方案：
步骤1：
向(S)-苄基2-(((苄氧基)羰基)氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯(70g，173mmol)和K2CO3(35.8g，259mmol)在DMF(350mL)中的冷却搅拌溶液中逐滴添加叔丁基-2-溴乙酸酯(30.6mL，207mmol)并且将所得的混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物用10％盐水溶液(1000mL)稀释并且用乙酸乙酯(2x250mL)萃取。将合并的有机层用水(500mL)、饱和盐水溶液(500mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并且浓缩，以得到无色胶状物。将粗化合物通过快速柱色谱纯化(使用在石油醚中的20％乙酸乙酯作为洗脱液)，以得到白色固体(78g，85％)。
步骤2：
将(S)-苄基2-(((苄氧基)羰基)氨基)-3-(4-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙氧基)苯基)丙酸酯(73g，140mmol)溶解在MeOH(3000mL)中并且用氮气吹扫5min。向上述经吹扫的混合物中添加Pd/C(18g，16.91mmol)并且在3kg的氢气压力下搅拌15小时。将反应混合物通过硅藻土床过滤并且用甲醇(1000mL)洗涤。将滤液在真空下浓缩，以得到白色固体(36g，87％)。
步骤3：
向(S)-2-氨基-3-(4-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙氧基)苯基)丙酸(38g，129mmol)和碳酸氢钠(43.2g，515mmol)在水(440mL)中的搅拌溶液中逐滴添加溶解在二噁烷(440mL)中的Fmoc-OSu(43.4g，129mmol)，并且将所得混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物用1.5NHCl(200mL)和水(500mL)稀释，并且用乙酸乙酯(2x250mL)萃取。将合并的有机层用水(250mL)、饱和盐水溶液(250mL)洗涤，并且经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩，以得到淡黄色胶状物。将粗化合物通过柱色谱(使用在氯仿中的6％MeOH作为洗脱液)纯化，以得到淡绿色胶状物。将胶状物用石油醚进一步研磨，以得到灰白色固体(45g，67％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.86-12.58(m,1H),7.88(d,J＝7.5Hz,2H),7.73-7.61(m,3H),7.58-7.47(m,1H),7.44-7.27(m,4H),7.18(d,J＝8.5Hz,2H),6.79(d,J＝8.5Hz,2H),4.57(s,2H),4.25-4.10(m,4H),3.34(br s,3H),3.02(dd,J＝13.8,4.3Hz,1H),2.81(dd,J＝14.1,10.5Hz,1H),1.41(s,9H)。
接头/尾合成：
(2S)-4-[(35-叠氮基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一氧杂三十五烷-1-基)氨基甲酰基]-2-(16-磺基十六碳酰胺基)丁酸(IUPAC)的制备
(4,N3-PEG11-γGlu-FSA16)
方案：
步骤1：
将16-巯基十六烷酸(5.3g，18.37mmol)添加到具有搅拌棒的500ml圆底烧瓶中。添加甲酸(172ml，4485mmol)，然后逐滴添加过氧化氢(12.3ml，120mmol)。将混合的悬浮液搅拌6小时，在空气中敞开。使氮气缓流跑过样品过夜。16小时后，产物是良好的白色粉末。泵送6小时，并且然后按原样使用。分离6.18g化合物1。分析LCMS条件O：保留时间＝1.30min；ESI-MS(+)m/z 337.0(M+1)
详尽设计的具有还原后处理的硫醇氧化步骤：经由加料漏斗向16-巯基十六烷酸(5.07g，17.57mmol)在甲酸(176ml)中的搅拌浆液中逐滴添加过氧化氢(11.76ml，115mmol)(经约5-10min)。将它在室温下搅拌6h。过氧化物试纸在反应表面上方测试阳性，深蓝色。浸没在反应溶液中后，它们变为黄色(未在颜色标度上描述)。LCMS显示存在所需的产物并且无可检测量的起始材料(程序性MW值，无UV信号，AA+/-离子模式)。将反应溶液用冰浴冷却并且装备有与歧管附接的2向氮气入口适配器。装上塞子，经由注射筒穿过塞子开始逐滴(约1mL/min)添加二甲基硫醚(3.90ml，52.7mmol)。用试纸测试，表面上阳性并且表面下黄色。开始缓慢添加剩余的二甲基硫醚(0.715ml，9.67mmol)并且用试纸监测。当接近完全添加时，试纸显示上述反应溶液没有指示并且浸没后测试呈阳性。剩余约0.1mL硫醚，试纸不再指示/改变颜色。移除冰浴，搅拌1h。在强氮气流下浓缩经过周末。在高真空上在真空中浓缩48h，分离：7.63g。与产物结构一致的NMR显示残留溶剂(主要是DMSO和水，微量二甲基硫醚)。使用75％的标称w％说明残留溶剂。
步骤2：
将Fmoc-Glu-OtBu(1.640g，3.86mmol)和PFTU(1.651g，3.86mmol)的干混合物用DMF(15ml)稀释。在氮气下搅拌的同时，经由注射筒缓慢添加DIEA(1.347ml，7.71mmol)。在搅拌1h后，使用极少DMF添加35-叠氮基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一氧杂三十五烷-1-胺(2.0g，3.50mmol)，以量化转移。在室温下搅拌1.5h后，将反应用10％ LiCl淬灭并且用EtOAc萃取一次。通过用90/10DCM/MeOH洗脱的正相ISCO纯化所得的浓缩物。将所得油状物用10ml DCM稀释，并且然后用15ml TFA处理。3/4小时后，将反应浓缩至干并且通过用85/15DCM/MeOH洗脱的ISCO色谱纯化。分离3.20g作为化合物2的产物。分析LCMS条件O：保留时间＝1.40min；ESI-MS(+)m/z 923.08(M+1)
步骤3：
将氯三苯甲基树脂(4334mg，13.88mmol)用5 x DCM洗涤，并且然后用DCM(20mL)稀释。然后向该溶液中添加2(3200mg，3.47mmol)，然后添加DIEA(4.85mL，27.8mmol)。反应立刻转变成葡萄色并且允许振荡1.5小时。然后将树脂用20ml的9:1甲醇/Hunigs碱溶液稀释并且快速过滤并且用3 x DCM和3 x DMF洗涤。然后将所得的带微棕色的紫色树脂用2x20％哌啶/DMF处理以去保护Fmoc基团，洗涤5 x DMF并且按原样使用。树脂颜色转变成黄色。用20％ HFIPA/DCM切割树脂等分试样。LCMS指示了树脂3上的所需产物。分析LCMS条件O：保留时间＝0.83min；ESI-MS(+)m/z 700.08(M+1)
步骤4：
将树脂3(5.74g，2.87mmol)用5 x DMF洗涤并且然后用DMF(40mL)稀释。然后向该溶液中添加1(1.642g，4.88mmol)和HATU(1.855g，4.88mmol)在DMF(40mL)中的溶液，然后添加N-甲基吗啉(2.52mL，22.96mmol)。允许将反应振荡16小时，并且然后用5 x DMF和5 xDCM洗涤。用20％ HFIPA/DCM处理30min，将产物从树脂切割。排出并且浓缩以得到2.92g的4。
分析LCMS条件O：保留时间＝1.30min；ESI-MS(+)m/z 1019.08(M+1)。1HNMR(400MHz,DMSO)δ1.25(s,22H),1.50(m,2H),1.80(m,2H),1.90(m,2H),2.10(m,5H),2.38(m,2H),3.20(m,2H),3.40(m,2H),3.50(m,40H),3.60(m,2H),4.20(m,1H),5.20(m,1H),8.10(s,1H),12.50(m,1H)。产率(4步)：96％。
(S)-1-叠氮基-37-氧代-40-(11-磺基十一碳酰胺基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一氧杂
-36-氮杂四十一烷-41-酸(6)的制备
步骤1：
将11-巯基十一烷酸(5.0g，22.90mmol)添加到具有搅拌棒的500ml圆底烧瓶中。添加甲酸(214mL，5587mmol)，然后逐滴添加过氧化氢(15.32mL，150mmol)。将混合的悬浮液搅拌6h，在空气中敞开。使氮气缓流鼓泡经过反应混合物。16h后，产物是良好的白色粉末。泵送6h，并且然后按原样使用。分离6.10g化合物5。分析LCMS条件P：保留时间＝1.03min；ESI-MS(+)m/z 267.0(M+1)
步骤2：
将树脂3(4.00g，2.00mmol)用5 x DMF洗涤并且然后用DMF(40mL)稀释。然后向该溶液中添加5(0.906g，3.40mmol)和HATU(1.293g，3.40mmol)在DMF(40mL)中的溶液，然后添加N-甲基吗啉(1.759mL，16.00mmol)。允许将反应振荡16h并且然后用5 x DMF和5 x DCM洗涤。用20％ HFIPA/DCM处理30min，将产物从树脂上切割。排出溶液并且浓缩以得到3.12g的6。分析LCMS条件P：保留时间＝1.29min；ESI-MS(+)m/z 949.0(M+1)。产率(4步骤)：96％。
14-巯基十四烷酸的制备
方案：
步骤1.
将溶解在DMF(34.1ml)中的PDC(10.26g，27.3mmol)添加到在DMF(34.1ml)中的14-溴十四-1-醇(2.0g，6.82mmol)中。将所得混合物在室温下搅拌过夜并且消耗大多数起始醇。添加水并且将所得混合物用CH2Cl2萃取。将有机相用盐水洗涤，经MgSO4干燥并且在真空中浓缩以得到粗14-溴十四烷酸，将其原样带到下一步骤。1H NMR(499MHz,氯仿-d)δ3.55-3.27(m,2H),2.49-2.17(m,2H),1.97-1.77(m,2H),1.71-1.56(m,2H),1.49-1.11(m,18H)。
步骤2.
将14-溴十四烷酸(2.096g，6.82mmol))和硫脲(0.880g，11.56mmol)在乙醇(42.6ml)中的混合物在氮气气氛下回流1天。将混合物冷却至室温并且在减压下蒸发溶剂。用NaOH(20mL，7.5mol/L)加热残余物持续另外6h。用HCl(1mol/L)谨慎酸化混合物。分离有机层。用CH2Cl2萃取水相。将合并的有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥并且在真空中浓缩以提供14-巯基十四烷酸，将其原样带到下一步骤。1H NMR(499MHz,氯仿-d)δ2.76-2.66(m,1H),2.58-2.50(m,1H),2.41-2.34(m,2H),1.72-1.60(m,4H),1.42-1.23(m,18H)。
根据先前描述的相同程序制备以下化合物。
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FPA16尾的合成
(S)-1-叠氮基-37-氧代-40-(16-膦酰基十六碳酰胺基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一氧杂-36-氮杂四十一烷-41-酸(3,N3-PEG11-γGlu-FPA16，A2323-456,457,459)的制备
步骤1：
将Fmoc-Glu-OtBu(2.0g，4.70mmol)和PFTU(2.214g，5.17mmol)的干混合物用DMF(15ml)稀释。在氮气下搅拌的同时，经由注射筒缓慢添加DIEA(1.806ml，10.34mmol)。在室温下搅拌1h后，使用极少DMF添加35-叠氮基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一氧杂三十五烷-1-胺(2.68g，4.70mmol)，以量化转移。
在室温下搅拌16h后，将反应用10％ LiCl淬灭并且用EtOAc萃取一次。通过用90/10DCM/MeOH洗脱的正相ISCO纯化所得的浓缩物。所得油状物用10mL DCM稀释，并且然后用15mL TFA处理。3/4h后，将反应浓缩至干并且通过用90/10DCM/MeOH洗脱的ISCO色谱纯化以得到3.9g产物化合物1。分析条件P：保留时间＝1.79min；ESI-MS(+)m/z 922.3(M+1)
步骤2：
将氯三苯甲基树脂(5282mg，16.92mmol)用5 x DCM洗涤，并且然后用DCM(20mL)稀释。然后向该溶液中添加1(3900mg，4.23mmol)，然后添加DIEA(5.91mL，33.8mmol)。反应立即转变为葡萄色并且允许振荡1.5h。然后将树脂用20mL的9:1甲醇/Hunigs碱溶液稀释并且快速过滤并且用3 x DCM和3 x DMF洗涤。然后将所得的带微棕色的紫色树脂用2x20％哌啶/DMF处理以去保护Fmoc基团，洗涤5 x DMF并且按原样使用。树脂颜色转变成黄色。用20％ HFIPA/DCM切割树脂等分试样。LCMS指示了树脂2上的所需产物。分析条件P：保留时间＝1.16min；ESI-MS(+)m/z 700.3(M+1)
步骤3：
将树脂2(1.0g，0.5mmol)用5 x DMF洗涤并且然后用DMF(40mL)稀释。然后向该溶液中添加16-膦酰基十六烷酸(0.336g，1.000mmol)和HATU(0.380g，1.000mmol)在DMF(40mL)中的溶液中，然后添加N-甲基吗啉(0.440mL，4.00mmol)。允许将反应振荡16h，并且然后用5 x DMF和5 x DCM洗涤。用20％ HFIPA/DCM处理30分钟，将产物从树脂上切割。将它排出并且浓缩以得到0.50g的3。分析条件P：保留时间＝1.73min；ESI-MS(+)m/z 1018.4(M+1)。产率(3步)：84％
15-磺基十五烷酸的制备
步骤1：
脱羧卤化：向40mL卸压小瓶中添加16-(叔丁氧基)-16-氧代十六烷酸(512mg，1.495mmol)、2-溴丙二酸二甲酯(0.555mL，3.74mmol)、[Ir(dF(CF3)ppy)2(dtbbpy)]PF6(33.5mg，0.030mmol)和碳酸铯(487mg，1.495mmol)。添加搅拌棒并且将混合物用氯苯(29.9mL)稀释，加盖，并且将氮气鼓泡10min。将器皿用封口膜(parafilm)密封并且用蓝色LED条形灯(λmax约450，距灯约1-2cm，风扇开)辐照伴随搅拌过夜。将小瓶离心并且将半透明溶液倾析。将反应混合物在真空中浓缩并且通过快速色谱(0-10％EtOAc/庚烷经15-20min)纯化。通过用KMnO4染色剂染色的TLC监测级分，并且将含有级分的产物收集并且浓缩以得到324.4mg的15-溴十五酸叔丁酯。1H NMR(499MHz,氯仿-d)δ3.41(t,J＝6.9Hz,2H),2.21(t,J＝7.6Hz,2H),1.86(dt,J＝14.6,7.1Hz,2H),1.59(br d,J＝7.4Hz,2H),1.45(s,9H),1.44-1.39(m,2H),1.36-1.20(m,18H)。
步骤2：
硫醇形成和氧化：根据用于制备14-巯基十四烷酸(步骤1)的硫醇化程序处理以上15-溴十五酸叔丁酯材料(292mg，0.774mmol)以得到219mg产物(作为tBu酯和游离羧酸的混合物)。然后根据用于制备16-磺基十五烷酸的程序将粗混合物氧化以提供241mg的15-磺基十五烷酸产物。1H NMR(499MHz,甲醇-d4)δ4.93(s,5H),2.88-2.79(m,2H),2.35-2.24(m,2H),1.83-1.74(m,2H),1.64-1.56(m,2H),1.47-1.39(m,2H),1.37-1.27(m,18H)。
炔烃中间体合成
以下是用于溶液相合成的Pra中间体的详细实施例。
INT-1001的制备
遵循针对实施例0001的制备描述的由以下通用程序构成的通用合成序列来制备INT-1001。向45mL聚丙烯固相反应器皿中添加在100μmol规模上的预加载有Fmoc-Pra-OH的2-氯三苯甲基树脂，并且将反应器皿放置在Symphony X肽合成器上。然后依序进行以下程序：
遵循“Symphony X树脂溶胀程序”；
用Fmoc-Cys(Trt)-OH遵循“Symphony X单偶联程序”；
用Fmoc-Leu-OH遵循“Symphony X单偶联程序”；
用Fmoc-N-Me-Nle-OH遵循“Symphony X单偶联程序”；
用Fmoc-N-Me-Nle-OH遵循“Symphony双偶联程序”；
用Fmoc-Trp(1-CH2COOtBu)-OH遵循“Symphony双偶联程序”；
用Fmoc-Dab(Boc)-OH遵循“Symphony X单偶联程序”；
用Fmoc-Trp(Boc)-OH遵循“Symphony X单偶联程序”；
用Fmoc-Hyp(OtBu)-OH遵循“Symphony X单偶联程序”；
用Fmoc-Leu-OH遵循“Symphony X单偶联程序”；
用Fmoc-Dap(Boc)-OH遵循“Symphony X单偶联程序”；
用Fmoc-Pro-OH遵循“Symphony X单偶联程序”；
用Fmoc-Asn(Trt)-OH遵循“Symphony双偶联程序”；
用Fmoc-N-Me-Ala-OH遵循“Symphony X单偶联程序”；
用Fmoc-Tyr(OtBu)-OH遵循“Symphony双偶联程序”；
遵循“Symphony X氯乙酸酐偶联程序”；
可替代地，将“Symphony X 4当量单偶联程序”或“Symphony X 4当量双偶联程序”用于肽延长的每个步骤；
可替代地，在Prelude肽合成器上组合以上线性序列，由以下通用程序构成：“Prelude树脂溶胀程序”、“Prelude单偶联程序”或“Prelude双偶联程序”(其中，4-5当量氨基酸和90-120min偶联时间用于每个偶联反应)以及“Prelude氯乙酸酐偶联程序”。
遵循“全面去保护方法A”；
遵循“环化方法A”。
将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在20％ B下保持0分钟，20％-60％ B经25分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。将材料用以下条件经由制备型LC/MS进一步纯化：柱：XBridge C18，200mm x30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在17％ B下保持0分钟，17％-57％ B经20分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：40mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为25.4mg，并且通过LCMS分析估计的其纯度为100％。
分析条件A：保留时间＝1.58min；ESI-MS(+)m/z[M+H]1+:1926.25。
分析条件B：保留时间＝1.69min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:963.98。
根据如INT-1001中描述的相似程序和上述通用程序合成以下炔烃化合物。
INT-1002的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1002。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在14％ B下保持0分钟，14％-54％ B经20分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。将材料用以下条件经由制备型LC/MS进一步纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在16％ B下保持0分钟，16％-56％ B经20分钟，然后在100％ B下保持4分钟；流速：40mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为3.1mg，并且通过LCMS分析估计的其纯度为100％。
分析条件A：保留时间＝1.55min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:1021.2。
INT-1003的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1003。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在25％ B下保持0分钟，25％-65％B经20分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。将材料用以下条件经由制备型LC/MS进一步纯化：柱：XBridgeC18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在30％ B下保持0分钟，30％-70％ B经20分钟，然后在100％ B下保持2分钟；流速：40mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为11.6mg，并且通过LCMS分析估计的其纯度为97％。
分析B：保留时间＝1.99min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:1069.4。
INT-1004的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1004。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在26％ B下保持0分钟，26％-66％B经25分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为11.2mg，并且通过LCMS分析估计的其纯度为92.8％。
分析条件B：保留时间＝1.81，2.02min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:1077。
INT-1005的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1005。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在25％ B下保持0分钟，25％-65％B经20分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为22.4mg，并且通过LCMS分析估计的其纯度为100％。
分析条件A：保留时间＝1.87min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:1084.4。
INT-1006的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1006。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含10mM乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含10mM乙酸铵)；梯度：在25％ B下保持0分钟，25％-65％ B经20分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为18.9mg，并且通过LCMS分析估计的其纯度为100％。
分析条件A：保留时间＝1.71min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:1084。
INT-1007的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1007。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在23％ B下保持0分钟，23％-63％B经20分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为26.8mg，并且通过LCMS分析估计的其纯度为99％。
分析B：保留时间＝2.23min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:1077.2。
INT-1008的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1008。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在23％ B下保持0分钟，23％-63％B经20分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为24.9mg，并且通过LCMS分析估计的其纯度为96.9％。
分析B：保留时间＝2.25min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:1077.4。
INT-1009的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1009。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在38％ B下保持0分钟，38％-78％ B经20分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为36.5mg，并且通过LCMS分析估计的其纯度为100％。
分析B：保留时间＝2.21min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:1055.4。
INT-1010的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1010。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在26％ B下保持0分钟，26％-66％B经20分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为26.3mg，并且通过LCMS分析估计的其纯度为100％。
分析条件A：保留时间＝1.92min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:1055.3。
INT-1011的制备
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遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1011。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在24％ B下保持0分钟，24％-64％B经20分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为17.7mg，并且通过LCMS分析估计的其纯度为96.9％。
分析B：保留时间＝2.13min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:1055.8。
INT-1012的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1012。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在38％ B下保持0分钟，38％-78％ B经25分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为16.1mg，并且通过LCMS分析估计的其纯度为98.9％。
分析B：保留时间＝2.18min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:1020.1。
INT-1013的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1013。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在19％ B下保持0分钟，19％-59％ B经20分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为20.2mg，并且通过LCMS分析估计的其纯度为96.3％。
分析条件A：保留时间＝1.53min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:1006.2。
INT-1014的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1014。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在14％ B下保持0分钟，14％-54％ B经20分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。
将材料用以下条件经由制备型LC/MS进一步纯化：柱：XBridge C18，200mm x30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在14％ B下保持0分钟，14％-54％ B经20分钟，然后在100％ B下保持2分钟；流速：40mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为10.7mg，并且通过LCMS分析估计的其纯度为100％。
分析条件A：保留时间＝1.5min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:1014。
INT-1015的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1015。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在14％ B下保持0分钟，14％-54％ B经20分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。将材料用以下条件经由制备型LC/MS进一步纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在16％ B下保持0分钟，16％-56％ B经20分钟，然后在100％ B下保持2分钟；流速：35mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为9.1mg，并且通过LCMS分析估计的其纯度为100％。
分析条件A：保留时间＝1.55min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:1021.1。
INT-1016的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1016。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在19％ B下保持0分钟，19％-59％ B经20分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为38.6mg，并且通过LCMS分析估计的其纯度为93％。
分析条件A：保留时间＝1.53min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:1028.4。
INT-1017的制备
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遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1017。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在19％ B下保持0分钟，19％-59％ B经20分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为38.3mg，并且通过LCMS分析估计的其纯度为90％。
分析条件A：保留时间＝1.52min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:1028。
INT-1018的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1018。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在19％ B下保持0分钟，19％-59％ B经20分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为22.7mg，并且通过LCMS分析估计的其纯度为92.6％。
分析条件A：保留时间＝1.43min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:1021.4。
INT-1019的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1019。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在20％ B下保持0分钟，20％-60％ B经20分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为23.6mg，并且通过LCMS分析估计的其纯度为91.2％。
分析条件B：保留时间＝1.59min；ESI-MS(+)m/z[M+3H]3+:681。
INT-1020的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1020。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在21％ B下保持0分钟，21％-61％ B经20分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为31.1mg，并且通过LCMS分析估计的其纯度为98.1％。
分析条件B：保留时间＝1.63min；ESI-MS(+)m/z[M+H]+:1997.3。
INT-1021的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1021。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在20％ B下保持0分钟，20％-60％ B经20分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。将材料用以下条件经由制备型LC/MS进一步纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在15％ B下保持0分钟，15％-55％ B经20分钟，然后在100％ B下保持2分钟；流速：40mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为12mg，并且通过LCMS分析估计的其纯度为100％。
分析B：保留时间＝1.62min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:999.3。
INT-1022的制备
遵循针对制备INT-1001描述的通用合成序列，在50μmol规模上使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1022。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在21％ B下保持0分钟，21％-61％ B经20分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。将材料用以下条件经由制备型LC/MS进一步纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在18％ B下保持0分钟，18％-58％ B经20分钟，然后在100％ B下保持2分钟；流速：40mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为11mg，并且通过LCMS分析估计的其纯度为98.3％。
分析条件A：保留时间＝1.59min；ESI-MS(+)m/z[M+H]+:1996.9。
INT-1023的制备
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根据先前描述的合成序列(参见方案1)，使用预加载Fmoc-Pra-OH的氯三苯甲基树脂制备INT-1023的线性序列。将方案1)中的线性序列树脂A切割并且使用“全面去保护方法A”全面去保护，并且使用“环化方法A”依序环化。将粗品通过反相HPLC纯化。产物的产量为30.4mg，并且通过LCMS分析估计的其纯度为95.1％。
分析条件A：保留时间＝1.53min；ESI-MS(+)m/z[M+H]+:1983.8。
最终化合物合成
以下是经由溶液相点击反应合成的最终化合物的详细实施例。
实施例1001
遵循通用程序“溶液相点击方法A”合成化合物。向20ml闪烁瓶中添加100倍所需量的(R)-2-((S)-1,2-二羟基乙基)-4-羟基-5-氧代-2,5-二氢呋喃-3-醇酸钠(0.987mg，4.89μmol)和五水硫酸铜(II)(0.622mg，2.492μmol)。将反应用水(10mL)稀释。将该溶液在室温下振荡1-10min。将所得的微黄色浆液添加到反应中。
向含有INT-1001(24mg，12.0μmol)的小瓶中添加tBuOH/水(v/v 1:1，1mL)和(S)-1-叠氮基-37-氧代-40-(16-磺基十六碳酰胺基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一氧杂-36-氮杂四十一烷-41-酸(N3-Peg11-γGlu-FSA16，16.49mg，0.016mmol)，然后添加100μL以上铜溶液。将混合物在室温下振荡1h并且通过LC/MS监测进程。完成后，将混合物用CH3CN:碳酸氢铵水溶液(v/v 1:1)稀释，过滤，并且经受单化合物纯化。
将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在26％ B下保持0分钟，26％-66％ B经20分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为8.8mg，并且通过LCMS分析估计的其纯度为99％。
分析条件A：保留时间＝1.55min；ESI-MS(+)m/z[M+3H]3+:982.10。
分析条件B：保留时间＝1.87min；ESI-MS(+)m/z[M+3H]3+:981.98。
遵循与实施例1001相似的程序，获得实施例1002-1006和1009中的以下化合物。
实施例1002的制备
在12μmol规模上制备实施例1002。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在25％ B下保持0分钟，25％-65％ B经20分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为5.6mg，并且通过LCMS分析估计的其纯度为97.8％。分析条件2：保留时间＝1.6min；ESI-MS(+)m/z 2+:1006.2。
实施例1003的制备
在10.3μmol规模上制备实施例1003。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在22％ B下保持0分钟，22％-62％ B经20分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为7mg，并且通过LCMS分析估计的其纯度为91.1％。分析条件1：保留时间＝1.54min；ESI-MS(+)m/z 2+:1530.1。
实施例1004的制备
在9.9μmol规模上制备实施例1004。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在16％ B下保持0分钟，16％-56％B经20分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为3.7mg，并且通过LCMS分析估计的其纯度为91.8％。分析条件2：保留时间＝1.76min；ESI-MS(+)m/z 2+:1015.3。
实施例1005的制备
在8μmol规模上制备实施例1005。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在25％ B下保持0分钟，25％-65％ B经20分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为6.7mg，并且通过LCMS分析估计的其纯度为98.9％。分析条件1：保留时间＝1.54min；ESI-MS(+)m/z 2+:1515.1。
实施例1006的制备
在10.6mmol规模上制备实施例1006。将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在25％ B下保持0分钟，25％-65％ B经20分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为1.5mg，并且通过LCMS分析估计的其纯度为91％。
分析条件A：保留时间＝1.49min；ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+:1367.3。
实施例1007的制备
使INT-1023的线性炔烃中间体材料(299mg，100μmol)经受与N3-Peg11-γGlu-FPA16的“在树脂上的点击反应方法A”，然后经受“全面去保护方法A”和“环化方法A”。
将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在25％ B下保持0分钟，25％-65％ B经20分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。将材料用以下条件经由制备型LC/MS进一步纯化：柱：XBridge C18，200mm x30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在15％ B下保持0分钟，15％-55％ B经20分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为2.8mg，并且通过LCMS分析估计的其纯度为100％。
分析条件A：保留时间＝1.75min；ESI-MS(+)m/z[M+3H]3+:1001.3。
分析条件B：保留时间＝1.82min；ESI-MS(+)m/z[M+3H]3+:1001.3。
实施例1008的制备
遵循如实施例1007的程序，从INT-1023的线性序列开始使用“在树脂上的点击反应方法A”与N3-Peg11-γGlu-FSA16，然后使用“全面去保护方法A”和“环化方法A”，在100μmol规模上制备实施例1008。
将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在24％ B下保持0分钟，24％-64％ B经20分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。将材料用以下条件经由制备型LC/MS进一步纯化：柱：XBridge C18，200mm x30mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在20％ B下保持0分钟，20％-60％ B经20分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：45mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为3mg，并且通过LCMS分析估计的其纯度为98.2％。分析条件B：保留时间＝1.83min；ESI-MS(+)m/z[M+3H]3+:1001.08。
实施例1009的制备
遵循实施例1007的程序，从INT-1023的线性序列开始使用“在树脂上的点击反应方法A”与(S)-4-叠氮基-2-(14-磺基十四碳酰胺)丁酸，然后使用“全面去保护方法A”和“环化方法A”，在50μmol规模上制备实施例1009。
在0.05mmol规模上对结合树脂的加帽线性肽A进行点击化学：将在Bio Rad管中的树脂A用DCM(3x 5mL)洗涤并且然后用DMF(4x 5mL)洗涤。向树脂中添加以下溶液：双(2,2,6,6-四甲基-3,5-庚二酮酸)铜(II)(10.75mg，0.025mmol)、维生素C(0.026g，0.150mmol)、2,6-二甲基吡啶(0.058ml，0.500mmol)、DIEA(0.087ml，0.500mmol)、THF(1.500mL)和DMF(1.5mL)。将以上溶液添加到(S)-4-叠氮基-2-(14-磺基十四碳酰胺)丁酸(0.037g，0.085mmol)的称重小瓶中。将所得溶液添加到树脂中。将管加盖并且在振荡台上振荡过夜。将溶液排出并且将树脂用DMF(6x 5ml)洗涤并且然后用DCM(3x 5mL)洗涤。将树脂用95％TFA 2.5％ TIS和2.5％ DTT(5mL)处理并且在室温下振荡1h。将溶液排出到50mL Falcon管中，所述Falcon管含有35mL冷却的Et2O。将所得的白色沉淀物通过离心(3x 4min x300RPM)收集，弃去醚层。将沉淀在室温下空气干燥1小时。将它溶解在DMF(30m)中并且添加DIEA(1mL)。将反应混合物在室温下振荡6h。将反应在Genevac上浓缩。将所得的样品溶解在2ml DMF中并且呈递以纯化。
将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在18％ B下保持0分钟，18％-60％ B经25分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为4.2mg，并且通过LCMS分析估计的其纯度为89％。使用分析型LC/MS确定最终纯度。注射1条件：柱：Waters XBridge C18，2.1mm x 50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含10mM乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含10mM乙酸铵)；温度：50℃；梯度：经3min 0％B至100％ B，然后在100％ B下保持0.50min；流量：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。注射1结果(分析条件A)：纯度：88.8％；观察质量：ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+1210.10；保留时间：1.5min。注射2条件：柱：Waters XBridge C18，2.1mm x 50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：0％ B至100％ B经3min，然后在100％ B下保持0.50min；流量：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。注射2结果(分析条件B)：纯度：98.1％；观察质量：ESI-MS(+)m/z[M+2H]2+1209.80；保留时间：1.74min。
实施例1010的制备
遵循实施例1001的程序，使用“在树脂上的点击反应方法A”使INT-1023与N3-Peg3-γGlu-FSA12反应，在44μmol规模上制备实施例1010。
将粗材料用以下条件经由制备型LC/MS纯化：柱：XBridge C18，200mm x 19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.05％三氟乙酸)；梯度：在20％ B下保持0分钟，20％-60％ B经20分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。将材料用以下条件经由制备型LC/MS进一步纯化：柱：XBridge C18，200mm x19mm，5μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含乙酸铵)；梯度：在13％ B下保持0分钟，13％-53％ B经20分钟，然后在100％ B下保持0分钟；流速：20mL/min；柱温：25℃。通过MS信号触发级分收集。将含有所需产物的级分合并并且经由离心蒸发干燥。产物的产量为17.0mg，并且通过LCMS分析估计的其纯度为98％。使用分析型LC/MS确定最终纯度。注射1条件：柱：Waters XBridge C18，2.1mm x 50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含10mM乙酸铵)；流动相B：95:5乙腈:水(含10mM乙酸铵)；温度：50℃；梯度：经3min 0％ B至100％ B，然后在100％ B下保持0.50min；流量：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。注射
1(分析条件A)结果：纯度：99.2％；观察质量：865.80；保留时间：1.46min。注射2条件：柱：Waters XBridge C18，2.1mm x 50mm，1.7μm颗粒；流动相A：5:95乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；流动相B：95:5乙腈:水(含0.1％三氟乙酸)；温度：50℃；梯度：0％ B至100％ B经3min，然后在100％ B下保持0.50min；流量：1mL/min；检测：MS和UV(220nm)。注射2(分析条件B)结果：纯度：97.7％；观察质量：1297.60；保留时间：1.66min。
用于使用均相时间分辨荧光(HTRF)结合测定测试大环肽与PD-1竞争结合PD-L1的能力的方法
使用PD-1/PD-L1均相时间分辨荧光(HTRF)结合测定研究本公开文本的大环肽与PD-L1结合的能力。
方法
可溶性PD-1与可溶性PD-L1结合的均相时间分辨荧光(HTRF)测定。可溶性PD-1和可溶性PD-L1是指具有羧基端截短的蛋白质，其去除跨膜区域(transmembrane-spanningregions)并与异源序列、特别是人免疫球蛋白G序列(Ig)的Fc部分或六组氨酸表位标记(His)融合。所有结合研究都在HTRF测定缓冲液中进行，所述缓冲液由补充有0.1％(w/v)牛血清白蛋白和0.05％(v/v)Tween-20的dPBS组成。对于PD-1-Ig/PD-L1-His结合测定，将抑制剂与PD-L1-His(最终10nM)在4μl测定缓冲液中预孵育15分钟，然后添加在1μl测定缓冲液中的PD-1-Ig(最终20nM)并且再孵育15分钟。使用来自人、食蟹猴、小鼠或其他物种的PD-L1融合蛋白。使用铕窝穴体(crypate)标记的抗Ig单克隆抗体(最终1nM)和别藻蓝蛋白(APC)标记的抗His单克隆抗体(最终20nM)实现HTRF检测。将抗体在HTRF检测缓冲液中稀释，并且在结合反应之上分配5μl。允许反应平衡30分钟，并且使用EnVision荧光计获得信号(665nm/620nm比率)。在PD-1-Ig/PD-L2-His(分别为20和5nM)、CD80-His/PD-L1-Ig(分别为100和10nM)和CD80-His/CTLA4-Ig(分别为10和5nM)之间建立了另外的结合测定。
如下进行生物素化的化合物编号71(关于结构参见WO2014/151634中的第212页的实施例72)与人PD-L1-His之间的结合/竞争研究。将大环肽抑制剂在4μl测定缓冲液中与PD-L1-His(最终10nM)预孵育60分钟，然后添加在1μl测定缓冲液中的生物素化的化合物编号71(最终0.5nM)。允许结合平衡30分钟，然后添加在5μl HTRF缓冲液中的铕窝穴体标记的链霉亲和素(最终2.5pM)和APC标记的抗His(最终20nM)。允许反应平衡30分钟，并且使用EnVision荧光计获得信号(665nm/620nm比率)。
重组蛋白。将具有C末端人Ig表位标记的羧基截短的人PD-1(氨基酸25-167)[hPD-1(25-167)-3S-IG]和具有C末端His表位标记的人PD-L1(氨基酸18-239)[hPD-L1(19-239)-烟草静脉斑驳病毒蛋白酶切割位点(TVMV)-His]在HEK293T细胞中表达，并且通过重组蛋白A亲和色谱法和尺寸排阻色谱法依次纯化。人PD-L2-His(Sino Biologicals)、CD80-His(Sino Biologicals)、CTLA4-Ig(RnD Systems)均通过商业来源获得。
重组人PD-1-Ig的序列
hPD1(25-167)-3S-IG
(SEQ ID NO:1)
重组人PD-L1-TVMV-His(PD-L1-His)的序列
hPDL1(19-239)-TVMV-His
(SEQ ID NO:2)
293T-hPD-L1细胞结合高内涵筛选测定(CBA)。藻红蛋白(PE)与人PD-1-Ig的Ig表位标签共价连接并且将荧光标记的PD-1-Ig用于与稳定过表达人PD-L1(293T-hPD-L1)的人胚胎肾细胞系(293T)的结合研究。简言之，将2x103个293T-hPD-L1细胞接种到在20μl补充有10％胎牛血清的DMEM中的384孔板中，并且过夜培养。将125nl化合物添加到细胞中，然后添加5μl PE标记的PD-1-Ig(0.5nM最终)，在补充有10％胎牛血清的DMEM中稀释，然后在37℃下孵育1h。将细胞在100μl dPBS中洗涤3次，然后在室温下用30μl在dPBS(含10μg/mlHoechst 33342)中的4％多聚甲醛固定30min。将细胞在100μl dPBS中洗涤3次，然后最后添加15μl dPBS。将数据收集并且使用Cell Insight NXT High Content Imager和相关软件处理。
表1列出了在PD-1/PD-L1均相时间分辨荧光(HTRF)结合测定和293T-hPD-L1细胞结合高内涵筛选测定中测量的本公开文本的代表性实施例的IC50值。
表1
对于本领域技术人员来说将清楚的是，本公开文本并不限于前述说明性实施例，并且本公开文本可以在不背离本公开文本的基本属性的情况下体现为其他具体形式。因此，希望所述实施例在所有方面均被视为说明性的而非限制性的，参考所附的权利要求而不是前述实施例，并且因此落入权利要求的等同内容的含义和范围内的所有变化均旨在包含在其中。
式(I)的化合物具有作为PD-1/PD-L1相互作用的抑制剂的活性，因此可以用于治疗与PD-1/PD-L1相互作用相关的疾病或缺陷。经由抑制PD-1/PD-L1相互作用，本公开文本的化合物可以用于治疗感染性疾病(诸如HIV、脓毒性休克、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎或丁型肝炎)和癌症。
应理解，具体实施方式部分而不是发明内容和摘要部分旨在用于解释权利要求。发明内容和摘要部分可以阐述如诸位发明人所设想的本公开文本的一个或多个但不是所有的示例性实施方案，因此并不旨在以任何方式限制本公开文本和所附的权利要求。
上文已经借助于说明特定功能的实现及其关系的功能构造模块描述了本公开文本。为了描述方便，本文已经任意定义了这些功能构造模块的边界。只要适当执行特定功能及其关系，就可以定义替代边界。
具体实施方案的前述描述将如此充分地揭示本公开文本的一般性质，使得其他人可以通过应用本领域技术范围内的知识，在无需过度实验并且不脱离本公开文本一般概念的情况下容易地修改和/或调整此类具体实施方案用于各种应用。因此，基于本文给出的传授内容和指导，此类调整和修改旨在包含在所公开的实施方案的等效方案的含义和范围内。应理解，本文中的措辞或术语是出于描述而非限制的目的，因此本说明书的术语或措辞将由熟练技术人员根据传授内容和指导来解释。
本公开文本的广度和范围不应当由任何上述示例性实施方案来限制，而应当仅根据以下权利要求及其等效物来定义。
序列表
<110> 百时美施贵宝公司
<120> 免疫调节剂
<130> 3338.281PC01
<150> US 63/165,455
<151> 2021-03-24
<160> 2
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 384
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组人PD-1-Ig -- hPD1(25-167)-3S-IG
<400> 1
Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala
1 5 10 15
Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe
20 25 30
Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro
35 40 45
Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln
50 55 60
Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg
65 70 75 80
Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr
85 90 95
Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu
100 105 110
Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro
115 120 125
Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Gly
130 135 140
Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Arg Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr
145 150 155 160
His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser
165 170 175
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
180 185 190
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
195 200 205
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
210 215 220
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
225 230 235 240
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
245 250 255
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
260 265 270
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
275 280 285
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
290 295 300
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
305 310 315 320
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
325 330 335
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
340 345 350
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
355 360 365
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375 380
<210> 2
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组人PD-L1-TVMV-His (PD-L1-His) --
hPDL1(19-239)-TVMV-His
<400> 2
Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser
1 5 10 15
Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu
20 25 30
Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln
35 40 45
Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg
50 55 60
Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala
65 70 75 80
Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys
85 90 95
Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val
100 105 110
Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro
115 120 125
Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys
130 135 140
Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys
145 150 155 160
Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr
165 170 175
Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr
180 185 190
Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile
195 200 205
Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr Gly Ser Ser
210 215 220
Glu Thr Val Arg Phe Gln Gly His His His His His His
225 230 235

Claims (19)

1.一种式(I)的化合物
或其药学上可接受的盐，其中：
A选自
其中：
表示与羰基的附接点，并且/>表示与氮原子的附接点；
n是0或1；
m是1或2；
u是0或1；
w是0、1或2；
Rx选自氢、氨基、羟基和甲基；
R14和R15独立地选自氢和甲基；
R16a选自氢和C1-C6烷基；
R16选自
-(C(R17a)2)2-X-R30、-(C(R17aR17))0-2-X'-R30、-(C(R17aR17)1-2C(O)NR16a)m'-X'-R30、
-C(R17a)2C(O)N(R16a)C(R17a)2-X'-R31、-(C(R17aR17))1-2C(O)N(R16a)C(R17a)2-X'-R31、
-C(R17a)2[C(O)N(R16a)C(R17a)2]w'-X-R31、-C(R17aR17)1-2[C(O)N(R16a)C(R17aR17)1-2]w'-X'-R31、
-(C(R17a)(R17)C(O)NR16a)n'-H；以及
-(C(R17a)(R17)C(O)NR16a)m'-C(R17a)(R17)-CO2H；
其中PEGq'间隔子能够插入R16的任何部分中(q'是PEG间隔子中的-(CH2CH2O)-单元的数量)；
其中w'是2或3；
n'是1-6；
m'是0-5；
q'是1-20
X是1与172个原子之间的链，其中所述原子选自n：
碳和氧，并且其中所述链能够含有一、二、三或四个嵌入其中的选自-NHC(O)-、-NHC(O)NH-和-C(O)NH-的基团；并且其中所述链任选地被一至六个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2、-CH2C(O)NH2和-(CH2)1-2CO2H的基团取代；
X'是1与172个原子之间的链，其中所述原子选自碳和氧，并且其中所述链能够含有一、二、三或四个嵌入其中的选自-NHC(O)-、-NHC(O)NH-和-C(O)NH-的基团；并且其中所述链任选地被一至六个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2和-(CH2)1-2CO2H的基团取代，前提是X'不是未经取代的PEG；
R30选自-SO3H、-S(O)OH和-P(O)(OH)2；
R31选自-S(O)2OH、-S(O)OH和-P(O)(OH)2；
每个R17a独立地选自氢、C1-C6烷基、-CH2OH、-CH2CO2H、-(CH2)2CO2H，
每个R17独立地选自氢、-CH3、(CH2)zN3、-(CH2)zNH2、-X-R31、-(CH2)zCO2H、-CH2OH、CH2C＝CH和-(CH2)z-三唑基-X-R35，其中z是1-6并且R35选自-SO3H、-S(O)OH和-P(O)(OH)2；前提是至少一个R17不是氢、-CH3或-CH2OH；
前提是存在R30、R31或R35中的至少一个；
Ra、Re、Rj和Rk各自独立地选自氢和甲基；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12和R13独立地选自天然氨基酸侧链和非天然氨基酸侧链或如下所述与对应的邻位R基团形成环；
Rb是甲基，或者Rb和R2与它们所附接的原子一起形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中每个环任选地被的一至四个独立地选自氨基、氰基、甲基、卤代基和羟基的基团取代；
Rd是氢或甲基，或者Rd和R4与它们所附接的原子一起能够形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中每个环任选地被一至四个独立地选自氨基、氰基、甲基、卤代基、羟基和苯基的基团取代；
Rg是氢或甲基，或者Rg和R7与它们所附接的原子一起能够形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中每个环任选地被一至四个独立地选自以下的基团取代：氨基、任选地被卤代基取代的苄基、苄氧基、氰基、环己基、甲基、卤代基、羟基、任选地被甲氧基取代的异喹啉基氧基、任选地被卤代基取代的喹啉基氧基、和四唑基；并且其中所述吡咯烷和所述哌啶环任选地与环己基、苯基或吲哚基团稠合；并且
Rl是甲基，或者Rl和R12与它们所附接的原子一起形成选自氮杂环丁烷和吡咯烷的环，其中每个环任选地被一至四个独立地选自氨基、氰基、甲基、卤代基和羟基的基团取代。
2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，
其中A是
m是1并且w是0；并且
R14、R15和R16a各自是氢。
3.根据权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中
R16选自-(C(R17a)2)2-X-R30、-(C(R17aR17))0-2-X'-R30和-(C(R17aR17)1-2C(O)NR16a)m'-X'-R30，每个R17a选自氢、-CO2H和-(CH2)1-2CO2H；
X是8与46个原子之间的链，其中所述原子选自碳和氧，并且其中所述链能够含有一、二或三个嵌入其中的-NHC(O)-、C(O)NH基团；并且其中所述链任选地被一或两个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2、-CH2C(O)NH2和-CH2CO2H的基团取代；并且
R30选自-SO3H和-P(O)(OH)2。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中
A是
m是1并且w是0；
R14、R15和R16a各自是氢；
R16选自-C(R17a)2C(O)N(R16a)C(R17a)2-X'-R31和-(C(R17aR17))1-2C(O)N(R16a)C(R17a)2-X'-R31，每个R17a选自氢、-CO2H和-CH2CO2H；
X'是8与48个原子之间的链，其中所述原子选自碳和氧，并且其中所述链能够含有一、二或三个嵌入其中的-NHC(O)-或-C(O)NH-基团；并且其中所述链任选地被一或两个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2、-CH2C(O)NH2和-CH2CO2H的基团取代；前提是X'不是未经取代的PEG；并且
R30选自-SO3H和-P(O)(OH)2。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中A是
m是1并且w是0；
R14、R15和R16a各自是氢；
R16选自-C(R17a)2[C(O)N(R16a)C(R17a)2]w'-X-R31和-C(R17aR17)1-2[C(O)N(R16a)C(R17aR17)1-2]w'-X'-R31，
每个R17a选自氢、-CO2H和-CH2CO2H；
X是8与48个原子之间的链，其中所述原子选自碳和氧，并且其中所述链能够含有一、二或三个嵌入其中的-NHC(O)-或-C(O)NH-基团；并且其中所述链任选地被一或两个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2、-CH2C(O)NH2和-CH2CO2H的基团取代；并且
R31选自-SO3H和-P(O)(OH)2。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中A是
m是1并且w是0；
R14、R15和R16a各自是氢；并且
R16是-(C(R17a)(R17)C(O)NR16a)n'-H，
每个R17a是氢；并且
每个R17选自氢、-CH3、(CH2)zN3、-(CH2)zNH2、-X-R31、-(CH2)zCO2H、-CH2OH、CH2C＝CH和-(CH2)z-三唑基-X-R35；前提是至少一个R17不是氢、-CH3或-CH2OH，并且前提是存在至少一个R31或R35；
z是1-4；
R31选自-SO3H和-P(O)(OH)2；
X是7与155个原子之间的链，其中所述原子选自碳和氧，并且其中所述链能够含有一、二或三个嵌入其中的-NHC(O)-或-C(O)NH-基团；并且其中所述链任选地被一或两个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2、-CH2C(O)NH2和-CH2CO2H的基团取代；并且
R35选自-SO3H和-P(O)(OH)2。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中
A是
m是1并且w是0；
R14、R15和R16a各自是氢；
R16是-(CR17a)(R17)C(O)NR16a)m'-C(R17a)(R17)-CO2H；
m'是0-3；
每个R17a是氢；
每个R17选自氢、-CH3、(CH2)zN3、-(CH2)zNH2、-X-R31、-(CH2)zCO2H、-CH2OH、CH2C＝CH、-(CH2)z-三唑基-X-R35；以及
前提是至少一个R17不是氢、-CH3或-CH2OH，并且前提是存在至少一个R31或R35；
z是1-4；
R31选自-SO3H和-P(O)(OH)2；
X是10与60个原子之间的链，其中所述原子选自碳和氧，并且其中所述链能够含有一、二或三个嵌入其中的-NHC(O)-、-C(O)NH-基团；并且其中所述链任选地被一或两个独立地选自-CO2H、-C(O)NH2、-CH2C(O)NH2和-CH2CO2H的基团取代；并且
R35选自-SO3H和-P(O)(OH)2。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中
R1是苯基C1-C3烷基，其中所述苯基部分任选地被羟基、卤代基或甲氧基取代；
R2是C1-C7烷基，或者R2和Rb与它们所附接的原子一起形成哌啶环；
R3是NRxRy(C1-C7烷基)、NRuRv羰基C1-C3烷基或羧基C1-C3烷基；
R4和Rd与它们所附接的原子一起形成吡咯烷环；
R5是羟基C1-C3烷基、咪唑基C1-C3烷基或NRxRy(C1-C7烷基)；
R6是羧基C1-C3烷基、NRuRv羰基C1-C3烷基、NRxRy(C1-C7烷基)或C1-C7烷基；
R7和Rg与它们所附接的原子一起形成任选地被羟基取代的吡咯烷环；
R8和R10是任选地被羧基C1-C3烷基取代的苯并噻吩基或吲哚基C1-C3烷基；
R9是羟基C1-C3烷基、氨基C1-C4烷基或C1-C7烷基，
R11是C1-C3烷氧基C1-C3烷基或C1-C7烷基；
R12是C1-C7烷基或羟基C1-C3烷基；并且
R13是C1-C7烷基、羧基C1-C3烷基或-(CH2)3NHC(NH)NH2。
9.根据权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐，其中
A是
m是1并且w是0；
R14和R15各自是氢；
R16a是氢或甲基；
Rd是甲基，或者Rd和R4与它们所附接的原子一起形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中每个环任选地被一或两个独立地选自氨基、氰基、甲基、卤代基、羟基和苯基的基团取代；
Rg是甲基，或者Rg和R7与它们所附接的原子一起
形成选自氮杂环丁烷、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪和四氢噻唑的环；其中每个环任选地被一或两个独立地选自以下的基团取代：氨基、任选地被卤代基取代的苄基、苄氧基、氰基、环己基、甲基、卤代基、羟基、任选地被甲氧基取代的异喹啉基氧基、任选地被卤代基取代的喹啉基氧基、和四唑基；并且其中所述吡咯烷和所述哌啶环任选地与环己基、苯基或吲哚基稠合；和吡咯烷。
10.一种化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物或其药学上可接受的盐是
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11.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至9中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐；和药学上可接受的载体。
12.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求10所述的化合物或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体。
13.一种增强、刺激和/或增加有需要的受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至10中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。
14.一种抑制有需要的受试者中癌细胞的生长、增殖或转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至10中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述癌症选自黑色素瘤、肾细胞癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非鳞状NSCLC、结直肠癌、去势抵抗性前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肝细胞癌、胰腺癌、头颈部鳞状细胞癌、食道癌、胃肠道癌和乳腺癌以及血液恶性肿瘤。
16.一种治疗有需要的受试者的感染性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至10中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述感染性疾病是由病毒引起的。
18.一种治疗有需要的受试者的脓毒性休克的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至10中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。
19.一种阻断受试者中PD-L1与PD-1和/或CD80的相互作用的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至10中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。
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