CN118147345A - 一种甘蓝型油菜耐盐胁迫的qtl及其分子标记与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物学及遗传育种技术领域，公开了一种甘蓝型油菜耐盐胁迫的QTL及其分子标记与应用，其中，能够控制甘蓝型油菜耐盐胁迫能力的QTL位点为iqSTI‑C1‑1、iqSTI‑C1‑2中的任意一者，iqSTI‑C1‑1的位置为甘蓝型油菜C1染色体11.0cM至11.5cM，其序列为Brassica napus的Darmor参考基因组C1染色体的136020bp至315548bp；iqSTI‑C1‑2的位置为甘蓝型油菜C1染色体20.1cM至20.6cM，其序列为Brassica napus的Darmor参考基因组C1染色体的1239322bp至1349184bp。本发明首次公布了两个高显著性的甘蓝型油菜耐盐胁迫的QTL位点iqSTI‑C1‑1和iqSTI‑C1‑2，并开发了与之连锁的SNP分子标记和AFLP分子标记，使其可有效地应用于分子标记辅助选择育种，加快耐盐胁迫品种培育进程。

Description

一种甘蓝型油菜耐盐胁迫的QTL及其分子标记与应用
技术领域
本发明属于生物学及遗传育种技术领域，更具体地，涉及一种甘蓝型油菜耐盐胁迫的QTL及其分子标记与应用，得到了2个调控甘蓝型油菜(Brassica napus)耐盐胁迫性状的数量性状位点(quantitative trait locus,QTL)，以及与之连锁的分子标记，能够应用于甘蓝型油菜耐盐胁迫方向的育种。
背景技术
盐胁迫是最常见非生物胁迫之一。提高作物的耐盐胁迫能力，对于开发和综合利用盐渍化土地和提高盐渍化耕地的农作物产量具有重要意义。
油菜是最重要的油料作物之一，同时还有饲用、旅游观光、蜜用等价值。而在油菜中，以甘蓝型油菜种植范围最广，产油量最高，具有“不与主粮争地”的优点因此。一般认为，甘蓝型油菜具有较强的耐盐胁迫能力，但不同材料的耐盐胁迫能力差异极大，故对甘蓝型油菜耐盐胁迫性状进行QTL研究以及开发和耐盐胁迫性状关联的分子标记(如SNP标记和AFLP标记等)，对通过分子标记辅助选择耐盐胁迫品种具有重要意义。
和传统育种手段相比，分子标记辅助选择育种通过使用与优良性状QTL连锁的分子标记进行筛选，可大幅提高选择效率，进而缩短育种周期。SNP分子标记可通过基因芯片筛选和高精度KASP实验等进行分析，通量和检测效率很高；AFLP分子标记可通过普通PCR进行检测，其检测效率低于SNP分子标记，但成本远低于前者。目前，这两种分子标记在分子标记辅助选择育种中均有应用。目前，已有大量研究针对甘蓝型油菜产量和品质性状进行了QTL定位分析，并已在实际育种工作中得到应用。然而，由于甘蓝型油菜耐盐胁迫QTL相关研究起步较晚，目前定位到的QTL数量很少，这限制了与耐盐胁迫性状连锁的分子标记的开发及其在育种中的应用。
综上所述，对甘蓝型油菜群体进行耐盐胁迫QTL分析，并开发与之连锁的分子标记，对通过分子标记辅助选择方法培育具有高耐盐胁迫能力的甘蓝型油菜品种具有重大意义。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种甘蓝型油菜耐盐胁迫的QTL及其分子标记与应用，首次公布了两个高显著性的甘蓝型油菜耐盐胁迫的QTL位点iqSTI-C1-1和iqSTI-C1-2，并开发了与之连锁的SNP分子标记和AFLP分子标记，使其可有效地应用于分子标记辅助选择育种，加快耐盐胁迫品种培育进程，节约育种成本。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种能够控制甘蓝型油菜耐盐胁迫能力的QTL位点，其特征在于，该QTL位点为iqSTI-C1-1、iqSTI-C1-2中的任意一者，其中：
iqSTI-C1-1的位置为甘蓝型油菜C1染色体11.0cM至11.5cM，其序列为Brassicanapus的Darmor参考基因组C1染色体的136020bp至315548bp；
iqSTI-C1-2的位置为甘蓝型油菜C1染色体20.1cM至20.6cM，其序列为Brassicanapus的Darmor参考基因组C1染色体的1239322bp至1349184bp。
按照本发明的另一方面，本发明提供了上述QTL位点在耐盐胁迫甘蓝型油菜育种中的应用。
按照本发明的又一方面，本发明提供了一种用于与控制甘蓝型油菜耐盐胁迫能力的QTL位点连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记为Bns_p3265_C1和Bns_p3268_C1的组合；其中，
所述Bns_p3265_C1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述Bns_p3268_C1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
按照本发明的再一方面，本发明提供了一种用于与控制甘蓝型油菜耐盐胁迫能力的QTL位点连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记为Bns_p2221和Bns_p2233的组合；其中，
所述Bns_p2221的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述Bns_p2233的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
按照本发明的再一方面，本发明提供了一种用于与控制甘蓝型油菜耐盐胁迫能力的QTL位点连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记为STI-C1-1a和STI-C1-1b的组合；
该STI-C1-1a的上游引物序列如SEQ ID NO.5所示，STI-C1-1a下游引物序列SEQID NO.6所示；
该STI-C1-1b的上游引物序列如SEQ ID NO.7所示，STI-C1-1b下游引物序列SEQID NO.8所示。
按照本发明的再一方面，本发明提供了一种用于与控制甘蓝型油菜耐盐胁迫能力的QTL位点连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记为STI-C1-2a和STI-C1-2b的组合；
该STI-C1-2a的上游引物序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物序列SEQ ID NO.10所示；
该STI-C1-2b的上游引物序列如SEQ ID NO.11所示，下游引物序列SEQ ID NO.12所示。
按照本发明的最后一方面，本发明提供了上述分子标记在耐盐胁迫甘蓝型油菜育种中的应用。
通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，本发明得到了2个甘蓝型油菜耐盐胁迫QTL(即，iqSTI-C1-1、iqSTI-C1-2)及与之连锁的分子标记。如后文实施例所详细展示的，本发明甘蓝型油菜耐盐胁迫QTL位点发掘，是利用两个耐盐胁迫能力不同的甘蓝型油菜材料Ken-C8和N53-2构建KN DH群体，并对群体中各株系进行耐盐胁迫能力的评估，通过QTL连锁作图鉴定到2个耐盐胁迫相关的QTL位点，并开发了与之连锁的分子标记，有助于通过分子标记辅助选择育种选育耐盐胁迫油菜品种。
包括甘蓝型油菜在内的各种作物，对盐胁迫的耐受能力是典型的数量性状，其表型考察难度高，受环境影响大，因此，相关育种工作难度高、成本大、进展缓慢。本发明研发得到的甘蓝型油菜耐盐胁迫QTL位点填补了国内相关专利的空白，且LOD值高达7.29和4.58(如后文实施例4所展示的)，对通过分子标记辅助选择方法提高甘蓝型油菜耐盐胁迫能力和培育耐盐胁迫品种具有重要意义。
现有技术对甘蓝型油菜耐盐胁迫QTL的研究较少，本发明是首次公布了两个高显著性的甘蓝型油菜耐盐胁迫的QTL位点iqSTI-C1-1和iqSTI-C1-2。退一步来讲，即使横向进行对比的话，在大豆、柳树等植物中有耐盐胁迫QTL和分子标记相关专利公布，如CN106978494B，CN109609672A等。然而，上述专利中所报道的耐盐胁迫QTL的LOD值均较低，分别为3.37、3.2和3.4，这意味着在实际应用中容易受环境影响，而难以稳定地被检测到。而本发明得到的两个甘蓝型油菜耐盐胁迫QTL的LOD值较高，分别为7.29和4.58(如后文实施例4所展示的)，保证了其在应用中的环境稳定性和可靠性。
本发明得到的用于与控制甘蓝型油菜耐盐胁迫的QTL位点连锁的SNP分子标记和AFLP分子标记中：
(1)与iqSTI-C1-1连锁的SNP分子标记Bns_p3265_C1和Bns_p3268_C1，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示，iqSTI-C1-1介于Bns_p3265_C1和Bns_p3268_C1之间。
(2)与iqSTI-C1-2连锁的SNP分子标记Bns_p2221和Bns_p2233，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示，iqSTI-C1-2介于Bns_p2221和Bns_p2233之间。
(3)与iqSTI-C1-1连锁的AFLP分子标记STI-C1-1a和STI-C1-1b，STI-C1-1a的引物序列为：上游引物序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物序列SEQ ID NO.6所示；STI-C1-1b的引物序列为：上游引物序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物序列SEQ ID NO.8所示。
(4)与iqSTI-C1-2连锁的AFLP分子标记STI-C1-2a和STI-C1-2b，STI-C1-2a的引物序列为：上游引物序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物序列SEQ ID NO.10所示；STI-C1-2b的引物序列为：上游引物序列如SEQ ID NO.11所示，下游引物序列SEQ ID NO.12所示。
本发明得到的与iqSTI-C1-1和iqSTI-C1-2连锁的SNP分子标记Bns_p3265_C1，Bns_p3268_C1，Bns_p2221和Bns_p2233，具有SNP分子标记已知的各项优点，例如，通量高、筛选速度快。该分子标记可用于通过分子标记辅助选择高耐盐胁迫能力甘蓝型油菜品种，加快育种进程，缩短其育种周期，减少人力物力消耗。
本发明得到的与iqSTI-C1-1连锁的AFLP分子标记STI-C1-1a和STI-C1-1b；以及与iqSTI-C1-2连锁的AFLP分子标记STI-C1-2a和STI-C1-2b。它们具有AFLP分子标记已知的各项优点，例如操作简单、检测门槛低。因此，该分子标记可用于通过分子标记辅助选择高耐盐胁迫能力甘蓝型油菜品种，可明显缩短其育种周期。
附图说明
图1为不同甘蓝型油菜株系的自然群体材料在三种不同盐浓度(50、100和150mMNaCl)下的STI分布，其中蓝色箭头和红色箭头分别表示Ken-C8和N53-2。
图2为N53-2和Ken-C8幼苗在纯水和不同程度盐胁迫条件下的干重和鲜重变化对比图。图中横坐标对应NaCl溶液的不同浓度(即，NaCl溶液的浓度分别为0，25，50，75，100，125，150，175，200，225，250mM)。
图3为Ken-C8和N53-2幼苗在不同程度盐胁迫条件下培养的表型图。其中，图3中的A对应使用纯水(左侧对应Ken-C8幼苗，右侧对应N53-2幼苗；下同)，图3中的B对应使用75mMNaCl溶液，图3中的C对应150mM NaCl溶液，图3中的D对应使用225mM NaCl溶液。
图4为KN DH群体的STI分布情况。图中横坐标对应STI，各个柱状示意自左至右分别表示STI∈[0，0.1]、(0.1，0.2]、(0.2，0.3]、(0.3，0.4]、(0.4，0.5]、(0.5，0.6]、(0.6，0.7]、(0.7，0.8]、(0.8，0.9]、(0.9，1.0]、(1.0，1.1]、(1.1，1.2]的频数。
图5为KN DH群体STI在C1染色体上的QTL扫描情况。图中蓝色星星标示的峰为iqSTI-C1-1，绿色星星标示的峰为iqSTI-C1-2。
图6为KN DH群体中iqSTI-C1-1和iqSTI-C1-2不同单倍型背景下STI的分布情况。图中上方的数值表示F检验下的差异显著性，分别为5.92×10-5、0.0243，分别达到了极显著和显著水平。
图7为iqSTI-C1-1和iqSTI-C1-2内的AFLP分子标记筛选情况。图7中的条带3个为一组，自右至左各组依次对应：M-136988、M-163862、M-164724、M-175085、M-189975、M-205681、M-288811、M-298067、M-1276437、M-1281982、M-1300816、M-1305441、M-1322285；每个标记对应的三个条带从右至左依次为“Ken-C8”,“N53-2”和二者的杂合子。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明进行了甘蓝型油菜耐盐胁迫QTL的发掘，总的来说，包括如下步骤：
a)将不同甘蓝型油菜株系在四种不同NaCl浓度下(0，50，100和150mM，其中0mM为对照组)进行培训，测量它们在这四种不同NaCl浓度下的生长状况；筛选获得油菜低盐胁迫敏感材料N53-2和高盐胁迫敏感材料Ken-C8；其中，与现有技术一致，Ken-C8属于春油菜品系，由“SE8”和“midas”杂交而来；N53-2属于冬油菜品系，由“1721-1B”·“strat”ד955”·“春陕2B”四元杂交后经小孢子培养而来；
b)利用N53-2和Ken-C8进行杂交，F1代花粉培养，经染色体加倍，获得双单倍体(DH)分离群体，共包含300个株系；
c)分别取亲本N53-2、Ken-C8和DH分离群体各株系新鲜叶片样品20mg，经液氮冷冻后充分研磨成粉末；
d)向样品中加入400ul的CTAB提取液(pH7.5，每500mL含NaCl40.908g，CTAB 10g，EDTA2.9224g)，涡旋振荡；
e)向体系中加入等体积饱和平衡酚，充分混匀后12000rpm离心5min，吸取转移上清液；
f)向上清液中加入等体积的酚氯仿(体积比为：Tris饱和酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1)，充分混匀后12000rpm离心5min，吸取转移上清液；
g)向上清液中加入2倍体积的乙醇(提前在-20℃冰箱中预冷)，观察到有白色沉淀，12000rpm离心5min收集沉淀；
h)使用70％(体积分数)乙醇(提前在-20℃冰箱中预冷)洗涤沉淀一次，而后干燥，即得到亲本N53-2、Ken-C8和DH分离群体各株系的DNA；
i)利用搜集自油菜公开数据库(http://www.ukcrop.net/Brassica DB)的PCR类型标记，使用各标记引物对N53-2和Ken-C8的DNA进行扩增，对扩增产物使用6％聚丙烯酰胺凝胶(即，每100ml聚丙烯酰胺胶溶液中含有5.7g丙烯酰胺和0.3g甲叉-双丙烯酰胺)进行电泳，而后使用0.1％的硝酸银溶液(即，每100ml含0.1g硝酸银)对电泳结果进行染色观察；
j)选择在N53-2和Ken-C8之间具有扩增多态性的PCR类型标记，使用其对DH分离群体各株系进行标记分型；
k)购买Illumina公司研制的60K油菜SNP芯片对油菜两亲本及DH分离群体DNA样品进行分型。利用在亲本中筛选到有多态性的标记位点后，获得多态性位点在KN DH群体中的分布；
l)对KN DH群体各株系种子进行萌发和水培，而后施加盐胁迫，考察盐胁迫和对照条件下的表型，衡量各株系的耐盐胁迫能力；
m)通过PCR类型标记和SNP标记在DH分离群体中的分布构建高密度的遗传图谱，借助各株系耐盐胁迫能力数据进行QTL位点分析，获得两个QTL：iqSTI-C1-1和iqSTI-C1-2；
n)使用软件Joinmap3.0、Windows QTL Cartographer 2.5(商业途径获得)，结合遗传连锁图谱、甘蓝型油菜Darmor_bzh参考基因组和QTL位点信息，获得与QTL连锁的分子标记。获得与iqSTI-C1-1连锁的分子标记，Bns_p3265_C1，Bns_p3268_C1；以及与iqSTI-C1-2连锁的分子标记，Bns_p2221，Bns_p2233。
o)根据Ken-C8和N53-2在iqSTI-C1-1和iqSTI-C1-2区间内的序列差异，分别设计开发了两对位于iqSTI-C1-1区间内的AFLP分子标记iqSTI-C1-1a和iqSTI-C1-1b；以及两对位于iqSTI-C1-2区间内的AFLP分子标记iqSTI-C1-2a和iqSTI-C1-2b。
具体的：
实施例1：甘蓝型油菜耐盐胁迫材料筛选
将不同油菜株系(如，N53-2、Ken-C8、J2016、J9709、Westar等)的种子分别消毒后放置于萌发袋中，在1/2霍格兰溶液条件下萌发并培养至3叶期；
完全去除萌发袋中的1/2霍格兰溶液，并替换为50、100、150mM的NaCl溶液(盐胁迫组)或纯水(对照组)，继续培养10天；
采集自然群体各株系盐胁迫组和对照组的幼苗，擦干水分后测量鲜重，按照公式：(STI＝盐胁迫组鲜重/对照组鲜重×100％)计算STI；
对比三种不同梯度(即，50、100和150mM NaCl)盐胁迫下各株系的STI，选出一个在三种不同盐浓度下均表现为较高STI的材料Ken-C8，和一个在三种不同盐浓度下均表现为较低STI的材料N53-2(图1)。
实施例2：甘蓝型油菜含油量定位群体和连锁图的构建
以N53-2为母本，Ken-C8为父本，通过人工去雄杂交，得到的F1代种植于田间。通过对F1代进行小孢子培养成功得到了500余株DH株系，最终从中选取生长状况良好的300个株系构建作图群体，并命名为KN DH群体。
实验中对群体分型用的是油菜60K芯片。此外，还加入了一些来自公开数据库和已发表文章中使用的SSR，SRAP和STS分子标记。
使用CTAB法提取N53-2、Ken-C8和KN DH群体各株系的DNA，而后根据Illumina公司提供的技术方法，使用油菜60K芯片对亲本和群体进行分型，实现快速大量的SNP多态性分析。
SSR和STS引物的PCR扩增程序采用“TOUCH DOWN”的方法：94℃预变性3min，1个循环；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸45s，10个循环，每个循环退火温度降低1℃；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸7min，10℃保存。如果有引物扩增效果不好，按照引物合成单上的Tm值，调节退火温度，时间不做调整。电泳检测前，在扩增产物中加入等体积的上样缓冲液，95℃变性5min，冰水中冷却后点样。
SRAP引物的PCR扩增程序为：94℃变性5min；94℃变性1min，35℃退火1min，72℃延伸1min，5个循环；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min，10℃保存。
SSR和STS引物扩增产物在6％(100ml聚丙烯酰胺胶溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克甲叉-双丙烯酰胺)的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离、银染、显影(方法见Sanguinetti等，1994)获得每个株系基因型和群体的分子标记多态性数据。SRAP标记PCR产物的分析用的是Applied Biosystems公司生产的全自动3730xl DNA测序仪的片段分析功能进行多态性分析。
通过标记在分离群体中的多态性和分布进行数据分析，用软件Joinmap3.0根据连锁交换率构建油菜的遗传连锁图谱。
实施例3：亲本和KN DH群体各株系苗期耐盐胁迫性状的数据获取
首先进行预实验，将N53-2和Ken-C8种子分别在0，25，50，75，100，125，150，175，200，225和250mM的NaCl溶液中萌发并光照培养10天。其中，0mM NaCl溶液即纯水，作为对照组。
取各条件下培养的N53-2和Ken-C8幼苗，统计其根长、芽长、鲜重和干重等数据。结果表明，在纯水条件下，N53-2的干重和鲜重均大于Ken-C8；在施加盐胁迫后，Ken-C8表现为干重和鲜重先上升后下降；当NaCl浓度超过150mM时，Ken-C8的鲜重开始显著低于对照组，当NaCl浓度超过175mM时，Ken-C8的干重开始显著低于对照组，即其生长遭受盐胁迫的影响；而N53-2的干重和鲜重随NaCl浓度增加不断下降。然而，当浓度高于150mM后，Ken-C8的干重鲜重下降速度超过N53-2(图2)。
另外，在未施加盐胁迫条件下，Ken-C8的根长和芽长均小于N53-2；当在75mM NaCl条件下，Ken-C8的根长和芽长反超N53-2；当在225mM NaCl条件下，Ken-C8的根长和芽长再次小于N53-2(图3)。
根据以上表型推断，当盐浓度在150mM以下时，Ken-C8表现出较强的耐盐胁迫能力，而当盐浓度在150mM以上时，N53-2表现出较强的耐盐胁迫能力。
取KN DH群体每个株系的种子，放置于萌发袋中，在1/2霍格兰溶液条件下萌发并培养至3叶期。
完全去除萌发袋中的1/2霍格兰溶液，并替换为150mM的NaCl溶液(盐胁迫组)或纯水(对照组)，继续培养10天。
将盐胁迫组和对照组的KN DH群体各株系幼苗采集，擦干水分后测量鲜重，按照公式：(STI＝盐胁迫组鲜重/对照组鲜重×100％)计算STI。
对KN DH群体中各株系的STI进行分布统计，结果表明其基本遵循正态分布，这是数量性状的典型特征，说明STI适用于QTL作图分析(图4)。
实施例4：KN DH群体耐盐胁迫QTL的扫描与分析
统计STI的群体分布情况，由分布图可知，STI在KN DH群体内整体呈正态分布，属于典型的数量性状，适用于QTL连锁作图。
使用Windows QTL Cartographer 2.5进行QTL连锁作图，采用复合区间作图的方法(CIM)。QTL统计由极大似然函数比的常用对数(LOD)和每个QTL解释的相关表型的表型变异百分率来决定。QTL阈值用重复抽样的1000次排布测验方法(permutation test)确定，以3.0为LOD值阈值，显著水平定为0.05。
QTL作图得到两个显著性QTL，分别命名为iqSTI-C1-1和iqSTI-C1-2。二者的LOD值分别为7.29和4.58，表型贡献率分别达到11.57％和9.02％。其中，iqSTI-C1-1的优势单倍型来自于N53-2，而iqSTI-C1-2的优势单倍型来自于Ken-C8(表1)。进一步分析表明，在KNDH群体中，iqSTI-C1-1区间内染色体来源于N53-2的株系(iqSTI-C1-1N53-2)，相较于iqSTI-C1-1区间内染色体来源于Ken-C8的株系(iqSTI-C1-1Ken-C8)，STI显著提高30.2％(从0.5732提高至0.7463)；而iqSTI-C1-2区间内染色体来源于Ken-C8的株系(iqSTI-C1-2Ken-C8)，相较于iqSTI-C1-2区间内染色体来源于N53-2的株系(iqSTI-C1-2N53-2)，STI显著提高15.6％(从0.6306提高至0.7293)(图6)。并且，图6中还标出了它们在F检验下的差异显著性，分别为5.92×10-5、0.0243，分别达到了极显著和显著水平(数值越小，显著性越好)。本发明采用各材料在盐胁迫条件下和对照条件下的鲜重比值来衡量盐胁迫耐受能力，进一步保证了耐盐胁迫QTL定位的准确性。
根据Darmor_bzh参考基因组(V4.1，可详见以下网址：https://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/data/)，iqSTI-C1-1和iqSTI-C1-2均位于甘蓝型油菜C1染色体上，其遗传距离分别为(11-11.5cM)和(20.1-20.6cM)，对应物理距离(136020-315548bp)和(1239322-1349184bp)，LOD值分别为7.29和4.58。根据遗传连锁图谱，Bns_p3265_C1和Bns_p3268_C1分别位于iqSTI-C1-1两侧，二者之间的区间包含了完整的iqSTI-C1-1，在作为SNP分子标记应用于分子标记辅助选择育种时可保证iqSTI-C1-1的完整性；而Bns_p2221和Bns_p2233分别位于iqSTI-C1-2两侧，二者之间的区间包含了完整的iqSTI-C1-2，在作为SNP分子标记应用于分子标记辅助选择育种时可保证iqSTI-C1-2的完整性(图5，表2)。
表1.iqSTI-C1-1和iqSTI-C1-2信息表
表2.部分SNP分子标记的在遗传连锁图谱上的位置
实施例5：AFLP分子标记开发
对Ken-C和N53-2进行重测序，根据重测序结果，在iqSTI-C1-1内挑选8个Indel设计扩增引物；同时在iqSTI-C1-2内挑选5个Indel设计扩增引物，其序列如表3所示。
使用上述扩增引物对Ken-C和N53-2的基因组DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸银染色，根据染色条带评估这些Indel在Ken-C和N53-2之间的扩增多态性。
经过筛选发现，相较于iqSTI-C1-1内的其他分子标记，STI-C1-1a和STI-C1-1b在Ken-C8和N53-2之间表现出清晰、单一的差异性扩增条带，且在杂合子中表现为共显性，因此在应用于分子标记辅助选择育种时易于区分不同背景的株系。而相较于iqSTI-C1-1内的其他分子标记，STI-C1-2a和STI-C1-2b在Ken-C8和N53-2之间表现出清晰、单一的差异性扩增条带，且在杂合子中表现为共显性，因此在应用于分子标记辅助选择育种时易于区分不同背景的株系。
因此，挑选上述四个分子标记分别作为与iqSTI-C1-1和iqSTI-C1-2连锁的AFLP分子标记(图7)。
表3.iqSTI-C1-1和iqSTI-C1-2区间内AFLP分子标记筛选所用全部引物
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种能够控制甘蓝型油菜耐盐胁迫能力的QTL位点，其特征在于，该QTL位点为iqSTI-C1-1、iqSTI-C1-2中的任意一者，其中：
iqSTI-C1-1的位置为甘蓝型油菜C1染色体11.0cM至11.5cM，其序列为Brassica napus的Darmor参考基因组C1染色体的136020bp至315548bp；
iqSTI-C1-2的位置为甘蓝型油菜C1染色体20.1cM至20.6cM，其序列为Brassica napus的Darmor参考基因组C1染色体的1239322bp至1349184bp。
2.如权利要求1所述QTL位点在耐盐胁迫甘蓝型油菜育种中的应用。
3.一种用于与控制甘蓝型油菜耐盐胁迫能力的QTL位点连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记为Bns_p3265_C1和Bns_p3268_C1的组合；其中，
所述Bns_p3265_C1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述Bns_p3268_C1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种用于与控制甘蓝型油菜耐盐胁迫能力的QTL位点连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记为Bns_p2221和Bns_p2233的组合；其中，
所述Bns_p2221的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述Bns_p2233的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
5.一种用于与控制甘蓝型油菜耐盐胁迫能力的QTL位点连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记为STI-C1-1a和STI-C1-1b的组合；
该STI-C1-1a的上游引物序列如SEQ ID NO.5所示，STI-C1-1a下游引物序列SEQ IDNO.6所示；
该STI-C1-1b的上游引物序列如SEQ ID NO.7所示，STI-C1-1b下游引物序列SEQ IDNO.8所示。
6.一种用于与控制甘蓝型油菜耐盐胁迫能力的QTL位点连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记为STI-C1-2a和STI-C1-2b的组合；
该STI-C1-2a的上游引物序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物序列SEQ ID NO.10所示；
该STI-C1-2b的上游引物序列如SEQ ID NO.11所示，下游引物序列SEQ ID NO.12所示。
7.如权利要求3－6任意一项所述分子标记在耐盐胁迫甘蓝型油菜育种中的应用。
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