CN118150728A - 一种复方脑蛋白水解物片中维生素b1降解杂质的分析方法 - Google Patents
一种复方脑蛋白水解物片中维生素b1降解杂质的分析方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种复方脑蛋白水解物片中维生素B1降解杂质的分析方法，首先采用0.1％甲酸溶液为溶剂制备供试品溶液与杂质对照品溶液；采用十八烷基键合金属含量极低的超纯硅胶UHPLC色谱柱，对杂质A与杂质B进行分离，最后采用采用三重四级杆质谱检测器，电喷雾离子化(ESI)正离子模式分析检测。本发明用于复方脑蛋白水解物片中维生素B1降解杂质的定量分析，实现了对复方脑蛋白水解片中维生素B1降解杂质的质量控制，保证公众用药的安全性与有效性。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种维生素B1降解杂质的液相色谱-质谱联用分析方法，用于复方脑蛋白水解物片中维生素B1降解杂质的分析检测。
背景技术
复方脑蛋白水解物片的处方有脑蛋白水解物、谷氨酸、硫酸软骨素钠、维生素B1与维生素B6，属于多组分生化药物的复方制剂。现行质量标准中没有对有关物质(如维生素B1降解杂质)的控制方法，通过稳定性试验研究，结果表明该复方制剂中维生素B1不稳定，在高温与高湿条件下易发生降解。
维生素B1由一个嘧啶环通过亚甲基桥连接在一个噻唑还上所组成，是B族维生素中最不稳定的一种，其在干燥和酸性溶液中均稳定，在碱性环境中，特别是在加热时加速其分解破坏，不耐高温。维生素B1的热降解通常由两环之间的亚甲基桥的断裂引起，生成5-(2-羟乙基)-4-甲基噻唑与2-甲基-4-氨基-5-羟甲基嘧啶，其降解机理如下：
将5-(2-羟乙基)-4-甲基噻唑命名为杂质A，将2-甲基-4-氨基-5-羟甲基嘧啶成为杂质B。按照《中国药典》2020年版四部通则9102药品杂质分析指导原则与ICH新制剂中的杂质(Q3B)指导原则的相关要求，制剂产品中降解杂质应定入质量标准，保证产品的安全性与有效性。
前期的研究结果表明，采用液相色谱紫外检测器检测杂质A与杂质B时，发现杂质A与杂质B色谱峰重合，且与样品中其他色谱峰无法达到完全分离，无法满足检测要求；采用气相色谱顶空进样分析方法，杂质A与杂质B的检测灵敏度达不到要求，重复性差。
综上所述，为了满足杂质A与杂质B的检测灵敏度要求，本发明开发了一种液相色谱串联三重四级杆质谱法，用于检测复方脑蛋白水解物片中的杂质A与杂质B。目前，关于复方脑蛋白水解物片中降解杂质的检测方法未见有公开的报道，因此，本发明对复方脑蛋白水解物片的质量控制及其用药安全性与有效性具有极其重要的意义。
发明内容
针对现阶段复方脑蛋白水解物片中维生素B1降解杂质检测困难的要求，本发明提供了一种复方脑蛋白水解物片中维生素B1降解杂质的分析方法，用于维生素B1降解杂质的含量检测。首先采用0.1％甲酸溶液为溶剂制备供试品溶液与杂质对照品溶液；采用十八烷基键合金属含量极低的超纯硅胶UHPLC色谱柱，对杂质A与杂质B进行分离，最后采用采用三重四级杆质谱检测器，电喷雾离子化(ESI)正离子模式分析检测，实现了对复方脑蛋白水解物片中维生素B1降解杂质的控制。
本发明的技术方案如下：
一种复方脑蛋白水解物片中维生素B1降解杂质的分析方法，首先采用0.1％甲酸溶液为溶剂制备供试品溶液与杂质对照品溶液；采用十八烷基键合金属含量极低的超纯硅胶UHPLC色谱柱，对杂质A与杂质B进行分离，最后采用采用三重四级杆质谱检测器，电喷雾离子化(ESI)正离子模式分析检测。
所述的维生素B1降解杂质为5-(2-羟乙基)-4-甲基噻唑与2-甲基-4-氨基-5-羟甲基嘧啶，分别命名为杂质A与杂质B。
优选地，检测采用的流动相A为0.1甲酸溶液，流动相B为0.1甲酸乙腈溶液，梯度洗脱；流速为0.3ml/min，柱温为40℃，进样体积为1μl。
优选地，梯度洗脱程序如下：
优选地，所述三重四级杆质谱检测器，采用电喷雾离子化(ESI)正离子模式。
优选地，化合物的监测离子对信息如下：
优选地，采用外标法以峰面积计算供试品溶液中杂质A与杂质B的含量：
杂质A(B)含量(％)＝Aai/Aas×Cas/Cai×100％
式中：Aai为供试品溶液色谱图中杂质A(B)的峰面积；
Aas为对照品溶液色谱图中杂质A(B)的峰面积；
Cai为供试品溶液中维生素B1的浓度，μg/ml；
Cas为对照品溶液中杂质A(B)的浓度，μg/ml。
本发明的另一个目的，保护一种复方脑蛋白水解物片的质量控制方法，采用上述分析方法进行测定。
本发明的另一个目的，保护一种维生素B1降解杂质的定量测定方法，采用上述分析方法进行测定。
本发明提供了一种液相色谱三重四级杆质谱联用法，用于复方脑蛋白水解物片中维生素B1降解杂质的定量分析。实现了对复方脑蛋白水解片中维生素B1降解杂质的质量控制，保证公众用药的安全性与有效性。
为准确检测复方脑蛋白水解物片中维生素B1降解杂质的含量，根据维生素B1的稳定性特点，本发明采用0.1％甲酸溶液为溶剂溶解供试品，确保维生素B1的稳定性；其次采用十八烷基键合金属含量极低的超纯硅胶UHPLC色谱柱，实现对杂质A与杂质B，及与其他色谱峰的有效分离；采用三重四级杆质谱检测器，电喷雾离子化正离子模式进行定量分析；并对流动相的梯度洗脱程序进行优化，最终确定了分析方法。
本发明的有益效果在于：
1.本发明采用液质联用法，检测时间短，消耗试剂少，很大程度上提高了工作效率，节约了工作成本，降低了环境污染。
2.本发明所用溶剂0.1％甲酸溶液，为维生素B1提供酸性环境，避免维生素B1的降解，实现了供试品溶液的稳定性，以及杂质A与杂质B检测的重复性与准确度。
3.本发明采用十八烷基键合金属含量极低的超纯硅胶UHPLC色谱柱，可以耐更高比例的水相，实现杂质A与杂质B，以及与其他色谱峰有效分离，提高杂质A与杂质B的离子化程度。
4.本发明分析方法采用质谱检测器，灵敏度高。
5.本发明分析方法的重复性好，准确度高。杂质A的平均回收率为89.57％(n＝18)，RSD为2.8％；杂质B的平均回收率为90.05％(n＝18)，RSD为4.1％。
6.本发明分析方法经方法学验证，方法的专属性、准确度、重复性、线性范围、检测限、定量限等验证指标均符合要求，证明本发明可用于复方脑蛋白水解物片中维生素B1降解杂质的定量分析。本发明对复方脑蛋白水解物片的质量控制及用药安全性与有效性具有重大意义，同时为复方脑蛋白水解物片质量标准提高工作提供了参考。
附图说明
图1为杂质A与杂质B对照品溶液色谱图；
图2为企业A的复方脑蛋白水解物片供试品溶液色谱图；
图3为企业B的复方脑蛋白水解物片供试品溶液色谱图；
图4为企业C的复方脑蛋白水解物片供试品溶液色谱图；
图5为杂质A与杂质B的线性关系图
图6为各企业复方脑蛋白水解物片中杂质A与杂质B的含量检测结果分布图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，而不是对发明进行限制。实施例中所用实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的试剂、耗材等如无特殊说明，均可以从商业途径得到。因此熟悉本领域的技术人员根据发明内容进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1溶剂的选择
根据维生素B1的理化特性，维生素B1在酸性条件下最稳定，为避免检测过程中维生素B1发生降解，造成结果偏高，选择0.1％甲酸溶液作为溶剂。
实施例2色谱条件的选择
1.对照品溶液的制备
取杂质A与杂质B对照品各约10mg，精密称定，置同一10ml量瓶中，加0.1％甲酸溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密称取0.1ml，置10ml量瓶中，用0.1％甲酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液；精密称取对照品贮备液1ml，置100ml量瓶中，用0.1％甲酸溶液稀释至刻度，摇匀(浓度约为100ng/ml)。
2.供试品溶液的制备
取复方脑蛋白水解物片20片，精密称定，研细，精密称取细粉适量(约相当于维生素B1 1mg)，置100ml量瓶中，加0.1％甲酸溶液适量，超声约30分钟，用0.1％甲酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液。
3.加标供试品溶液的制备
取复方脑蛋白水解物片20片，精密称定，研细，精密称取细粉适量(约相当于维生素B1 1mg)，置100ml量瓶中，加0.1％甲酸溶液适量，精密加入对照品贮备液1ml，超声约30分钟，用0.1％甲酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液。
4.流动相梯度洗脱程序选择
以AcclaimTM RSLC 120C18(150×2.1mm，2.2μm)为色谱柱；以0.1％甲酸溶液为流动相A，以0.1％甲酸乙腈溶液为流动相B；流速为每分钟0.3ml；进样体积为1μl。
质谱条件：采用三重四级杆质谱检测器，电喷雾离子化(ESI)正离子模式。化合物的监测离子对、离子源参考参数见下表。
监测离子对：
离子源参数：
| 气帘气(psi) | 40 |
| 碰撞气(psi) | 10 |
| 离子化电压(V) | 4500 |
| 涡旋离子喷雾温度(℃) | 550 |
| 雾化气(psi) | 60 |
| 辅助加热气(psi) | 60 |
设置不同的流动相梯度洗脱程序，取对照品溶液、供试品溶液、加标供试品溶液分别进样分析，计算杂质A与杂质B的回收率，选择杂质A与杂质B分离度良好、回收率高的色谱条件为最终色谱条件。
5.结果与讨论
因复方脑蛋白水解片含有多种游离氨基酸与多种肽、硫酸软骨素钠、维生素B6，成分比较复杂，且维生素B1的含量很低(1mg/片)，检测过程中，供试品溶液中其他成分会影响杂质A与杂质B的离子化程度，进而会影响回收率的结果。通过多次调整流动相梯度洗脱程序，最终使杂质B的回收率结果符合方法学验证要求，且杂质A与杂质B的重复性结果均良好，确定流动相梯度洗脱程序如下：
实施例3方法学考察
专属性考察：空白溶剂与制剂空白辅料溶液均不干扰杂质A与杂质B的检测，空白溶剂色谱图如图1所示，制剂空白辅料溶液色谱图与空白溶剂色谱图一致，供试品溶液色谱图如图2所示。
仪器精密度考察：取对照品溶液，按照确定的色谱条件，连续进样6次，计算杂质A与杂质B峰面积的RSD，结果杂质A与杂质B峰面积的RSD分别为0.6％、1.8％，均小于2％，说明仪器精密度良好。对照品溶液色谱图如图3所示。
线性关系考察：取对照品贮备液稀释为不同浓度的溶液，进样分析，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归，结果杂质A在3.07～153.32ng/ml浓度范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系，相关系数为0.9998；杂质B在3.37～168.44ng/ml浓度范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系，相关系数为0.9992，线性关系良好。杂质A与杂质B的线性关系图如图4所示。
检测限与定量限考察：取对照品溶液逐级稀释至一定浓度的溶液，进样分析，选择信噪比约为3的溶液作为检测限溶液，信噪比约为10时的溶液为定量限溶液。结果杂质A的定量限浓度为3.07ng/ml(占维生素B1浓度的0.03％)，检测限浓度为1.02ng/ml(占维生素B1浓度的0.01％)；杂质B的定量限浓度为3.37ng/ml(占维生素B1浓度的0.03％)，检测限浓度为1.12ng/ml(占维生素B1浓度的0.01％)。
方法准确度与重复性考察：取3家企业的复方脑蛋白水解物片，分别制备加标供试品溶液，每家企业样品分别制备6份加标供试品溶液，计算杂质A与杂质B的回收率结果与RSD。结果杂质A的回收率为84.58％～94.27％，平均值为89.57％(n＝18)，RSD为2.8％；杂质B的回收率为85.29％～95.93％，平均值为90.05％(n＝18)，RSD为4.1％。说明该方法的准确度与重复性均良好。
样品测定：取3家企业的复方脑蛋白水解物片，按照确定的试验方法进行检测，
表1各厂家产品杂质A与杂质B检查结果
Claims (8)
1.一种复方脑蛋白水解物片中维生素B1降解杂质的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
首先采用0.1％甲酸溶液为溶剂制备供试品溶液与杂质对照品溶液；采用十八烷基键合金属含量极低的超纯硅胶UHPLC色谱柱，对杂质A与杂质B进行分离，最后采用采用三重四级杆质谱检测器，电喷雾离子化(ESI)正离子模式分析检测；
所述的维生素B1降解杂质为5-(2-羟乙基)-4-甲基噻唑与2-甲基-4-氨基-5-羟甲基嘧啶，分别命名为杂质A与杂质B。
2.根据权利要求1所述的一种复方脑蛋白水解物片中维生素B1降解杂质的分析方法，其特征在于，检测采用的流动相A为0.1甲酸溶液，流动相B为0.1甲酸乙腈溶液，梯度洗脱；流速为0.3ml/min，柱温为40℃，进样体积为1μl。
3.根据权利要求1所述的一种复方脑蛋白水解物片中维生素B1降解杂质的分析方法，其特征在于，梯度洗脱程序如下：
4.根据权利要求1所述的一种复方脑蛋白水解物片中维生素B1降解杂质的分析方法，其特征在于，所述三重四级杆质谱检测器，采用电喷雾离子化(ESI)正离子模式。
5.根据权利要求4所述的一种复方脑蛋白水解物片中维生素B1降解杂质的分析方法，其特征在于，化合物的监测离子对信息如下：
6.根据权利要求1所述的一种复方脑蛋白水解物片中维生素B1降解杂质的分析方法，其特征在于，采用外标法以峰面积计算供试品溶液中杂质A与杂质B的含量：
杂质A(B)含量(％)＝Aai/Aas×Cas/Cai×100％；
式中：Aai为供试品溶液色谱图中杂质A(B)的峰面积；
Aas为对照品溶液色谱图中杂质A(B)的峰面积；
Cai为供试品溶液中维生素B1的浓度，μg/ml；
Cas为对照品溶液中杂质A(B)的浓度，μg/ml。
7.一种复方脑蛋白水解物片的质量控制方法，采用权利要求1-6任一项所述的分析方法进行测定。
8.一种维生素B1降解杂质的定量测定方法，采用权利要求1-6任一项所述的分析方法进行测定。
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