CN118146345A - Actc1突变体蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了ACTC1突变体蛋白及其应用。ACTC1突变体蛋白的氨基酸序列为人类野生型ACTC1的氨基酸序列的第308位的酪氨酸突变为组氨酸，所述人类野生型ACTC1的氨基酸序列的NCBI登录号为NP_005150。ACTC1基因突变体能够用于肥厚型心肌病患病风险筛查、肥厚型心肌病的非人类动物模型的构建，从而有利于探索基因突变导致的肥厚型心肌病的发病机制，对于发掘肥厚型心肌病可干预的治疗靶点以及药物具有重要意义。
Description
技术领域
本申请涉及生物医学技术领域，具体涉及ACTC1突变体蛋白及其应用。
背景技术
肥厚型心肌病（hypertrophic cardiomyopathy，HCM）是一种以左心室及室间隔不对称性肥厚为基本特征的原发性心肌病，可导致心力衰竭、恶性心律失常甚至心脏性猝死，多由编码肌小节结构蛋白的基因突变引起。因此，通过研究基因突变致HCM的潜在分子机制，对于HCM的早期预防和个体化治疗十分必要。
心肌肌动蛋白α1（ACTC1）基因作为肥厚型心肌病的常见致病基因之一，其所编码的心脏α肌动蛋白含377个氨基酸，是组成肌小节细肌丝的中心骨架蛋白。了解ACTC1基因突变致肥厚型心肌病的潜在机理，对于理解肥厚型心肌病的发生及发展有重要意义。
国内外对于ACTC1基因突变致肥厚型心肌病的研究尚显缺乏，并且建立有效的动物模型是深入探索基因突变致肥厚型心肌病发病机制的重要前提，对于进一步发掘肥厚型心肌病可干预的药物治疗靶点具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本申请提供了ACTC1突变体蛋白、编码ACTC1突变体蛋白的核苷酸序列、用于筛查肥厚型心肌病风险的试剂盒、检测ACTC1突变体蛋白或检测其核苷酸序列的试剂在制备用于筛查肥厚型心肌病风险的试剂盒中的应用、打靶载体、打靶载体在构建具有肥厚型心肌病的非人类动物模型或构建具有ACTC1基因突变的非人类动物模型中的应用、用于构建具有肥厚型心肌病的非人类动物模型或构建具有ACTC1基因突变的非人类动物模型的方法、具有肥厚型心肌病的非人类动物模型或具有ACTC1基因突变的非人类动物模型在筛选预防或治疗肥厚型心肌病的药物或制备评估治疗肥厚型心肌病效果的产品中的应用、筛查肥厚型心肌病风险的装置。
第一方面，本申请提供了一种ACTC1突变体蛋白，所述ACTC1突变体蛋白的氨基酸序列为人类野生型ACTC1的氨基酸序列的第308位的酪氨酸（Tyr，Y）突变为组氨酸（His，H），所述人类野生型ACTC1的氨基酸序列的NCBI登录号为NP_005150。也就是说，ACTC1突变体蛋白具有Y308H突变。
可以理解的，美国国家生物技术信息中心(National Center of BiotechnologyInformation，简称NCBI)网址为https://www.ncbi.nlm.nih.gov/。
第二方面，本申请提供了编码第一方面所述的ACTC1突变体蛋白的核苷酸序列。
可选的，所述核苷酸序列为人类野生型ACTC1的核苷酸序列的第922位的T突变为C，所述人类野生型ACTC1的核苷酸序列的NCBI登录号为NM_005159。
第三方面，本申请提供了一种用于筛查肥厚型心肌病风险的试剂盒，包括用于检测第一方面所述的ACTC1突变体蛋白或检测第二方面所述的核苷酸序列的试剂。
第四方面，本申请提供了检测第一方面所述的ACTC1突变体蛋白或检测第二方面所述的核苷酸序列的试剂在制备用于筛查肥厚型心肌病风险的试剂盒中的应用。
第五方面，本申请提供了一种打靶载体，包括编码目标非人类动物的ACTC1突变体蛋白的核苷酸序列或其片段，所述编码目标非人类动物的ACTC1突变体蛋白的核苷酸序列或其片段中与人类野生型ACTC1的核苷酸序列的第922位碱基对应的碱基突变为C，所述人类野生型ACTC1的核苷酸序列的NCBI登录号为NM_005159。
第六方面，本申请提供了如第五方面所述的打靶载体在构建具有肥厚型心肌病的非人类动物模型或构建具有ACTC1基因突变的非人类动物模型中的应用。
第七方面，本申请提供了一种用于构建具有肥厚型心肌病的非人类动物模型或构建具有ACTC1基因突变的非人类动物模型的方法，包括采用第六方面所述的打靶载体构建具有肥厚型心肌病的非人类动物模型或构建具有ACTC1基因突变的非人类动物模型；或采用基因编辑技术将非人类动物的ACTC1氨基酸序列中与人类野生型ACTC1氨基酸序列的第308位氨基酸对应的氨基酸突变为组氨酸，得到具有肥厚型心肌病的非人类动物模型或具有ACTC1基因突变的非人类动物模型，所述人类野生型ACTC1的氨基酸序列的NCBI登录号为NP_005150。
第八方面，本申请提供了如第七方面所述的方法制得的具有肥厚型心肌病的非人类动物模型或具有ACTC1基因突变的非人类动物模型在筛选预防或治疗肥厚型心肌病的药物或制备评估治疗肥厚型心肌病效果的产品中的应用。
第九方面，本申请提供了一种筛查肥厚型心肌病风险的装置，包括：
输入模块，用于接收输入的受试者的氨基酸序列和/或核苷酸序列；
处理模块，用于若确定出所述受试者的氨基酸序列与人类野生型ACTC1的氨基酸序列相比，第308位的酪氨酸突变为组氨酸，或者所述受试者的核苷酸序列与人类野生型ACTC1的核苷酸序列相比，第922位的T突变为C，生成第一处理结果，所述第一处理结果用于指示所述受试者具有肥厚型心肌病的风险，所述人类野生型ACTC1的氨基酸序列的NCBI登录号为NP_005150，所述人类野生型ACTC1的核苷酸序列的NCBI登录号为NM_005159；
输出模块，用于输出所述第一处理结果。
本申请提供了一种新的与肥厚型心肌病相关的ACTC1突变体蛋白Y308H，相应提供了对该ACTC1突变体蛋白的检测手段，使得能及时进行疾病筛查和治疗干预；还根据该ACTC1突变体，提供用于构建肥厚型心肌病非人类动物模型的打靶载体以及非人类动物模型构建方法，得到的肥厚型心肌病非人类动物模型能够在体模拟肥厚型心肌病的发病过程，更客观的反映ACTC1基因突变致肥厚型心肌病的病理特征，深入探索基因突变致肥厚型心肌病的发病机制，对于进一步发掘肥厚型心肌病可干预的治疗靶点和药物具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
图1为人、小鼠、牛、热带爪蟾、鸡、斑马鱼的ACTC1序列同源性比较结果。
图2为HCM家系先证者突变基因的鉴定结果。
图3为小鼠基因组鉴定结果。
图4为小鼠ACTC1蛋白表达水平的变化结果，其中图4中（a）为ACTC1蛋白表达检测结果，图4中（b）为ACTC1蛋白表达检测结果的统计图。
图5为小鼠心脏的纵切四腔心染色结果。
图6为小鼠心肌组织马松染色结果，其中图6中（a）为WT及KI小鼠心肌染色结果图，图6中（b）为纤维化面积占比统计结果。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请提供了一种ACTC1突变体蛋白，ACTC1突变体蛋白的氨基酸序列为人类野生型ACTC1的氨基酸序列的第308位的酪氨酸（Tyr，Y）突变为组氨酸（His，H），人类野生型ACTC1的氨基酸序列的NCBI登录号为NP_005150。也就是说，ACTC1突变体蛋白与人类野生型ACTC1相比，具有p.Y308H突变，该ACTC1突变体蛋白与肥厚型心肌病存在关联，对于肥厚型心肌病的发病机制、检测、干预治疗等具有重要意义。
可以理解的，“野生型”为本领域常用术语，野生型基因/氨基酸序列/核苷酸序列是指未发生基因突变的、原始的基因/氨基酸序列/核苷酸序列。
本申请提供了编码ACTC1突变体蛋白的核苷酸序列。编码该ACTC1突变体蛋白的核苷酸序列能够用于肥厚型心肌病的发病机制、检测、干预治疗中。
在本申请一实施方式中，编码ACTC1突变体蛋白的核苷酸序列为人类野生型ACTC1的核苷酸序列的第922位的T突变为C，人类野生型ACTC1的核苷酸序列的NCBI登录号为NM_005159。也就是说，ACTC1突变体蛋白与人类野生型ACTC1相比，具有c.922T>C突变。其中，人类野生型ACTC1的核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。NM_005159中所示的核苷酸序列包括了非编码区以及编码区的核苷酸信息，本领域技术人员可以理解的，人类野生型ACTC1的核苷酸序列是指编码区的核苷酸序列，如SEQ ID NO .1所示，SEQ ID NO .1所示的核苷酸序列中第922位为T。
本申请对核苷酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与ACTC1突变体蛋白的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。核苷酸可以包括互补双链的任意一条或者两条，当公开一条链时实际上也公开了与之互补的另一条链。本领域技术人员可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。
本申请提供了一种用于筛查肥厚型心肌病风险的试剂盒，包括用于检测上述任一实施方式中的ACTC1突变体蛋白或检测上述任一实施方式中的核苷酸序列的试剂。也就是说，该试剂盒中的试剂可以检测生物样品中的ACTC1序列是否具有p.Y308H突变或c.922T>C突变；例如，试剂盒中含有适于检测ACTC1序列p.Y308H突变体的试剂。通过该试剂盒可以筛查具有或怀疑具有肥厚型心肌病风险的受试者。
可以理解的，受试者可以人或非人类动物。生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品是否存在突变的核酸样本即可。例如，生物样品可以为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种，如外周血等。由此，可以方便地进行取样和检测，从而能够进一步提高筛选易患肥厚型心肌病的生物样品的效率。核酸样本可以是任何能够反映生物样品中是否存在突变的样本，例如可以是从生物样品中直接提取的全基因组DNA，也可以是该全基因组中包含致病基因编码序列的一部分，可以是从生物样品中提取的总RNA，也可以是从生物样品中提取的mRNA。
在本申请一实施方式中，试剂可以是基于核酸检测技术检测编码基因的试剂。具体的，试剂可以但不限于选自核酸测序中涉及的DNA聚合酶、引物、探针、报告标记（比如荧光标记）等。
在本申请一实施方式中，试剂可以是基于蛋白检测技术检测目标蛋白的试剂。具体的，试剂可以但不限于选自特异性抗体等。
本申请提供了检测上述任一实施方式中的ACTC1突变体蛋白或检测上述任一实施方式中的核苷酸序列的试剂在制备用于筛查肥厚型心肌病风险的试剂盒中的应用。
本申请提供了一种筛查肥厚型心肌病风险的方法，包括获取生物样品，检测生物样本中ACTC1序列是否具有p.Y308H突变或c.922T>C突变。若生物样本中ACTC1序列具有p.Y308H突变或c.922T>C突变，则确认具有肥厚型心肌病的风险。
在本申请一实施方式中，可以基于核酸检测技术或基于蛋白检测技术检测生物样本中ACTC1序列是否具有p.Y308H突变或c.922T>C突变。
本申请提供了一种治疗肥厚型心肌病的方法，包括获取生物样品，检测生物样本中ACTC1序列具有p.Y308H突变或c.922T>C突变，对其施用治疗剂。其中，当生物样本中ACTC1序列具有p.Y308H突变或c.922T>C突变时，确认具有肥厚型心肌病的风险，可以使用治疗剂进行治疗；还可以在通过其他检测手段，如受试者生理指征等，判断给予受试者何种治疗剂。
在本申请一实施方式中，治疗剂选自抗肥厚型心肌病药物。在本申请一实施例中，治疗剂可以为β受体阻滞剂；例如普萘洛尔、美托洛尔等。在本申请另一实施例中，治疗剂可以为非二氢吡啶类钙离子通道阻滞剂；例如维拉帕米、地尔硫䓬等。
本申请提供了一种非人类动物的ACTC1突变体蛋白，非人类动物的ACTC1突变体蛋白的氨基酸序列中与人类野生型ACTC1的氨基酸序列的第308位氨基酸对应的氨基酸突变为组氨酸，人类野生型ACTC1的氨基酸序列的NCBI登录号为NP_005150。本申请提供了一种编码非人类动物的ACTC1突变体蛋白的核苷酸序列或其片段，编码非人类动物的ACTC1突变体蛋白的核苷酸序列或其片段中与人类野生型ACTC1的核苷酸序列的第922位碱基对应的碱基突变为C，人类野生型ACTC1的核苷酸序列的NCBI登录号为NM_005159。该非人类动物的ACTC1突变体蛋白或编码的核苷酸序列可以用于非人类动物突变模型的构建中，有利于肥厚型心肌病的研究。
可以理解的，通过将非人类动物的ACTC1的氨基酸或核苷酸序列与人类野生型ACTC1的ACTC1的氨基酸或核苷酸序列进行比对，根据比对结果即可得到与人类野生型ACTC1的氨基酸序列的第308位氨基酸对应的氨基酸位点、与人类野生型ACTC1的核苷酸序列的第922位碱基对应的碱基位点。
本申请提供了一种打靶载体，包括编码目标非人类动物的ACTC1突变体蛋白的核苷酸序列或其片段，编码目标非人类动物的ACTC1突变体蛋白的核苷酸序列或其片段中与人类野生型ACTC1的核苷酸序列的第922位碱基对应的碱基突变为C，所述人类野生型ACTC1的核苷酸序列的NCBI登录号为NM_005159。也就是说，打靶载体中包括了编码ACTC1突变体蛋白的核苷酸序列，或者打靶载体中包括了编码ACTC1突变体蛋白的核苷酸序列片段，可以用于替换目标非人类动物基因组中对应的内源性基因序列，使得目标非人类动物的ACTC1序列中对应人ACTC1序列的第308位氨基酸的氨基酸突变为组氨酸或对应人ACTC1序列的第922位碱基突变为C，有利于构建肥厚型心肌病动物模型，进而有助于肥厚型心肌病的研究。
在本申请一实施方式中，打靶载体还包含目标非人类动物基因靶位点上下游的同源序列和载体的本身成分。在本申请一实施例中，打靶载体还包含正负选择标记，有利于后续筛选。在本申请一实施方式中，打靶载体可以包括质粒载体。
可以理解的，不同动物的相应组织氨基酸序列具有高度同源性，可以将人体中发现的ACTC1序列位点结合至不同动物的ACTC1序列中，不同动物的ACTC1序列中对应人ACTC1序列突变位点的位点进行突变从而构建打靶载体以及构建相应的突变体非人类动物模型，从而进行医学研究。
发明人利用NCBI数据库比较了人、小鼠、牛、热带爪蟾、鸡、斑马鱼各个物种的ACTC1序列同源性，它们在人ACTC1序列的Y308附近序列一致，如图1所示，构建它们的Y308H突变动物模型也同样具有研究意义。例如，小鼠ACTC1序列的NCBI登录号分别为NM_009608，通过序列比对发现，小鼠中ACTC1蛋白序列的第308位氨基酸（酪氨酸）对应人ACTC1蛋白序列中第308位氨基酸（酪氨酸），通过基因编辑技术将小鼠ACTC1蛋白序列的第308位氨基酸突变为组氨酸，能够获得具有肥厚型心肌病的小鼠动物模型。
本申请提供了上述任一实施方式中的打靶载体在构建具有肥厚型心肌病的非人类动物模型或构建具有ACTC1基因突变的非人类动物模型中的应用。
本申请提供了一种用于构建具有肥厚型心肌病的非人类动物模型或构建具有ACTC1基因突变的非人类动物模型的方法，包括采用上述任一实施方式中打靶载体构建具有肥厚型心肌病的非人类动物模型或构建具有ACTC1基因突变的非人类动物模型；或采用基因编辑技术将非人类动物的ACTC1氨基酸序列中与人类野生型ACTC1氨基酸序列的第308位氨基酸对应的氨基酸突变为组氨酸，得到具有肥厚型心肌病的非人类动物模型或具有ACTC1基因突变的非人类动物模型，所述人类野生型ACTC1的氨基酸序列的NCBI登录号为NP_005150。通过上述打靶载体或基因编辑技术使非人类动物的ACTC1序列对应人类野生型ACTC1序列的308位氨基酸的氨基酸突变为组氨酸，从而获得具有肥厚型心肌病的非人类动物模型、具有ACTC1序列突变的非人类动物模型，有利于肥厚型心肌病的医学研究。
在本申请一实施方式中，采用基因编辑技术将非人类动物的ACTC1核苷酸序列中与人类野生型ACTC1氨基酸序列的第922位碱基对应的碱基突变为C，从而使非人类动物的ACTC1氨基酸序列中与人类野生型ACTC1氨基酸序列的第308位氨基酸对应的氨基酸突变为组氨酸。
在本申请一实施方式中，基因编辑技术选自基于同源重组的基因打靶技术、锌指核酸酶技术、转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）技术、CRISPR/Cas9技术中的至少一种。采用上述基因编辑技术能够获得具有ACTC1 p.Y308H对应突变的非人类动物模型。在本申请一实施例中，利用同源重组的方法构建具有肥厚型心肌病的非人类动物模型的方法包括：通过Infusion无缝克隆（In-Fusion）的方法构建小鼠胚胎干细胞（ES细胞）打靶载体，该载体经线性化后，电转转染C57小鼠和129小鼠的ES细胞；经遗传霉素（G418）和丙氧鸟苷（Ganc）药物筛选后获得正确同源重组的阳性克隆；阳性ES细胞克隆经扩增后，注射入C57BL/6J小鼠的囊胚中，获得嵌合鼠；高比例嵌合小鼠与表达翻转重组酶（FLP）转基因小鼠（Flp小鼠）交配获得阳性F1代小鼠。
在本申请一实施方式中，非人类动物或非人类动物模型可以为哺乳动物，例如小鼠、大鼠、牛、热带爪蟾、鸡、兔、犬、黑猩猩、斑马鱼中的至少一种。
本申请提供了一种具有肥厚型心肌病的非人类动物模型或具有ACTC1基因突变的非人类动物模型，其中该具有肥厚型心肌病的非人类动物模型或具有ACTC1基因突变的非人类动物模型中与人ACTC1氨基酸序列（NP_005150）第308位对应的氨基酸为组氨酸。根据心肌病国际指南，成人心肌肥厚的定义是任何心肌节段的室壁厚度在15mm以上；在本申请中，非人类动物模型出现以下情况认为具有肥厚型心肌病：心脏/体重比较同窝野生型对照增加、心脏超声提示舒张期左室前壁厚度增加、马松（Masson）染色提示心肌纤维化增加、和/或分子生物学实验提示心肌肥厚标记物ANP、BNP、MYH7表达增加。
本申请提供了上述任一实施方式中的方法制得的具有肥厚型心肌病的非人类动物模型或具有ACTC1基因突变的非人类动物模型在筛选预防或治疗肥厚型心肌病的药物或制备评估治疗肥厚型心肌病效果的产品中的应用。也就是说，具有肥厚型心肌病的非人类动物模型或具有ACTC1基因突变的非人类动物模型在筛选预防或治疗肥厚型心肌病的药物中的应用，或者具有肥厚型心肌病的非人类动物模型或具有ACTC1基因突变的非人类动物模型在制备评估治疗肥厚型心肌病效果的产品中的应用。其中，产品可以但不限于为药物。
本申请提供了一种筛查肥厚型心肌病风险的装置，包括：
输入模块，用于接收输入的受试者的氨基酸序列和/或核苷酸序列；
处理模块，用于若确定出受试者的氨基酸序列与人类野生型ACTC1的氨基酸序列相比，第308位的酪氨酸突变为组氨酸，或者受试者的核苷酸序列与人类野生型ACTC1的核苷酸序列相比，第922位的T突变为C，生成第一处理结果，第一处理结果用于指示受试者具有肥厚型心肌病的风险，人类野生型ACTC1的氨基酸序列的NCBI登录号为NP_005150，人类野生型ACTC1的核苷酸序列的NCBI登录号为NM_005159；
输出模块，用于输出第一处理结果。
在本申请一实施方式中，装置还包括预存模块，预存模块用于存储人类野生型ACTC1的氨基酸序列和/或人类野生型ACTC1的核苷酸序列，人类野生型ACTC1的氨基酸序列的NCBI登录号为NP_005150，人类野生型ACTC1的核苷酸序列的NCBI登录号为NM_005159。可以理解的，当预存模块存储人类野生型ACTC1的氨基酸序列时，输入模块接收输入的受试者的氨基酸序列；当预存模块存储人类野生型ACTC1的核苷酸序列时，输入模块接收输入的受试者的核苷酸序列；当预存模块存储人类野生型ACTC1的氨基酸序列和人类野生型ACTC1的核苷酸序列，输入模块接收输入的受试者的氨基酸序列和/或核苷酸序列。
在本申请一实施方式中，输入模块还用于接收输入的人类野生型ACTC1的氨基酸序列和/或人类野生型ACTC1的核苷酸序列，人类野生型ACTC1的氨基酸序列的NCBI登录号为NP_005150，人类野生型ACTC1的核苷酸序列的NCBI登录号为NM_005159。可以理解的，当输入模块接收输入的人类野生型ACTC1的氨基酸序列时，输入模块则接收输入的受试者的氨基酸序列；当输入模块接收输入的人类野生型ACTC1的核苷酸序列时，输入模块则接收输入的受试者的核苷酸序列；当输入模块接收输入的人类野生型ACTC1的氨基酸序列和人类野生型ACTC1的核苷酸序列，输入模块则接收输入的受试者的氨基酸序列和/或核苷酸序列。
在本申请中，处理模块可以将受试者的氨基酸序列与人类野生型ACTC1的氨基酸序列比对，或者将受试者的核苷酸序列与人类野生型ACTC1的核苷酸序列比对，从而确定出第308位氨基酸或者第922位碱基是否发生突变以及发生何种突变，并生成处理结果。
在本申请一实施方式中，处理模块还用于若确定出受试者的氨基酸序列与人类野生型ACTC1的氨基酸序列相比第308位氨基酸相同，或受试者的核苷酸序列与人类野生型ACTC1的核苷酸序列相比第922位碱基相同，生成第二处理结果，第二处理结果用于指示受试者不具有肥厚型心肌病的风险；输出模块还用于输出第二处理结果。
以下通过具体示例对本申请技术方案的效果做进一步说明。
实施例中采用的设备和材料均为可商购的，以下列举了部分设备和试剂的来源，其中表1为所需设备及其来源：
表1 所需设备
所需主要试剂及其来源包括：
（1）甲醇（汕头市西陇科学有限公司，中国）；
（2）聚偏二氟乙烯膜（密理博Milipore，美国）；
（3）过硫酸铵（天津市大茂化学试剂厂，中国）；
（4）磷酸盐缓冲液（北京市中山金桥有限公司，中国）；
（5）异氟烷（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，中国）；
（6）封闭专用脱脂奶粉、蛋白免疫印迹膜再生液（北京市普利莱有限公司，中国）;
（7）放射免疫沉淀法（RIPA）细胞裂解液（强）、蛋白质上样缓冲液、BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海市碧云天有限公司，中国）；
（8）蛋白酶/磷酸酶抑制剂、凝胶标准Marker、荧光显色试剂盒（Thermo FisherScientific，美国）；
（9）四甲基乙二胺、苯甲基磺酰氟、三羟甲基氨基甲烷（Tris-base）粉末、十二烷基硫酸钠（SDS）粉末、吐温-20（Tween-20）、甘氨酸（北京市索莱宝有限公司，中国）；
（10）血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒、RNA样品总RNA提取试剂盒（北京市天根生化科技有限公司）；
（11）细胞核萃取试剂（Nuclear Extraction Reagent，NER）（Thermo FisherScientific，美国）；
（12）一抗抗体ACTC1（66125-1-Ig，蛋白技术Proteintech，美国）；
（13）一抗抗体甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（60004-1-Ig，Proteintech，美国）；
（14）鼠/兔二抗（北京市中山金桥有限公司，中国）。
发明人对有猝死家族史的肥厚型心肌病家系进行外周血样品DNA高通量测序，发现了其中ACTC1序列发生了Y308H突变，明确了该突变与肥厚型心肌病发病的关联。对于疾病筛查，发现关联基因点突变是关键，发明人提供了ACTC1序列p.Y308H突变与肥厚型心肌病疾病关联信息，本领域技术人员根据该信息再结合本领域常规技术手段，能够在核酸检测技术和多肽检测技术方面开发相应的诊断试剂、诊断方法和系统，对此不再赘述。基于该突变体的发现，也可以构建相应的疾病动物模型从而方便进行医学研究，下文将详细讲述ACTC1序列p.Y308H突变与肥厚型心肌病疾病关联信息发现过程，以及构建疾病动物模型的过程。
实施例1 临床肥厚型心肌病家系患者突变基因的筛查
查询肥厚型心肌病患者既往临床资料和辅助检查结果，完善患者临床信息采集，包括：基本信息、一般情况、现病史、既往史、家族史及心脏结构改变情况等。患者获取充分知情权，告知操作目的并取得同意，签署知情同意书，在南昌大学第二附属医院抽血处采集该患者外周静脉血5 mL。
本发明纳入的是一个有猝死家族史的肥厚型心肌病家系。先证者超声心动图显示心肌肥厚，有数位家系成员发生猝死。根据临床表现、辅助检查及家族史，初步判断该家系为肥厚型心肌病家系。
对先证者外周静脉血提取DNA进行高通量测序，将高通量测序结果在人类基因突变数据库(The Human Gene Mutation Database，HGMD)中进行序列比对，并对在线人类孟德尔遗传(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)数据库中所有明确致病关系的基因进行逐个分析，结合GeneCards数据库分析基因的功能，确定候选突变基因为ACTC1。对家系成员基因组DNA中ACTC1序列突变区域进行聚合酶链式反应（PCR）扩增，通过Sanger法测序验证突变位点。筛选和验证突变的基因位点，发现ACTC1 p.Y308H突变为首次发现的基因突变。其中，图2为HCM家系先证者突变基因的鉴定结果，其中为反向测序结果，即图2中显示的是原始的A变为了G，即ACTC1正向序列中的第922位的T突变为C，形成p.Y308H突变。由于之前没有该突变的相关报道，于是本研究根据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)指南中致病变异分级标准对变异进行分级，依据ACMG遗传变异分类联合标准规则对致病性进行判定，结果提示该变异为可能致病变异。
实施例2 构建ACTC1序列Y308H突变动物模型
利用同源重组修复的方式，采用ES细胞打靶方式引入目的点突变。过程如下：通过In-Fusion的方法构建小鼠ES细胞打靶载体，该载体经线性化后，电转转染C57小鼠和129小鼠的ES细胞；经G418和Ganc药物筛选后获得正确同源重组的阳性克隆；阳性ES细胞克隆经扩增后，注射入C57BL/6J小鼠的囊胚中，获得嵌合鼠；高比例嵌合小鼠与Flp小鼠交配获得阳性F1代小鼠。
实施例3 小鼠DNA的提取与鉴定
3.1 小鼠鼠尾基因组DNA的提取
（1）剪取小鼠尾部尖端（长度<0.3 cm），放置于1.5 mL的无核酶离心管中，利用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒进行后续提取；
（2）加入200 µL缓冲液GA及20 µL蛋白酶K（Proteinase K）溶液，将溶液彻底混匀并确保溶液浸没鼠尾；
（3）将离心管在56℃恒温水浴箱中放置，将鼠尾消化过夜；
（4）在离心管中加入200 µL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10 min，此时溶液可变为清亮，短暂离心以将管内壁水珠去除；
（5）加入200 µL无水乙醇，充分振荡混匀15 s，可出现絮状沉淀，简短离心以去除内壁水珠；
（6）将所得溶液和絮状沉淀一起加入吸附柱CB3中（吸附柱置于收集管内），12000rpm离心30 s，倒除废液，将吸附柱CB3放回收集管中；
（7）向吸附柱CB3中加入500 µL缓冲液GD，12000 rpm离心30 s，倒去废液，将吸附柱放回收集管中；
（8）向吸附柱CB3中加入600 µL漂洗液PW，12000 rpm离心30 s，倒去废液，将吸附柱CB3重新放回收集管内；
（9）重复操作第8步；
（10）12000 rpm离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置10分钟，彻底晾干残留漂洗液PW；
（11）将吸附柱CB3转入干净离心管中，向中央部位滴加80 µL洗脱缓冲液TE，室温放置5 min，12000 rpm离心2 min，将所得液体收集至离心管中；上述采用的试剂均为试剂盒中的试剂。
3.2 小鼠ACTC1基因型鉴定
在后续小鼠交配繁殖过程中，可通过短片段PCR的方式对小鼠ACTC1基因型进行鉴定，将鼠尾DNA进行PCR扩增，并对获得产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据PCR产物的有无和片段大小的不同从而对基因型进行判断，若出现两条条带则认为发生了突变，若出现一条条带则认为未发生突变。结果如图3所示，可以看出KI小鼠PCR产物有两条条带，而WT小鼠PCR产物仅有一条条带。后续小鼠繁育各步骤中，小鼠基因型鉴定所需引物及条件，如下所示。
（1）引物设计：
使用DNA STAR软件中的Primer Select程序进行PCR扩增及测序引物设计，确保5’端和3’端引物之间及自身无互补结构和发卡结构，同时使测序能够覆盖突变位点区域，其中前向引物序列如SEQ ID NO .2所示，反向引物序列如SEQ ID NO .3所示。
（2）PCR反应体系配置如表2所示，所用试剂均为试剂盒中试剂：
表2 PCR反应体系
实施例4 模型小鼠突变基因表达变化测定
使用免疫印迹（Western blot）技术检测野生型（WT）小鼠和突变小鼠（KI）心肌中ACTC1蛋白的表达情况。
4.1 组织总蛋白提取
（1）按照比例配制RIPA裂解液（含有1%苯甲基磺酰氟及各10%预先配制好的蛋白酶及磷酸酶抑制剂）；
（2）将肝素化小鼠（按照体重5 IU/g腹腔注射肝素钠溶液）用异氟烷气体麻醉，仰卧固定于工作台上；
（3）迅速打开胸腔获取小鼠心脏，将获取组织置于事先预冷的PBS（磷酸盐）溶液中，灌注冲洗心脏内残留血液；
（4）取50 mg组织，用吸水纸吸干水分，放入预冷的1.5mL离心管中，各加入500 µLRIPA裂解液；
（5）将组织剪切成细小的碎片，并用匀浆机匀浆，直至充分裂解；
（6）预冷低温冷冻高速离心机至4℃，将离心管置于离心机中配平，设定12000 rpm离心15 min，待离心结束后小心取出离心管（避免振荡沉淀），将上清充分分离并加入预冷离心管，置于-80℃冰箱冷冻备用。
4.2 蛋白免疫印迹
（1）将准备好制胶垫及胶架放置于水平台面，把厚、薄玻璃板清洗洁净并充分干燥，将玻璃板紧密固定装配，按照说明书上配制表制作合适量的浓缩胶和分离胶；
（2）将上一步骤配制好的分离胶混匀后迅速灌注入固定好的厚、薄玻璃板间，并在上方预留2.5 cm空间留待浓缩胶灌注，此时将无水乙醇轻柔的加入分离胶上方，去除气泡进行封胶，静置至少30 min，待胶充分凝固后，倒弃无水乙醇并使用滤纸吸去残余无水乙醇，待充分去除后进行下一步骤；
（3）将配置好的浓缩胶充分混匀后迅速且均匀地灌入凝固的分离胶上方，去除漂浮气泡，并小心插入分齿梳，静置至少30 min，待胶充分凝固后进行下一步骤；
（4）去除附着于玻璃板上未凝固的凝胶，将玻璃板稳定固定于电泳槽内并加入预先配制好的电泳液，直至电泳液完全覆盖并没过凝胶，轻柔且垂直地拔出分齿梳，用200 µL微量移液器吸头仔细吹去加样孔内的杂质及气泡；
（5）使用10 µL微量移液器将处理后的蛋白样品（加入样品1/4体积的5×上样缓冲液（Loading Buffer），并于沸水浴中处理10 min）加入设计好的上样孔内，上样量为20 µL-40 µL（根据蛋白浓度决定），并于样品孔的两侧加入适量的分子量标准（Marker）（可根据分离胶浓度决定）；
（6）上样完成后，盖好盖子并将起始电泳电压设置为80V，根据情况在后续适当增加电压。最终根据所需目的蛋白的分子量决定电泳终止时间，电泳完成之后将凝胶小心取出，倒弃电泳液，将电泳槽洗净备用；
（7）将凝胶板取出后用ddH2O小心冲洗，去除残余电泳液，使用翘板在边缘处小心分离厚、薄玻璃板，并根据所需分子量大小适当裁切凝胶，随后将剩余凝胶剥离玻璃板并轻柔转移至浸泡在转膜液中的滤纸上，平衡5 min；
（8）裁剪合适大小的聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene fluoride，PVDF）膜并置于甲醇中预激活，将PVDF膜轻柔均匀地覆盖于凝胶上，排尽凝胶及膜之间的气泡，从上至下按照海绵垫、滤纸、膜、凝胶、滤纸、海绵垫的顺序摆放，同时用转膜夹固定，按正负极方向正确置于转膜槽中，倒入预先配好的1×SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）转膜液直至完全覆盖转膜夹，同时放置冰袋降温，将转膜槽放置于4℃层析冷柜中，将恒定电流设定为300 A进行转膜（可根据需求调整恒定电流数值），依据所需要分子量大小设定转膜时间；
（9）待转膜完成后关闭电源，丢弃凝胶，小心夹取出PVDF膜，置于1×TBST溶液（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐+吐温溶液）中轻柔漂洗5min，洗去多余转膜液；
（10）将上一步骤漂洗完成的PVDF膜加入预配制的封闭用5%脱脂牛奶中，室温下封闭至少1h（封闭时可置于水平摇床上轻柔晃动，使膜与牛奶充分接触）；
（11）待封闭完成后轻柔取出PVDF膜，置于1×TBST中漂洗去除残留的脱脂牛奶；
（12）将PVDF膜根据实验需求分子量大小进行裁剪，用塑封膜封闭裁剪后的PVDF膜，加入事先配制的一抗稀释液（按照说明书配制合适浓度抗体稀释液），赶尽气泡后迅速封口，放置于4℃层析冷柜内孵育过夜（至少需12h以上）；
（13）于次日孵育结束后，将一抗稀释液回收放置于4℃层析冷柜中存储，将膜浸泡在1×TBST缓冲液中，放在水平摇床上于室温下漂洗3次（10min/次）；
（14）配制对应抗性的二抗稀释液（稀释比例为1:4000至1:8000），用塑封膜封闭洗涤好的PVDF膜，加入适量的二抗稀释液后迅速封口，放置于水平摇床上轻柔晃动，室温孵育至少1h，待孵育完成后，取出PVDF膜并浸泡于1×TBST中，置于水平摇床在室温下漂洗3次（10min/次）；
（15）待洗膜完成后，配制适量的显色试剂（发光试剂A和B按1:1比例混匀，现配现用），并将配制好的显色试剂用移液器轻柔且均匀地吹打覆盖PVDF膜表面，将与显色试剂充分反应的PVDF膜使用凝胶成像仪器进行曝光，设置适宜的曝光参数后进行图像采集；
（16）图像采集完成后，使用ImageLab 4.0.1软件分析条带数据并保存留待统计分析。
结果如图4所示，图4为小鼠ACTC1蛋白表达水平的变化结果，其中图4中（a）为ACTC1蛋白表达检测结果，图4中（b）为ACTC1蛋白表达检测结果的统计图，可以看出WT及KI小鼠心脏组织ACTC1蛋白表达无明显差异。
实施例5 模型小鼠超声心动图检测
选取9周龄，生长发育相似的WT（n=11）和KI（n=11）小鼠，利用吸入性麻醉异氟醚迅速麻醉。使用小动物超声设备获取实验小鼠的二维超声心动图数据。二维超声心动图数据显示，WT与KI两组小鼠在心脏结构和心功能方面均未见明显差异，两组数据都处于正常值内。结果如下表3所示：
表3 二维超声心动图数据
实施例6 切片染色
6.1 小鼠心肌组织苏木精-伊红（HE）染色
（1）取新鲜的小鼠心肌组织；
（2）制作石蜡切片；
（3）将石蜡切片放入二甲苯溶液中脱蜡，然后放入不同浓度梯度的乙醇中脱水，依次为：二甲苯(I)浸泡20min→二甲苯(II)浸泡20min→100%乙醇浸泡5min→95%乙醇浸泡5min→75%乙醇浸泡5min→双蒸水浸洗5min；
（4）将石蜡切片放入苏木素染液着色5min，双蒸水洗，酸水和氨水分化十几秒，40-50℃左右温水中浸泡5min-10min，流动水冲洗；
（5）将石蜡切片依次放入不同浓度梯度的乙醇中脱水：95%乙醇浸泡5min→95%乙醇浸泡5min→100%乙醇浸泡5min→二甲苯(I)浸泡5min→二甲苯(II)浸泡5min透明→盖上盖玻片，中性树胶封片；
（6）等到树脂干燥后，分别在100和400倍下随机选取3个视野进行图像采集（细胞核呈蓝色，细胞质呈红色）。
6.2 马松染色
（1）取新鲜的小鼠心肌组织，用4%多聚甲醛溶液固定；
（2）制作石蜡切片；
（3）将石蜡切片放入二甲苯溶液中脱蜡，然后放入不同浓度梯度的乙醇中脱水，依次为：二甲苯(I)浸泡20min→二甲苯(II)浸泡20min→100%乙醇浸泡5min→95%乙醇浸泡5min→75%乙醇浸泡5min→双蒸水浸洗5min；
（4）甲醛固定的心脏组织切片需要经过铬化处理或去汞盐沉淀，将切片放入重铬酸钾溶液浸泡过夜，然后用双蒸水冲洗干净；
（5）配制铁苏木素染液（铁苏木素A液与B液等比例混合）→将切片放入铁苏木素染色3min，双蒸水冲洗→分化液分化，双蒸水冲洗；
（6）将切片放入丽春红酸性品红染色5min-10min，双蒸水漂洗数次；
（7）使用1%磷钼酸水溶液浸染切片1min-3min，磷钼酸水溶液浸染结束后不需流水冲洗，可以马上用苯胺蓝染液染切片3min-6min；
（8）将切片用1%冰醋酸分化，不同浓度梯度的乙醇溶液脱水，二甲苯透明，最后盖上盖玻片，中性树胶封片，干燥24h；
（9）等到树脂干燥后，分别在100和400倍下随机选取3个视野进行图像采集（细胞核呈蓝色，细胞质呈红色）。
结果如图5和图6所示，图5为小鼠心脏的纵切四腔心染色结果，可以看出KI小鼠心室肌较WT小鼠肥厚；图6为小鼠心肌组织马松染色结果，图6中（a）为WT及KI小鼠心肌染色结果图，图6中（b）为纤维化面积占比统计结果，可以看出KI小鼠心肌纤维化面积占比较WT小鼠增加。
以上所述是本申请的优选实施方式，但并不能因此而理解为对本申请范围的限制。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本申请的保护范围。
Claims (10)
1.一种ACTC1突变体蛋白，其特征在于，所述ACTC1突变体蛋白的氨基酸序列为人类野生型ACTC1的氨基酸序列的第308位的酪氨酸突变为组氨酸，所述人类野生型ACTC1的氨基酸序列的NCBI登录号为NP_005150。
2.编码权利要求1所述的ACTC1突变体蛋白的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列为人类野生型ACTC1的核苷酸序列的第922位的T突变为C，所述人类野生型ACTC1的核苷酸序列的NCBI登录号为NM_005159。
4.一种用于筛查肥厚型心肌病风险的试剂盒，其特征在于，包括用于检测权利要求1所述的ACTC1突变体蛋白或检测权利要求2-3任一项所述的核苷酸序列的试剂。
5.检测权利要求1所述的ACTC1突变体蛋白或检测权利要求2-3任一项所述的核苷酸序列的试剂在制备用于筛查肥厚型心肌病风险的试剂盒中的应用。
6.一种打靶载体，其特征在于，包括编码目标非人类动物的ACTC1突变体蛋白的核苷酸序列或其片段，所述编码目标非人类动物的ACTC1突变体蛋白的核苷酸序列或其片段中与人类野生型ACTC1的核苷酸序列的第922位碱基对应的碱基突变为C，所述人类野生型ACTC1的核苷酸序列的NCBI登录号为NM_005159。
7.如权利要求6所述的打靶载体在构建具有肥厚型心肌病的非人类动物模型或构建具有ACTC1基因突变的非人类动物模型中的应用。
8.一种用于构建具有肥厚型心肌病的非人类动物模型或构建具有ACTC1基因突变的非人类动物模型的方法，其特征在于，包括采用权利要求6所述的打靶载体构建具有肥厚型心肌病的非人类动物模型或构建具有ACTC1基因突变的非人类动物模型；或采用基因编辑技术将非人类动物的ACTC1氨基酸序列中与人类野生型ACTC1氨基酸序列的第308位氨基酸对应的氨基酸突变为组氨酸，得到具有肥厚型心肌病的非人类动物模型或具有ACTC1基因突变的非人类动物模型，所述人类野生型ACTC1的氨基酸序列的NCBI登录号为NP_005150。
9.如权利要求8所述的方法制得的具有肥厚型心肌病的非人类动物模型或具有ACTC1基因突变的非人类动物模型在筛选预防或治疗肥厚型心肌病的药物或制备评估治疗肥厚型心肌病效果的产品中的应用。
10.一种筛查肥厚型心肌病风险的装置，其特征在于，包括：
输入模块，用于接收输入的受试者的氨基酸序列和/或核苷酸序列；
处理模块，用于若确定出所述受试者的氨基酸序列与人类野生型ACTC1的氨基酸序列相比，第308位的酪氨酸突变为组氨酸，或者所述受试者的核苷酸序列与人类野生型ACTC1的核苷酸序列相比，第922位的T突变为C，生成第一处理结果，所述第一处理结果用于指示所述受试者具有肥厚型心肌病的风险，所述人类野生型ACTC1的氨基酸序列的NCBI登录号为NP_005150，所述人类野生型ACTC1的核苷酸序列的NCBI登录号为NM_005159；
输出模块，用于输出所述第一处理结果。
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Citations (3)
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110098196A1 (en) * | 2008-03-25 | 2011-04-28 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Multiplex Screening for Pathogenic Hypertrophic Cardiomyopathy Mutations |
| CN116024327A (zh) * | 2022-10-14 | 2023-04-28 | 百世诺（北京）医疗科技有限公司 | 用于检测肥厚型心肌病myh7致病基因的试剂及其应用 |
| CN116042801A (zh) * | 2022-10-14 | 2023-05-02 | 百世诺（北京）医疗科技有限公司 | 用于检测肥厚型心肌病突变基因tnni3、actc1和mypn的试剂及其应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| BERGE K.E., ET AL.: "Genetics of hypertrophic cardiomyopathy in Norway", 《CLIN GENET》, vol. 86, 31 December 2014 (2014-12-31), pages 355 - 360, XP071087691, DOI: 10.1111/cge.12286 * |
| CLINVAR: "NM_005159.5(ACTC1):c.922T>C (p.Tyr308His) Variation ID: 948806 Accession: VCV000948806.7", 《CLINVAR》, 28 February 2024 (2024-02-28), pages 1 - 2 * |
| EVAN A. DESPOND ET AL.: "Classifying Cardiac Actin Mutations Associated With Hypertrophic Cardiomyopathy", 《FRONTIERS IN PHYSIOLOGY 》, vol. 9, no. 405, 17 April 2018 (2018-04-17), pages 1 - 6 * |
| 宋艳瑞等: "肥厚型心肌病的致病分子机制研究进展", 《遗传》, vol. 33, no. 6, 30 June 2011 (2011-06-30), pages 549 - 557 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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