CN118146958A - 一种产群体效应抑制剂的真菌 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于微生物开发利用技术领域,提供了一种产群体效应抑制剂的真菌及其应用,所述真菌为JW‑13‑1,其保藏编号为CGMCC No.41110。并将所述真菌应用于生产青霉酸中。所提供的真菌产青霉酸的产量为每1 L发酵生产得到0.1 g青霉酸,并且青霉酸的纯度在99.5%以上,较常规产青霉酸的微生物真菌相比,该真菌生产青霉酸的产量提高了100~200%,将其应用于青霉酸生产,可有效提高青霉酸的产量,提升青霉酸的生产效率。
Description
技术领域
本发明属于微生物开发利用技术领域,尤其涉及一种产群体效应抑制剂的真菌及其应用。
背景技术
青霉酸是一种无色针状结晶化合物,熔点83℃,分子式为C8H10O4,相对分子量为170.163,极易溶于热水、乙醇、乙醚和氯仿,但不溶于戊烷、己烷。青霉酸主要为青霉属菌株代谢产物的主要成分,且具有广泛的生物活性,同时它对各种动物具有毒性,主要引起心脏、肝脏和肾脏等器官的损伤,并广泛存在于动物饲料中。
目前,青霉酸的毒理学研究是寻找治疗动物青霉素中毒的有效方法,但研究必须要求浓度纯度高的化合物作为标准品,但是目前采用生物方法生产的青霉素存在产量和纯度偏低的问题,往往依赖于后续纯化工艺,容易出现青霉酸供应不足的情况,同时还大大提高了青霉酸的生产成本。因此,提供一种可以大量产生青霉酸的真菌,用于规模化生产,对青霉酸在农业生产中的开发、研究和应用具有重要意义。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种产群体效应抑制剂的真菌及其应用,旨在解决上述背景技术中提出的问题。
本发明实施例是这样实现的,一种产群体效应抑制剂的真菌,所述真菌为JW-13-1,其保藏编号为CGMCC No.41110。
本发明实施例的另一目的在于,一种产群体效应抑制剂的真菌的应用,将所述真菌应用于生产青霉酸中。
进一步的技术方案,所述应用包括以下步骤:
步骤1、将所述真菌接种至发酵培养基中,在25~30℃条件下摇床振荡发酵培养9天后,得到发酵产物;
步骤2、用乙酸乙酯浸泡所述发酵物,萃取提取青霉酸,分离得到的乙酸乙酯浸提液经减压蒸馏回收溶剂,得到青霉酸。
进一步的技术方案,在所述步骤1中,将所述真菌接种至发酵培养基前,对真菌进行扩大培养;扩大培养用培养基采用以水为溶剂的PDA培养基,扩大培养的温度优选为28℃,扩大培养的环境优选为生化培养箱,扩大培养的时间为3天。
进一步的技术方案,所述PDA培养基的配制方法为:200 g去皮土豆切丁后用水煮20分钟,纱布过滤得浸汁,于浸汁中添加20 g葡萄糖和18 g琼脂,并用蒸馏水定容至1 L,在121 ℃高温高压下蒸汽灭菌30 分钟。
进一步的技术方案,所述发酵培养基为每200 mL水中包含以下重量的组分:甘露醇4 g、葡萄糖4 g、蛋白胨2 g、KH2PO4 0.1 g、MgSO4·7H2O 0.06 g、酵母浸粉1 g、玉米浆0.2g、维生素溶液0.1 mL。
进一步的技术方案,所述发酵培养基盛装在500 mL的锥形瓶中。
进一步的技术方案,在所述步骤1中,发酵培养的温度优选为28 ℃,所述发酵培养的环境优选为生化培养箱,有利于维持恒定的温度。
进一步的技术方案,在所述步骤2中,所述浸泡的时间为10~14小时,更优选为12小时,有利于将发酵物中的青霉酸溶解于乙酸乙酯中;同时,浸泡温度为20~27 ℃,更优选为22~25 ℃。
进一步的技术方案,在所述步骤2中,所述减压蒸馏的压力为-0.1~0 MPa相对压力;减压蒸馏水浴温度优选为25 ℃。
进一步的技术方案,在所述步骤2中,回收溶剂得到的是青霉酸粗提液,还需对回收的粗提液进行提纯;所述提纯包括以下步骤:
a.将所述粗提液经减压ODS-C18反相柱分离,收集液相;
b.将液相经高压液相分离,得到青霉酸纯品。
进一步的技术方案,在所述步骤a中,减压ODS反相柱的固定相为ODS,流动相为甲醇-水混合溶剂,且甲醇-水混合溶剂中的甲醇和水的体积比为3:7。
进一步的技术方案,所述步骤b中,高压液相分离所用的流动相为体积浓度21%的甲醇水溶液。
本发明实施例提供的一种产群体效应抑制剂的真菌及其应用,所提供的真菌产青霉酸的产量为每1 L发酵生产得到0.1 g青霉酸,并且青霉酸的纯度在99.5%以上,较常规产青霉酸的微生物真菌相比,该真菌生产青霉酸的产量提高了100~200%,将其应用于青霉酸生产,可有效提高青霉酸的产量,提升青霉酸的生产效率。
附图说明
图1为真菌JW-13-1发酵粗提物HPLC指纹谱图;
图2为目标化合物的MS;
图3为目标化合物的 1H-NMR图;
图4为目标化合物的 13C-NMR图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
本发明一个实施例提供的一种产群体效应抑制剂的真菌,所述真菌为JW-13-1,其保藏编号为CGMCC No. 41110,于2024年03月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC),地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明另一个实施例提供的一种产群体效应抑制剂的真菌的应用,鉴于上述真菌具有青霉酸产量高且纯度高的特点,将上述真菌应用于生产青霉酸中。
所述应用包括以下步骤:
步骤1、将所述真菌接种至发酵培养基中,在25~30℃条件下摇床发酵培养9d后,得到发酵物;
步骤2、用乙酸乙酯浸泡所述发酵物,萃取提取青霉酸,分离得到的乙酸乙酯浸提液经减压蒸馏回收溶剂,得到青霉酸。
作为本发明的一种优选实施例,将所述真菌接种至发酵培养基前,将所述真菌进行扩大培养。扩大培养用培养基采用PDA培养基,扩大培养的温度优选为28℃,扩大培养的环境优选为生化培养箱,扩大培养的时间为3天。
在本发明实施例中,所述PDA培养基的配制方法为:200g去皮土豆切丁后用水煮20分钟,纱布过滤得浸汁,于浸汁中添加20g葡萄糖和18g琼脂,并用水定容至1L,在121℃高温高压下蒸汽灭菌30min。
作为本发明的一种优选实施例,所述发酵培养基为每200ml水中包含以下重量的组分:甘露醇4g、葡萄糖4g、蛋白胨2g、KH2PO4 0.1g、MgSO4·7H2O 0.06g、酵母浸粉1g、玉米浆0.2g、维生素溶液0.1mL。
在本发明实施例中,所述发酵培养基优选盛装在500ml的锥形瓶中。
作为本发明的一种优选实施例,在所述步骤1中,发酵培养的温度优选为28℃,所述发酵培养的环境优选为生化培养箱,有利于维持恒定的温度。
作为本发明的一种优选实施例,在所述步骤2中,所述浸泡的时间优选为10~14h,更优选为12h。所述浸泡有利于将发酵物中的青霉酸溶解于乙酸乙酯中。所述浸泡的温度优选为20~27℃,更优选为22~25℃。所述搅拌萃取有利于加强青霉酸充分溶解于乙酸乙酯中。
作为本发明的一种优选实施例,所述减压蒸馏的压力优选为-0.1~0MPa相对压力;减压蒸馏的水浴温度优选为20~25℃。对所述减压蒸馏的方法没有特殊限制,采用本领域技术所熟知的减压蒸馏的方法即可。
作为本发明的一种优选实施例,回收溶剂得到的是青霉酸粗提液,将所述青霉酸粗提液进行指纹谱图分析。具体分析的流动相的浓度如下:
0~5min体积浓度10%甲醇水溶液;
5~45min体积浓度10%~100%甲醇水溶液;
经指纹图谱分析,17.4分钟时出峰化合物为青霉酸。
在所述步骤2中,回收溶剂后还包括对回收的粗提液进行提纯;
所述提纯的方法包括以下步骤:
a.将所述粗提液经减压ODS-C18反相柱分离,收集液相;
b.将液相经高压液相分离,得到青霉酸纯品。
在本发明实施例中,所述步骤a中的减压ODS反相柱的固定相优选为ODS,减压ODS反相柱的流动相优选为甲醇-水混合溶剂;所述甲醇-水混合溶剂中,甲醇和水的体积比为3:7。
所述步骤b中,高压液相分离所用的流动相为体积浓度21%的甲醇水溶液。
为了明确提取物成分,收集高压液相分离15分钟时出峰的化合物分别进行核磁共振、高效液相制备谱图、氢谱和碳谱分析,结果发现,提取物为青霉酸。
实施例1:从吉安市井冈山地区岩壁上采集的泥炭藓,用于后续分离。将样品研磨后接种于PDA培养基上在28℃条件下进行分离培养,经形态鉴定,筛选得到的真菌为JW-13-1。
实施例2:将实施例1分离得到JW-13-1真菌接种至菌种培养基(PDA培养基)上培养,得到菌种。配制含如下成分的培养基作为发酵培养基,每250 mL的锥形瓶中添加:甘露醇4 g、葡萄糖4 g、蛋白胨2 g、KH2PO4 0.1 g、MgSO4·7H2O 0.06 g、酵母浸粉1 g、玉米浆0.2g,维生素溶液0.1 mL,200 mL水、经过高压灭菌,得到发酵培养基。将制备的0.5cm×0.5cm×0.5cm规格的琼脂块菌种接种三块至锥形瓶中,接种30个锥形瓶置于28℃恒温培养9天,得到发酵物。
将发酵液进行固液分离,收集菌液用乙酸乙酯萃取,得到的乙酸乙酯相经减压蒸馏回收溶剂(转蒸发仪:水浴温度为25℃,循环水式真空泵使装置为真空状态,真空表读数约为-0.1MPa相对压力),最后所得粗提物3.0 g。将粗提物进行指纹谱图分析,分析条件如下:
0~5分钟:体积浓度10%甲醇水溶液;5~45分钟:体积浓度100%甲醇水溶液;45~50分钟:纯甲醇。
粗提物的指纹谱图见图1,17.4分钟出峰化合物经检测为青霉酸。
实施例3:将实施例2制备的粗提物过ODS-C18反相柱,固定相为ODS,流动相为甲醇-甲醇水混合溶剂,甲醇和水的体积比为3:7,分离得到青霉酸,将得到的混合物经高效液相分离,得到精制提取物。21%甲醇水溶液作为流动相,在第24分钟出峰,收集峰组分进行核磁共振氢谱/碳谱、质谱分析。经核磁数据对比鉴定为青霉酸,青霉酸质谱见图2,氢谱谱图见图3,碳谱谱图见图4。
经紫外检测器检测,本发明提取得到的青霉酸纯品,纯度在99.5%以上。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种产群体效应抑制剂的真菌,其特征在于,所述真菌为JW-13-1,其保藏编号为CGMCC No.41110。
2.一种产群体效应抑制剂的真菌的应用,基于上述权利要求1所述的产群体效应抑制剂的真菌,其特征在于,将所述真菌应用于青霉酸生产中。
3.根据权利要求2所述的产群体效应抑制剂的真菌的应用,其特征在于,所述应用包括以下步骤:
步骤1、将所述真菌接种至发酵培养基中,在25~30 ℃条件下,摇床振荡发酵培养9天后,得到发酵产物;
步骤2、用乙酸乙酯萃取发酵上清液,减压蒸馏得到粗提物,利用色谱学手段分离纯化得到青霉酸单体。
4.根据权利要求3所述的产群体效应抑制剂的真菌的应用,其特征在于,在所述步骤1中,将所述真菌接种至发酵培养基前,对真菌进行扩大培养;扩大培养用培养基采用以水为溶剂的PDA培养基,扩大培养的温度为28 ℃,扩大培养的环境为生化培养箱,扩大培养的时间为3天。
5.根据权利要求3所述的产群体效应抑制剂的真菌的应用,其特征在于,所述发酵培养基为每200 mL水中包含以下重量的组分:甘露醇4 g、葡萄糖4 g、蛋白胨2 g、KH2PO4 0.1 g、MgSO4·7H2O 0.06 g、酵母浸粉1 g、玉米浆0.2 g、维生素溶液0.1 mL。
6.根据权利要求3所述的产群体效应抑制剂的真菌的应用,其特征在于,在所述步骤2中,浸泡的时间为10~14小时,浸泡温度为20~27 ℃。
7.根据权利要求3所述的产群体效应抑制剂的真菌的应用,其特征在于,在所述步骤2中,所述减压蒸馏的压力为-0.1~0 MPa;减压蒸馏水浴温度为25 ℃。
8.根据权利要求3所述的产群体效应抑制剂的真菌的应用,其特征在于,在所述步骤2中,得到含青霉酸的粗提物后,还需对粗提物进行分离纯化;所述分离纯化包括以下步骤:
步骤a.将所述粗提物经减压ODS-C18反相柱分离,收集馏分;
步骤b.将馏分经高效液相色谱分离,得到青霉酸纯品。
9.根据权利要求8所述的产群体效应抑制剂的真菌的应用,其特征在于,在所述步骤a中,流动相为甲醇/水混合溶剂,甲醇和水的体积比例为3:7。
10.根据权利要求8所述的产群体效应抑制剂的真菌的应用,其特征在于,在所述步骤b中,高效液相色谱分离流动相为21%的甲醇水溶液。
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