JP2002355088A - 変異嚢胞性線維症膜通過伝導率制御タンパク質（ｃｆｔｒ）の製造法 - Google Patents

変異嚢胞性線維症膜通過伝導率制御タンパク質（ｃｆｔｒ）の製造法

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JP2002355088A JP2001402257A JP2001402257A JP2002355088A JP 2002355088 A JP2002355088 A JP 2002355088A JP 2001402257 A JP2001402257 A JP 2001402257A JP 2001402257 A JP2001402257 A JP 2001402257A JP 2002355088 A JP2002355088 A JP 2002355088A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＣＦキャリアーのスクリーニング及び検出、
ＣＦ診断および治療のための技術を提供すること。 【解決手段】 キャリアーのスクリーニング及び検出、
ＣＦ診断および治療に使用し得るＣＦタンパク質遺伝子
をクローニングし、単離精製する。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって支給
されたグラントＲ０１ＤＫ３９６９０−０２およびＤＫ
３４９４４による政府後援で行われた。政府は、本発明
について一定の権利を有する。発明の分野 本発明は、概して嚢胞性線維症（ＣＦ）遺伝子に関し、
さらに詳細には正常および変異ＣＦ遺伝子類に対応する
ＤＮＡ配列の同定、単離およびクローニング、ならびに
それらの転写体および遺伝子産物類に関する。本発明
は、さらに、ＣＦキャリアーのスクリーニングおよび検
出方法、ＣＦ診断および出生前ＣＦスクリーニングおよ
び診断、および前記ＤＮＡＮ タンパク質、および前記
タンパク質の代謝機能から誘導した情報を用いる組換え
技術および薬物療法を利用した遺伝子治療に関する。発明の背景 嚢胞性線維症（ＣＦ）は、コーカサス人種において最も
よくみられる重篤な常染色体劣性遺伝的疾患である。そ
れは、北アメリカにおける生存出生２０００人中およそ
１人に影響を及ぼす［Ｂｏａｔら、ＴｈｅＭｅｔａｂｏ
ｌｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉ
ｓｅａｓｅ，第６版、２６４９−２６８０頁、 ＭｃＧ
ｒａｗ Ｈｉｌｌ、 ＮＹ（１９８９）］。２０人中お
よそ１人が本疾患のキャリアーである。本疾患は１９３
０年代後半に初めて記載されたが、その根本的欠陥は不
明のままである。嚢胞性線維症の主な症状として、慢性
肺疾患、膵外分泌不全、および汗電解質レベル上昇が挙
げられる。本症状は、外分泌障害である嚢胞性線維症と
一致している。最近ＣＦ患者細胞の上皮の先端膜を横断
するイオン運搬の解析が進んではいるが、塩素イオン
（ｃｈｌｏｒｉｄｅ）チャンネルの異常制御が本疾患の
一次欠陥を示すかどうかは明らかでない。本疾患の分子
メカニズムの理解が欠如していることを考慮し、したが
って、関与遺伝子の直接クローニングによりその染色体
位置に基づいて分子欠損の性質を理解する試みが、異な
る別の方法として行われた。しかし、本疾患の遺伝的基
礎の正確な性質を導くようなまたは嚢胞性線維症遺伝子
の同定を可能とするような明確な表現型は皆無である。
集団遺伝学データに関連するＣＦ欠陥の性質は、容易に
は明らかとはならない。本疾患の有病率および臨床的異
質性は、２−３の異なるメカニズム；高変異率、ヘテロ
接合体の長所、遺伝的変動、複数座、および繁殖代償作
用によって説明されてきた。仮説の多くは、根本的欠陥
の知識が欠けているために試験することができない。し
たがって、ＣＦ遺伝子の決定および特性解析のための別
の方法では、遺伝子解析によってこの遺伝子の局在を同
定する試みを中心とした。ＣＦ遺伝子の抗原性かつタン
パク質マーカー類への連結解析が１９５０年代に試みら
れたが、確たる結果は全く得られなかった［Ｓｔｅｉｎ
ｂｅｒｇら，アメリカンジャーナル・オブ・ヒューマン
ジェネティックス（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）
８：１６２−１７６，（１９５６）；Ｓｔｅｉｎｂｅｒ
ｇおよびＭｏｒｔｏｎ、 アメリカンジャーナル・オブ
・ヒューマンジェネティックス（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇ
ｅｎｅｔ．）８：１７７−１８９，（１９５６）；Ｇｏ
ｏｄｃｈｉｌｄら、ジャーナル・オブ・メディカルジェ
ネティックス（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．）７：４１７
−４１９，１９７６］。さらに最近になって、連結解析
を促進するためにＲＦＬＰ類を使用することが可能とな
った。ＣＦ遺伝子へのＲＦＬＰの最初の連結は、１９８
５年に記載され［Ｔｓｕｉら、サイエンス Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ）２３０：１０５４−１０５７，１９８５］、その
中で連結がＣＦ遺伝子と特性解析されていないマーカー
ＤＯＣＲＩ−９１７との間に見られた。本関連は、ＣＦ
に罹患した子供を有する３９０家族の解析で判明した。
このことは、染色体局在は立証されなかったが、本疾患
遺伝子の局在がヒトゲノムのおよそ１％に、すなわち、
３０００万ヌクレオチド塩基対に狭められたことを示唆
している。ＤＯＣＲＩ−９１７プローブの染色体局在
は、異なるヒト染色体補体を含むげっし類−ヒトハイブ
リッド細胞株類を用いて立証された。ＤＯＣＲＩ−９１
７（およびしたがってＣＦ遺伝子）がヒト染色体７にマ
ップされることが示された。ＣＦ遺伝子の位置を特定す
る試みとして、さらに物理的および遺伝的な遺伝子連結
研究を行った。Ｚｅｎｇｅｒｌｉｎｇら［アメリカンジ
ャーナル・オブ・ヒューマンジェネティックス（Ａｍ．
Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）４０：２２８−２３６（１
９８７）］は、ヒト−マウス体細胞ハイブリッドを用い
てＣＦ遺伝子とそれに連結していることが公知のマーカ
ー類とのさらに詳細な物理的関係を得たことを記載して
いる。この刊行物は、ＣＦ遺伝子が、染色体７上のバン
ドｑ２２の遠位部またはｑ３１の近位部のいずれかに帰
せられることを示している。Ｒｏｍｍｅｎｓら［アメリ
カンジャーナル・オブ・ヒューマンジェネティックス
（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）４３：６４５−６
６３，（１９８８）］は、多数の新規７ｑ３１プローブ
類の単離について詳細に検討している。概説された本方
法により、互いに近接している２個の新規プローブ類、
Ｄ７Ｓ１２２およびＤ７Ｓ３４０が単離された。パルス
フィールドゲル電気泳動マッピングは、これらの２個の
ＲＦＬＰマーカー類がＣＦ遺伝子に隣接する２個のマー
カー類、ＭＥＴ［Ｗｈｉｔｅ，Ｒ．，Ｗｏｏｄｗａｒｄ
Ｓ．，Ｌｅｐｐｅｒｔ Ｍ．ら，ネーチャー（Ｎａｔ
ｕｒｅ）３１８：３８２−３８４，（１９８５）］およ
びＤ７Ｓ８［Ｗａｉｎｗｒｉｇｈｔ、Ｂ．，Ｊ．，Ｓｃ
ａｍｂｌｅｒ，Ｐ．Ｊ．，およびＪ．Ｓｃｈｍｉｄｔｋ
ｅ，ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３１８：３８４−３８
５，（１９８５）］の間にあり、したがって、ＣＦ遺伝
子領域の中にあることを示唆している。これらのマーカ
ー類の発見は、染色体歩行およびジャンピング（ｊｕｍ
ｐｉｎｇ）の出発点を提供する。Ｅｓｔｉｖｉｌｌｅ
ら、［ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３２６：８４０−８
４５ （１９８７）］は、候補ｃＤＮＡ遺伝子の位置を
調べ部分的に特性解析した。しかし、このことは、ＣＦ
遺伝子の正確な位置を教示するものではない。この参考
文献はＣｐＧ島の下流にある候補ｃＤＮＡ遺伝子を記載
しており、これは、多数の脊椎動物遺伝子類の上流の低
メチル化ＧＣヌクレオチド含量の多い領域である。この
候補座の染色体位置は、ＸＶ２Ｃ領域として同定されて
いる。この領域は、欧州特許出願８８３０３６４５．１
に記載されている。しかし、この実際の領域は、ＣＦ遺
伝子を擁していない。ＣＦ遺伝子同定で大きな問題は、
マップ位置の知識によるヒト疾患遺伝子のクローニング
におけるこれまでの全ての成功を非常に促進し細胞学的
に検出可能な染色体再配列類または欠失類がないことで
あった。このような再配列類および欠失類は細胞学的に
観察でき、その結果、特定染色体上における物理的位置
が特定疾患と相関させられる。さらに、この細胞学的位
置は、一般に入手可能なＤＮＡプローブ類および細胞学
的に可視可能な染色体中の改変の間の公知の関係に基づ
き、分子的位置と相関させられる。特定疾患遺伝子の分
子的位置の知識によって、特に遺伝子産物が公知でかつ
このクローニングされた遺伝子類の発現産物のイムノア
ッセイによって確認できる時、通常の操作によってこの
遺伝子をクローニングしかつ配列決定することができる
であろう。対照的に、先行技術では、嚢胞性線維症の遺
伝子の細胞学的位置または遺伝子産物のいずれも公知で
なかった。ＣＦ遺伝子に隣接するがその分子的位置を特
定することはないマーカー類であるＭＥＴおよびＤ７Ｓ
８が最近同定され、本発明者らは、本発明によってＣＦ
遺伝子に迫るためにさまざまな新しい手段を開発した。
これらの手段に用いられた方法として、隣接マーカー類
からの染色体ジャンピング、パルスフィールドゲル電気
泳動の使用による定められた物理的領域からのＤＮＡ断
片類のクローニング、ＣＦ近傍の低メチル化ＣｐＧ島か
らのＤＮＡ断片類の単離のために設計された体細胞ハイ
ブリッドおよび分子クローニング技術の併用、染色体微
細切断およびクローニング、および７ｑ３１領域からの
多数のＤＮＡマーカー類の飽和クローニングが挙げられ
る。これらの新規手段によって、本発明者らは、先行技
術では明確でなくまたは１例では誤りがあった嚢胞性線
維症に関与する遺伝子を同定することができた。これら
の遺伝的および分子クローニング手段を応用して、その
染色体位置に基づき嚢胞性線維症遺伝子の単離およびｃ
ＤＮＡクローニングが、その方法を示唆するゲノム再配
列の恩恵を受けることなく可能となった。ＣＦ遺伝子お
よび遺伝子産物の正常および変異形態の同定によって、
核酸プローブ類およびこの遺伝子産物に対する抗体類を
用いるＣＦスクリーニングおよび臨床試験の開発が可能
となった。欠陥遺伝子産物およびこの遺伝子産物が関与
する経路の相互作用によって、正常遺伝子産物補充およ
び遺伝子操作および運搬（デリバリ）による治療がこれ
で可能となる。発明の要約 嚢胞性線維症疾患過程に関与する遺伝子は以下で”ＣＦ
遺伝子”およびその機能的等価物と称するが、これが同
定され、単離され、そして、ｃＤＮＡがクローニングさ
れ、その転写物および遺伝子産物が同定かつ配列決定さ
れた。前記遺伝子産物中におけるフェニルアラニン残基
の欠失をもたらす３個の塩基対欠損が決定され、ＣＦ罹
患患者の約７０％におけるＣＦ遺伝子の変異に対応して
おり、残りの症例の全部とはいわないまでもほとんどに
おいて異なる変異が関与していた。前記遺伝子および遺
伝子産物の同定および配列決定により、核酸プローブ類
および前記遺伝子産物に対した作成した抗体類を種々の
ハイブリダイゼーションおよび免疫アッセイに用いて、
正常または欠損ＣＦ遺伝子または遺伝子産物のいずれの
存在をもスクリーニングしかつ検出できる。このような
スクリーニングおよび診断のためのアッセイキット類
も、また、提供できる。さて、遺伝子組換え法を用いて
産生を増幅できる前記の正常遺伝子産物またはその機能
的等価物を補充することによる患者の治療が、同様に可
能となった。さらに、嚢胞性線維症は、前記の遺伝子欠
損をインサイチュー（ｉｎ ｓｉｔｕ）で矯正するかま
たは正常遺伝子産物発現が可能なＤＮＡ配列を前記患者
の細胞に導入する組換えまたは他のビーイクル類を用い
て治癒できまたは管理することができる。本発明の１面
によれば、ＤＮＡ分子は、 （ａ）下記の図１に示したアミノ酸残基１位から１４８
０位までのＤＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列類； （ｂ）下記の図１によるアミノ酸残基１位から１４８０
位までの配列を有する正常ＣＦＴＲポリペプチド類をコ
ードするＤＮＡ配列類； （ｃ）アミノ酸残基１位から１４８０位までの間の少な
くとも１６個の連続ヌクレオチド類を含む下記の図１の
配列断片に対応するＤＮＡ配列類； （ｄ）少なくとも１６個のヌクレオチド類からなりかつ
下記図１のアミノ酸配列の断片をコードするＤＮＡ配列
類；および （ｅ）下記図１の配列中においてアミノ酸残基１位から
１４８０位までの間の少なくとも１８個の連続ヌクレオ
チド類によってコードされるエピトープをコードするＤ
ＮＡ配列類、からなる群から選択されたＤＮＡ配列から
なる。本発明のもうひとつの面によれば、精製された変
異ＣＦ遺伝子はある１個のタンパク質のアミノ酸配列を
コードするＤＮＡ配列からなり、この中で、前記タンパ
ク質は、ヒト体細胞中で発現された時に遺伝的疾患嚢胞
性線維症に相関する改変された細胞機能に関連してい
る。本発明のもうひとつの側面によれば、精製されたＤ
ＮＡ分子は、上記のＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列か
らなる。本発明のもうひとつの側面によれば、１個のＤ
ＮＡ分子は、上記のＤＮＡ配列に対応するｃＤＮＡ分子
からなる。本発明のもうひとつの側面によれば、精製さ
れた核酸プローブは、群（ａ）から（ｅ）までの上記に
記載の選択されたＤＮＡ配列類に対応するＤＮＡまたは
ＲＮＡヌクレオチド配列からなる。本発明のもうひとつ
の側面によれば、ＤＮＡ分子は、下記の図１に示したア
ミノ酸残基１位から１４８０位までの配列を有する変異
ＣＦＴＲポリペプチドをコードするＤＮＡ配列からな
る。本配列は、さらに、アミノ酸残基５０８位からのフ
ェニルアラニンの欠失をもたらす３個の塩基対変異によ
って特徴づけられる。本発明のもうひとつの面によれ
ば、１個のＤＮＡ分子は、（ａ）変異ＤＮＡ配列に対応
し、かつ、発現されると変異ＣＦＴＲポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列類（ｂ）少なくとも２０個のヌクレ
オチド類を含む変異ＤＮＡ配列類の１個の断片に対応す
るＤＮＡ配列類；（ｃ）少なくとも２０個のヌクレオチ
ド類からなりかつ変異ＣＦＴＲタンパク質アミノ酸配列
の１個の断片をコードするＤＮＡ配列類；および（ｄ）
この変異ＤＮＡ配列中の少なくとも１８個の連続ヌクレ
オチド類によってコードされるエピトープをコードする
ＤＮＡ配列類、からなる群から選択された１個のＤＮＡ
配列からなる。本発明のもうひとつの面によれば、ＲＮ
Ａ配列からなる精製されたＲＮＡ分子は、変異ＤＮＡ配
列に対応する。本発明のもうひとつの面によれば、正常
または変異ＤＮＡおよびその断片類のＤＮＡ配列類から
なる組換えクローニングベクターが提供される。本発明
の面によれば、前記ベクターが、組換えＤＮＡ分子中に
おいて発現制御配列に操作上連結され、その結果、正常
ＣＦＴＲタンパク質が発現されるか、または、これとは
別に他の選択された変異ＤＮＡ配列によって、変異ＣＦ
ＴＲポリペプチドが発現できる。発現制御配列は、原核
または真核細胞類およびそれらのウイルス類およびその
組み合わせ類の遺伝子類の発現を制御する配列からなる
群から選択される。本発明のもうひとつの面によれば、
正常ＣＦＴＲポリペプチドを産生する方法は、（ａ）培
地中でかつ正常ＣＦＴＲポリペプチドの発現に好適な条
件下で正常ＤＮＡ配列のための組換えベクターを移入さ
れた宿主細胞を培養すること、および（ｂ）前記発現さ
れた正常ＣＦＴＲポリペプチドを単離すること、の段階
からなる。本発明のもうひとつの面によれば、変異ＣＦ
ＴＲポリペプチド産生の方法は、（ａ）培地中でかつ変
異ＣＦＴＲポリペプチドの発現に好適な条件下で変異Ｄ
ＮＡ配列のための組換えベクターを移入された宿主細胞
を培養すること、および（ｂ）前記発現された変異ＣＦ
ＴＲポリペプチドを単離すること、の段階からなる。本
発明のもうひとつの面によれば、ヒト細胞膜起源の精製
されたタンパク質は、前記タンパク質がヒト細胞膜中に
存在する時遺伝的疾患である嚢胞性線維症を起こす細胞
機能と関連している変異ＤＮＡ配列によってコードされ
るアミノ（酸）配列からなる。本発明のもうひとつの面
によれば、前記ＣＦＴＲポリペプチドは、約１７０，０
００ダルトンの分子量および上皮細胞膜通過（トランス
メンブレン）イオン伝導率に影響を及ぼす活性を特徴と
する。本発明のもうひとつの面によれば、実質的に純粋
なＣＦＴＲタンパク質がヒト上皮細胞において発現さ
れ、かつ、上皮細胞膜に結合することによって上皮細胞
膜中に形成されたチャンネルを介してイオンの動きを修
飾することによって、上皮細胞を介してイオン輸送の制
御およびコントロールに関与することができることを特
徴とする。本発明のもうひとつの面によれば、ＣＦＴＲ
タンパク質を単離する工程は、（ａ）末梢タンパク質を
上皮細胞膜から抽出し、前記のＣＦＴＲタンパク質を含
む必須タンパク質を有する膜物質を提供すること；
（ｂ）前記膜物質の前記必須タンパク質類を溶解し、前
記必須タンパク質類の溶液を形成すること；（ｃ）前記
ＣＦＴＲタンパク質を分離し、哺乳類起源の残りの全て
の他のタンパク質類を除去すること、からなる。本発明
のもうひとつの面によれば、対象がＣＦキャリアーまた
はＣＦ患者であるかどうかを決定するために患者をスク
リーニングする方法が提供され、本方法は、前記スクリ
ーニングすべき対象の生物試料を提供すること、前記生
物試料中において正常ＣＦ遺伝子、正常ＣＦ遺伝子産物
類、変異ＣＦ遺伝子、変異ＣＦ遺伝子産物類およびその
混合物類からなる群由来の少なくとも１つの構成員の存
在を検出するためのアッセイを提供することの段階から
なる。本発明のもうひとつの面によれば、ＣＦＴＲポリ
ペプチドに特異的な免疫活性抗ＣＦＴＲポリクローナル
またはモノクローナル抗体が提供される。本発明のもう
ひとつの面によれば、イムノアッセイ法によってＣＦ遺
伝子の存在をアッセイするキットは、（ａ）ＣＦ遺伝子
の遺伝子産物に特異的に結合する抗体；（ｂ）前記遺伝
子産物への抗体の結合を検出するための試薬手段；およ
び（ｃ）それぞれ、前記イムノアッセイを実施するため
に有効な量で存在する抗体および試薬手段からなる。本
発明のもうひとつの面によれば、ハイブリダイゼーショ
ン法によってＣＦ遺伝子の存在をアッセイするためのキ
ットは、（ａ）特異的に前記ＣＦ遺伝子に結合するオリ
ゴヌクレオチドプローブ；（ｂ）前記オリゴヌクレオチ
ドプローブの前記ＣＦ遺伝子へのハイブリダイゼーショ
ンを検出するための試薬手段；および（ｃ）それぞれ、
前記ハイブリダイゼーションアッセイを実施するために
有効な量で存在する抗体および試薬手段からなる。本発
明のもうひとつの面によれば、患者の嚢胞性線維症を治
療するための方法が提供される。本治療は、患者に対し
て治療有効量の正常ＣＦＴＲタンパク質を投与する段階
からなる。本発明のもうひとつの面によれば、嚢胞性線
維症の遺伝子治療方法は、正常ＣＦＴＲタンパク質をコ
ードする正常ＤＮＡ配列に対応する配列を含むＤＮＡ分
子の運搬（デリバリ）段階からなる。本発明のもうひと
つの面によれば、動物は、非相同細胞系からなる。前記
細胞系は、この動物における嚢胞性線維症症状を含む変
異ＤＮＡ配列に対応する組換えＤＮＡ配列を含む組換え
ＤＮＡ配列を含む組換えクローニングベクターを含む。
本発明のもうひとつの面によれば、トランスジェニック
マウスは、嚢胞性線維症症状を呈する。図面の簡単な説明 図１は、ＣＦ遺伝子のヌクレオチド配列およびＣＦＴＲ
タンパク質の前記アミノ酸配列である。図２は、ＣＦ遺
伝子の制限地図および前記遺伝子への染色体歩行および
ジャンピングに使用された略手段である。図３は、前記
ＣＦ遺伝子を含みかつ取り囲む領域のパルスフィールド
ゲル電気泳動地図である。図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃは、
種間ハイブリダイゼーションによる保存されたヌクレオ
チド配列類の検出を示している。図４Ｄは、プローブ類
Ｅ４．３およびＨ１．６の重複するセグメント類の制限
地図である。図５は、ゲノムおよびｃＤＮＡプローブ類
を用いたＲＮＡブロットハイブリダイゼーション解析で
ある。繊維芽細胞、気管（正常およびＣＦ）、膵、肝、
ＨＬ６０、Ｔ８４、および脳ＲＮＡへのハイブリダイゼ
ーションを示している。図６は、前記ＣＦ遺伝子の５’
末端におけるＥ４．３クローニング領域のメチル化状況
である。図７は、ｃＤＮＡのゲノムＤＮＡ断片類への配
列を示したＣＦＴＲ ｃＤＮＡの制限地図である。図８
は、ＣＦＴＲ ｃＤＮＡ（クローン１０−１）の部分に
よる６．５ｋｂのｍＲＮＡ転写体への種々のヒト組織中
におけるハイブリダイゼーションを示したＲＮＡゲルブ
ロット解析である。図９は、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ
ＩＩＩで消化したゲノムＲＮＡへのＣＦＴＲ ｃＤＮＡ
クローン類によるハイブリダイゼーションを示したＤＮ
Ａブロットハイブリダイゼーション解析である。図１０
は、ＣＦＴＲ ｃＤＮＡの５’および３’末端を特性解
析したプライマー延長実験である。図１１は、ヒドロパ
シープロフィールであり、かつ、ＣＦＴＲの予測２次構
造を示している。図１２は、予測されたＣＦＴＲポリペ
プチド中における内部相同性のドットマトリックス解析
である。図１３は、予測されたＣＦＴＲタンパク質の略
モデルである。図１４は、ＣＦ遺伝子に緊密に連結した
制限断片長多形性（ＲＦＬＰ類）の略図であり、その中
で、倒立三角形は、Ｆ５０８ ３塩基対欠失の位置を示
している。図１５は、正常配列を検出するプローブＮお
よびＣＦ変異配列を検出するプローブＦによるオリゴヌ
クレオチドハイブリダイゼーションによるＦ５０８変異
の検出を示したものである。図１６は、ＣＦＴＲの延長
ＮＢＦ類の最もよく保存されたセグメント類と他のタン
パク質類の匹敵する領域類との配列を示したものであ
る。図１７は、Ｆ５０８欠失周辺のＤＮＡ配列である。
図１８は、Ｆ５０８欠失におけるＤＮＡ配列を示したヌ
クレオチド配列決定ゲルを示したものである。図１９ａ
および１９ｂは、ｐＧＥＸプラスミド類によって形質転
換された細菌溶解物（ＪＭ１０１）からのタンパク質の
電気泳動後クーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｉｅ Ｂｌ
ｕｅ）染色ポリアクリルアミドゲル類である。図２０
は、２匹の異なるウサギから得た免疫前および免疫血清
による融合タンパク質＃１含有細菌溶解物のイムノブロ
ットである。図２１は、図２０のウサギ＃１からの免疫
血清を用いたＴ−８４膜類のイムノブロットである。図
２２は、表８のペプチド＃２とＫＬＨとの結合物で免疫
したウサギ由来免疫前血清および免疫血清で探索したイ
ムノブロットである。好適な態様の詳細な説明 １．定義 本発明のさまざまな態様のレビューおよび本発明をなす
ためにかつそれを用いる際に利用したさまざまな要素類
および構成の理解を円滑にするために、本発明に使用し
た以下の用語の定義は、下記のようである： ＣＦ−嚢胞性線維症 ＣＦキャリアー−外見上健康であるがその染色体がその
人の子孫に遺伝することができる変異ＣＦ遺伝子を含有
する者。
ＣＦ患者−各染色体上に変異ＣＦ遺伝子を有する者で、
それらが嚢胞性線維症の症状を示す者。
ＣＦ遺伝子−その変異形態が本疾患嚢胞性線維症に関連
している遺伝子。この定義は、存在する種々の配列多形
性を含むものと理解されるが、前記遺伝子配列中でヌク
レオチド置換が前記遺伝子産物の必須機能に影響を及ぼ
さないことを特徴とする。この用語は、元来、単離され
たコード配列に関するが、また、隣接制御要素類および
／またはイントロン類の一部または全てを含むことがで
きる。
ＣＦ−ＰＩ−嚢胞性線維症膵不全は嚢胞性線維症患者の
主要臨床サブグループであり、膵外分泌機能不全を特徴
とする。
ＣＦ−ＰＳ−嚢胞性線維症膵良好群（ｓｕｆｆｉｃｉｅ
ｎｔ）は、正常食物消化のための十分な膵外分泌機能を
有する嚢胞性線維症患者の臨床サブグループである。
ＣＦＴＲ−嚢胞性線維症膜通過（トランスメンンブレ
ン）伝導率制御タンパク質で、ＣＦ遺伝子によってコー
ドされる。この定義には、ヒトまたは動物起源から単離
されたか、組換え有機体によって産生されたか、および
化学的または酵素的に合成されたようなタンパク質を含
む。この定義は、前記配列中の種々の領域内のアミノ酸
置換が前記タンパク質の本来の機能、またはそのヒドロ
パシープロフィールまたは２次または３次構造に影響を
及ぼさないさまざまな多形性形態を含むものと理解され
る。
ＤＮＡ−標準的命名法を用いて塩基類を同定した。イン
トロンを有さないＤＮＡ−内部非コードセグメント類、
例えばｃＤＮＡを欠失しているＤＮＡ片。
ＩＲＰ座配列−（プロトオンコジーンｉｎｔ−１関連）
ＣＦ遺伝子近傍に局在する遺伝子。
変異ＣＦＴＲ−１次、２次およ３次構造の関連からＣＦ
ＴＲに高度に類似しているタンパク質であるが、少数の
アミノ酸置換および／または欠失および／または挿入の
結果、その本来の機能が傷害され、上皮細胞がＣＦＴＲ
よりもむしろ変異ＣＦＴＲを発現する有機体が嚢胞性線
維症の症状を示すようなタンパク質。
ｍＣＦ−ヒトＣＦ遺伝子に同じ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕ
ｓ）マウス遺伝子。
ＮＢＦ類−ヌクレオチド（ＡＴＰ）結合折り畳み。
ＯＲＦ−読みとり枠。
ＰＣＲ−ポリメラーゼチェーン反応。
タンパク質−標準的一文字表記命名法を用いてアミノ酸
類を記載する。
Ｒ−領域−ＣＦＴＲタンパク質の高度に価電された細胞
質領域。
ＲＳＶ−ラウス肉腫ウイルス。
ＳＡＰ−表面活性タンパク質 ＲＦＬＰ−制限酵素断片長多形性２．前記ＣＦ遺伝子の単離 染色体歩行、ジャンピングおよびｃＤＮＡハイブリダイ
ゼーションを用いて、５００キロベース対（ｋｂ）以上
を擁するＤＮＡ配列類を、嚢胞性線維症（ＣＦ）遺伝子
を含有するヒト染色体７の長腕上の領域から単離した。
数個の転写配列および保存セグメント類を、本領域で同
定した。これらのひとつはＣＦ遺伝子に対応しており、
かつ、ゲノムＤＮＡのおよそ２５０ｋｂにまたがる。重
複する相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クローン類を、嚢胞性
線維症遺伝子部分を含有するゲノムＤＮＡセグメントに
よって上皮細胞ライブラリから単離した。この単離され
たｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、図１に示してある。
それぞれの配列類の各列で、下列はヌクレオチド配列の
標準命名法によるリストである。それぞれの配列の各列
の上列は、それぞれのコドンに対応するアミノ酸の標準
一文字表記命名法である。したがって、本発明は、 （ａ）下記の図１に示したアミノ酸残基１位から１４８
０位までのＤＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列類； （ｂ）下記の図１によるアミノ酸残基１位から１４８０
位までの配列を有する正常ＣＦＴＲポリペプチド類をコ
ードするＤＮＡ配列類； （ｃ）アミノ酸残基１位から１４８０位までの間の少な
くとも１６個の連続ヌクレオチド類を含む下記の図１の
配列断片に対応するＤＮＡ配列類； （ｄ）少なくとも１６個のヌクレオチド類からなりかつ
下記図１のアミノ酸配列の断片をコードするＤＮＡ配列
類；および （ｅ）下記１図の配列中においてアミノ酸残基１位から
１４８０位までの間の少なくとも１８個の連続ヌクレオ
チド類によってコードされるエピトープをコードするＤ
ＮＡ配列類、 からなる群から選択されたＤＮＡ配列からなるＤＮＡ分
子を提供する。本発明は、また、 （ａ）ヒト上皮細胞中における嚢胞性線維症関連活性を
特徴づける変異ＣＦＴＲポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列、または、さらに３個の塩基対変異によりアミノ
酸残基５０８位からフェニルアラニン欠失が結果として
生じることを特徴とするアミノ酸残基１位から１４８０
位までの図１のＤＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列類； （ｂ）パラグラフａ）の配列類の断片に対応しかつ少な
くとも１６個のヌクレオチド類を含むＤＮＡ配列類； （ｃ）少なくとも１６個のヌクレオチド類からなりかつ
パラグラフ（ａ）のＤＮＡ配列によってコードされるア
ミノ酸配列の断片をコードするＤＮＡ配列類；および （ｄ）パラグラフａ）の配列中の少なくとも１８個の連
続ヌクレオチド類によってコードされるエピトープをコ
ードするＤＮＡ配列類、 からなる群から選択されたＤＮＡ配列からなるＤＮＡ分
子を提供する。長さがおよそ６，５００個のヌクレオチ
ド類の転写体は、ＣＦ患者中の罹患組織中で検出可能で
ある。単離されたヌクレオチド配列に基づいて、予測さ
れたタンパク質は、それぞれが膜会合に一致する特性を
有する第１領域およびＡＴＰ結合に関与すると確信され
ている第２領域を有する２つの類似領域からなる。３ｂ
ｐの欠失は、第１予測ヌクレオチド結合領域（ＣＦ遺伝
子産物のアミノ酸５０８位）の中央のフェニルアラニン
残基の欠落となり、これは、ＣＦ患者中で検出された。
図１の正常ＤＮＡ配列中のこの変異は、嚢胞性線維症患
者における変異のおよそ７０％に対応する。推定された
疾患遺伝子に緊密に結合したＤＮＡマーカー類に基づい
て延長されたハプロタイプデータから、ＣＦ変異遺伝子
プールの残りが複数の異なる変異から構成されているこ
とが示唆される。これらの後者の変異対立遺伝子のサブ
グループ（約８％）が、膵が良好である患者サブグルー
プにおいて残りの膵外分泌機能を付与できる。２．１ 染色体歩行およびジャンピング Ｒｏｍｍｅｎｓら、同上のＤ７Ｓ１２２およびＤ７５３
４０連結領域を包囲する大量のＤＮＡが、候補遺伝子配
列類として検索された。従来の染色体歩行方法に加え
て、染色体ジャンピング法をこの検索過程を加速するた
めに採用した。各ジャンピング終端から、新しい両方向
性歩行を開始させることができた。しばしば哺乳類ゲノ
ム中で遭遇する”クローニング不可”の領域による連続
歩行の停止は、染色体ジャンピングによって回避するこ
とができた。使用した染色体ジャンピングライブラリ
は、過去に記載されている［Ｃｏｌｌｉｎｓら、サイエ
ンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３５，１０４６（１９８
７）；Ｉａｎｕｚｚｉら、アメリカンジャーナル・オブ
・ヒューマンジェネティックス（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇ
ｅｎｅｔ．）４４、６９５（１９８９）］。当初のライ
ブラリは分取用パルスフィールドゲルによって調製し、
７０−１３０ｋｂの部分的ＥｃｏＲＩ断片類を含有させ
ることを意図した；このライブラリによるその後の実験
から、小断片類が同様に示されることが示唆され、ジャ
ンピングの長さが２５−１１０ｋｂであることが判明し
た。このライブラリをｓｕｐ宿主ＭＣ１０６１に接種
し、標準的手法によってスクリーニングした［Ｍａｎｉ
ａｔｉｓら］。陽性クローンをｐＢＲＡｖａ２３Ａｖａ
２中にサブクローニングし、Ｃｏｌｌｉｎｓら、ゲノム
アナリシス（Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ）：ア・
プラクティカルアプローチ（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ）（ＩＲＬ，ロンドン，１９８８）、
７３−９４頁）に記載のようにして、ジャンピング開始
および末端をＥｃｏＲＩおよびＡｖａＩ消化によって同
定した。各クローンについて、ジャンピング末端からの
断片を調べ、染色体７上におけるその位置を確認した。
染色体歩行およびジャンピングによって包含される隣接
染色体領域は約２５０ｋｂであった。ジャンピングの方
向は、プローブを注意深く選択することによって、Ｃｏ
ｌｌｉｎｓらおよびＩａｎｕｚｚｉら、同上によって記
載のようにして偏らせた。ＣＦ遺伝子 ｃＤＮＡの使用
によって単離された配列類を含む全領域をクローニング
し、これは約５００ｋｂである。染色体歩行およびジャ
ンピング手段の概略を図２に示した。ＣＦ遺伝子エクソ
ン類は、本図においてローマ数字によって示されてい
る。地図上の水平線は、歩行段階を示しており、一方、
地図上の弓形はジャンプ段階を示している。本図では６
段のそれぞれで左から右へ進行しており、末端の方向
は、示してあるように、７ｃａｎおよび７ｑｔｅｒに向
かっている。酵素ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、および
ＢａｍＨＩ酵素類の制限地図は、実線上に示してあり、
全クローン領域を網羅している。垂直線よりもむしろ矢
印で示した制限部位は、明確には位置が定められていな
い部位を示している。他の酵素類のための付加的制限部
位を線の下に示してある。クローニングされた領域内の
ギャップは、‖によって示されている。これらは、ＣＦ
転写体のｃＤＮＡクローン類によって検出される部分に
のみ出現する。これらのギャップは、本領域のパルスフ
ィールドマッピングに基づくと、大きいことはありえな
い。地図上の水平線によって示された歩行クローン類
は、各クローンで得られた歩行の進行を示す矢印の方向
を有している。コスミドクローン類は、文字ｃによって
開始する。他の全てのクローン類は、ファージである。
コスミドＣＦ２６はキメラであることが証明された；点
線を付けた部分は、もうひとつの染色体上の異なるゲノ
ム断片から由来する。ローマ数字ＩからＸＸＩＶまで
は、ＣＦ遺伝子エクソン類の位置を示している。線の上
に示した水平の四角は、本実験の間に使用したプローブ
類である。前記プローブ類のうちの３個が、本領域の多
形性検出のために先に同定された断片類の独立したサブ
クローニングを示している：Ｈ２．３ＡはプローブＸＶ
２Ｃ（Ｘ．Ｅｓｔｉｖｉｌｌｅら、ネーチャー（Ｎａｔ
ｕｒｅ）、３２６：８４０（１９８７））に対応し、お
よびプローブＥ４．１はＭｐ６ｄ．９（Ｘ．Ｅｓｔｉｖ
ｉｌｌｅら、アメリカンジャーナル・オブ・ヒューマン
ジェネティックス（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）
４４、７０４（１９８９）に対応している。Ｇ−２は、
転写された配列を検出するＥ６の小断片である。Ｒ１６
１，Ｒ１５９、およびＲ１６０は、ＩＲＰ座配列の部分
から構築された合成オリゴヌクレオチドであり［Ｂ．
Ｊ．Ｗａｉｎｗｒｉｇｈｔら，ＥＭＢＯ Ｊ、７：１７
４３（１９８８）］、この転写体のゲノム地図上におけ
る位置を示している。前記の２個の別々に単離されたＤ
ＮＡマーカー類としてのＤ７Ｓ１２２（ｐＨ１３１）お
よびＤ７Ｓ３４０（ＴＭ５８）はおよそ１０ｋｂしか離
れていないので（図２）、前記歩行およびジャンピング
は、本質的に単一点から開始されていた。ＭＥＴおよび
Ｄ７Ｓ８に関する歩行およびジャンピングの方向は、次
に、数個の稀にしか切断されない（ＸｈｏＩ、ＮｒｕＩ
およびＮｏｔＩに対するそれらのような、図２参照）制
限エンドヌクレアーゼ認識部位の交差によっておよび
Ｊ．Ｍ．Ｒｏｍｍｅｎｓら、アメリカンジャーナル・オ
ブ・ヒューマンジェネティックス Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．
Ｇｅｎｅｔ．）、印刷中；Ａ．Ｍ．Ｐｏｕｓｔｋａら，
ゲノミックス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）２、３３７（１９８
８）；Ｍ．Ｌ．Ｄｒｕｍｍら、ゲノミックス（Ｇｅｎｏ
ｍｉｃｓ）２、３４６（１９８８）の長い範囲の物理的
地図を参考にして確認された。パルスフィールドマッピ
ングデータは、同様に、本発明の発明者らによって同定
されたこのＮｏｔＩ部位（図２参照、１１３ｋｂ位）
が、ＩＲＰ座に関連した先に見いだされたもの（Ｅｓｔ
ｉｖｉｌｌｅら１９８７、同上）に対応していることを
明らかとしていた。その後の遺伝的研究からＣＦがＩＲ
ＰおよびＤ７Ｓ８の間に位置している可能性［Ｍ．Ｆａ
ｒｒａｌｌら、アメリカンジャーナル・オブ・ヒューマ
ンジェネティックス（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ
ｔ．）４３、４７１（１９８８）、Ｂ．Ｓ．Ｋｅｒｅｎ
ら、アメリカンジャーナル・オブ・ヒューマンジェネテ
ィックス（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）４４，８
２７（１９８９）］が極めて高かったので、歩行および
ジャンピング作業をこの区間のクローニングにのみ向け
て継続した。しかし、図２に示した他のコード領域は、
例えば、Ｇ−２、ＣＦ１４およびＣＦ１６が局在され、
さらに、広範囲に研究された。これらのその他の領域の
このような広範囲の研究から、それらが遺伝的データお
よび配列解析に基づきＣＦ遺伝子ではないことが明らか
となった。ＣＦ遺伝子の位置およびその特徴についての
知識がないので、この推定上の周辺コード領域を広い範
囲で時間をかけて検討しても、ＣＦ遺伝子の検索の方向
が進展することはなかった。しかし、これらの研究は、
ＣＦ遺伝子がそれらの領域内にある可能性を除外するた
めに必要であった。２８０ｋｂセグメント内の３個の領
域が、最初に使用した増幅ゲノムライブラリ中に回収可
能でないことが判明した。これらのクローニング可能性
が少ない領域はＨ２．３ＡおよびＸ．６ＤＮＡセグメン
トの近傍に位置しており、それぞれ、図２の７５−１０
０ｋｂ，２０５−２２５ｋｂおよび２７５−２８５ｋｂ
位のコスミドｃＷ４４をちょうど越えたところにあっ
た。Ｈ２．３Ａの近傍の組換えクローン類は極めて不安
定であり、細菌培養を数代しか継代しなくてもその後に
急激な再配列を起こすことが判明した。結果として生成
したギャップを充填するため、不安定配列類の繁殖を可
能とすると報告されている［Ａ．Ｒ．Ｗｙｍａｎ、Ｌ．
Ｂ．Ｗｏｌｆｅ，Ｄ．Ｂｏｔｓｔｅｉｎ、プロシーディ
ングズ・オブ・ナショナルアカデミー・オブ・サイエン
シズ米国（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ）８２，２８８０（１９８５）；Ｋ．Ｆ．Ｗｅｒｔｍ
ａｎ，Ａ．Ｒ．Ｗｙｍａｎ，Ｋ．Ｆ．Ｂｏｔｓｔｅｉ
ｎ、Ｄ．Ｂａｒｋｅｒ、Ｃ．Ｈｅｌｍｓ，Ｗ．Ｈ．Ｐｅ
ｔｒｉ，ジーン（Ｇｅｎｅ）、４９，２６３（１９８
６）］特定の宿主−ベクター系を使用して１次歩行ライ
ブラリを構築した。コスミドｃＷ４４近傍の領域は回収
されることに変わりはなかったが、Ｘ．６近傍の領域は
これらのライブラリによって救援され成功した。２．２ ゲノムライブラリの構築 ゲノムライブラリは、Ｍａｎａｔｉｓ（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ？）ら、モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）：ア・ラボラトリマニュアル
（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ）に記載の操作の後に構築され、表１に列挙した。
これには、８個のファージ類が含まれており、そのひと
つは、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ［Ｆｒｉｔｓｃｈら、セル
（Ｃｅｌｌ）、１９：９５９（１９８０）］によって提
供された；残りは、本研究の部分としてＭａｎｉａｔｉ
ｓら、同上に記載の操作に従って構築した。下記製造業
者によって供与されたベクター腕によって、４個のファ
ージライブラリがλＤＡＳＨ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅか
ら商業的に入手可能）中にクローニングされ、３個がλ
ＦＩＸ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから商業的に入手可能）
中にクローニングされた。１個のλＤＡＳＨライブラリ
は、ヒト染色体７含有ヒト−ハムスターハイブリッド
（４ＡＦ／１０２／Ｋ０１５）由来Ｓａｕ３Ａ−部分消
化ＤＮＡから構築され、他のライブラリは、ヒト末梢血
またはリンパ芽球性ＤＮＡの部分Ｓａｕ３Ａ，総Ｂａｍ
ＨＩ、または総ＥｃｏＲＩ消化から構築された。不安定
配列類の損失を避けるため、このファージライブラリの
内の５つを組換え−欠失宿主ＤＢ１３１６（ｒｅｃＤ
−）、ＣＥＳ２００（ｒｅｃＢＣ−）［Ｗｙｍａｎら、
同上、Ｗｅｒｔｍａｎ等、同上、Ｗｙｍａｎ等、同
上］；またはＴＡＰ９０［Ｐａｔｔｅｒｓｏｎらヌクレ
イックアシッズリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．）１５：６２９８（１９８７）］上で繁殖さ
せた。３つのコスミドライブラリを次に構築した。１つ
では、ベクターｐＣＶ１０８［Ｌａｕら、プロシーディ
ングズ・オブ・ナショナルアカデミー・オブ・サイエン
シズ米国（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ）８０：５２２５（１９８３）を用いて、部分消化
（Ｓａｕ３Ａ）ＤＮＡを４ＡＦ／１０２／Ｋ０１５［Ｒ
ｏｍｍｅｎｓら、［アメリカンジャーナル・オブ・ヒュ
ーマンジェネティックス（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ
ｔ．）４３：４（１９８８）］をクローニングした。第
２のコスミドライブラリは、部分消化（ＭｂｏＩ）ヒト
リンパ芽球性ＤＮＡを、インターロイキン−２レセプタ
ーα鎖のための前記ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロ
モータ駆動ｃＤＮＡ（Ｍ．ＦｏｒｄｉｓおよびＢ．Ｈｏ
ｗａｒｄによって供与された）をｐＷＥ１５の新耐性遺
伝子の代わりに挿入することによって調製したベクター
ｐＷＥ−ＩＬ２Ｒ中にクローニングすることによって、
調製した［プロシーディングズ・オブ・ナショナルアカ
デミー・オブ・サイエンシズ米国（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）８４：２１６０（１９８
７）］。追加の部分ＭｂｏＩコスミドライブラリは、Ｓ
ａｌＩリンカーをｐＷＥ−ＥＬ２ＲのＢａｍＨＩクロー
ニング部位に挿入することによって作製された［Ｍ．Ｄ
ｒｕｍｍ，未公表データ］ベクターｐＷＥ−ＩＬ２−Ｓ
ａｌ中で調製された；これによって、ＳａｌＩおよびＭ
ｂｏＩ末端の連結のために部分充填法を使用でき、タン
デム挿入を回避する［Ｚａｂａｒｏｖｓｋｙら、ジーン
（Ｇｅｎｅ）４２：１９（１９８６）］。コスミドライ
ブラリは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主株ＤＨ１または
４９０Ａ中で繁殖させた［Ｍ．Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ，
Ａ．Ｗｉｎｏｔｏ，Ｋ．Ｍｉｎａｒｄ，Ｌ．Ｈｏｏｄ，
セル（Ｃｅｌｌ）２８，４８９（１９８２）］。
このファージライブラリの３種を増殖させ、そして、大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＬＥ３９２中で増幅させた。４
種のその後のライブラリは、組換え欠損宿主類ＤＢ１３
１６（ｒｅｃＤ−）またはＣＥＳ２００（ｒｅｃＢＣ
−）［Ｗｙｍａｎ１９８５，同上；Ｗｅｒｔｍａｎ１９
８６，同上；およびＷｙｍａｎ１９８６，同上］にまた
は１例ではＴＡＰ９０［Ｔ．Ａ．Ｐａｔｔｅｒｓｏｎお
よびＭ．Ｄｅａｎ，ヌクレイックアシッズリサーチ（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１５、
６２９８（１９８７）］に接種された。各ファージまた
はコスミド挿入物末端近傍の（繰り返し要素類を全く有
していない）単一コピーＤＮＡセグメント類を精製し、
標準的手法による重複ＤＮＡ断片類を単離するためのラ
イブラリスクリーニングのプローブ類として使用した
（Ｍａｎｉａｔｉｓら、同上）。１−２×１０６ファー
ジクローン類は、適当なインディケータ細菌宿主ととも
に１５０ｍｍシャーレ ２５−３０個に接種後、３７°
Ｃで１０−１６時間インキュベートした。各プレートに
ついて二重”リフト”をニトロセルロースまたはナイロ
ン膜で調製し、記載の条件で予備ハイブリダイズおよび
ハイブリダイズさせた［Ｒｏｍｍｅｎｓら、１９８８，
同上］。プローブは、ランダムプライミング操作［Ａ．
Ｐ．ＦｅｉｎｂｅｒｇおよびＢ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉ
ｎ、アナリティカルバイオケミストリ（Ａｎａｌ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．１３２，６（１９８３）］を用いて比放射
能５×１０８ｃｐｍ／μｇを越えるまで３２Ｐで標識し
た。このコスミドライブラリをアンピシリン含有プレー
ト上に塗布し同様にしてスクリーニングした。高いバッ
クグラウンドシグナルを示すＤＮＡプローブ類は、前記
プローブをハイブリダイゼーションバッグに入れる前に
沸騰したプローブを２５０μｇ／ｍｌのせん断された変
性胎盤ＤＮＡとともに６０分間前アニーリングすること
によって、より良好に頻繁に使用できた。各歩行段階に
ついて、クローニングされたＤＮＡ断片の中身は、その
染色体位置を確認するための体細胞ハイブリッドパネル
によるハイブリダイゼーションによって、そのゲノムと
の同一直線性を確認するための制限マッピングおよびサ
ザンブロット解析によって決定した。単離されたゲノム
ＤＮＡ配列類および重複するｃＤＮＡクローン類を全て
組み合わせたクローニングされた領域は、５００ｋｂを
越えて伸長していた。染色体歩行およびジャンピング操
作によって単離されたＤＮＡセグメント類は、ゲノム配
列と同一直線にあることを立証するため、各セグメント
を： （ａ）染色体７の局在を確認するためのヒト−げっ歯類
ハイブリッド体細胞によるハイブリダイゼーション解
析、（ｂ）パルスフィールドゲル電気泳動、および
（ｃ）クローニングされたＤＮＡの制限地図とゲノムＤ
ＮＡのそれとの比較、によって調べた。したがって、単
一コピーヒトＤＮＡ配列類は、各組換えファージおよび
コスミドクローンから単離され、Ｍａｎｉａｔｉｓら、
同上の操作によって行うこれらのハイブリダイゼーショ
ン解析のそれぞれにおいてプローブとして使用した。フ
ァージおよびコスミド単離物の大半は正確な歩行および
ジャンプクローンを示す一方で、わずかが、クローニン
グアーティファクトまたはヒトゲノム中の他の領域から
の交差ハイブリダイゼーション配列類から、または、前
記ライブラリがヒト−ハムスターハイブリッド細胞株か
ら由来する場合ハムスターゲノムから、結果として生成
した。正確な位置の確認は、染色体ジャンピングによっ
て単離されたクローン類について特に重要であった。多
くのジャンプクローン類を検討し、前記遺伝子から研究
の方向をそらすような結論とはならない情報が得られ
た。２．３ 制限地図の確認 さらに、重複するクローン類の重複物理地図の確認を、
パルスフィールドゲル電気泳動を用いて長い範囲の制限
マッピング解析によって得た（Ｊ．Ｍ．Ｒｏｍｍｅｎ
ｓ，アメリカンジャーナル・オブ・ヒューマンジェネテ
ィックス（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．印刷中、
Ａ．Ｍ．Ｐｏｕｓｔｋａら、１９８８、同上、Ｍ．Ｌ．
Ｄｒｕｍｍら、１９８８、同上）。図３Ａから３Ｅまで
は、長い範囲の制限マッピング研究の知見を例示してお
り、その中で、本領域の概略をパネルＥに示した。ヒト
−ハムスター細胞株４ＡＦ／１０２／Ｋ０１５由来ＤＮ
Ａは、酵素（Ａ）ＳａｌＩ、（Ｂ）ＸｈｏＩ、（Ｃ）Ｓ
ｆｉＩおよび（Ｄ）ＮａｅＩによって消化され、パルス
フィールドゲル電気泳動によって分離され、そして、ゼ
ータプローブ（ＺｅｔａｐｒｏｂｅＲ）（バイオラッド
（ＢｉｏＲａｄ））に移した。各酵素について、単一ブ
ロットを連続して図ＡからＤまでのパネル類のそれぞれ
の下に示したプローブ類とハイブリダイズさせ、前記ブ
ロットをハイブリダイゼーションの間で切断した。図３
Ｅの各酵素の記号は：Ａ，ＮａｅＩ；Ｂ，ＢｓｓＨＩ
Ｉ；Ｆ，ＳｆｉＩ；Ｌ，ＳａｌＩ；Ｍ，ＭｌｕＩ；Ｎ、
ＮｏｔＩ；Ｒ，ＮｒｕＩ；およびＸ，ＸｈｏＩである。
Ｃは、ゲルの圧縮ゾーン領域に対応する。ＤＮＡ調製
物、制限消化、および交差フィールドゲル電気泳動方法
が記載されている（Ｒｏｍｍｅｎｓら、印刷中、同
上）。図３のゲル類は、０．５ＸＴＢＥ中を２０時間、
７ボルト／ｃｍで走行させ、（Ａ），（Ｂ）および
（Ｃ）について１０−４０秒間直線的に傾斜させて切り
替え、８ボルト／ｃｍで２０時間、（Ｄ）について５０
−１５０秒間直線的に傾斜させて切り替えた。ハイブリ
ダイゼーションパターンの解釈図を各パネルの下に示し
た。断片長さはキロベースとして、そして、オリゴマー
としたバクテリオファージλＤＮＡおよびサッカロミセ
ス・セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）染色体との比較によって大きさを分
類した。Ｈ４．０，Ｊ４４，ＥＧ１．４は、歩行および
ジャンピング実験から生じたゲノムプローブ類である
（図２参照）。Ｊ３０は、Ｄ７Ｓ８からの４つの連続ジ
ャンプによって単離された（Ｃｏｌｌｉｎｓら、１９８
７、同上；Ｉａｎｕｚｚｉら、１９８９，同上；Ｍ．Ｄ
ｅａｎら、公表のために提出）。１０−１，Ｂ．７５，
およびＣＥ１．５／１．０は、ＣＦ転写体の異なる領域
を包含するｃＤＮＡプローブ類である：１０−１は、エ
クソン類Ｉ−ＶＩを含有し、Ｂ．７５はエクソン類Ｖ−
ＸＩＩを含有し、およびＣＥ１．５／１．０は、エクソ
ン類ＸＩＩ−ＸＸＩＶを含有する。図３Ｅには、全ＭＥ
Ｔ−Ｄ７Ｓ８区間の組成地図を示した。四角の領域は、
歩行およびジャンピングによってクローニングされたセ
グメントを示唆しており、そして、斜線を入れた部分
は、ＣＦ転写体によって網羅された領域を示唆してい
る。Ｄ７Ｓ２３座に関連したＣｐＧ含量の多い領域（Ｅ
ｓｔｉｖｉｌｌｅら、１９８７，同上）は、カッコに示
したＮｏｔＩ部位にある。カッコまたはカギカッコに示
したこの部位および他の部位は、４ＡＦ／１０２／Ｋ０
１５内で切断せず、しかし、ヒトリンパ芽球性細胞株類
で観察された。２．４ ＣＦ遺伝子の同定 上記で詳細に述べた長い範囲の制限マッピングの知見に
基づき、全ＣＦ遺伝子が、３８０ｋｂのＳａｌＩ断片上
に含有されることが決定された。パルスフィールドゲル
解析から由来する制限部位類の部分重複ゲノムＤＮＡク
ローン類で同定されたそれらとの配列から、このＣＦ遺
伝子の大きさが約２５０ｋｂであることが明らかとなっ
た。クローニングされたＤＮＡ断片類の地図および長い
範囲の制限地図の配列に役だった最も情報に富んだ制限
酵素は、ＸｈｏＩであった；組換えＤＮＡクローン類に
よって同定された９個のＸｈｏＩ部位の全てが、ゲノム
ＤＮＡ中の少なくとも部分切断に感受性であるらしかっ
た（図１および２の地図と比較）。さらに、ＣＦ遺伝子
の３’末端由来プローブ類とのハイブリダイゼーション
解析では、２個のＳｆｉＩ部位が同定され、予測Ｎａｅ
Ｉ部位の位置が確認された。これらの知見は、さらに、
染色体歩行およびジャンピング操作によって単離された
ＤＮＡセグメント類が、真の配列と同一直線にあること
を裏付けた。２．５ 同定の基準 １個以上の下記の基準に基づいた陽性の結果は、クロー
ニングされたＤＮＡセグメントが候補遺伝子配列類を含
有できることを示唆していた： （ａ）他種における交差ハイブリダイズ配列類の検出
（多くの遺伝子類が進化論的保存を示すので） （ｂ）脊椎動物遺伝子類の５’末端を頻繁にマークする
ＣｐＧ島の同定［Ａ．Ｐ．Ｂｉｒｄ，ネーチャー（Ｎａ
ｔｕｒｅ），３２１，２０９（１９８６）；Ｍ．Ｇａｒ
ｄｉｎｅｒ−ＧａｒｄｅｎおよびＭ．Ｆｒｏｍｍｅｒ，
ジャーナル・オブ・モレキュラーバイオロジー（Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．）１９６，２６１（１９８７）］、 （ｃ）ＣＦ患者中の罹患組織中での可能なｍＲＮＡ転写
体の検索、 （ｄ）対応するｃＤＮＡ配列類の単離、 （ｅ）クローニングされたＤＮＡセグメント類の直接配
列決定による読みとり枠の同定。
種間ハイブリダイゼーションは、ＣＦ１４，Ｅ４．３お
よびＨ１．６をプローブとして用いたときにヒトおよび
ウシＤＮＡの間に強い配列保存があることを示してお
り、その結果は、図４Ａ，４Ｂおよび４Ｃに示してあ
る。ヒト、ウシ、マウス、ハムスター、およびニワトリ
ゲノムＤＮＡ類は、ＥｃｏＲＩ（Ｒ），ＨｉｎｄＩＩＩ
（Ｈ）、およびＰｓｔＩ（Ｐ）によって消化され、電気
泳動させ、そして、ゼータバインド（Ｚｅｔａｂｉｎｄ
Ｒ）（バイオラド（ＢｉｏＲａｄ））にブロットされ
た。Ｒｏｍｍｅｎｓら、１９８８，同上のハイブリダイ
ゼーション操作を、５５°Ｃ、０．２Ｘ ＳＳＣ，およ
び０．１％ＳＤＳによる最大緊縮洗浄とともに用いた。
図４のハイブリダイゼーションに使用したプローブ類
は：（Ａ）全コスミドＣＦ１４，（Ｂ）Ｅ４．３、
（Ｃ）Ｈ１．６を含んでいた。図（Ｄ）の略図におい
て、影を付けた領域は、種間保存領域を示している。異
なるサブセットのバンドがこれらの２つの重複するＤＮ
Ａセグメント類（Ｈ１．６およびＥ４．３）で検出され
たという事実は、この保存配列が重複した領域の境界に
位置している（図４（Ｄ））ことを示唆していた。これ
らのＤＮＡセグメント類を用いてさまざまな組織からＲ
ＮＡ転写体を検出するとき、ハイブリダイゼーションシ
グナルが検出された。交差ハイブリダイズ領域を理解し
かつ可能な読みとり枠を同定する試みとして、全Ｈ１．
６のＤＮＡ配列類および前記Ｅ４．３断片の部分を決定
した。結果は、２種の制限酵素（ＢｓｓＨＩＩおよびＳ
ａｃＩＩ）のためのＣＧ含量の多い配列の長い伸長部は
しばしば低メチル化ＣｐＧ島に関連して見られるが、こ
れらを除くと、強い種間ハイブリダイーゼーションシグ
ナル類を容易には説明できない短い読みとり枠しかなか
ったことを示していた。このＣｐＧ高含量の領域の配列
決定によって明らかとなったメチル化状況を調べるため
に、繊維芽細胞およびリンパ芽球性細胞から調製したゲ
ノムＤＮＡ試料を制限酵素ＨｐａＩＩおよびＭｓｐＩに
よって消化し、ゲルブロットハイブリダイゼーションに
よって解析した。酵素ＨｐａＩＩは、第２のシトシンが
低メチル化である時にのみＤＮＡ配列５’−ＣＣＧＧ−
３’を切断し、一方、ＭｓｐＩは、メチル化の状態に関
わらずこの配列を切断する。小さいＤＮＡ断片類は両酵
素によって産生され、このＣｐＧ含量の多い領域が実際
にはゲノムＤＮＡ中において低メチル化であることを示
唆していた。Ｅ４．３セグメント（図６）によるゲルブ
ロットハイブリダイゼーションによって、両酵素によっ
て極めて小さなハイブリダイズ断片類が明らかとなり、
低メチル化ＣｐＧ島の存在を示唆していた。上記の結果
は、この座におけるコード領域の存在を示唆している。
本領域から種間ハイブリダイゼーションシグナル類を検
出するＤＮＡセグメント類（Ｅ４．３およびＨ１．６）
をプローブ類として用いて、数組織および細胞タイプか
ら作成したｃＤＮＡライブラリをスクリーニングした。
培養上皮細胞からのｃＤＮＡライブラリは、下記のよう
にして調製した。ＣＦ患者以外の者およびＣＦ患者から
由来する汗腺細胞を、記載のようにして初代継代した
［Ｇ．Ｃｏｌｌｉｅら、インビトロセルラー・エンド・
デベロップメントバイオロジー（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃ
ｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．）２１，５９２，１９８
５］。外側における整流チャンネルの存在は、これらの
細胞中で確認された（Ｊ．Ａ．Ｔａｂｃｈａｒａｎｉ，
Ｔ．Ｊ．Ｊｅｎｓｅｎ，Ｊ．Ｒ．Ｒｉｏｒｄａｎ，Ｊ．
Ｗ．Ｈａｎｒａｈａｎ，ジャーナル・オブ・メンブレン
バイオロジー（Ｊ．Ｍｅｍｂ．Ｂｉｏｌ．）、印刷中）
が、しかし、このＣＦ細胞類は、サイクリックＡＭＰに
よる活性化に無感受性であった（Ｔ．Ｊ．Ｊｅｎｓｅ
ｎ，Ｊ．Ｗ．Ｈａｎｒａｈａｎ，Ｊ．Ａ．Ｔａｂｃｈａ
ｒａｎｉ，Ｍ．ＢｕｃｈｗａｌｄおよびＪ．Ｒ．Ｒｉｏ
ｒｄａｎ，ペディアトリックパルモノロジー（Ｐｅｄｉ
ａｔｒｉｃ Ｐｕｌｍｏｎｏｌｏｇｙ）、補遺２、１０
０，１９８８）。ＲＮＡは、それらから、Ｊ．Ｍ．Ｃｈ
ｉｒｇｗｉｎら（バイオケミストリ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ）１８，５２９４，１９７９）の方法によって
単離した。ポリＡ＋ＲＮＡが選択され（Ｈ．Ａｖｉｖお
よびＰ．Ｌｅｄｅｒ，プロシーディングズ・オブ・ナシ
ョナルアカデミー・オブ・サイエンシズ米国（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）６９、１４０
８，１９７２）、オリゴ（ｄＴ）１２−１８をプライマ
ーとするｃＤＮＡ合成のための鋳型（テンプレート）と
して使用した。第２の鎖は、ＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆ
ｆｍａｎによって合成した（ジーン（Ｇｅｎｅ）２５，
２６３，１９８３）。これは、ＥｃｏＲＩメチラーゼに
よってメチル化され、末端は、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ
によって平滑にした。リン酸化されたＥｃｏＲＩリンカ
ー類をこのｃＤＮＡに連結し、ＥｃｏＲＩによって制限
した。過剰のリンカーの除去および部分的サイズ分画
は、バイオゲル（Ｂｉｏｇｅｌ）Ａ−５０クロマトグラ
フィによって達成した。このｃＤＮＡ類は、次に市販の
λＺＡＰのＥｃｏＲＩ部位に連結した。組換え体は、大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＢ４中に封入され増殖させた。
この封入された混合物の部分を増幅し、残りは、増幅前
にスクリーニングのために保存した。同一操作を用い
て、Ｔ−８４結腸腫瘍細胞株（Ｄｈａｒｍｓａｔｈａｐ
ｈｏｒｏｎ、Ｋら、アメリカンジャーナル・オブ・フィ
ジオロジー（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．）２４６，Ｇ
２０４，１９８４）の飽和前培養物から単離されたＲＮ
Ａからライブラリを構築した。３つのライブラリの独立
した組換え体の数は、非ＣＦ汗腺細胞について２×１０
６個、ＣＦ汗腺細胞について４．５×１０６個およびＴ
−８４細胞について３．２×１０６個であった。これら
のファージ類は、１５ｃｍプレート当たり５０，０００
個接種し、プラークリフトは、ナイロン膜（バイオダイ
ン（Ｂｉｏｄｙｎｅ））を用いて作成し、そして、ＤＮ
ＡポリメラーゼＩおよびプライマーとしてのオリゴヌク
レオチド類の無作為混合物を用いて３２Ｐで標識したＤ
ＮＡ断片でプロービングした。ハイブリダイゼーション
条件は、Ｇ．Ｍ．ＷａｈｌおよびＳ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ
（メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ．）１５２，４１５，１９８７）によった。
ブルースクリプト（ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＲ）プラスミ
ド類は、Ｍ１３ヘルパーファージによる切断によってプ
ラーク生成クローン類から救援した。肺および膵ライブ
ラリは、クロンテックラボラトリ社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
Ｌａｂ．Ｉｎｃ．）から購入し、その報告された大き
さは１．４×１０６および１．７×１０６個である独立
したクローン類であった。それぞれが１×１０５−５×
１０６個の独立したクローン類を有する７種の異なるラ
イブラリをスクリーニングした後、１個の単一クローン
（１０−１として同定）を、非罹患（非ＣＦ）者の培養
汗腺上皮細胞類から作成したｃＤＮＡライブラリからＨ
１．６によって単離した。ＤＮＡ配列決定解析は、１０
−１が大きさが９２０ｂｐの挿入物および１個の長い潜
在的読みとり枠（ＯＲＦ）を含有することを示してい
た。本配列の１端はＨ１．６と完全な配列同一性を有し
ていたので、ｃＤＮＡクローンがおそらくこの領域から
由来していると結論された。しかし、この共通のＤＮＡ
配列は１１３ｂｐの長さしかなかった（図１および７を
参照）。下記に詳細に記したように、この配列は現実に
推定ＣＦ遺伝子の最も５’側のエクソンに対応してい
た。短い配列の重複はしたがってライブラリスクリーニ
ングにおける弱いハイブリダイゼーションシグナル類お
よびＲＮＡゲルブロット解析における転写体の検出不能
を説明した。さらに、転写単位の方向は、１０−１の推
定ＯＲＦによるゲノムＤＮＡ配列の整列を基準として暫
定的に立証された。この対応する転写体は、ＲＮＡゲル
ブロットハイブリダイゼーション実験によって長さがお
よそ６５００個のヌクレオチドであると推定されたの
で、さらに、ｃＤＮＡライブラリスクリーニングがコー
ド領域の残りをクローニングするために必要となった。
結腸腫瘍細胞株Ｔ８４から作製されたｃＤＮＡライブラ
リによるいくつかの連続スクリーニングの結果、正常お
よびＣＦ汗腺細胞、膵および成人肺、１８個のその他の
クローン類が単離された（さらに詳細には下記で検討し
た、図７）。ＤＮＡ配列解析は、これらのｃＤＮＡクロ
ーン類のいずれも観察された転写体の長さに対応してい
ないことを明らかとしているが、しかし、重複領域類に
基づいて共通配列を誘導することが可能であった。前記
転写体の５’および３’末端に対応する付加的ｃＤＮＡ
クローン類は、５’および３’プライマー伸長実験から
誘導した。これとともに、これらのクローン類は総計で
６．１ｋｂにわたりかつ１４８０アミノ酸残基のポリペ
プチドをコード可能なＯＲＦを含有する。ここで単離さ
れたｃＤＮＡクローン類のほとんどは図７の制限地図の
さまざまな位置における配列挿入物を含有していたこと
を観察したことは異常であった。本地図は、ＣＦ遺伝子
のゲノム構造を詳細に示している。エクソン／イントロ
ン境界が示されており、その中では、単離された全ての
ｃＤＮＡクローン類が図の上半分に概略示されている。
これらの余分な配列類の多くは、ゲノムＤＮＡ配列類と
の配列で明らかなように、ｃＤＮＡ構築の間に逆転写さ
れたイントロン領域に明確に対応していた。ライブラリ
スクリーニングで検出されたＣＦ遺伝子の組換えｃＤＮ
Ａクローン類の数はＲＮＡハイブリダイゼーション実験
で推定された豊富な転写体から予測されるよりもはるか
に少なかったので、異常構造を含有するクローン類が優
先して保存され一方適切なクローン類が増殖時に喪失す
るらしかった。本研究で単離された組換えクローン類の
大半が、この解釈と一致するように、使用したベクター
に無関係に増殖不良であることが観察された。ｃＤＮＡ
の５’および３’末端類を得るために使用した操作は、
記載されたものと類似していた（Ｍ．Ｆｒｏｈｍａｎ
ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナルアカデミー
・オブ・サイエンシズ米国（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、８５、８９９８−９００２，１
９８８））。５’末端クローン類について、総膵および
Ｔ８４ポリＡ＋ＲＮＡ試料を、放射性トレーサーを本反
応に含めた以外はプライマー伸長反応について記載され
たのと同様に、エクソン２に特異的な１個のプライマー
（１０ｂ）を使用して逆転写した。１次鎖合成のアガロ
ースビーズカラムから採取した分画を、溶出分画のポリ
メラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）によってアッセイし
た。使用したオリゴヌクレオチドは、伸長プライマーの
ちょうど５’の１０−１配列内部に（ヌクレオチド１４
５個離れて）あった。ＰＣＲ産物を生成する最初の分画
をプールし、蒸発によって濃縮し、供給者（ＢＲＬラボ
ラトリ（ＢＲＬ Ｌａｂｓ．））が推奨するように末端
デオキシヌクオレチジルトランスフェラーゼ（ＢＲＬラ
ボラトリ）およびｄＡＴＰでその後末端につないだ。次
に、２次鎖合成を、Ｔａｑポリメラーゼ（シータス（Ｃ
ｅｔｕｓ）社、ＡｍｐｌｉＴａｑＲ）によって、末端に
連結したリンカー配列５’ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＧＡＧ
ＡＴＣ（Ｔ）１２３’を含有するオリゴヌクレオチドを
用いて実行した。次に、前記のリンカー配列、およびＥ
ｃｏＲＩ制限部位をその５’末端に有する伸長プライマ
ーのちょうど内側のプライマーを用いる固定（ＰＣＲ）
実験による増幅を、行った。酵素類ＥｃｏＲＩおよびＢ
ｇｌＩＩによる制限およびアガロースゲル精製後、サイ
ズ別に選択した産物を標準的操作によって（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓら、同上）Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから購入可能な
プラスミドブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）
ＫＳへクローニングした。回収されたクローン類の基本
的に全てが３５０個未満ののヌクレオチド類挿入物を含
有していた。３’末端クローン類を得るため、プライマ
ー伸長のそれに類似の条件で、先に記載の末端連結リン
カーオリゴヌクレオチドを用いて、１次鎖ｃＤＮＡを２
μｇのＴ８４ポリＡ＋ＲＮＡの逆転写によって調製し
た。ＰＣＲによる増幅を前記のリンカーオリゴヌクレオ
チドおよびクローンＴ１６−４．５の公知の配列類に対
応する３つの異なるオリゴヌクレオチド類によって実行
した。分取用スケールの反応（２×１００μｌ）を、配
列５’ＡＴＧＡＡＧＴＣＣＡＡＧＧＡＴＴＴＡＧ３’を
有するこれらのオリゴヌクレオチド類のひとつで行っ
た。このオリゴヌクレオチドは、Ｔ１６−４．５の公知
の配列内部のＨｉｎｄＩＩＩ部位の上流の約７０個のヌ
クレオチドである。ＰＣＲ産物のＨｉｎｄＩＩＩおよび
ＸｈｏＩによる制限を行い、次に、アガロースゲル精製
で１．０−１．４ｋｂのバンドをサイズ選択した。この
産物をその後Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから購入可能なプラ
スミドブルースクリプトＫＳ中にクローニングした。得
られたクローンの約２０％をＴ１６−４．５の３’末端
部分にハイブリダイズさせた。これらのクローン類から
単離されたプラスミド類の１０／１０が同一制限地図を
有しており、その挿入物の大きさは、約１．２ｋｂであ
った。ＰＣＲ反応の全てを酵素供給業者が示唆した緩衝
液中で３０サイクル行った。１０−１クローンの５’末
端から１５７ｎｔに位置する伸長プライマーを用いて、
推定ＣＦ転写体の開始点を同定した。このプライマーの
末端を５０００キューリー／ミリモルでγ［３２Ｐ］Ａ
ＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで標識し、ス
パンカラムゲルろ過によって精製した。次に、放射性標
識プライマーをＴ−８４結腸腫瘍細胞から調製した４−
５μｇのポリＡ＋ＲＮＡと２ｘ逆転写酵素緩衝液中で２
時間、６０°Ｃでアニーリングした。希釈およびＡＭＶ
逆転写酵素（ライフサイエンシズ社（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．））の添加後、４１°Ｃにおける
インキュベーションを１時間行った。試料を次に０．４
ＭＮａＯＨおよび２０ｍＭ ＥＤＴＡに調節し、最終的
にＮＨ４ＯＡｃ、ｐＨ４．６で中性とし、フェノール抽
出、エタノール沈澱、ホルムアミドによる緩衝液への再
溶解、さらに、ポリアクリルアミドシークエンシングゲ
ル上での解析を行った。これらの方法の詳細は、記載さ
れている（メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔ
ｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．））１５２，１９８７，Ｓ．Ｌ．
Ｂｅｒｇｅｒ，Ａ．Ｒ．Ｋｉｍｍｅｌ編著，アカデミッ
クプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、Ｎ．
Ｙ．）。１０−１の５’末端からの１５７ヌクレオチド
で開始する伸長オリゴヌクレオチドプライマーを用いる
プライマー伸長実験の結果を、図１０のパネルＡに示し
た。ＨａｅＩＩＩ（ＢＲＬラボラトリ）で消化した末端
標識φＸ１７４バクテリオファージをサイズマーカーと
して使用する。２個の主要産物が、２１６および１００
ヌクレオチドで観察される。１０−１中の１００ヌクレ
オチドに対応する配列は、極めてＧＣ含量の多い配列
（１１／１２）に対応し、これが逆転写酵素停止部位で
ありうることを示唆していた。５’固定ＰＣＲ結果は、
図１０のパネルＢに示してある。左に示した１．４％ア
ガロースゲルをブロットし、ゼータベース（Ｚｅｔａｂ
ａｓｅＲ）膜（バイオラドラボラトリ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ
Ｌａｂ））に移した。放射性標識１０−１とのＤＮＡ
ゲルブロットハイブリダイゼーションは、右に示した。
５’伸長産物は、１７０−２８０ｎｔまで大きさが変化
し、主要産物は約２００ヌクレオチドにあることがわか
る。ＰＣＲ対照レーンは、１４５ヌクレオチドの断片を
示している。それは、１０−１配列内部の試験オリゴマ
ー類を用いて得られた。示したサイズマーカー類は、サ
イズ１５４，２２０／２１０，２９８，３４４，３９４
ヌクレオチド類（１ｋｂラダー（ｌａｄｄｅｒ）は、Ｂ
ＲＬラボラトリから購入した）に対応している。図１０
のパネルＢの下方に示した略図は、図７に示したクロー
ン類ＰＡ３−５およびＴＢ２−７を産生するための増幅
およびクローニングのために使用した２重鎖ｃＤＮＡを
得るための操作を概略したものである。３’末端を特性
解析するための固定ＰＣＲ実験は、パネルＣに示した。
図１０Ｃの下方の略図に示したように、互いの相対位置
が公知である３個のプライマー類を、逆転写されたＴ８
４ＲＮＡによる増幅のために記載のように使用した。こ
れらの産物類は１％アガロースゲル上で分離し、上記に
記載のようにナイロン膜上にブロットした。Ｔ１６−
４．５クローンの３’部分とのＤＮＡ−ブロットハイブ
リダイゼーションは、使用した特定オリゴマーおよび転
写体の３’末端の間の距離に対応する大きさのバンド類
を産生した。レーン１、２ａおよび３内のこれらのバン
ド類は、図１０のパネルＣの下に概略示してある。レー
ン３のバンドは、このセグメントのヌクレオチド６０個
しか使用しなかったプローブと重複しないので、弱い。
同様に略図に示しかつレーン２ｂに示したように、固定
ＰＣＲ産物の制限によって産生された産物はクローニン
グを促進し、図７に示したＴＨＺ−４クローンを産生す
る。全転写体を網羅するｃＤＮＡ類の部分をプローブと
したＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ酵素類によって消
化したゲノムＤＮＡのＤＮＡ−ブロットハイブリダイゼ
ーション解析から、本遺伝子がローマ数字ＩからＸＸＩ
Ｖまでとして番号を付けた少なくとも２４個のエクソン
類を含有することを示唆している（図９参照）。これら
は、図７に示した数値１から２４までに対応する。各バ
ンドの大きさは、ｋｂで示してある。図７において、白
色の四角は、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニングから
および前記の５’および３’末端をクローニングするた
めに設計された固定ＰＣＲ実験から２２個を越えるクロ
ーン類を単離することによって同定された２４個のエク
ソン類のおよその位置を示している。各エクソンによっ
て検出されたＥｃｏＲＩゲノム断片のｋｂ単位の長さ
も、また、示した。図７の斜線入り四角は、イントロン
配列類の存在を示唆しており、かつ、点線入り四角は、
他の配列類を示している。左下に閉鎖四角で示したの
は、正常汗腺ライブラリの１０６個のファージ中から最
初のｃＤＮＡクローンを検出するために使用したクロー
ンＨ１．６の相対位置である。図４（Ｄ）および７に示
したように、このゲノムクローンＨ１．６は、部分的に
４．３ｋｂのＥｃｏＲＩ断片と重複する。示したｃＤＮ
Ａクローン類の全てがゲノムＤＮＡにハイブリダイズ
し、および／または制限地図上に良好にマッピングされ
た。このｃＤＮＡ類内部または対応するゲノム断片類中
に出現する制限部位類の例を示した。図９を参照とし
て、ハイブリダイゼーション解析は、プローブ類；すな
わち、パネルＡについてｃＤＮＡクローン類、パネルＢ
についてＴ１６−１（３’部分）、パネルＣについてＴ
１６−４．５（中央部分）およびパネルＤについてＴ１
６−４．５（３’末端部分）を含む。図９のパネルＡに
おいて、ｃＤＮＡプローブ１０−１は、エクソンＩから
ＶＩまでのゲノムバンド類を検出している。ＮｒｕＩ制
限によって作製されたＴ１６−１の３’部分は、パネル
Ｂに示したようにエクソンＩＶからＸＩＩＩまでを検出
する。このプローブは、１０−１と部分的に重複する。
パネルＣおよびＤは、それぞれ、クローンＴ１６−４．
５の中央および３’末端ＥｃｏＲＩ断片類によって検出
されるゲノムバンド類を示している。２個のＥｃｏＲＩ
部位がｃＤＮＡ配列内部に出現し、エクソンＸＩＩＩお
よびＸＩＸを分割する。カッコ内のエクソン類によって
示したように、２個のゲノムＥｃｏＲＩバンド類がこれ
らのエクソン類のそれぞれに対応する。他のゲノム断片
類への交差ハイブリダイゼーションが観察された。これ
らのバンド類はＮによって示され、それらはヒト染色体
７を含有するヒト−ハムスターハイブリッド中に出現し
ないので、染色体７起源のものではない。カギカッコ中
のＸＩによって示したパネルＤ中のかすかなバンドは、
前記ｃＤＮＡとの内部相同性による配列類の交差ハイブ
リダイゼーションが原因であると確信されている。Ｔ−
８４結腸腫瘍細胞株由来ＲＮＡのゲルブロットハイブリ
ダイゼーション上で１０−１が強いバンドを検出したの
で、このｃＤＮＡを用いてその起源から構築されたライ
ブラリをスクリーニングした。１５個の陽性物が得ら
れ、それから、クローン類Ｔ６，Ｔ６／２０，Ｔ１１，
Ｔ１６−１およびＴ１３−１が精製されかつ配列決定さ
れた。同ライブラリをＴ１６−１の３’末端からのＢａ
ｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片０．７５ｋｂで再度スクリーニ
ングして、Ｔ１６−４．５を生成した。Ｔ１６−４．５
の３末端からの１．８ｋｂのＥｃｏＲＩ断片は、Ｔ８−
Ｂ３およびＴ１２ａを生成し、この後者は、ポリアデニ
ル化シグナルおよび末端を有していた。同時に、ヒト肺
ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングした；ここで接頭
辞”ＣＤＬ”によって示したものを含めて多くのクロー
ン類が単離された。膵ライブラリを同様にスクリーニン
グして、クローンＣＤＰＪ５を生成した。この転写体コ
ピーをＣＦ患者から得るため、患者１例からの汗腺上皮
細胞のｃＤＮＡライブラリを、Ｔ１６−１の３’末端か
らの０．７５ｋｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片によっ
てスクリーニングして、エクソン１を除く全てを包含す
るクローン類Ｃ１６−１およびＣ１−１／５を単離し
た。これら２種のクローン類は両方ともエクソン１０中
の３ｂｐの欠損を示し、これは、そのエクソンを有する
他の全てのクローンに存在していない。肺ライブラリ由
来のＣＤＬＳ２６−１およびＴ８４から単離されたＴ６
／２０およびＴ１３−１は、部分処理転写体類から誘導
した。このことは、ゲノムハイブリダイゼーションによ
っておよび各クローンのためのエクソン−イントロン境
界を横切る配列決定によって確認した。Ｔ１１は、同様
に、各末端で付加的配列を有していた。Ｔ１６−４．５
は、イントロン配列に対応しないエクソン類１０および
１１の間の境界近傍で小さい挿入物を有していた。肺ラ
イブラリからのクローン類ＣＤＬＳ１６Ａ，１１Ａおよ
び１３Ａは，同様に、未知の起源の外来性配列類を有し
ていた。このクローンＣ１６−１は、また、大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）のγ−トランスポゾンの１部分に対応
する短い挿入物を含有していた；この要素は、他のクロ
ーン中で検出されなかった。膵ＲＮＡから作製された
５’クローン類ＰＡ３−５および固定ＰＣＲ法を用いて
Ｔ８４ＲＮＡから作製されたＴＢ２−７は、図１に示し
たように５’末端における１個のヌクレオチドの長さに
おける差異を除いて同一の配列を有している。Ｔ８４Ｒ
ＮＡから得られた３’クローンのＴＨＺ−４は、この領
域のゲノム配列に一致する転写体の３’配列を有してい
る。ＣＦ遺伝子の推定コード領域を示す組み合わせ配列
は、重複するｃＤＮＡクローン類から作製された。ｃＤ
ＮＡクローン類のほとんどが明らかに未処理転写体から
誘導されたので、この組み合わせ配列の正確さを確認す
るためにさらに研究を行った。各ｃＤＮＡクローンにつ
いて、１個のヒト染色体７を含有するヒト−ハムスター
体細胞ハイブリッドによるハイブリダイゼーション解析
によっておよびパルスフィールドゲル電気泳動によって
染色体７に対する局在を最初に試験した。微細な制限酵
素マッピングを各クローンについて同様に行った。重複
する領域が明らかにクローン類のほとんどについて同定
可能であるので、多くが、独自の制限パターンの領域を
含有していた。さらにこれらのｃＤＮＡクローン類を解
析するために、これらをプローブ類としてＥｃｏＲＩ−
またはＨｉｎｄＩＩＩで消化したヒトゲノムＤＮＡによ
るゲルハイブリダイゼーション実験で用いた。図９に示
したように、５個乃至６個の異なる制限断片類が、１０
−１ｃＤＮＡによって検出でき、かつ、類似数の断片類
が他のｃＤＮＡクローン類で検出でき、推定ＣＦ遺伝子
のために複数のエクソン類が存在することを示唆してい
る。このハイブリダイゼーション研究は、また、未処理
イントロン配列類を有するｃＤＮＡクローン類がゲノム
ＤＮＡ断片類のサブセットに対して優先的なハイブリダ
イゼーションを示したので、これらを同定した。確認さ
れたｃＤＮＡクローン類について、それらの対応するゲ
ノムＤＮＡセグメント類が単離されかつエクソン類およ
び／またはエクソン／イントロン境界が配列決定され
た。図７に示したように、総計２４個のエクソン類が識
別された。この情報および物理的マッピング実験の結果
に基づいて、遺伝子座が染色体７上で２５０ｋｂに及ぶ
と推定された。２．６ 配列 図１は、演繹されたアミノ酸配列とともに、ＣＦＴＲを
コードするクローニングされたｃＤＮＡのヌクレオチド
配列を示している。最初の塩基位置は、Ｔｂ２−７より
もヌクレオチド１個だけ長い５’伸長クローンＰＡ３−
５中の最初のヌクレオチドに対応する。矢印は、プライ
マー伸長解析による転写開始部位の位置を示している。
ヌクレオチド６１２９の後にポリ（ｄＡ）鎖（ｔｒａｃ
ｔ）が続く。エクソン結合部の位置は、垂直腺によって
示唆される。膜を貫通する潜在的セグメント類は、Ｅｉ
ｓｅｎｂｅｒｇら、ジャーナル・オブ・モレキュラーバ
イオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）１７９：１２５
（１９８４）のアルゴリズムを用いて確認した。解析し
かつ図１１に示した膜をおおう潜在的セグメント類は、
図１の四角に囲んだ。図１１において、残基９個のペプ
チド類の平均ヒドロパシー係数［ＫｙｔｅおよびＤｏｏ
ｌｉｔｔｌｅ，ジャーナル・オブ・モレキュラーバイオ
ロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）１５７：１０５、
（１９８２）］をアミノ酸の数に対してプロットする。
Ｇａｒｎｉｅｒら、（ジャーナル・オブ・モレキュラー
バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）１５７、１６
５（１９８２））によって予測した２次構造特徴の対応
する位置は、下のパネルに示した。推定上のＡＴＰ結合
折り畳みからなるアミノ酸類は、図１でアンダーライン
を付けた。プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）またはＣ
（ＰＫＣ）によってリン酸化が可能な部位は、白丸およ
び黒丸によってそれぞれ示してある。白三角は、ＣＦに
おいて欠失している３ｂｐ（ＣＴＴ）上にある。図１の
このｃＤＮＡクローン類は、ジュポンジェネシス（Ｄｕ
Ｐｏｎｔ Ｇｅｎｅｓｉｓ）２０００Ｒ自動ＤＮＡシー
クエンサーにより３５Ｓ標識ヌクレオチド類を用いたジ
デオキシチェーン法によって配列決定した。組み合わせ
たｃＤＮＡ配列は、未翻訳領域の３’末端のポリ（Ａ）
テイルを除く６１２９塩基対を跨いでおり、そして、１
４８０個のアミノ酸のポリペプチドをコード可能なＯＲ
Ｆを有している（図１）。ＡＴＧトリプレット（ＡＵ
Ｇ）が、このＯＲＦの最初に存在している（塩基位置１
３３−１３５）。このコドン（５’−ＡＧＡＣＣＡＵＧ
ＣＡ−３’）を取り囲むこのヌクレオチド配列は、真核
生物翻訳開始部位の共通配列（ＣＣ）Ａ／ＧＣＣＡＵＧ
Ｇ（Ｇ）の提起された特徴を−３位の高度に保存された
Ａとともに有しているので、このＡＵＧが推定ポリペプ
チドの最初のメチオニンコドンに対応すること可能性が
極めて高い。転写体の５’末端に対応する配列を得るた
め、プライマー−伸長実験を先にも述べたように実施し
た。図１０Ａに示したように、約２１６個のヌクレオチ
ド類のプライマー伸長産物が観察され、前記転写体の
５’末端がｃＤＮＡクローン１０−の末端の上流の約６
０個のヌクレオチドで開始することを示唆していた。次
に修飾されたポリメラーゼチェーン反応（固定ＰＣＲ）
を用いて、この５’末端配列類のクローニングを促進し
た（図１０ｂ）。２個の独立した５’伸長クローン類は
ひとつは膵由来で他方はＴ８４ＲＮＡ由来であり、ＤＮ
Ａ配列決定によって特性解析し、長さで１塩基しか違わ
ないことが見いだされ、図１に示したように最も可能性
の高い転写開始部位を示唆していた。開始ｃＤＮＡクロ
ーン類のほとんどはｍＲＮＡ末端を示唆するポリＡテイ
ルを有していないので、固定ＰＣＲを同様に転写体の
３’末端に適用した（Ｆｒｏｈｍａｎら、１９８８，同
上）。３個の３’伸長オリゴヌクレオチド類をｃＤＮＡ
クローンＴ１６−４．５の末端部分に対して作製した。
図１０ｃに示したように、異なる大きさの３個のＰＣＲ
産物が得られた。全てが転写体の末端がヌクレオチド５
０２７位ＩＩおけるＨｉｎｄＩＩＩ部位の下流のおよそ
１．２ｋｂであるという解釈と矛盾していなかった（図
１参照）。代表的クローン類から誘導したＤＮＡ配列
は、Ｔ８４ｃＤＮＡクローンＴ１２ａのそれ（図１およ
び７参照）、その対応する２．５ｋｂのＥｃｏＲＩゲノ
ム断片の配列と一致していた。３．０ ＣＦの分子遺伝学 ３．１ 発現部位 推定ＣＦ遺伝子のための転写体を可視化するため、ＲＮ
Ａゲルブロットハイブリダイゼーション実験をプローブ
としての１０−１ ｃＤＮＡで行った。ＲＮＡハイブリ
ダイゼーション結果は、図８に示した。ＲＮＡ試料は、
外科病理からまたは剖検で得られた組織試料から先に記
載の方法にしたがって調製した（Ａ．Ｍ．Ｋｉｍｍｅ
ｌ，Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ，編著、メソッズ・イン・エ
ンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．）１５
２，１９８７）。ホルムアルデヒドゲルをナイロン膜に
移した（ゼータプローブ（ＺｅｔａｐｒｏｂｅＲ）；バ
イオラドラボラトリ（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂ．））。先
に公表された操作（Ｊ．Ｒｏｍｍｅｎｓら、アメリカン
ジャーナル・オブ・ヒューマンジェネティックス（Ａ
ｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）４３，６４５−６６
３，１９８８）にしたがって、ランダムプライミング法
によってこの膜を次に標識されたＤＮＡプローブ類と高
比放射能となるまでハイブリダイズさせた（Ａ．Ｐ．Ｆ
ｅｉｎｂｅｒｇおよびＢ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、アナ
リティカルバイオケミストリ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．）１３２，６，１９８３）。図８は、ｃＤＮＡクロ
ーン１０−１による示した組織中における６．５ｋｂの
転写体へのハイブリダイゼーションを示している。各組
織の総ＲＮＡ（１０μｇ）およびＴ８４結腸腫瘍細胞株
のポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（１μｇ）は、１％ホルムアルデ
ヒドゲル上で分離した。２８Ｓおよび１８Ｓ ｒＲＮＡ
バンド類の位置を示している。矢印は、転写体の位置を
示している。ＲＮＡマーカー標準物質（ＢＲＬラボラト
リ）との比較によって、大きさを決めた。ＨＬ６０はヒ
ト前骨髄細胞性白血病細胞株であり、Ｔ８４はヒト結腸
癌細胞株である。解析から、Ｔ８４細胞中において大き
さが約６．５ｋｂの顕著なバンドが明らかとなった。同
様に、強いハイブリダイゼーションシグナルが膵および
鼻ポリープ由来細胞の初代培養中で検出され、推定ＣＦ
遺伝子の成熟ｍＲＮＡが約６．５ｋｂであることを示唆
している。おそらく分解産物を示しているのであろう小
さなハイブリダイゼーションシグナルが、低サイズ範囲
で検出されたが、それらは、異なる実験間で変化してい
た。同一の結果が、他のｃＤＮＡをプローブとしても得
られた。ハイブリダイゼーションバンド強度および他の
転写体について同一実験条件下で検出されたそれらとの
比較に基づき、推定ＣＦ転写体がＴ８４細胞中の総ｍＲ
ＮＡのおよそ０．０１％を構成すると推定した。いくつ
かの他の組織も、１０−１遺伝子の発現パターンとＣＦ
の病理を相関させるためにＲＮＡゲルブロットハイブリ
ダイゼーション解析によって調べた。図８に示したよう
に、全て同一サイズの転写体が、肺、結腸、汗腺（培養
上皮細胞）、胎盤、肝、および耳下腺で見られたが、こ
れらの組織におけるシグナル強度は調製物が異なると変
化し、かつ、膵および鼻ポリープ中で検出されるそれよ
りも一般に弱かった。強度は調製物が異なると変化して
おり、たとえば、腎におけるハイブリダイゼーション
は、図８に示した調製物中で検出されなかったが、以後
アッセイを繰り返して識別できる。脳または副腎ではい
かなるハイブリダイゼーションシグナルも識別できず
（図８）、または、皮膚繊維芽細胞およびリンパ芽球性
細胞株でも識別できなかった。要約すれば、ＣＦ遺伝子
の発現は調べた組織の多くで起こるらしかったが、ＣＦ
に重篤に罹患している組織中で高レベルであった。この
上皮組織特異的発現パターンは本疾患の病理と極めてよ
く一致している一方で、ＣＦおよび対照組織由来転写体
の量および大きさには有意な差が検出されず、ＣＦ変異
がヌクレオチドレベルにおけるわずかな変化であるとい
う仮定と一致している。３．２ 主なＣＦ変異 図１７は、Ｆ５０８欠失におけるＤＮＡ配列を示してい
る。左は、（ｃＤＮＡクローンＴ１６から誘導した）正
常配列の塩基位置１６４９−１６６４からの配列の逆転
写である。このヌクレオチド配列は、ジュポンジェネシ
ス（ＤｕＰｏｎｔ Ｇｅｎｅｓｉｓ）２０００ＲＮＡ解
析システムの２個の光電子増倍管（ＰＭＴ＃１および＃
２）のそれぞれについて時間（ｘ軸）に対してプロット
した（勝手に付けた蛍光強度単位による、ｙ軸）出力と
して表示されている。対応するヌクレオチド配列は、下
方に示されている。右は、（ｃＤＮＡクローンＣ１６か
ら誘導した）変異配列からの同一領域である。２重鎖プ
ラスミドＤＮＡテンプレートは、アルカリ溶解操作によ
って調製した。アニーリングを４５°Ｃで３０分間行っ
たことおよび伸長／終止段階を４２°Ｃで１０分間行っ
たことを除いて、ＤｕＰｏｎｔによって推奨されたプロ
トコールにしたがって、プラスミドＤＮＡ５μｇおよび
オリゴヌクレオチドプライマー７５ｎｇを各配列決定反
応に使用した。非取り込み蛍光ヌクレオチド類は、ｐＨ
７．０の２．５Ｍ酢酸アンモニウムの存在下におけるＤ
ＮＡ配列決定反応産物のエタノール沈澱によって除去
し、７０％エタノールで１回洗浄した。Ｔ１６−１配列
決定のために使用したプライマーは、塩基位置１７０８
−１７３１にまたがる特異的オリゴヌクレオチド５’Ｇ
ＴＴＧＧＣＡＴＧＣＴＴＴＧＡＴＧＡＣＧＣＴＴＣ３’
であり、Ｃ１６−１に対するそれは、ブルースクリプト
ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に対する普遍的プラ
イマーＳＫであった。図１８は、また、手動配列決定に
よって決定したＦ５０８欠失の周りのＤＮＡ配列を示し
ている。（ｃＤＮＡ Ｔ１６−１からの）塩基位置１７
２６−１６５１からの正常配列を（ｃＤＮＡＣ１６−１
からの）ＣＦ配列の側に示した。左のパネルは、Ｂプラ
イマー（５’ＧＴＴＴＴＣＣＴＧＧＡＴ−ＴＡＴＧＣＣ
ＴＧＧＧＣＡＣ３’）によって得られたコード鎖からの
配列を示しており、かつ、右のパネルは、Ｄプライマー
（５’ＧＴＴＧＧＣＡＴＧＣＴＴＴＧＡＴＧＡＣＧＣＴ
ＴＣ３’）による反対鎖のそれらを示している。カギカ
ッコは、ＣＦにはない正常者の３個のヌクレオチド類を
示している（矢印先端）。配列決定は、Ｆ．Ｓａｎｇｅ
ｒ、Ｓ．Ｎｉｃｋｌｅｎ，Ａ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｅｎ、プ
ロシーディングズ・オブ・ナショナルアカデミー・オブ
・サイエンシズ米国（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ）７４；５４６３（１９７７）に記載のよ
うにして行った。この欠失を有するＣＦ患者の割合を調
べるため、患者およびその親からのゲノムＤＮＡ試料を
それぞれこの変異に隣接するオリゴヌクレオチドプライ
マー類でポリメラーゼチェーン反応で増幅し、正常およ
び推定変異配列類（図２参照）に特異的な３２Ｐ標識オ
リゴヌクレオチド類にハイブリダイズさせた。本解析の
結果は、表２に示してある。
ＣＦ−ＰＩ（膵不全）およびＣＦ−ＰＳ（膵良好）染色
体のデータは、我々の連結解析で使用したＣＦ家族から
誘導した。これらの家族は、当初ＰＩまたはＰＳの知識
もなく選択された；その後同定されたＣＦ−ＰＳの１５
家族は、この計算の一部には入れなかった。未分類のＣ
Ｆ染色体は、トロント小児病院のＤＮＡ診断室（ＤＮＡ
Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｔ
ｔｈｅＨｏｓｐｉｔａｌ ｆｏｒＳｉｃｋ Ｃｈｉｌｄ
ｒｅｎ）から得られ、それらについての膵機能データは
入手できなかった。一般患者群のＣＦ染色体の６８％
（１４５／２１４）は、Ｆ５０８欠失を有していた（表
２）。対照的に、Ｎ染色体では、この欠失を有するもの
は皆無であり（０／１９８）（表２；χ２＝２０７，ｐ
＜１０−５７．５）、この配列変化がＣＦに特異的であ
ることおよびそれが本疾患を起こす主な変異であること
を示唆していた。Ｆ５０８欠失とＣＦとの間に全く組換
えは検出されなかった。配列の他の差異は、正常（Ｔ１
６−４．５）およびＣＦ（Ｃ１−１／５）ｃＤＮＡクロ
ーン類との間で見られた。Ｔ１６−４．５は、塩基位置
２６２９で１個のＣを示し、Ｃ１−１／５は１個のＴを
示し、その結果、アミノ酸レベルでロイシン（Ｌｅｕ）
からフェニルアラニン（Ｐｈｅ）への変化を起こしてい
る。一４５４５で、塩基はＴ１６−４．５でＧである
が、Ｃ１−１／５ではＡであった（ＶａｌからＭｅ
ｔ）。これらの知見は、配列多形性を表すと確信され
る。患者／家族ＤＮＡの特異的オリゴヌクレオチドハイ
ブリダイゼーション解析によって、これらが他の変異可
能性として同定されるであろう。さらに、ヌクレオチド
における差異が、異なるｃＤＮＡクローン類とゲノムＤ
ＮＡ配列との間の３’未翻訳領域で観察された。配列の
このような差異および認識された他の配列修飾が可能で
ある；たとえば、この差異が正常配列多形性およびクロ
ーニングアーティファクトによるものであり、このよう
な差異の全てがその機能およびその商業的適用の観点か
らして図１に記載のような配列に基本的に等価である。
さらに遺伝的および物理的マッピングデータは、染色体
上の小セグメントのＤＮＡを中心とする分子クローニン
グ研究に向けられた。ＣＦにおける染色体欠失および再
配列（の知識が）が欠けているためにおよびＣＦ遺伝子
産物のための十分に開発された機能的アッセイがないた
めに、ＣＦ遺伝子の同定では、座そのものの詳細な特性
解析およびＣＦおよび正常（Ｎ）対立遺伝子の間の比較
を必要とした。ランダム（遺伝的に浮動性）で表現型で
は正常な者は、この群において無症状のキャリアーが高
頻度であることから前記の比較の対照には入れなかっ
た。その結果、それぞれが１個のＮおよび１個のＣＦ染
色体を有すると定義されているＣＦ患者の両親のみが、
本解析に適していた。さらに、ＣＦおよび近接連結ＤＮ
Ａマーカーの一部の間で観察された強い対立遺伝子関連
の故に、ＮおよびＣＦの間に検出された配列差異が本疾
患座に関連する多形性である可能性を除外することが必
要になった。３．３ ＲＦＬＰ類および家族研究の同定 染色体歩行およびジャンピング実験から単離されたＤＮ
Ａセグメント類のそれぞれのＣＦとの関係を決定するた
め、制限断片長多形性（ＲＦＬＰ類）を同定しかつＣＦ
と他の隣接ＤＮＡマーカーとの間に交雑事象が過去に観
察されている家族を研究するために用いた。図１４に示
したように、総計１８種のＲＦＬＰ類が５００ｋｂ領域
に検出された；それらの内の１７（Ｅ６からＣＥ１．０
まで）を表３に列挙した；それらの一部は、先に報告さ
れたマーカー類に対応していた。ＲＦＬＰ類の５つが、
すなわち、１０−１Ｘ．６，Ｔ６／２０，Ｈ１．３およ
びＣＥ１．０が、推定ＣＦ遺伝子から誘導したｃＤＮＡ
およびゲノムＤＮＡプローブ類で同定された。このＲＦ
ＬＰデータは表３に示してあり、ＭＥＴおよびＤ７Ｓ８
領域中のマーカー類も比較のために示してある。これら
のマーカー間の物理的距離ならびにＤ７Ｓ８に対する関
連を図１４に示した。
表３の注 （ａ）ＮおよびＣＦ−ＰＩ（膵不全ＣＦ）染色体の数
は、関連解析に含めた家族の両親から誘導した［Ｔｓｕ
ｉら、コールドスプリングハーバーシンポジウム（Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．）クオ
ンティテイティブバイオロジー（Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏ
ｌ．）５１：３２５（１９８６）］。
（ｂ）Ｎ染色体中におけるＤＮＡマーカー対立遺伝子分
布の変動で余り影響を受けない標準化された関係（Ａ）
をここで用いて、ユール（Ｙｕｌｅ）の連関係数Ａ＝
（ａｄ−ｂｃ）／（ａｄ＋ｂｃ）（式中、ａ，ｂ，ｃお
よびｄはＮ染色体の数であり、それぞれ、ＤＮＡマーカ
ー対立遺伝子は１、ＣＦは１、Ｎは２、ＣＦは２であ
る）を比較した。相対リスクは、関係ＲＲ＝（１＋Ａ）
／（１−Ａ）またはその逆数を用いて計算できる。
（ｃ）Ａ．Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉら、アメリカンジャ
ーナル・オブ・ヒューマンジェネティックス（Ａｍ．
Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）３６，１２３９、（１９８
４）によって本群におけるＣＦ染色体の頻度を０．０２
と想定し計算した対立遺伝子連関（＊）は、比較のため
に含めてある。
本解析で利用できた組換え家族の数が研究したマーカー
類とＣＦとの距離が近接していることから予測されたよ
うに少ないために、また、診断過失の可能性のために、
さらにＣＦ遺伝子の微細マッピングにおいて別の手法が
必要であった。３．４ 対立遺伝子連関 対立遺伝子連関（連関非平衡）は、多くの近接連関ＤＮ
Ａマーカー類について検出された。対立遺伝子連関の遺
伝子距離測定における用途は不確かである一方で、ＣＦ
と隣接ＤＮＡマーカー類との間で全体としての相関が観
察された。ＣＦによる強い関連が、より近接したＤＮＡ
マーカー類、Ｄ７Ｓ８およびＤ７Ｓ１２２について注目
され、一方、距離がより離れたマーカー類、ＭＥＴ、Ｄ
７Ｓ８またはＤ７Ｓ２４についてはほとんどまたは全く
関連が検出されなかった（図１参照）。３にも示したよ
うに、ＤＮＡマーカー類とＣＦとの間の連関の程度は、
（ユールの連関係数によって測定したように）ｍｅｔＨ
について０．３５からおよびＪ３２について０．１７か
ら１０−１Ｘ．６について０．９１まで（ＣＦ−ＰＩ患
者家族のみを本解析で使用。彼らが、ＣＦ−ＰＳよりも
遺伝的により均質であるように見えたので。）連関係数
は、ＥＧ１．４からＨ１．３で３００ｋｂにわたってや
や一定しているように見えた；数個の位置で検出された
変動は、特にＨ２．３Ａ、Ｅ４．１およびＴ６／２０で
最も顕著であったのは、おそらく、Ｎ染色体中における
対立遺伝子分布の変動が原因であったのだろう（表２参
照）。これらのデータは、したがって、組換え家族の研
究からの結果と矛盾していなかった（図１４参照）。同
様に、ＣＦ染色体類に関連する伸長されたＤＮＡマーカ
ーハプロタイプ類を調べることによって、類似の結論に
至った（下記参照）。しかし、ＥＧ１．４とＨ１．３の
長い物理的距離にわたって検出された強い対立遺伝子連
関も、ＣＦ遺伝子のより詳細なマッピングをさらに可能
とすることはなかった。Ｊ４４は染色体歩行およびジャ
ンピングによってｃＤＮＡクローンが同定される前に単
離された最後のゲノムＤＮＡクローンであるので、前記
のＪＧ２Ｅ１−Ｊ４４区間について検出された強い対立
遺伝子連関によって、我々は、この全長にわたり候補遺
伝子配列類を検索することになった。最大の対立遺伝子
連関が、実際には、ＣＦおよび１０−１Ｘ．６によって
検出された２個のＲＦＬＰ類の間で主要ＣＦ変異近傍領
域で検出された。表４は、ＣＦに近接して連関するＤＮ
Ａマーカー類間の対になった対立遺伝子連関を示してい
る。これらの計算で用いた平均染色体数は、７５−８０
であり、ＣＦ−ＰＩ家族由来染色体のみをＣＦ染色体を
数える際に使用した。類似の結果が、ユールの標準化さ
れた連関（ａ）を使用したときに得られた）。
強い対立遺伝子連関は、また、ＣＦおよびＮ染色体の両
方で小群のＲＦＬＰ類中でも検出された。表４に示した
ように、互いに物理的に近接しているＤＮＡマーカー類
は一般に互いに強い連関を有しているようであった。た
とえば、強い（一部の場合では、ほとんど完全な）対立
遺伝子連関は、隣接マーカー類Ｅ６およびＥ７の間、ｐ
Ｈ１３１およびＷ３Ｄ１．４の間、１０−１Ｘ．６によ
って検出されかつＥＧ１．４，ＪＧ２Ｅ１，Ｅ２．６
（Ｅ．９），Ｅ２．８およびＥ４．１中で検出されたＡ
ｃｃ−およびＨａｅＩＩＩ多形性部位類の間で検出され
た。ＭＥＴおよびＤ７Ｓ８領域中の遠位マーカー類の前
記２群は、また、それ自体の間である程度の連関非平衡
を示したが、それらは、Ｅ６からＣＥ１．０までのマー
カー類との連関をほとんど示さず、ＭＥＴとＤ７Ｓ８の
遠い位置と矛盾していなかった。一方、物理的に近接し
ているＤＮＡマーカー間に関連がないことは、組換えホ
ットスポットの存在を示唆するかも知れない。これらの
潜在的ホットスポットの例として、Ｅ７およびｐＨ１３
１との間、Ｈ２．３Ａの近傍、Ｊ４４とプローブ類１０
−１Ｘ．６およびＴ６／２０によって網羅される領域と
の間の領域が挙げられる（図１４参照）。頻度の高い組
換え切断点を含有するこれらの領域は、ＣＦ領域のため
の伸長ハプロタイプデータの以下の解析で有用であっ
た。３．５ ハプロタイプ解析 ２３個のＤＮＡマーカー類に基づいた伸長ハプロタイプ
類は、先に関連解析で使用した収集された家族中のＣＦ
およびＮ染色体類について作製された。異なるハプロタ
イプの染色体間の組換えを想定して、観察されたＣＦ染
色体類のいくつかの系統を構築すること、および本疾患
座の位置を予測することが可能であった。異なるＣＦ変
異の性質を理解するために有用な情報をさらに得るた
め、Ｆ５０８欠失データを伸長ＤＮＡマーカーハプロタ
イプ類と相関させた。表５に示したように、ＮおよびＣ
Ｆハプロタイプの５種の主な群が、推定ＣＦ遺伝子内部
またはそれに直接隣接する（領域６−８）ＲＦＬＰ類に
よって定義された。
表５（続き） （ａ） 伸長されたハプロタイプデータは、先の連関研
究で使用したＣＦ家族（表３の脚注（ａ）参照）ならび
にその後収集したＣＦ−ＰＳ家族（Ｋｅｒｅｍら、アメ
リカンジャーナル・オブ・ヒューマンジェネテックス
（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）４４：８２７（１
９８９））から誘導した。このデータは、紙面削減のた
め群（領域）別に示してある。領域は、表４に示した対
にした関連データにしたがって、おもに示されており、
領域６−８は、推定ＣＦ座（Ｆ５０８）にまたがる領域
であり、欠失は領域６と７の間にある。棒線−は、不完
全データまたは相確立が不可であったためにハプロタイ
プが決定されなかった領域に示されている。異なるハプ
ロタイプ認定もデータが不完全である場合に示してあ
る。未分類には、３個以上の分類不明の染色体を含めて
ある。９つの各領域のハプロタイプ定義は、下記のよう
である： （ｂ）各群で数えた染色体の数： ＣＦ−ＰＩ（Ｆ）＝Ｆ５０８欠失を有するＣＦ−ＰＩ患
者からのＣＦ染色体類； ＣＦ−ＰＳ（Ｆ）＝Ｆ５０８欠失を有するＣＦ−ＰＳ患
者からのＣＦ染色体類； ＣＦ−ＰＩ＝ＣＦ−ＰＩ患者からの他のＣＦ染色体類； ＣＦ−ＰＳ＝ＣＦ−ＰＳ患者からの他のＣＦ染色体類； Ｎ＝キャリアー両親から誘導した正常染色体類。
ほとんどの組換えは領域１と２および領域８と９の間に
起こることが明らかで、再度、これらの領域間の相対的
に長い物理的距離と良好な一致を示していた。より頻度
は低いが他の切断点も短距離区間に観察され、それら
は、一般に、上記に示した対になった対立遺伝子関連研
究によって同定されたホットスポットに対応していた。
驚くべき結果として、このＦ５０８欠失が、最も頻度が
高いＣＦハプロタイプであるＩ群とほとんど独占的に関
連していたことが挙げられ、この欠失がＣＦにおける主
な変異を構成しているという見解を裏付けている。さら
に重要であることとして、このＣＦ染色体の８９％（６
２／７０）で検出され、ＡＡハプロタイプ（前記２個の
領域６と７に対応している）が前記欠失に隣接している
が、同一群内部で１４Ｎ染色体類中で全く見られなかっ
た（χ２＝４７．３，ｐ＜１０−４）ことである。この
Ｆ５０８欠失は、したがって、Ｉ群のハプロタイプのコ
アに関連した共通の配列多形性ではなかった（表５参
照）。Ｆ５０８欠失のための特異的オリゴヌクレオチド
プローブによって検出されたＣＦ染色体類のひとつは、
異なるハプロタイプ群（ＩＩＩ群）に属していることが
判明した。同一群の他の９個のＣＦ染色体または１７Ｎ
染色体類のいずれもこのプローブにハイブリダイズしな
かった。この特異的ハイブリダイゼーション結果は、こ
の染色体に含まれる変異がＦ５０８に類似していること
を示唆している。組換えまたは遺伝子変換はＩ群以外の
ハプロタイプ上における欠失の存在を説明できるメカニ
ズムではあるが、これらの２種のＩＩＩ群染色体類が再
発変異事象、すなわち、βグロビン座におけるβＳおよ
びβＥ変異に類似の状況を表わす可能性が高い。これと
ともに、前記のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーシ
ョン研究の結果およびハプロタイプ解析は、本文に述べ
た遺伝子座がＣＦ遺伝子であること、および前記の３ｂ
ｐ（Ｆ５０８）欠失がＣＦにおける最も一般的な変異で
あるという事実を裏付ける。３．６ 他のＣＦ変異 Ｆ５０８欠失の１個の共通及び１個の稀なＣＦハプロタ
イプとの連関によって、本患者群に関与している可能性
のある変異事象の数についての洞察がさらに得られた。
広範囲のハプロタイプデータに基づき、Ｆ５０８欠失が
起こっている２個の元来の染色体類が、表５にも示した
ように、ハプロタイプ−ＡＡＡＡＡＡＡ−（Ｉａ群）、
および−ＣＢＡＡＣＢＡ−（ＩＩＩａ群）を有している
らしい。この欠失を有している他のＩ群ＣＦ染色体は、
おそらく、当初の染色体から誘導した組換え産物類であ
ろう。もし各ハプロタイプ群中のこのＣＦ染色体類が同
一起源から誘導されると見なされるならば、３−４個の
付加的変異事象しか予測されないであろう（表５参
照）。しかし、同一群内のＣＦ染色体類の多くは互いに
顕著に異なっているので、各群をさらに細かく群別する
ことが可能である。その結果、より多くの独立した変異
事象が考えられ、そして、本データは、少なくとも７個
の付加的推定変異もまたＣＦ−ＰＩ表現型に関与してい
ることを示唆する（表４参照）。ＣＦ−ＰＳサブグルー
プを生む変異類は、おそらくさらに不均質であろう。７
個の付加的ＣＦ−ＰＩ変異は、ハプロタイプ類：−ＣＡ
ＡＡＡＡＡ−（Ｉｂ群）、−ＣＡＢＣＡＡＤ−（Ｉｃ
群）、−−−ＢＢＢＡＣ−（ＩＩａ群）、−ＣＡＢＢＢ
ＡＢ−（Ｖａ群）によって表される。これらの各変異に
おける分子欠損はまだ決定されていないが、これらの変
異のいずれも、ＰＣＲ／ハイブリダイゼーション実験で
使用したオリゴヌクレオチド結合部位類に対応する領域
に影響を及ぼさないことが明らかである。３．７ 膵良好 ＣＦ−ＰＳは、食物消化のための膵外分泌機能が良好で
あるとして臨床的には定義される；しかし、残りの膵酵
素活性の消化系におけるレベルは、患者毎に変化する。
先のハプロタイプデータは、ＣＦ−ＰＩおよびＣＦ−Ｐ
Ｓ患者が異なる変異対立遺伝子の故に存在することを示
唆していた。ＣＦにおける根本的生化学的欠損はまだ明
らかとなっていないが、ＣＦ−ＰＳ患者におけるこの残
りの膵酵素活性が変異ＣＦ遺伝子産物の活性を直接反映
している可能性がある。したがって、穏和な（ＣＦ−Ｐ
Ｓ）対立遺伝子によって付与された残りの外分泌機能は
正常遺伝子産物のそれよりもはるかに低いが、ほとんど
か全く機能を持たないより重篤な（ＣＦ−ＰＩ）変異の
それをしのぐ優性表現型を構成するのであろう。したが
って、重篤対立遺伝子を２コピーしか有していない患者
のみがＣＦ−ＰＩであり、かつ、１個または２個の穏和
な対立遺伝子を有する患者はＣＦ−ＰＳであるのであろ
う。上記仮説を試験するため、Ｆ５０８欠失を有するＣ
Ｆ患者の割合についての情報を利用することができた。
重篤な変異は穏和な変異に対して劣性でかつＣＦ対立遺
伝子の患者群での分布がハーディー・ワインバーグ則
（Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｌａｗ）に従うと想
定して、重篤対立遺伝子の頻度が０．６２であり、穏和
対立遺伝子（Ｍ）のそれは０．０８であると推定できた
（表６参照）。
（ａ）対立遺伝子定義：Ｆ＝前記の３ｂｐ欠失（アミノ
酸５０８位におけるフェニルアラニン欠失）；Ｓ＝未解
析の重篤変異対立遺伝子；Ｍ＝未解析穏和対立遺伝子。
（ｂ）ＣＦ−ＰＩ変異表現型は、ＣＦ−ＰＳ変異表現型
に対して劣性であると想定して、３ｂｐ欠失を含むＣＦ
−ＰＩ変異対立遺伝子の頻度をＣＦ臨床で観察されたＣ
Ｆ−ＰＩ患者の割合から推定できた［Ｃｏｒｅｙら、ジ
ャーナル・オブ・ペディアトリックス（Ｊ．Ｐｅｄｉａ
ｔｒ．）１１５：２７４（１９８９）］、すなわち、
（０．８５）＝０．９２。観察された総ＣＦ群における
Ｆの対立遺伝子頻度は０．６８（表３）である；Ｓの頻
度は０．９２−−０．６８−０．２４である；Ｍの頻度
は１−０．９２−０．０８である。各遺伝型の頻度を次
に、ハーディー・ワインバーグ則（Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉ
ｎｂｅｒｇ ｌａｗ）を用いて計算した。
（ｃ）各分類のＣＦ−ＰＩおよびＣＦ−ＰＳ患者の数
は、図１５に示したオリゴヌクレオチドハイブリダイゼ
ーションによって得られた。患者は、我々の連関解析で
使用したＣＦ家族由来であり、さらに、その他に以後の
研究からの１４ＣＦ−ＰＳ患者／家族があった。ＳＭお
よびＭＭは遺伝型または表現型では識別できないが、そ
れらは、本解析でまとめた。
（ｄ）期待数は、各群内で標準化した後ＣＦ−ＰＩおよ
びＣＦ−ＰＳについて計算した。適合のχ２は、０．８
６であり、ｄ．ｆ．＝３，０．７４＜ｐ＜０．９０であ
る。
（ｅ）この数値は、もしＦ５０８欠失が全ＣＦ染色体中
でハーディー・ワインバーグ（Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂ
ｅｒｇ）平衡にあるならば、期待されるよりも高い（観
察値１５対期待値９．６）（χ２＝６．４８、ｄ．ｆ．
＝１，ｐ＜０．０１１）。
ＣＦ−ＰＩ患者の大半はＦ５０８変異に対してホモ接合
（Ｆ）であることが見いだされたので、この変異が重篤
対立遺伝子のひとつに対応すると想定することが論理的
であった。調べたＣＦ群におけるＦの観察頻度（０．６
８）を考慮し、残りの重篤対立遺伝子（Ｓ）の頻度を誘
導できた。ＦＦ，ＳＳ，ＭＭ，ＦＳ，ＦＭおよびＳＭ患
者の割合を次に計算した。ＳＭおよびＭＭの各患者は表
現型または遺伝型で識別できなかったので、それらを解
析でまとめた。表６に示したように、全５群の患者の観
察頻度は、この仮説から予測された通りであった。した
がって、上記解析から、ＣＦ−ＰＩが２個の重篤対立遺
伝子の存在によることおよびＣＦ−ＰＳ患者が単一の重
篤対立遺伝子かまたは２個の穏和な対立遺伝子のいずれ
かを有しているという我々の見解の強い裏付けが得られ
る。このモデルは、同様に、ＣＦ−ＰＩ群よりもＣＦ−
ＰＩにおけるＦ５０８欠失の低い頻度および１コピーの
欠失を有するＣＦ−ＰＳ患者の過剰数を説明する。Ｍ対
立遺伝子によって付与される予測優性表現型を考慮すれ
ば、Ｍ対立遺伝子類を有する者を同定するために、ＣＦ
−ＰＳ患者中におけるＣＦ染色体を検討することが必要
であった。表７に示したように、７０の代表的ＣＦ−Ｐ
Ｓ患者の内の５例が１コピーのＦ５０８欠失を有してい
る；少なくとも５種の異なるハプロタイプのＣＦ染色体
と関連づけることができた。
（ａ）ハプロタイプ定義は表５の場合と同様である。
（ｂ）対立遺伝子の定義は表６の場合と同様である：Ｆ
＝Ｆ５０８欠失；Ｓ＝未解析重篤変異対立遺伝子；Ｍ＝
未解析穏和変異対立遺伝子。
これらの後者の観察から、ＣＦ−ＰＳ患者の大半が複合
ヘテロ接合体であることの裏付けがさらに得られる。４．０ ＣＦＴＲタンパク質 図１のＤＮＡ配列に関して検討したように、重複してい
るｃＤＮＡクローン類の配列の解析から、分子量１６
８，１３８ダルトンを有するアミノ酸１４８０個の未処
理ポリペプチドが予測された。以下で説明するように、
前記タンパク質における多形性の故に、このタンパク質
の分子量は、あるアミノ酸の置換または欠失の可能性の
ために変化することができる。この分子量は、また、炭
水化物単位の付加で変化し、糖タンパク質を形成するで
あろう。なた、前記細胞中の機能的タンパク質が、未処
理ポリペプチドに類似であろうと考えられるが、細胞代
謝の故に改変されるかもしれない。したがって、本発明
は、分子量約１７０，０００ダルトンおよび上皮細胞膜
通過（トランスメンブレン）イオン伝導率活性を有する
ことを特徴とする精製された正常ＣＦＴＲポリペプチド
を提供する。この正常ＣＦＴＲポリペプチドは実質的に
他のヒトタンパク質類を全く含んでおらず、上述のＤＮ
Ａ配列によって図１の１態様によって、コードされる。
このようなポリペプチドは、正常ＣＦＴＲポリペプチド
の免疫または生物活性を示す。以下でも説明するが、こ
のＣＦＴＲポリペプチドまたはその断片類は、化学また
は酵素ペプチド合成によって作製できるかまたは適当な
培養細胞系で発現できる。本発明は、また、ヒト上皮細
胞における嚢胞性線維症関連活性を特徴とする精製され
た変異ＣＦＴＲポリペプチドを提供する。このような変
異ＣＦＴＲポリペプチドは、他のヒトタンパク質を実質
的に含まないので、この変異ＤＮＡ配列によってコード
できる。４．１ ＣＦＴＲの構造 前記の予測タンパク質の最も特徴的な特性として、それ
ぞれが膜を数回貫通することが可能な１組のアミノ酸残
基類とその後に続く共通配列（ＡＴＰ）結合折りたたみ
（ＮＢＦｓ）に類似の配列で構成されている２種の繰り
返し単位が存在していることが挙げられる（図１１、１
２および１６）。これらの特徴は、哺乳類多剤耐性Ｐ−
糖タンパク質およびいくつかの他の膜関連タンパク質類
のそれに極めて類似しており、したがって、前記予測さ
れたＣＦ遺伝子産物が膜を横切る物質類（イオン類）の
運搬に関与しているらしいことおよびこの膜が膜タンパ
ク質スーパーファミリの一員であるらしいことを示唆し
ている。図１３は、予測ＣＦＴＲタンパク質の概略モデ
ルである。図１３において、円柱は膜を貫通するらせん
を示しており、斜線を入れた（ｈａｔｃｈｅｄ）球はＮ
ＢＦ類を示している。この点を入れた球は、極性のＲ領
域である。前記分子の各半分における６本の膜を貫通す
るらせんは、円柱として描かれている。内部の細胞質に
対してＮＢＦ類は斜線入り球として示されており、スロ
ットは、ヌクレオチドによる流入手段を示している。こ
の２個の半分を結合する大きい極性Ｒ領域は、点入り球
によって表される。膜通過（トランスメンブレン）セグ
メント類内部およびＲ領域表面上の価電された各アミノ
酸類は、電荷の符号を有する小円として描かれている。
膜円柱に結合する内部および外部ループ類上およびＮＢ
Ｆ類の領域上における真の電荷は、白色正方形中に含ま
れている。プロテインキナーゼＡまたはＣによるリン酸
化の部位類は、それぞれ、黒の三角形および白の三角形
で示されている。Ｋ，Ｒ，Ｈ，ＤおよびＥは、それぞ
れ、アミノ酸類であるリシン、アルギニン、ヒスチジ
ン、アスパラギン酸およびグルタミン酸の標準的命名法
である。ＣＦＴＲタンパク質の予測された膜関連領域の
それぞれは、高度に疎水性でＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉ
ｔｔｌｅのアルゴリズムおよびＧａｒｎｉｅｒら（ジャ
ーナル・オブ・モレキュラーバイオロジー（Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．）１２０，９７（１９７８））のアルゴ
リズムに従って脂質２重層にまたがることが可能な６個
のセグメント類から構成されている（図１３）。この膜
関連領域には、それぞれ、ＮＢＦ類を含有する大きな親
水性領域が続いている。他の公知のヌクレオチド結合タ
ンパク質類との配列整列に基づくと、ＣＦＴＲにおける
推定ＮＢＦ類のそれぞれは、少なくとも残基１５０個か
らなる。ＣＦ患者の大半で検出された前記の３ｂｐ欠失
は、ＣＦＴＲの第１番目のＮＢＦの最も高度に保存され
たセグメント類２個の間に局在している。フェニルアラ
ニン欠失を取り囲む領域といくつかの他のタンパク質類
の対応する領域類間のアミノ酸配列同一性から、この領
域が機能的に重要であることが示唆される（図１６）。
通常芳香族側鎖を有するものである疎水性アミノ酸１個
が、ＣＦＴＲタンパク質のＦ５０８に対応する位置のこ
れらのタンパク質類のほとんどに存在している。アミノ
酸多形性がＤＮＡ多形性の結果として存在できることが
わかる。図１６は、ＣＦＴＲの伸長されたＮＢＦ類の最
も保存されたセグメント類３個の整列と他のタンパク質
類の対応する領域類を示している。これらの３個のセグ
メント類は、ＣＦＴＲのＮ末端半分の残基４３３−４７
３，４８８−５１３，および５４３２−５８４およびＣ
末端半分の１２１９−１２５９，１２７７−１３０２，
および１３４０−１３８２から構成されている。厚く線
を重ねたところは、類似性最大の領域類を示唆してい
る。ギャップを導入しないでも付加的な一般的相同性が
見られる。ＮＢＦ類のタンパク質の構造および配列保存
における全体としての対称性にもかかわらず、予測され
たＣＦＴＲタンパク質の２個の半分の間の配列相同性が
中等度である。このことは図１２に示されており、アミ
ノ酸１−１４８０が各軸上に示されている。同一性斜線
の片側の線は、内部類似性の位置を示している。したが
って、４組の内部配列同一性が、Ｌａｗｒｅｎｃｅら
［Ｃ．Ｂ．Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｄ．Ａ．Ｇｏｌｄｍａ
ｎ，およびＲ．Ｔ．Ｈｏｏｄ，ブリテン・オブ・マシマ
ティカルバイオロジー（Ｂｕｌｌ ＭａｔｈＢｉｏ
ｌ．）４８，５６９（１９８６）］によって適用された
Ｄａｙｈｏｆｆ点数表を用いて図１２に示したように検
出でき、これらの内の３つのみが、標準偏差の小さい方
のしきい値設定値で明らかである。最も強い同一性は、
ＮＢＦ類のカルボキシル末端における配列類の間にあ
る。配列した６６個の残基中、２７％が同一で、さらに
１１％が機能的に類似である。全体的に弱い相同性が、
遺伝子複製仮説が提示されている（Ｇｒｏｓら、セル
（Ｃｅｌｌ）４７，３７１，１９８６，Ｃ．Ｃｈｅｎ
ら、セル（Ｃｅｌｌ）４７，３８１，１９８６，Ｇｅｒ
ｌａｃｈら、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３２４，４
８５，１９８６，Ｇｒｏｓら、モレキュラーセルバイオ
ロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）８，２７７
０，１９８８））Ｐ−糖タンパク質中においてはるかに
高度（＞７０％）であるのと対照的である。エクソン−
イントロン境界の相対的位置における保存の欠如は、Ｃ
ＦＴＲのこのようなモデルに反するとして議論できる
（図２）。ＣＦＴＲのアミノ末端にシグナルペプチドは
明らかに存在していないので、最初のトラスメンブラン
配列に先行する高度に電荷を帯びた親水性セグメント
は、おそらく細胞質の方向を向いているであろう。２組
の疎水性ヘリクスは膜を介して３つのトランスバースル
ープを形成していると考えられ、トラスメンブランセグ
メント７と８との間の領域を除いて、タンパク質全体の
配列のうち、外表面に出ている部分はほとんどないこと
が考えられる。Ｎグリコシル結合をする可能性のある２
つの部位は後の領域に含まれることに着目することが大
切である。膜会合領域のそれぞれに上記のＮＢＦが後続
する。さらに、高度に電荷を帯びた細胞質ドメインは、
予想されるＣＦＴＲポリペプチドの中央部に見い出すこ
とができ、このタンパク質の両半分を連結している。こ
のドメインは、Ｒ−ドメインと呼ばれ、単一の大きなエ
クソンによって機能的に限定される。なお、このエクソ
ン中では、２４１個のアミノ酸のうち６９個が、正およ
び負の荷電を交互に繰り返すクラスター中に存在する極
性残基である。さらに、プロテインキナーゼＡ（ＰＫ
Ａ）によるリン酸化に必要な１０個のコンセンサス配列
のうちの９個、およびＣＦＴＲに見られるプロテインキ
ナーゼＣ（ＰＫＣ）に対して可能性のある基質領域の７
つは、このエクソン中に位置している。
４．２ ＣＦＴＲの機能 ＣＦＴＲの性質は、他の膜会合タンパク質との比較から
理解される（図１６）。哺乳類のｐ−糖タンパクとの全
体的構造類似性に加えて、ＣＦＴＲ中の２つの予想され
るドメインのそれぞれは、大腸菌のヘモリシンの単一ド
メイン構造およびショウジョウバエの白色遺伝子産物に
著しく類似している。これらのタンパク質は、ヘモリシ
ン系の溶解ペプチドおよび眼の色素分子の輸送にそれぞ
れ関与している。大腸菌のビタミンＢ１２輸送系、Ｂｔ
ｕＤ、および機能が未知の苔類のクロロプラスト遺伝子
も、類似構造のモチーフを有している。さらに、ＣＦＴ
Ｒタンパク質は、グラム陰性菌のペリプラズム溶解輸送
系のいくつかと構造的類似性を共有している。なお、そ
のグラム陰性菌では、トランスメンブラン領域およびＡ
ＴＰ結合層が、第３の基質結合ポリペプチドと関連して
機能する別々のタンパク質に含まれている。ＣＦＴＲ中
のトランスメンブラン領域の全構造配列は、最近記載さ
れたウシの脳のアデニレートシクラーゼ、ならびに数種
のカチオンチャンネルタンパク質および数種のカチオン
トランスローケイションＡＴＰアーゼに類似している。
この位相的分類は、６つのトランスメンブラン領域から
なるが、その分類の機能的意義は推測の域を出ない。ま
た、配列を同定する短い領域が、ＣＦＴＲの想定トラン
スメンブラン領域と他の膜貫通タンパクとの間で検出さ
れている。興味あることに、ＣＦＴＲのカルボキシ末端
から約５０残基に位置する長さ１８残基のアミノ酸配
列、およびこれらの１２位が同一のアフリカ・ツメガエ
ルのｒａｆセリン／スレオニンキナーゼ前癌遺伝子の配
列も存在する。最後に、アミノ酸配列の同定（１０／１
３保存残基）は、ＣＦＴＲの高度に電荷を帯びたＲドメ
イン内の親水性セグメント（７０１〜７１３位）と、ラ
ットの脳およびウナギの両者にみられるナトリウムチャ
ンネルの最初のトランスメンブランループ直前の領域と
の間で着目されてきた。ＣＦＴＲの電荷を帯びたＲドメ
インは、位相的に極めて関連したＰ糖タンパクとの共有
点はなく、２つのタンパク質間で２４１個のアミノ酸連
結ペプチドに大きな相違は明らかにない。つまり、ＣＦ
ＴＲタンパク質の１次構造の特徴は、それが、ＣＦで影
響を受けた組織の上皮細胞におけるイオン輸送の調節と
制御への関与に適した性質をもっていることである。２
つの領域中で膜へ確実に結合することは、細胞膜の細胞
質表面近くの３つの主要な細胞内ドメイン（ヌクレオチ
ド結合層１および２ならびにＲドメイン）を配置させる
に役立つ。そこで、これらのドメインは、ＣＦＴＲトラ
ンスメンブランセグメントまたは他の膜タンパク質によ
って形成されたチャンネルを通るイオンの移動を調節す
る。遺伝子データ、組織特異性、およびＣＦＴＲタンパ
ク質の想定された性質の観点から、ＣＦＴＲがＣＦに直
接起因するとの結論が理に適ったものである。しかし、
ＣＦＴＲが上皮細胞の頂端膜のイオン伝導度の制御に関
与するか否かは不明である。ＣＦＴＲがイオンチャンネ
ル自体として機能することが考えられる。図１３に示す
ように、１２個のトランスメンブラン領域のうちの１０
個は、電荷を帯びた側鎖を有する１つ以上のアミノ酸、
脳のナトリウムチャンネルに類似の特性、およびＧＡＢ
Ａ受容体塩化物チャンネルのサブユニットを含む。そこ
で、電荷を帯びた残基は、サブユニットすなわち繰り返
し単位ごとに６個の各膜会合ドメインうちの４個、およ
び４個のうちの３個に存在する。これらトランスメンブ
ランセグメントの両親媒性によって、これら分子のチャ
ンネル形成能が付与されると考えられる。また、ＣＦＴ
Ｒは、イオンチャンネルではないこともあるが、イオン
チャンネル活性の調節に役立つ。後者の仮定を支持する
上で、脂質膜中の塩化物チャンネルを再構成し得る、気
管および腎臓から得られた精製ポリペプチド［Ｌａｎｄ
ｒｙ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：１４６９
（１９８９）］のどれもが、分子量から判断した場合、
ＣＦＴＲとは考えられない。どちらの場合も、ＣＦＴＲ
中にＡＴＰ結合ドメインが存在することは、ＡＴＰ加水
分解が輸送機能に直接関与しかつ必要であることを示唆
する。ＰＫＡおよびＰＫＣに対する高密度リン酸化部
位、ならびにＲドメインにおける荷電残基のクラスター
は、両者とも上記の活性の調節機能をはたす。ＮＢＦ中
におけるフェニルアラニン残基の欠失によって、ＡＴＰ
の適切な結合または立体配座の変化が起きなくなること
がある。なお、これは一般的にはないことであるが、Ｃ
Ｆ頂端塩化物の伝導回路のＰＫＡまたはＰＫＣ媒介リン
酸化による活性化に対する悲感受性となって認められ
る。この想定タンパク質は、いくつかのドメインを含
み、他成分分子系の一部として機能することが多い一群
のタンパク質に属するので、ＣＦＴＲは、活性の上皮組
織機能またはイオン輸送に無関係の調節にも関与するこ
とがある。用手法で単離したＣＦ遺伝子（ｃＤＮＡ）を
用いれば、ＣＦにおける基本的な生化学的欠陥を限定す
ることができ、そして更に、一般的な上皮細胞のイオン
輸送回路の調節を容易にことができる。したがって、Ｃ
ＦＴＲの想定構造とは無関係に得られた知識とともにこ
のタンパク質自体の研究からの知見によって、この疾病
の改良された治療法の開発の基礎が得られる。こういっ
た研究では後述のように、ＣＦＴＲタンパク質に対する
抗体がつくられてきた。
４．３ タンパク質の精製 ＣＦＴＲタンパク質は、その配列から明らかにされたよ
うに、性質に基づいて選択された方法によって選択する
ことができる。例えば、それが膜内在性タンパク質の際
立った性質を有するために、それが高度に発現される上
皮細胞の膜分画は、確立された方法［Ｊ．Ｅ．Ｌａｎｇ
ｒｉｄｅ，ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ａｃｔｓ．７５１：３１８（１９３８）］を用いて
最初に分離される。これらの膜の周縁タンパク質は、高
濃度の塩、高ｐＨまたはジヨードサリチル酸リチウムな
どのカオトロピック試薬を用いた抽出によって除去され
たものである。次いで、ＣＦＴＲタンパク質を含む内在
性タンパク質のすべては、オクチルグルコシドなどの界
面活性剤（Ｌａｎｄｒｙら、上掲）、ＣＨＡＰＳ［Ｄ．
Ｊ．Ｂｅｒｏｓ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６２：１０６１３（１９８７）］、または類似作
用の他の化合物を用いて可溶化される。ＣＦＴＲのヌク
レオチド結合ドメインを利用するとともに、シバクロン
ブルー［Ｓ．Ｔ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７２：６
６９（１９７５）］を使って、ＣＦＴＲタンパク質を結
合させ、これを界面活性剤安定化混合物に存在する他の
内在性タンパク質から除去する。ＣＦＴＲが糖タンパク
であるため、分別レクチンクロマトグラフィーによって
更なる精製が可能である［Ｒｉｏｒｄａｎ ｅｔ ａ
ｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：１２７０（１９
７９）］。続いて、均質化のための最終的精製が、他の
標準的な精製手法、例えば、イオン交換クロマトグラフ
ィー、ゲル浸透クロマトグラフィー、吸着クロマトグラ
フィーまたは必要に応じて等電点電気泳動を用いて行わ
れる。また、ＣＦＴＲタンパク質（もしくはその断片）
に対する固定化抗体を用いた免疫アフィニティークロマ
トグラフィーまたはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ社の「２３０ ＨＰＥＣ Ｓｙｓｔｅｍ」のような
新型装置を用いた調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳
動など単一の精製法も利用される。ｐ−糖タンパク［Ｒ
ｉｏｒｄａｎ ｅｔ ａｌ，上掲］の精製、すなわちヌ
クレオチド結合輸送・会合膜タンパク質による一般的方
法に基づけば、ＣＦＴＲタンパク質の精製が容易にな
る。ＣＦＴＲタンパク質が高度に発現する組織および細
胞からの精製法に加えて、上記のようにＣＦ遺伝子（ｃ
ＤＮＡ）を含むベクターで感染させた細胞からＣＦＴＲ
を精製するために類似の手法が用いられる。ｃＤＮＡ配
列の修飾型の発現から得られるタンパク質産物を類似の
方法で精製する。このように提供されたタンパク質の相
同性の範囲には、２次元ゲル電気泳動およびＮ末端アミ
ノ酸分析などタンパク化学の領域で標準的なものが含ま
れる。この精製タンパク質は、その２次および３次構造
の性質を決定するために用いられ、ＣＦの突然変異型の
適切な機能を促進する薬剤の設計に役立つ。タンパク療
法で使用するための調製では、有毒と思われる夾雑物質
が入らないことが重要である。このタンパク質の疎水性
には、操作の全段階で界面活性剤やその他の物質［Ｖ．
Ｊ．Ａｍｂｕｄ Ｋａｒａｎｄ Ｐ．Ｃ．Ｍａｌｏｎｅ
ｙ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１００７９（１
９８６）］などの両親媒性の化合物が含まれていること
を必要とする。
５．０ ＣＦのスクリーニング ５．１ ＤＮＡ診断 ここに記載されたように、主要な突然変異型の知識があ
れば、キャリアーのスクリーニングおよび出産前の診断
を以下のように実施することができる。嚢胞性線維症に
対する高リスク集団は、白人である。生殖年令に達した
各白人の女性および／または男性は、彼らがキャリアー
であるか否かを判定するためにスクリーニングされるこ
とになる（各個人に対して約５％の確率）。両人がキャ
リアーであれば、彼らは嚢胞性線維症の子供が生まれる
リスクが高い夫婦である。リスクの高い夫婦の各子供が
嚢胞性線維症にかかる率は２５％である。プローブを用
いてキャリアーの状態を判定する手法は以下に開示され
る。正常および突然変異型ＣＦ遺伝子のＤＮＡ配列に関
する１つの大きな応用例は、遺伝子試験、キャリアー検
出および出生前診断の領域にある。ＣＦ遺伝子の突然変
異を有するキャリアー（疾病のキャリアーまたは患者）
は、さまざまな手法を使用してＤＮＡレベルで検出する
ことができる。診断に使用されるベノムＤＮＡは、抹消
血、尿、唾液、組織生検試料、外科的試料および剖検物
質中に存在する細胞など、体内の細胞から得ることもで
きる。そのＤＮＡは、特異的配列の検出のために直接使
用されることもあり、解析に先立ってＰＣＲ法［Ｓａｉ
ｋｉｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３５０−
１３５３（１９８５）、Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａ
ｔｕｒｅ ３２４：１６３−１６６（１９８６）］を用
いてインビトロで酵素的に増幅されることも可能であ
る。ＲＮＡまたはそのｃＤＮＡ型は、同一の目的のため
に使用されることもある。このテーマに関する最近の総
説は、カスキーの文献［Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２
２３−８：（１９８９）］およびランデグレンらの文献
［Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：２２９−２３７（１９８
９）］に提示されてきた。特異的ＤＮＡの検出は、特異
的オリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーション
［Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏ
ｌ．５１：２５７−２６１（１９８６）］、ＤＮＡの直
接配列決定法［Ｃｈｕｒｃｈ ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒ
ｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８１：１９９１−１９９５（１９８８）］、制限酵素
の使用［Ｆｌａｖｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １
５：２５（１９７８）；Ｇｅｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７
８：５０８１（１９８１）］、変成剤を用いたゲル中で
の電気泳動的移動度に基づく識別［Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ
Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｕｒ Ｓｙｍ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２７５
−２８４（１９８６）］、ＲＮアーゼの保護［Ｍｙｅｒ
ｓ，Ｒ．Ｍ．，Ｌａｒｉｎ，Ｊ．，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２（１９
８５）］化学的開裂［Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：４
３９７−４４０１，（１９８５）］およびリガーゼ媒介
型検出法［Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ２４１：１０７７（１９８８）］などの方法によ
って行うこともできる。正常または突然変異型配列に特
異的なオリゴヌクレオチドは、市販の機器を用いて化学
的に合成され、同位体（３２Ｐなど）で放射線標識また
は非放射線（ビオチンなどのＴａｑつき）標識され［Ｗ
ａｒｄ ａｎｄ Ｌａｎｇｅｒ ｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：６６３３
−６６５７（１９８１）］、およびドットブロットまた
は電気泳動後のゲルからのトランスファーによる膜また
は固体支持体上で固定化された各ＤＮＡ試料にハイブリ
ダイズさせられる。これら特異的配列の有無は、オート
ラジオグラフィーまたは蛍光反応［Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ
ｅｔ ａｌ．（１９８９）、上掲］もしくは呈色反応
［Ｇｅｂｅｙｅｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｃｈ １５：４５１３−４５３４
（１９８７）］などの方法によって肉眼で観察される。
このオリゴヌクレオチドスクリーニング法の具体例は、
ここに記載されるようなＦ５０８欠失の検出に応用され
てきた。正常と突然変異型との間の配列の差異は、チャ
ーチとギルバートのＤＮＡ直接配列決定法（上掲）によ
って明らかにされることもある。クローン化ＤＮＡセグ
メントは、特異的ＤＮＡセグメントを検出するためにプ
ローブとして使用することもできる。この方法の感受性
は、ＰＣＲ法と組み合わせた場合に大幅に高められる
［Ｗｒｉｃｈｎｉｋ ｅｌ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：５２９５４２（１９８７）；
Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３３０：３８４
−３８６（１９８７）；Ｓｔｏｆｌｅｔ ｅｔ ａｌ．
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４９１−４９４（１９８
８）］。後者の方法では、増幅配列中にある配列プライ
マーが、２本鎖ＰＣＲ産物または修飾ＰＣＲによって生
じる１本鎖鋳型とともに使用される。配列の決定は、放
射能標識ヌクレオチドを用いた従来の方法または蛍光Ｔ
ａｑを用いた自動配列決定法によって行われる。配列の
変更は、適当な酵素での消化の後に行われる従来のゲル
ブロットハイブリダイゼーション［Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ９８：５０３（１９７５）］の
使用によって明らかにされる偶然の制限酵素認識部位を
稀に生じ得る。この部位（正常または突然変異）を有す
るＤＮＡ断片は、サイズの減少または対応する制限酵素
断片数の増加によって検出される。ゲノムＤＮＡ試料
は、適当な制限酵素を用いた処理に先立つＰＣＲによっ
て増幅されることもあり、異なったサイズの断片は、ゲ
ル電気泳動後の臭化エチジウムの存在下ＵＶ光のもとで
肉眼で観察される。ＤＮＡ配列の差異に基づく遺伝的試
験は、変成剤の有無にかかわらずゲル中でのＤＮＡ断片
の電気泳動的移動度の変化を検出することによって行う
ことも可能である。小さい配列の欠失および挿入は、高
解像度のゲル電気泳動によって肉眼で観察することがで
きる。例えば、３ｂｐの欠失を有するＰＣＲ産物は、変
成剤を含有しない８％のポリアクリルアミドゲル上で正
常な配列から明らかに区別される。異なった配列組成物
のＤＮＡ断片は、異なったＤＮＡ断片の移動度が比「部
分的溶融」温度に従ったさまざまな位置でゲル中での遅
れが生じる変成ホルムアミド勾配ゲル上での区別が可能
である（Ｍｙｅｒｓ、上掲）。さらに、配列の変更、特
に小さな欠失は、３ｂｐ（Ｆ５８０）突然変異および他
の実験系で検出されるように、非変成ゲル電気泳動にお
けるＤＮＡヘテロ２本鎖の移動パターンの変化として検
出されることもある［Ｎａｇａｍｉｎｅ ｅｔ ａｌ．
Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ，４５：３３７−３３９
（１９８９）］。また、単一塩基の置換または他の小変
化は、ＰＣＲにおける識別プライマーの長さに基づくこ
ともあり得る。例えば、１つの不変プライマーは、突然
変異に特異的なプライマーに添加して使用可能である。
次いで、正常および突然変異型遺伝子のＰＣＲ産物が、
アクリルアミドゲル中で別個に検出され得る。特定部位
での配列の変化は、ＲＮアーゼの保護［Ｍｙｅｒｓ、上
掲］、Ｓｌ保護［Ｂｅｒｋ，Ａ．Ｊ．，ａｎｄ Ｐ．
Ａ．Ｓｈａｒｐｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ７５：１２７４（１９７８）］、化学的
開裂法［Ｃｏｔｔｏｎ、上掲］およびリガーゼ媒介型検
出法［Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ、上掲］などの方法によって
解明し得る。従来のゲル電気泳動およびブロットハイブ
リダイゼーション法に加えて、ＤＮＡ断片は、個々のＤ
ＮＡ試料が膜に固定化されない方法によっても肉眼で観
察し得る。このプローブおよび標的配列は双方とも溶液
中に存在することがあり、またはそのプローブ配列が固
定化されていることもある［Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８
６：６２３０−６２３４（１９８９）］。放射性同位体
が関与するオートラジオグラフィー、放射能崩壊の直接
検出（シンチラントの有無にかかわらず）、呈色反応が
関与する分光光度法、および蛍光反応が関与する蛍光分
析法など、さまざまな方法を使用して特定個人の遺伝子
型を同定することもできる。１カ所を超える突然変異が
ＣＦ遺伝子中に生じていることが予想されるので、マル
チプルズシステムは、ＣＦキャリアーのスクリーニング
および特定の突然変異型検出のための理想的なプロトコ
ールである。例えば、複数の特異的オリゴヌクレオチド
プライマーおよびハイブリダイゼーションプローブを使
用して、起こり得るすべての突然変異を同時に同定する
こともできる［Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｃｈ１６：１
１４１−１１５５（１９８８）］。この方法には、固定
化された配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ［Ｓａ
ｉｋｉ ｅｔ ａｌ．上掲］が含まれることもある。
５．２ 主要な突然変異型の検出 これらの検出法は、羊水細胞および絨毛膜絨毛生検によ
るか、母体の循環血液から死細胞を分けることによっ
て、出生前の診断に応用することもできる。集団中のＣ
Ｆキャリアーの試験は、共通の疾病に関する大規模な遺
伝的試験計画に重要な一環として取り入れることもでき
る。次いで、この発明の一実施態様によれば、この実施
態様に基づく突然変異などの突然変異を検知するＤＮＡ
セグメント部分、すなわち、Ｆ５０８の欠失の近傍にあ
る部分は、標準的なＰＣＲ法［Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４
２：２２９−２３７（１９８８）に記された、Ｌａｎｄ
ｅｇｒｅｎ，Ｕｌｆ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｋａｉｓｅｒ，
Ｃ．Ｔｈｏｍａｓ Ｃａｓｋｅｙ， ａｎｄ Ｌｅｒｏ
ｙ Ｈｏｏｄの総説「ＤＮＡ診断−分子的手法および自
動化」］。使用されるＤＮＡセグメント部分は、単一の
ＤＮＡセグメントまたは異なったＤＮＡセグメントの混
合物であってもよいことが示唆される。この方法の詳細
な記載は以下の通りである。ヒトまたは胎児からのゲノ
ムＤＮＡの特定領域がスクリーニングの対象となる。こ
ういった特定領域は、オリゴヌクレオチドプライマーＣ
１６Ｂ（５’ＧＴＴＴＴＣＣＴＧＧＡＴＴＡＴＧＣＣＴ
ＧＧＧＣＡＣ３’）およびＣ１６Ｄ（５’ＧＴＴＧＧＣ
ＡＴＧＣＴＴＴＧＡＴＴＧＡＣＧＣＴＴＣ３’）によっ
て限定される。この特定領域は、ポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）によって増幅される。ＣＦ患者および彼らの
親の培養リンパ芽球または抹消血試料から得られた２０
０〜４００ｎｇのゲノムＤＮＡを、上記のオリゴヌクレ
オチドプライマーを用いた各ＰＣＲで使用した。このオ
リゴヌクレオチドは、販売元が進める方法に従って、Ｏ
ｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ ＣａｒｔｒｉｄｅｓＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ社）またはＮＥＮＳＯＲＢＴＭＰＲＥ
Ｐカラム（Ｄｕｐｏｎｔ社）を用いて精製した。このプ
ライマーを６２℃で４５秒間アニーリングし、７２℃で
１２０秒（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ２単位を用いて）
かけて伸長させて、Ｓｔｅｐ−Ｃｙｃｌｅプログラム
（１．５分で変換セッティング）を用いたＰｅｒｋｉｎ
−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ自動サーモサイクラー中で２
８サイクルと７分間の最終サイクルに９４℃で６０秒間
かけて変成させた。ＰＣＲ産物の部分を１．４％アガロ
ースゲルの電気泳動によって分離し、標準法に従ってＺ
ｅｔａｂｉｎｄＴＭ（Ｂｉｏｒａｄ社）膜に転写した。
５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭジチオスレイトール、１０ｍＭ
スペルミジン、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび３０〜４０μＣ
ｉのγ［３２Ｐ］ＡＴＰを含む１０μｌの反応液に溶け
た１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ社）で、図１５（各１０ｎｇ）の２つのオリ
ゴヌクレオチドプローブを別々に３７℃で２０〜３０分
間かけて標識した。取り込まれなかった放射能ヌクレオ
チドを、使用前にＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５のカラム
で除去した。ハイブリダイゼーション条件は、温度を３
７℃とした以外は前記［Ｊ．Ｍ．Ｒｏｍｍｅｔｓ ｅｔ
ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４３，６４５
（１９８８）］と同様であった。膜は、５×ＳＳＣを用
いて室温で２回洗浄し、２×ＳＳＣを用いて３９℃で２
回洗浄した（１×ＳＳＣ＝１５０ｍＭＮａＣｌおよび１
５ｍＭクエン酸ナトリウム）。オートラジオグラフィー
を室温で一晩実施した。オートラジオグラフィーは、図
１５に示したように、２つの特異的オリゴヌクレオチド
プローブを用いたゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーショ
ン結果を示す。プローブＣは、正常なＤＮＡ配列を検出
し、プローブＦは突然変異型配列を検出する。家族の一
人一人から得られたゲノムＤＮＡ試料をポリメラーゼ連
鎖反応によって増幅させ、産物を１．４％アガロースゲ
ルの電気泳動によって分離してから標準法に従ってＺｅ
ｔａｂｉｎｄ（Ｂｉｏｒａｄ社）膜に転写した。水盲検
およびプラスミドＤＮＡ、Ｔ１６およびＣ１６［それぞ
れ正常配列（Ｎ）およびＦ５０８欠失（ＣＦ）に相当す
る］を対照として含めた。また、３ｂｐの欠失はポリア
クリルアミドゲル電気泳動によって見い出された。上記
のＣ１６ＢおよびＣ１６Ｄプライマーによって生じたＰ
ＣＲを、９０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．３）中にて２
０Ｖ／ｃｍで２時間８％ポリアクリルアミドゲルにかけ
たとき、３ｂｐの欠失をともなわない個人、欠失に対し
てヘテロ型またはホモ型の個人を明確に検出し得た。さ
らに、エキストラＤＮＡバンドは、正常ＤＮＡ鎖と突然
変異ＤＮＡ鎖との間のヘテロ２本鎖であるが、ヘテロ接
合体に着目した。また、ＰＣＲ中に形成されたヘテロ２
本鎖のゲル移動度における類似の変更が、小さな欠失が
関与する実験系で報告されている（Ｎａｇａｍｉｎｅｅ
ｔ ａｌ．上掲）。これら移動度のシフトは、非放射性
遺伝的スクリーニング試験の基礎として使用されること
もある。
５．３ ＣＦのスクリーニング法 キャリアーの７０％だけが、この発明におけるこの特別
な実施態様の特異的Ｆ５０８プローブを用いて検出可能
であることが認識される。したがって、Ｆ５０８プロー
ブを使って試験された個人がキャリアーでなければ、キ
ャリアーの状態を除くことはできず、彼らに前記のよう
な他の突然変異が生じている可能性がある。しかし、試
験された個人とその配偶者の双方がＦ５０８突然変異の
キャリアーであれば、彼らがリスクの高い夫妻となるこ
とは当然である。ここに開示したような遺伝子配列は、
その他の突然変異型を判定するための基本的な必要条件
である。出生前の診断は、キャリアースクリーニングの
論理的な延長線にある。２通りのうちのいずれかで、夫
妻が嚢胞性線維症の子供をもつリスクがあると見られ
る。彼らが嚢胞性線維症の子供１人をすでにもっている
ならば、この夫妻はどちらかが、定義によって嚢胞性線
維症のキャリアーとみられ、その後から生まれる子供が
この疾患にかかる率は２５％である。この発明の主要な
利点は、家系分析を必要としない点であり、この発明に
よれば、上記のような遺伝子突然変異スクリーニング法
または他の類似の方法を用いて、機能の変化したタンパ
ク質の産生につながる遺伝的突然変異を同定することが
できる。これは、疾病の子供から前の家系を確証するこ
とにはつながらない。上記のように、胎児のＤＮＡ試
料、例えば羊水細胞および絨毛膜絨毛検体を得ることが
できる。次いで、標準的なＰＣＲ法による増幅を、この
鋳型ＤＮＡ上で行うことができる。両親がＦ５０８欠失
をもつキャリアーであることが分かれば、結果の解釈は
以下のようなものとなる。正常（図１５に示すような非
欠失）プローブに対して胎児のＤＮＡがハイブリダイズ
すれば、この胎児は嚢胞性線維症にかからないであろう
が、ＣＦキャリアーである可能性はある（リスクの高い
夫妻の１人の胎児に対する確率は５０％）。この胎児の
ＤＮＡがＦ５０８欠失プローブとのみハイブリダイズ
し、正常プローブ（図１５に示したように）とはハイブ
リダイズしなければ、この胎児は嚢胞性線維症に罹患す
るであろう。ＣＦ遺伝子におけるこれらの突然変異につ
いて、さまざまな一連の特異的方法を用いて、すべての
潜在的ＣＦキャリアーまたは患者に対する完全な診断を
行うことができる。３種類の方法を後で十分に記載す
る。したがって、被験者がＣＦキャリアーまたはＣＦ患
者であれば、この発明によって測定方法および測定用キ
ットが提供される。すなわち、このスクリーニング法
は、スクリーニング対象となる被験者の生体試料を提供
する工程、ならびにその生体試料中に、正常なＣＦ遺伝
子、正常なＣＦ遺伝子産物、突然変異ＣＦ遺伝子、突然
変異ＣＦ遺伝子産物およびそれらの混合物からなる群よ
り選ばれた少なくとも１つの要素の有無を検出する方法
を提供する工程を含む。この方法は、例えば図１のＤＮ
Ａにおける異なったＤＮＡ断片、またはヒトの第７染色
体の異なったＤＮＡ配列断片であり、図１のＤＮＡ配列
のどちらかの側に位置する少なくとも１つ以上のヌクレ
オチドプローブを含むことによってもさらに特徴づける
ことができる。この発明の一実施態様に従って、スクリ
ーニング法での使用に適し、免疫検定法によってＣＦ遺
伝子の有無をスクリーニングするためのキットは、以下
からなる。
（ａ）ＣＦ遺伝子の遺伝子産物に特異的に結合する抗
体、（ｂ）その遺伝子産物に対する抗体への結合を検出
する試薬、ならびに（ｃ）その抗体および試薬が、その
免疫検定法を実施するに有効量存在する。ＣＦ遺伝子の
存在を検出するためのキットはまた、ハイブリダイゼー
ション法によっても提供され得る。このキットは、以下
からなる。
（ａ）ＣＦ遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチ
ドプローブ、（ｂ）ＣＦ遺伝子に対するオリゴヌクレオ
チドのハイブリダイゼーションを検出する試薬、ならび
に（ｃ）このプローブおよび試薬が、そのハイブリダイ
ゼーション法を実施するに有効量存在する。
５．４ ＣＦＴＲを検定する抗体 上記のように、ＣＦＴＲタンパク質内のエピトープに対
する抗体は、このタンパク質の性質に関する徹底的な知
見および他の有意義な知見を提供するために作成され
る。後者の知見は以下からなる。
１．タンパク質が免疫ブロット法（ウエスタン法）、そ
の後のポリアクリルアミドゲル電気泳動によって発現さ
れる、細胞および組織中のタンパク質の肉眼での観察を
可能とすること。これによって、例えば、オリゴサッカ
リド鎖およびフォスフェート基などの翻訳後の修飾部分
をもった細胞からの影響を含む成熟タンパク質の分子量
サイズの推定がなされる。免疫蛍光法および免疫電子顕
微鏡法を含む免疫細胞化学的手法を利用でき、細胞膜の
タンパク質の細胞質中の局在が確立される。この抗体を
利用して、サイズが変化したタンパクの合成を生じる他
のいかなるＣＦ突然変異型を検出する上でもう一つの手
法を提供することができる。
２．このタンパク質の別のドメインに対する抗体を利用
して、細胞膜中でのタンパク質の位相的配列を解明する
ことができる。これによって、薬物療法のための外から
投与された調節剤に許容的であるタンパク質のセグメン
トに関する情報が得られる。
３．このタンパク質のさまざまな部分の構造と機能との
関係は、特異的抗体を用いて調べることができる。例え
ば、細胞中に、トランスメンブラン配列ならびにヌクレ
オチド結合層の部分およびＲドメインを連結させる荷電
した各細胞質ループを認識する抗体を導入することがで
きる。タンパク質の機能的パラメータへのこれら抗体の
影響を考慮すると、細胞の調節機構の洞察が得られ、Ｃ
Ｆ患者における欠陥タンパク質の活性を調節する手段が
示唆される。
４．適当な結合能を有する抗体は、そのタンパク質の免
疫沈降および免疫親和的精製を可能とする。免疫沈降か
ら、合成ならびにＡＴＰ結合およびリン酸化を含む翻訳
後修飾の特徴が容易に解明される。精製は、タンパク質
の構造の研究およびその機能の研究に必要であって、タ
ンパク質療法にも必要である。
抗体を調製するために、適切なクローニングビークル中
で相当するＤＮＡ配列を発現させることによって、ＣＦ
ＴＲポリペプチドの限定部分を含む融合タンパク質を合
成し、一方小さなペプチドを表８に記載された通り化学
的に合成した。この融合タンパク質を、例えば、グルタ
チオン−アガロースのアフィニティークロマトグラフィ
ーによって精製して、このペプチドをキャリアータンパ
ク質（ヘモシアニン）に結合させ、フロインドアジュバ
ントと混合して、ウサギに注射した。２週間間隔でのブ
ースター注射に続いて、ウサギを放血させて血清を分離
した。染色された融合タンパク質を図１９ａに示す。レ
ーン１は非誘導の対照プラスミド、レーン２はグルタチ
オン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を発現するＩ
ＰＴＧ誘導の対照プラスミド、レーン３はアフィニティ
ー精製した２７キロダルトン（ｋＤ）のＧＳＴバンド、
レーン４は非誘導プラスミド、レーン５は誘導プラスミ
ドであり、レーン６は表８の精製された融合タンパク質
＃１である。図１９では、表８（レーン１および２）の
融合タンパク質＃５ならびに表８（レーン３および４）
の融合タンパク質＃２を含むｐＧＥＴプラスミドで形質
転換された細菌からの溶解物のゲル電気泳動を示す。図
１９ｂのレーン１は非誘導プラスミドに関するものであ
るが、レーン２は融合タンパク質＃５を発現させる誘導
プラスミドに関するものである。図１９ｂのレーン３は
非誘導プラスミドに関するものであるが、レーン２は融
合タンパク質＃２を発現させる誘導プラスミドに関する
ものである。２匹の異なったウサギの２回目の放血から
得られた抗血清でプローブした融合タンパク質＃１のイ
ムノブロットを図２０に示す。染色は、アルカリフォス
ファターゼ結合第２抗体を用いて行う［Ｂｌａｋｅ ｅ
ｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３６：１７５
（１９８４）］。これら免疫染色の両者は、３２ｋＤの
融合タンパク質を染色するが、プレ免疫血清は染色しな
い。図２１は、ＣＦＴＲ転写物を高レベルで発現させる
Ｔ８４コロニー癌細胞から分離された、膜中のサイズが
約２００ｋＤのバンドに対するこれら免疫血清のうちの
１つとの反応性を示す。このバンドは、翻訳後修飾前の
想定分子量１６９ｋＤを有するＣＦＴＲタンパク質で期
待し得るサイズ領域にある。ペプチド＃２のＬＫＨ複合
体で免疫したウサギからの血清を、図２２で示されるよ
うに純粋なペプチドとＫＬＨの両者に対してスクリーニ
ングした。この図では、Ｈはヘモシアニンを、Ｐ１はペ
プチド＃１を、Ｐ２はペプチド＃２を示す。ｎｇでドッ
トされたタンパク質またはペプチドの量を示す。この抗
血清は、そのペプチドを１ｎｇ程度の少量まで検出し、
対照タンパク質＃１とは全く反応しない。したがって、
ＣＦＴＲタンパク質の部分および配列の短いセグメント
に相当するペプチドを含む両融合タンパク質に特異的な
ポリクローナル抗体を作成することが可能である。同様
に、マウスに表８のペプチド１、２および７のＫＬＨ複
合体を注射し、ＣＦＴＲタンパク質のこれらのセグメン
トに対するモノクローナル抗体を産生させることができ
る。モノクローナル抗体は、同様にＣＦＴＲタンパク質
の他のドメインに対しても作成することができる。ポリ
クローナル抗体の産生に関して、ＣＦＴＲタンパク質に
対するモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）作成用の免疫原
は、ＣＦＴＲポリペプチドの部分または配列の短い（ア
ミノ酸１２ないし２５個の長さ）セグメントに相当する
合成ペプチドを含む細菌の融合タンパク質［Ｓｍｉｔｈ
ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ６７：３１（１９８８）］。
基本的な方法論は、コーラーとミルシュタインのもの
［Ｎａｕｒｅ２５：４９５（１９７５）］である。ＢＡ
ＬＢ／ｃマウスを、不完全フロインドアジュバントに溶
けた純粋な融合タンパク質または合成ペプチド５００μ
ｇの腹腔内注射によって免疫する。２回目の注射は１４
日後に行い、２１日後に３回目、そして２８日後に４回
目の注射を行う。こうして免疫した各動物を、最終の注
射から１、２および４週後に解剖する。脾臓を摘出し、
その細胞をばらしてから回収し、文献［Ｇｅｆｔｅｒ
ｅｔａｌ．Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ ３：２３１（１９７７）］に従ってＳｐ２／Ｏ−Ａ
ｇ１４黒色腫細胞と融合させた。この融合混合物を融合
細胞の増殖用培地に播種し、融合細胞を、それらが約２
５％コンフルエンスに達するまで増殖させる。同時に、
培養上清に対して、特定のＣＦＴＲ抗原と反応する抗体
の存在を調べる試験を行う。次いで、アルカリホスファ
ターゼ標識抗マウス第２抗体を使って陽性のものを検出
する。さらに、陽性の培養穴からの細胞を培地中で増殖
させ、更なる試験のために上清を回収し、細胞は凍結保
護剤含有培地中で凍結させた。大量のｍＡｂを得るため
に、産生細胞を動物あたり細胞濃度５×１０６で腹腔に
注射し、腹水を得る。精製は、文献［Ｅｙ ｅｔ ａ
ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １５：４２９
（１９７７）］に従ってプロテインＧおよびプロテイン
Ａアガロースのクロマトグラフィーによって行う。ＣＦ
ＴＲタンパク質とこれらｍＡｂの反応性は、ＣＦＴＲタ
ンパク質が発現される上皮細胞から分離された膜のポリ
アクリルアミドゲル電気泳動、およびイムノブロット
［Ｔｏｗｂｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：４３５０（１９７
９）］によって確認される。ＣＦＴＲタンパク質の異な
った各ドメインに特異的なモノクローナル抗体の使用し
てそれら個々の機能を調べることに加えて、その他のｍ
Ａｂは、ＣＦＴＲタンパク質の正常と突然変異型との間
の識別することが可能でるが、鼻粘膜の生検検体「ブル
ッシュリング（ｂｒｕｓｈｉｎｇｓ）」［Ｒ．Ｄｅ−Ｌ
ｏｕｇｈ ａｎｄ Ｊ．Ｒｕｔｌａｎｄ，Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｐａｔｈｏｌ．４２，６１３（１９８９）］または
汗腺を含む皮膚の生検検体など、患者から得られた上皮
細胞試料中の突然変異タンパク質を検出するために用い
られる。この識別可能な抗体は、アミノ酸位５０８（例
えば、ＧＴＩＫＥＮＩＩＦＧＶＳＹ）にフェニルアラニ
ンを含むペプチドまたはＦ５０８を欠く以外同一のペプ
チド（ＧＴＩＫＥＮＩＩＧＶＳＹ）で免疫化した何組か
の対のマウスからのハイブリドーマを識別的にスクリー
ニングすることによって得られる。Ｆ５０８欠失が加わ
ったかまたはそれを欠いた患者に存在するＣＦＴＲタン
パク質の他の突然変異型を認識し得るｍＡｂは、類似の
モノクローナル抗体産生法を使って得られる。ＣＦＴＲ
タンパク質およびそのセグメントの正常およびＣＦ型に
対する抗体は、免疫細胞化学および免疫蛍光光学顕微鏡
法ならびに免疫電子顕微鏡法による診断に使用され、Ｃ
Ｆ患者、ＣＦキャリアーおよび非ＣＦキャリアーの人の
器官内におけるＣＦＴＲの細胞および細胞下分布が示さ
れる。ＣＦ患者およびＣＦ患者の細胞におけるＣＦＴＲ
タンパク質の活性を促進させることによって、治療面で
調節を行うのに抗体が用いられる。こういった調節様式
には、多価抗体とＣＦＴＲタンパク質分子との架橋によ
る刺激、ならびにインシュリン受容体［Ｏ’Ｂｒｉｅｎ
ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：８４６
（１９８３）］、上皮成長因子受容体［Ｓｃｈｒｅｉｂ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：
８４６（１９８３）］などのある種の細胞表面の膜受容
体、およびＣＤ４［Ｖｅｉｌｌｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．
Ｎａｔｕｒｅ，３３８：２５７（１９８７）］などのＴ
細胞受容体関連分子の刺激が関与する。ＣＦにおいて欠
陥ＣＦＴＲタンパク質を発現する細胞への治療薬の運搬
を規定するために抗体が用いられる。この目的には、抗
体は、薬剤などの治療薬または正常遺伝子を運ぶリポゾ
ーム［Ｍａｔｔｈａｙ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ．４６：４９０４（１９８６）］などのビークルに
取り込まれる。
ａ文献［Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ６７：３
１（１９８８）］で確認されたように、ｐＧＥＸプラス
ミド発現ベクター中で、日本住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏ
ｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）のグルタチオンＳ−ト
ランスフェラーゼの３’末端に連結したこれら断片をコ
ードする制限酵素切断断片。
ｂ文献［Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ２８：４
７７（１９８２）］に従って、キャリアータンパク質の
キーホール・リンペットのヘモシアニン（ＫＬＨ）にＮ
末端システインを介して結合したペプチド。ＴＭはトラ
ンスメンブラン配列を示す。
５．５ ＲＦＬＰ分析 この発明は、ただちに実際的用途が見い出されるＣＦ遺
伝子の発見および特徴決定から直接由来する多くの利点
を提供する。ＣＦＴＲのアミノ酸配列から、ＣＦＴＲが
関与し、嚢胞性線維症で欠陥を提示する分子的機構と同
様に、このタンパク質の構造および機能の洞察が可能で
ある。この知見によれば、この疾病に対する研究および
治療において、いっそうの手段および概念の形成され得
る。この発明の用途のうちには、キャリヤーの検出、Ｄ
ＮＡ診断、家系図調査などが挙げられる。従来のＤＮＡ
を基準とする遺伝的試験は、疾病のある子供をもった家
族およびその近親者に対して主に利用されてきた。ＤＮ
Ａ配列レベルでＣＦ突然変異が知られれば、いかなる個
人の試験も任意に行える。われわれの推定によれば、過
去の家系が分からないＣＦ患者の４６％は、ＤＮＡ解析
によって正確に判断可能であって、母集団中のＣＦキャ
リヤーの６８％がＦ５０８欠失によって確認できる。北
アメリカの母集団におけるキャリヤーの頻度を１／２０
とすれば、例えば、キャリヤーの状態に関して生殖年令
の女性および／または男性のすべてをスクリーニングす
ることが妥当である。Ｆ５０８欠失に特異的なプローブ
を用いたキャリヤーの検出は、キャリヤーの７０％まで
見い出されよう。残りのキャリヤーは、上記でさまざま
なハプロタイプ群に特異的な一群のプローブによって検
出されよう。Ｆ５０８欠失は全ＣＦ突然変異型の約７０
％を構成するので、ＲＦＬＰ分析は、ＣＦ患者の家族ま
たは近親者に対する直接検出試験を補足するものとして
使用が可能である。Ｆ５０８突然変異が起きていないＣ
Ｆ患者の約５５％がわれわれのＣＦリンケージ家族の事
後分析に基づいてＤＮＡマーカーＪＧ２Ｅ１（ＫＭ１
９）［Ｋｅｒｅｍ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇ
ｅｎｅｔ ４４：８２７−８３４（１９８９）； Ｅｓ
ｔｉｖｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１：２５
７（１９８７）］から知見が得られるものと予想され、
Ｅ６（ＴａｑＩ）［Ｋｅｒｅｍ ｅｔ ａｌ．上掲］お
よびＪ３．１１（ＭｓｐＩ）［Ｗａｉｎｒｉｇｈｔ ｅ
ｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）］も試験された場
合、さらに３９％の知見が得られるであろう。すなわ
ち、Ｈ２．３（ＸＶ２Ｃ−ＴａｑＩ）［Ｋｅｒｅｍ ｅ
ｔ ａｌ．上掲；Ｅｓｔｉｖｅｌｌ ｅｔ ａｌ． Ｎ
ａｔｕｒｅ（１９８７）］、Ｅ２．６（Ｅ．９）（Ｍｓ
ｐＩ）［必要に応じて入手可能なプローブ］、Ｅ４．１
（Ｍｐ６ｄ．９）（ＭｓｐＩ）［必要に応じて入手可能
なプローブ、Ｅｓｔｉｖｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．
Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８９）］、Ｊ４４（Ｅ
３．１）（ＸｂａＩ）［必要に応じて入手可能なプロー
ブ］およびｍｅｔＤ（ＢａｎＩ）［Ｓｐｅｎｃｅ ｅｔ
ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８
９）；ＡＴＣＣ＃４０２１９］が含まれる場合、ほぼす
べての親から知見が得られることになる。これらプロー
ブの有用性は、これらが多形の制限酵素切断部位を認識
するという事実にある。したがって、これらのプローブ
は一般に、多形部位を介してこれらの配列によって限定
されず、隣接配列の知見に基づいて利用されるので、当
該分野の技術者には既に知られているように、問題の領
域におけるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を可能とす
る。例えば、プローブＥ２．６（ＭｓｐＩ）は、２つの
隣接オリゴマー（５’ＧＴＧＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＣＴ
ＣＴＣＣＡ３’、および５’ＧＧＡＡＴＣＡＣＴＣＴＣ
ＴＴＣＣＴＧＡＴＡＴ３’）によって完全に限定され
る。ＭｓｐＩの多形性を検出するＥ２．６ＰＣＲ産生プ
ローブを使用することによって、ＭｓｐＩ部位の有無に
応じて、２つの異なった対立遺伝子（８５０ｋｂの断
片、または４９０ｂｐおよび３６０ｂｐ断片）が検出さ
れよう。同様に、プローブＪ４４（Ｅ３．１）（Ｘｂａ
Ｉ）は、２つの隣接オリゴマー（５’ＣＡＡＴＧＴＧＡ
ＴＴＧＧＴＧＡＡＡＣＴＡ３’、および５’ＣＴＴＣＴ
ＣＣＴＣＣＴＡＧＡＣＡＣＣＴＧＣＡＴ３’）によって
完全に限定される。ＸｂａＩの多形性を検出するＥ２．
６ＰＣＲ産生プローブを使用することによって、Ｘｂａ
Ｉ部位の有無に応じて、２つの異なった対立遺伝子（８
６０ｋｂの断片、または６１０ｂｐおよび２５０ｂｐ断
片）が検出されよう。連結されたＲＦＬＰは、Ｆ５０８
欠失をもたない個人に対するリスクの計算に使用するこ
ともできる。一般的なリスクの推定法は、文献［Ｂｅａ
ｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ
４４：３１９−３２６］で考察されている。出生前診
断には、微小絨毛性小腸酵素の分析を行って、ＤＮＡ診
断が不完全な場合に診断の信頼性を高めることもでき
る。ＤＮＡ診断は現在、胎児が嚢胞性線維症にかかてい
るか否かを判定するために使用されているが、歴史的に
は、特定の両親に確実なキャリアーと同定された１人の
嚢胞性線維症児が生まれた後にだけ実施されてきた。し
かし、上記のようなキャリアー検出と組み合わせて、キ
ャリアーの夫妻でのすべての妊娠に対してＤＮＡ診断を
行うことは可能であろう。両親がすでに１人の嚢胞性線
維症児をもっていれば、広範なハプロタイプ分析を行う
ことができ、疑陽性または疑陰性の比率が大幅に減少さ
れよう。嚢胞性線維症には臨床的異質なものがあると多
年考えられてきたが、現在では、いわゆる健全な膵臓
（ＣＦ−ＰＳ）および膵臓不全（ＣＦ−ＰＩ）という２
分類が登場している。これらの疾病の概念に関連した突
然変異の特徴がよく解明されれば、この疾病の臨床的表
現形をもった特定の突然変異に結び付けることができ
る。これによって、各患者の治療が変えられる。したが
って、突然変異の特徴から、ある程度まで、患者の診断
が予測され、特定の治療方針が定まるであろう。
６．０ 嚢胞性線維症の分子生物学 ＣＦＴＲが、イオンチャンネル、特にＣＦにおける機能
的欠陥として意味付けられる塩素チャンネルの外向きへ
の機能を調節し得るという仮説は、アフリカルメガエル
の卵細胞においてインビトロで転写された完全な長さの
ＣＦＴＲｍＲＮＡの注入および翻訳によっで調べること
ができる。卵細胞の膜を通過するイオン流の確かな変化
は、電位が固定弁で調節されるので、測定することがで
きる。ＣＦＴＲは内在性卵細胞のチャンネルを調節する
ことができ、またはチャンネルタンパク質の翻訳を規定
するために上皮細胞ＲＮＡを導入させるためにも必要で
あり得る。この発明によって提供されるように、正常な
ＣＦＴＲおよび突然変異型ＣＦＴＲをコードするｍＲＮ
Ａの使用によって、これらの実験が可能となる。異質細
胞系における他の発現様式によっても、構造−機能の関
係の解明が容易になる。プラスミド発現ベクターに連結
された完全なＣＦＴＲのＤＮＡ配列は、細胞を感染させ
るために使用される結果、イオン輸送に対する影響を判
定することができる。特定部位で修飾された配列部分と
ともに正常ＣＦＴＲ配列の一部を有するプラスミド発現
ベクターは、調節機能に決定的なＣＦＴＲタンパク質の
部分を同定するために行われるインビトロでの突然変異
実験に使用することができる。
６．１ ＤＮＡ配列の発現 このＤＮＡ配列は、その遺伝子および産物の発現を理解
する研究、ならびに機能的解析、抗体産生および患者の
治療のために大量のタンパク質を産生させる研究におい
て操作可能である。この配列の変化は、相対量、組織特
異性および機能的特性の面で発現パターンを変えること
も変えないこともある。部分的または完全な長さのｃＤ
ＮＡ配列は、目的とするタンパク質をコードし、修飾ま
たは未修飾のものがあり、以下のような細菌の発現ベク
ターに連結することも可能である。例えば、従来考察さ
れたタンパク質の精製法に従って分離し得る対応のタン
パク質の産生のために大腸菌細胞に導入可能なｐＲＩＴ
［Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．４：１０
７５−１０８０（１９８５）］、ｐＧＥＸ［Ｓｍｉｔｈ
ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅ ６７：３１−４
０（１９８８）］またはｐＡＴＨ［Ｓｐｉｎｄｌｅｒ
ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４９：１３２−１４１
（１９８４）］の各プラスミドである。このＤＮＡ配列
を本来の配列から他のクローニングビークル、例えば、
他のプラスミド、バクテリオファージ、コスミド、動物
ウイルス、酵母の合成染色体（ＹＡＣ）［Ｂｕｒｋｅ
ｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：８０６−８１２，
（１９８７）］、体細胞、ならびに細菌、苔［Ｔｉｍｂ
ｅｒｌａｋｅ ａｎｄ Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４４：１３１３−１３１７（１９８９）］、無
脊椎動物、植物［Ｇａｓｓｅｒ ａｎｄ Ｆｒａｌｅ
ｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２９３（１９８９）］
および豚［Ｐｕｒｓｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｊｅｎｃｅ
２４４：１２８１−１２８８（１９８９）］などの他
の下等および高等生物に移入させることもできる。哺乳
類細胞における発現では、このｃＤＮＡ配列を、サルウ
イルス（ＳＶ）４０、ｐＳＶ２ベクター中のプロモータ
ー［Ｍｕｌｌｉｇａｎ ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＡＳ，７８：２０７２
−２０７６（１９８１）］などの異質プロモーターに連
結することもでき、サルのＣＯＳ−１細胞［Ｇｌｕｚｍ
ａｎ，Ｃｅｌｌ，２３：１７５−１８２（１９８１）］
などの細胞に導入して、一過性または長期にわたって発
現させることもできる。キメラ遺伝子構成体の安定な組
込みは、ネオマイシン［Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ａｎｄＢｅ
ｒｇ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌｎ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２
７−３４１（１９８１）］およびマイコフェノール酸
［Ｍｕｌｌｉｇａｎ ａｎｄ ｂｅｒｇ，上掲］を使っ
た生化学的選択によって哺乳類細胞中で維持することも
できる。ＤＮＡ配列の操作は、制限酵素での消化、ＤＮ
Ａポリメラーゼを用いた挿入、エキソヌクレアーゼによ
る欠失、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ
による伸長、合成またはクローン化ＤＮＡ配列の連結、
１本鎖バクテリオファージ中間体またはＰＣＲと組み合
わせた特異的オリゴヌクレオチドの使用による部位特異
的配列の変更などの標準的な方法で行うことができる。
ｃＤＮＡ配列（もしくはそれに由来する部分）またはミ
ニ遺伝子（イントロンおよびそれ独自のプロモーターを
有するｃＤＮＡ）を、従来の手法によって真核細胞の発
現ベクターに導入される。ｃＤＮＡの転写を開始および
昂進させ、その適切なスプライシングおよびポリアデニ
ル化を保証する調節配列を提供することによって真核細
胞中でｃＤＮＡを転写させるように、これらのベクター
が設計される。サルウイルス（ＳＶ）４０のプロモータ
ーおよびエンハンサー領域、またはラウス肉腫ウイルス
のＬＴＲ、ならびにポリアデニル化およびＳＶ４０から
のスプライシングシグナルを含むベクターは容易に入手
できる［Ｍｕｌｌｉｇａｎｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：１０７８−２
０７６（１９８１）；Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：６
７７７−６７８１（１９８２）］。また、ＣＦＴＲの内
在性プロモーターも使用できる。ｃＤＮＡの発現レベル
は、この型のベクターを用いて以下のいずれかの方法に
よって操作することができる。すなわち、さまざまな活
性（例えば、バキュロウイルスｐＡＣ３７３は、Ｓ．フ
ルギペルダ（Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞中で高レベル
のｃＤＮＡを発現し得る［Ｍ．Ｄ．Ｓｕｍｍｅｒｓ ａ
ｎｄ Ｇ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ“ＧｅｎｅｔｉｃａｌｌｙＡ
ｌｔｅｒｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｅｎ
ｖｉｒｏｎｍｅｎｔ”（Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ，ｅｔ ａ
ｌ．編）ｖｏｌ．２２ ｎｏ３１９−３２８，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｐｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｈａｒｂｏｕｒ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，１９８５］）を有するプロモーターを使用す
るか、調節を受け易いプロモーター（例えば、マウスの
乳癌ウイルス［Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２
９４：２２８（１９８２）］から得られるグルココルチ
コイド反応性プロモーターを含むベクターを使用する。
ｃＤＮＡの発現は、レシピエント細胞中で導入後２４〜
７２時間モニター可能である（一過性発現）。さらに、
ベクターの中には、選択可能なマーカー（ｇｐｔ［Ｍｕ
ｌｌｉｇａｎｅｔ Ｂｅｒｇ、上掲］）または化学的選
択によって細胞を分離させるｎｅｏ［Ｓｏｕｔｈｅｒｎ
ａｎｄ Ｂｅｒｇ Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌｎ．Ｇｅｎ
ｅｔ１：３２７−３４１（１９８２）］細菌遺伝子も含
まれ、これらは、レシピエント細胞中で安定で長期間ベ
クターを発現させる。これらベクターは、パピローマ
［Ｓａｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉ
ｏｌ．１：１８６（１９８１）］またはエプシュタイン
ーバール［Ｓｕｇｄｅｎ ｅｔａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．５：４１０（１９８５）］などのウイルス
の調節エレメントを用いて、自由に複製するエピトープ
などの細胞中で維持することができる。また、このベク
ターをゲノムＤＮＡに組み込んだ細胞系を産生すること
もできる。これら両型の細胞系は、遺伝子産物を連続的
に産生する。ベクターのコピー数（したがって、ｃＤＮ
Ａのコピー数も）を増幅させ、高レベルの遺伝子産物を
産生し得る細胞系を創製することもできる［Ａｌｔ ｅ
ｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７
（１９７８）］。真核細胞、特にヒトまたは他の哺乳類
細胞へのＤＮＡの転移は、現在では一般的方法である。
ベクターは、例えば、リン酸カルシウムを用いた沈澱
［Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ ｖａｎｄｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ ５２：４６６（１９７３）］、リン酸スト
ロンチウム［Ｂｒａｓｈ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌＢｉｏｌ．７：２０１３（１９８７）］、電気穿孔法
［Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ １：８４
１（１９８２）］、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃ
ｔｉｏｎ）［Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７４１３
（１９８７）］、ＤＥＡＥデキストラン法［ＭｃＣｕｔ
ｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ，Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉ
ｎｓｔ．４１：３５１（１９６８）］、マイクロインジ
ェクション法［Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ １
５：５７９（１９８７）］、プロトプラスト融合法［Ｓ
ｓｈｆｎｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，７２：２１６３］またはペレットガン法
［Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３２７：７
０（１９７８）］によっで、純粋なＤＮＡとしてレシピ
エント細胞中に導入（移入）される。また、ｃＤＮＡ
は、ウイルスベクターを用いた感染によって導入するこ
とができる。例えば、レトロウイルス［Ｂｅｒｎｓｔｅ
ｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ
ｉｎｇ ７：２３５（１９８５）］、アデノウイルス
［Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ５７：２
６７（１９８６）］またはヘルペスウイルスを使ったシ
ステムが開発されている。これら真核細胞の発現系は、
ＣＦ遺伝子およびＣＦＴＲ産物に関する多くの研究に使
用することができる。これらには、以下のような研究が
挙げられる。例えば、（１）遺伝子が適切に発現されて
いるか否か、および完全な生物学的活性が適切に現れる
か否かの測定。（２）ＣＦ遺伝子の５’末端に位置する
調節エレメント、ならびにＣＦ遺伝子発現の組織制御お
よび一時的制御における調節エレメントの役割の確認。
（３）分離および精製のため大量の正常タンパク質の産
生。（４）ＣＦＴＲタンパク質に対する抗体を調べる測
定系または薬剤の有効性を試験する測定系としてＣＦＴ
Ｒタンパク質を発現する細胞の使用。（５）正常で完全
なタンパク質、タンパク質の特定部分、または天然に存
在する突然変異型タンパク質もしくは人工的に産生され
た突然変異型タンパク質の機能の研究。天然に存在する
突然変異型タンパク質はＣＦ患者に存在する一方、人工
的に産生された突然変異型タンパク質は、部位特異的配
列を変更することによって設計可能である。これら後者
の研究では、アミノ酸をコードするヌクレオチドを突然
変異させることによってタンパク質中の目的とするいか
なるアミノ酸残基の機能も調べることができる。上記の
方法を用いて、ＣＦ遺伝子配列またはその断片を含む発
現ベクターを、必要に応じてヒトの細胞、ヒト以外の哺
乳類細胞または非哺乳類細胞に導入することができる。
細胞の選択は、処理の目的によって決められる。例え
ば、高レベルのＳＶ４０Ｔ抗原を産生し、複製のＳＶ４
０源を含むベクターを複製させるサルのＣＯＳ細胞［Ｇ
ｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ，２３：１７５（１９８１）］
を使用することができ、この細胞を使用して、機能は要
求されないので、ベクターがタンパク質産物を発現し得
ることを示すことができる。類似の処理は、チャイニー
ズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）またはマウスのＮＩＨ３
Ｔ３線維芽細胞、またはヒトの線維芽細胞もしくはリン
パ芽球を用いて行うことができよう。この発明の組換え
クローニングベクターは、適切な宿主中での発現に対し
てこの発明のＤＮＡ配列の中から選定されたＤＮＡを含
む。ＤＮＡをベクターに連結させ、発現の対照配列は、
原核または真核細胞の遺伝子ならびにそれらのウイルス
およびそれらの組合わせの発現を調節するさまざまな配
列からなる群より選ばれてもよい。発現対照の配列は、
ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、λファージ
の主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコー
トタンパク質の対照領域、ＳＶ４０の初期および後期プ
ロモーター、ポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイ
ルス、バキュロウイルスおよびサルウイルスから由来す
るプロモーター、３−フォスホグリセレートキナーゼの
プロモーター、酵母の酸性ホスファターゼのプロモータ
ー、酵母のα−対合因子のプロモーター、ならびにそれ
らの組合わせからなる群より特に選ばれてもよい。この
発明のベクターで感染させることもできる宿主細胞は、
大腸菌、シュードモナス、枯草菌、バチルス・ステアロ
サーモフィリスまたは他の桿菌、他の細菌、酵母、苔、
昆虫、マウスもしくは他の動物、植物宿主、またはヒト
の組織細胞からなる群より選ばれてもよい。突然変異Ｄ
ＮＡ配列では、類似の系を使用して突然変異産物を発現
および産生させることは当然である。
６．２ タンパク質機能の考察 ＣＦＴＲタンパク質の機能を研究するには、レシピエン
トとしての上皮細胞を使用することが好ましい。適切な
機能の発現には、他の経路またはこの種の細胞中でのみ
発現される遺伝子産物が必要だからである。使用可能な
細胞の例としては、健常者もしくはＣＦ被験者由来のＴ
８４（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ２４８）もしくはＰＡＮＣ−１
（ＡＴＣＣ＃ＣＬＬ１４６９）などのヒト上皮細胞系、
またはＴ４３不動化ＣＦ鼻上皮細胞系［Ｊｅｔｔａｎ
ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）］、および初
代［Ｙａｎｈｏｓｋｅｓ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ．Ｒｅ
ｖ．Ｒｅｓｐ．Ｄｉｓ．１３２：１２８１（１９８
５）］もしくは形質転換［Ｓｃｈｏｌｔｅ ｅｔ ａ
ｌ．Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１８２：５５９（１９
８９）］ヒト鼻ポリープもしくは気道細胞、膵臓細胞
［Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｃｏｌｅｍａｎ Ｊ．Ｃｅｌ
ｌ Ｓｃｉ．８７：６９５（１９８７）］、または汗腺
細胞［Ｃｏｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ
２１：５９７（１９８５）］が挙げられる。ＣＦ細胞
は、突然変異ＣＦ遺伝子の機能的活性を調べるために使
用することができる。現在利用可能な機能測定法には、
細胞中ＡＭＰレベルを上昇させ、塩素チャンネルを活性
化する試薬によって、細胞の刺激機能として細胞膜を通
過するアニオン（ＣｌまたはＩ）の移動試薬が含まれ
る。その他の測定法には、細胞全体もしくは分離さらた
膜のパッチクランピングによる細胞電位の変化の測定
［Ｆｒｉｚｚｅｌｌ ｅｔ ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
３３：５５８（１９８６）；Ｗｅｌｓｃｈ ａｎｄ Ｌ
ｉｅｄｔｋｅ Ｎａｔｕｒｅ ３３２：４６７（１９８
６）］、またはコンフルエント細胞の上皮層におけるイ
オン流の試験［Ｗｉｄｄｉｃｏｍｂｅ ｅｔ ａｌ．Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：
６１６７（１９８５）］が含まれる。また、ＣＦ遺伝子
から作成されたＲＮＡは、アフリカツメガエルの卵細胞
に注入し得る。この卵細胞はＲＮＡをタンパク質に翻訳
するので、この試験が可能となる。その他のより特異的
な測定法も開発されているので、感染されたＣＦＴＲタ
ンパク質の試験にも使用できる。ＣＦＴＲとヒトの多剤
耐性ｐ−糖タンパクとの間の「ドメイン交換」実験は、
ＣＦＴＲタンパク質の更なる研究で行うことができる。
これらの実験では、プラスミド発現ベクターは、これら
２つのタンパク質の各部分を含むタンパク質がプラスミ
ドで感染された宿主細胞によって合成されるように、Ｃ
ＦＴＲ配列の断片およびＤＮＡリガーゼで連結されたｐ
−糖タンパクの配列断片から通常の方法によって構成さ
れる。この手法には、多剤耐性に関連した多くの実験的
パラメータが測定可能であるという利点がある。したが
って、ＣＦＴＲのセグメントがこれらパラメータに及ぼ
す影響力を評価することができる。イオン輸送に関する
ＣＦＴＲの影響を調べるこれらの実験は、上皮輸送の分
野を分子論的に解明するに役立つであろう。これは、完
全な１次構造を示す上皮細胞から第１輸送に関連した分
子である。ＣＦＴＲの知識は、この分野における上皮細
胞膜の特徴を分子レベルでより理解するために利用でき
る。例えば、ＣＦＴＲに最も類似した分子は、架橋実験
によって判明することができる。ＣＦＴＲの役割がイオ
ンチャンネルを調節することであるという仮説は、必ず
しもこのカテゴリーにあてはまらないであろう。ＣＦＴ
ＲｃＤＮＡのクローニングのために構成さえた大きな高
品質のｃＤＮＡライブラリーも、共輸送、逆輸送および
能動輸送系と同様に他のチャンネルを含む他の輸送系を
構成するポリペプチドのｃＤＮＡのクローニングに有用
であろう。
６．３ 治療法 この発明の組成物を用いたさまざまな生化学的試験の主
要な目的は、ＣＦ疾患を克服する治療法の開発であっ
て、薬理学的手段といわゆる遺伝子療法の両者が試みら
れる。薬理学的手段では、ＣＦ疾患を克服する薬剤が探
求される。最初は、基本的には化合物がランダムにスク
リーニングされるので、多くの候補化合物から識別する
ためのスクリーニングシステムが必要である。この発明
は、さまざまな突然変異ＣＦ遺伝子を発現する宿主細胞
系を提供し、第１段階のスクリーニングシステムとして
使用するに最適である。好ましくは、ＣＦ発生突然変異
型を含むＣＦＴＲタンパク質のコードＤＮＡ配列からな
る発現ベクターを感染させた哺乳類細胞（ヒトの細胞が
最も好ましい）を使った細胞培養系スクリーニング法に
用いられる。候補にあがった薬剤は、その薬剤の存在下
で細胞をインキュベーションし、ＣＦＴＲに依存するこ
れらの細胞性機能を測定すること、特にはトランスメン
ブラン電位が固定弁でクランプされるイオン流を測定す
ることによって試験される。しかし、多数の測定試料を
扱うには、例えば、イオン感受性蛍光色素の使用に基づ
いたより簡便な測定法がある。塩素イオン濃度ＳＰＱま
たはその類似体の変化を検出することが有用である。ま
た、無細胞系も使用可能である。精製されたＣＦＴＲ
は、人工膜中で再構成され、薬剤が無細胞系でスクリー
ニング可能となる［Ａｌ−Ａｑｗａｔｔ，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，（１９８９）］。第２段階では、動物試験が必要で
ある。マウスなどの動物でＣＦ遺伝子に相対する遺伝子
の正常な発現を阻害することによってＣＦのモデル実験
の開発が可能である。動物の胚に遺伝子の突然変異型を
導入することによる遺伝子の「ノックアウト」によっ
て、ＣＦ様症候群の動物系統が得られる。これによっ
て、第１段階の細胞レベルでのスクリーニングで有望と
みられる薬剤の試験が可能である。タンパク質の性質と
その機能について更に詳しい知識が得られるので、ＣＦ
ＴＲタンパク質と相互作用するタンパク質または他の化
合物の構造を予測することができよう。これに続いて、
このタンパク質と相互作用し、患者の治療になんらかの
効果がみられるような薬剤に関するある種の予想が可能
となろう。すなわち、この種の薬剤は設計が可能であ
り、ＣＦＴＲのドメインとの相互作用が要求される仮想
の構造に基づいて化学的に合成され得る。この試みは、
総説［Ｃａｐｓｅｙ ａｎｄ Ｄｅｌｖａｔｔｅ，Ｇｅ
ｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｈｕｍａ
ｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇｓ，Ｓｔｏｃｋ
ｔｏｎＰｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８］にま
とめられている。これら可能性のある薬剤は、このスク
リーニング系で試験されねばならない。
６．３．１ タンパク質置換療法 ＣＦの治療は、欠陥タンパク質を正常なタンパク質で置
換すること、欠陥タンパク質の機能を調節すること、ま
たは生理学的異常を矯正するためにＣＦＴＲが関与する
経路のもう一つの段階を修飾することによって行うこと
ができる。この欠陥タンパク質を正常なもので置換可能
とするには、大量の純粋なＣＦＴＲタンパク質を当然得
ねばならない。初めに記載したように、純粋なタンパク
質は培養細胞系から得られる。疾病に侵された気道にこ
のタンパク質を運搬するには、細胞膜中にこのタンパク
質を容易に取り込ませる脂質含有ビークル中にこれをパ
ッケイジングする必要がある。少なくとも肺胞細胞で
は、当然この機能を発揮する、ＳＡＰ（Ｖａｌ）または
ＳＡＰ（Ｐｈｅ）などの界面活性タンパク質のようなタ
ンパク質を取り込むビークルを使用することが妥当とい
えよう。［ＰＣＴ特許出願 ＷＯ／８８０３１７０，Ｗ
ｈｉｔｓｅｔｔ ｅｔ ａｌ．１９８８年５月７日；Ｐ
ＣＴ特許出願 ＷＯ８９／０４３２７，Ｂｅｎｓｏｎ
ｅｔ ａｌ．１９８９年５月１８日］。このＣＦＴＲ含
有ビークルは、ＣＦの治療に現在使用されている方法で
ある吸入または刺激によって気道に導入される［Ｂｏａ
ｔｅｔ ａｌ．上掲］。
６．３．２ 薬物療法 ＣＦＴＲ機能の調節は、治療薬（薬物）を使用して行う
ことができる。これらは、欠陥ＣＦＴＲタンパク質を調
節する際の有効性がインビトロでモニターされるスクリ
ーニング法を用いてランダムな手段で確認することがで
きる。このスクリーニング法では、そこで欠陥ＣＦＴＲ
タンパク質が発現される培養細胞系が用いられる。ま
た、ＣＦＴＲタンパク質の構造と機能との相関に関する
知見、ならびにさまざまなＣＦＴＲ突然変異タンパク質
の特定の欠陥に関する知見［Ｃａｐｓｅｙ ａｎｄ Ｄ
ｅｌｖａｔｔｅ，上掲］から、ＣＦＴＲ活性を調節する
ために薬物を設計することができる。各突然変異ＣＦＴ
Ｒタンパク質は、特定の調節のために異なった薬物を必
要とすることが考えられる。したがって、薬物療法を開
始する前に各ＣＦ患者で特異的な突然変異を同定する必
要がある。薬物を設計して、ＣＦＴＲタンパク質の構造
または機能に関して異なった観点で相互作用を起こさせ
ることができる。例えば、薬物（または抗体）は、タン
パク質の折り畳み構造に結合して欠陥構造を修正するこ
とができる。また、特定の機能をもつ残基に結合して、
基質またはコファクターに対する親和性を増す薬剤もあ
る。ＣＦＴＲが構造的に相同性をもつタンパク質群の要
員は、さまざまな薬物と相互作用し、これに結合し、こ
れを輸送するので、薬物関連療法がＣＦの治療に有効で
あることが当然予想される。有効な薬物の活性を高める
第３の機構があるとすれば、細胞中でＣＦＴＲの産生ま
たは安定性を調節することであろう。ＣＦＴＲ量の増加
によって、その欠陥機能の代償となり得る。薬物療法
は、ＣＦＴＲ機能の発現にとって必要な生理学的または
生化学的経路の他の成分との相互作用によってＣＦＴＲ
の欠陥機能を補うためにも利用され得る。これら相互作
用は、付随タンパク質の活性の減少または増加に結び付
き得る。これら薬物の同定法は、ＣＦＴＲ関連薬物に関
して上記で記載したものと類似しているであろう。他の
遺伝的疾患では、食餌を改良することによって正常な機
能の変化または欠損による状況を改善することができ
る。これは、フェニルケトン尿症の場合のように代謝産
物の除去という形をとる。その疾病では、知能的発育の
遅れを防ぐため、生後５年間食餌からフェニルアラニン
が除かれる。または、アデノシンデアミナーゼ欠損症の
場合のように、大量の代謝産物を食餌に添加することも
ある。この疾病では、食餌に酵素を添加することによっ
て、酵素活性の機能的修復をはかることができる。した
がって、ＣＦＴＲ機能の詳細が解明され、ＣＦの基礎的
欠陥が定義されれば、食餌の調節によって治療を行うこ
ともできる。第２の重要な治療法は、いわゆる「遺伝子
療法」であって、これでは、罹患した組織の重要な上皮
細胞において正常なタンパク質を好適にコードするよう
に、患者にＣＦ遺伝子の正常なコピーが導入される。気
管の気道上皮細胞にこれを到達させる試みが最も重要で
ある。ＣＦ遺伝子は、それが取り込まれ、調節機能を与
えるに十分なタンパクをコードし得る形態で、これらの
細胞に運ばれる。結果として、患者の生命の質と長さが
大幅に伸びる。勿論、この遺伝子をすべての罹患した組
織に運ぶことが究極の目的である。
６．３．３ 遺伝子療法 ＣＦの療法の一つは、罹患した患者の気道上皮に正常な
形のＣＦ遺伝子を挿入することである。呼吸器系がＣＦ
における罹患率と死亡率の主要な原因であり、膵臓疾患
は主要な性質であるが、今日この疾患は酵素の補充によ
って比較的よく治療されることに着目するのは重要であ
る。したがって、気道を標的とする体細胞の遺伝子療法
［総説として、Ｔ．Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２４４：１２７５（１９８９）］は、ＣＦに関連し
た最も重篤な疾患を軽減するであろう。
Ａ．レトロウイルスのベクター。レトロウイルスは、感
染効率が高く、安定な組込みおよび発現を有し、体細胞
遺伝子療法における実験で好ましいベクターと見られて
きた［Ｏｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｇ．Ｍｅｄ．Ｇ
ｅｎｅｔ ７：１３０（１９８８）］。欠点があるとす
れば、レトロウイルスの組込みにとって細胞の分裂を要
し、その結果、細胞周期にある気道の標的細胞をレトロ
ウイルスの感染に先立って化学的手段によって引き出す
必要があることである。完全な長さのＣＦ遺伝子のｃＤ
ＮＡは、レトロウイルス中にクローニングすることがで
き、その内在性プロモーターまたはレトロウイルスのＬ
ＲＴから抜く出すことができる。ウイルスの投与は気管
へのエーロゾル噴霧または滴下によって行うことができ
よう。
Ｂ．その他のウイルスベクター。利用可能な他の運搬系
としては、アデノウイルス［ＡＡＶ，ＭｃＬａｕｇｈｌ
ｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６２：１９６３
（１９８８）］、ウシパピローマウイルス［Ｒａｓｍｕ
ｓｓｅｎ ｅｔａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ
１３９：６４２（１９８７）］またはエプシュタイン
−バールウイルスなどのヘルペスウイルス群の一員［Ｍ
ａｒｇｏｌｓｋｅｅ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ ８：２９３７（１９８８）］が挙げられる。
これらの基礎的な生物学を知る必要性は大きいが、気管
支に対する天然の向性を有するウイルスベクター（例え
ば、呼吸器シンシチアルウイルス、エコウイルス、コク
サックウイルスなど）を使用するという考え方も可能で
ある。
Ｃ．非ウイルス遺伝子の運搬 呼吸器上皮細胞へのＣＦ遺伝子の他の挿入方法は生産的
であり、これらの多くは効率が低く、インビトロでの感
染、トラスフェクタントの選択、および再移植を潜在的
に必要とする。これには、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ
デキストラン、電気穿孔、およびプロトプラスト融合が
含まれる。特に興味深い概念は、リポゾームの使用であ
って、これはインビボでの実施が可能である［Ｏｓｔｒ
ｏ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ−Ｄｅｋｋｅ
ｒ，１９８７］。
ＤＯＴＭＡ ［Ｆｅｌｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：７４１３（１９８７）］
などの合成カチオン性脂質は、効率を高め、この方法の
実施を容易にすることもある。
６．４ ＣＦの動物実験モデル ＣＦに対するマウスまたは他の動物実験モデルの作成
は、この疾病および可能性のある治療法を理解するに重
要であろう［動物実験モデル作成の一般的総説：Ｅｒｉ
ｃｋｓｏｎ，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４３：５
８２（１９８８）］。現在では、ＣＦの動物実験モデル
は全くない。図４に示すように、進化におけるＣＦ遺伝
子の保存性（Ｅ４．３およびＨ１．６に対して交差種の
ハイブリダイゼーションブロットで示される）は、マウ
スにおけるオートロガス（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ）遺
伝子の存在を示し（以降、ｍＣＦと標記され、それに相
当するタンパク質はｍＣＦＴＲと標記される）、これ
は、ヒトのＣＦ遺伝子を用いてマウスのゲノムおよびｃ
ＤＮＡライブラリーにクローニングすることが可能であ
る。Ｆ５０８突然変異に類似したマウスの遺伝子中の特
定突然変異の形成は表現型を再生産するために最適であ
るが、ｍＣＦＴＲの完全な不活化は、有効な突然変異と
いえることが期待される。
Ａ．突然変異誘起。受精後のマウスのｍＣＦ遺伝子の不
活化は化学薬品［例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７８：３１３８（１９８１）］またはＸ線突然変異誘起
［Ｐｏｐｐ ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２
７：１４１（１９７９）］によって行われる。次いで、
ｍＣＦＴＲの不活化に対する異質の子孫はサザン法によ
って同定され、用量によって１つの対立遺伝子の欠損が
示され、ＲＦＬＰマーカーが評価されるならば、１匹の
親の対立遺伝子を受け継げない。この方法は従来、マウ
スにおいてα−グロブリン［Ｗｈｉｎｅｙ ｅｔ ａ
ｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
７７：１０８７（１９８０）］、フェニルアラニンヒド
ロキシラーゼ［ＭｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．Ｐｅｄ
ｉａｔｒ．Ｒｅｓ．２３：６３（１９８８）］、および
カルボニックアンヒドラーゼＩＩ［Ｌｅｗｉｓｅｔ ａ
ｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．
８５：１９６２（１９８８）］の突然変異型を同定する
ために用いられてきた。
Ｂ．トランスジェニック 卵細胞インジェクションの標準法を用いて、ＣＦＴＲま
たはｍＣＦＴＲの正常型または突然変異型をマウスの生
殖系に挿入することができる［Ｃａｍｐｅｒ，Ｔｒｅｎ
ｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９８８）］、ｍＣＦ
遺伝子を不活化または置換することが望ましければ、胚
の幹（ＥＳ）細胞［Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４４：１２８８（１９８９）］を使って同族の組換
え系を利用することができる。
１．卵細胞インジェクチョン。 マウスの生殖系にラン
ダムに位置する正常または異常ｍＣＦの１つ以上のコピ
ーの置換は、受精したてのマウス卵細胞の前核へのマイ
クロインジェクチョンによって行なうことができ、続い
て、疑妊娠の養母に再移植する。新生マウスのインテグ
ラントを、ヒトＣＦ遺伝子配列の存在に対して尾のＤＮ
Ａの解析によってスクリーニング可能である。同一のプ
ロトコールを使って、突然変異ｍＣＦ遺伝子に挿入する
ことができる。マウスの実験モデルを作成するには、突
然変異誘起（上記参照）または同質的組換え（下記参
照）によって、内在性ｍＣＦが不活化されているマウス
にこのトランスジーンを挿入することを考えるであろ
う。このトランスジーンは次のいずれかであり得る。
ａ）完全なゲノム配列であるが、このサイズ（約２５０
ｋｂ）では、このトランスジーンを酵母の人工染色体ま
たは染色体断片に注入する必要がある。ｂ）天然のプロ
モーターまたは異質プロモーターを有するｃＤＮＡ。
ｃ）コード領域のすべて、ならびにイントロン、プロモ
ーターおよび最適発現に必要とみられる３’末端隣接エ
レメントなどの他のさまざまなエレメントを含む「ミニ
遺伝子」。
２．初期胚のレトロウイルス感染 この代わりの方法は、レトロウイルスベクターにＣＦＴ
ＲまたはｍＣＦを挿入し、発生の初期段階にあるマウス
の胚に直接感染させ、キメラを作成することである［Ｓ
ｏｒｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ４６：１９（１
９８６）］。このうちの少なくともいくつかは、生殖系
トランスミッションに結び付くであろう。
３．ＥＳ細胞および相同的組換え 胚の幹細胞方法［Ｃａｐｅｃｃｈｉ，上掲；Ｃａｐｅｃ
ｃｈｉ，ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ ５：７０（１９８
９）］によって、遺伝子トランスファーを行える確率が
得られ、スクリーニングが可能となり、全形成能細胞が
生じて、希な相同的組換体を確認できる。一度確認され
れば、これらの組換体を使って、マウスの芽球の注入に
よってキメラが生じ、得られるマウスの比率は、組換体
系から生殖系への伝達を示す。これがＣＦに関するマウ
スの実験モデルの作成に有用であり得るいくつかの方法
がある。
ａ）ｍＣＦの不活化は、ｎｅｏなどの選択可能なマーカ
ーに隣接するｍＣＦＴＲエクソンからの配列を含むＤＮ
Ａ断片を設計することによって好適に行われる。相同性
組換えは、エクソンの中央部でのｎｅｏ配列の挿入につ
ながり、ｍＣＦＴＲを不活化するであろう。この相同性
組換体（通常約１／１０００）は、個々のクローンのＤ
ＮＡ解析［通常ＰＣＲを使う。Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｍ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：８８８７
（１９８８）；Ｊｏｙｎｅｒ ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ
３３８：１５３（１９８９）；Ｚｉｍｍｅｒ ｅｔ
ａｌ．上掲ｐ．１５０］、または異質組換体に対する負
の選択［構成体の末端でＨＳＶＴＫ遺伝子の使用に続い
てガンシクロビル（Ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ）選択な
ど、Ｍａｎｓｏｕｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３３
６：３４８（１９８８）］によって異質のものから確認
される。次いで、この不活化ｍＣＦＴＲマウスは、突然
変異ＣＦ遺伝子またはＦ５０８異常もしくは他のいかな
る目的とする突然変異をも含むｍＣＦ遺伝子を導入する
ために使用され得る。
ｂ）ｍＣＦＴＲの特定の突然変異を１段階で生起させる
ことができる。例えば、５’末端にｍＣＦイントロン９
配列、中央部に選択可能なｎｅｏ遺伝子、および３’末
端にイントロン９＋エクソン１０（Ｆ５０８突然変異の
マウス型を含む）を含む構成体を作成することができ
る。相同的組換体はイントロン９におけるｎｅｏ遺伝子
の挿入および突然変異型でのエクソン１０の置換につな
がる。
ｃ）イントロン中の選択可能なｎｅｏマーカーの存在が
ｍＣＦ遺伝子の発現を変更させる場合、第２の相同再組
換段階におけるそれの切り出しが可能である。
ｄ）目的とする突然変異型を含むオリゴヌクレオチドの
注入および得られた細胞のＰＣＲによるスクリーニング
によってマウスの生殖系に突然変異を誘起させることが
できる。
この発明のこの実施態様は、嚢胞性線維症に関するマウ
スの実験モデルと主に考えられてきた。図４は、マウス
のＤＮＡだけでなく、ウシ、ハムスター、およびニワト
リのＤＮＡに対する種間ハイブリダイゼーションを主に
示す。したがって、オルソロガス遺伝子は他の多くの種
類にも存在するものと考えられる。そこで、類似の手法
を用いて他の動物実験モデルを作り出すことができよ
う。この発明の好ましい実施態様がここで詳細に記載さ
れているが、当該分野の技術者には、この発明の精神ま
たは添付の請求の範囲の領域から逸脱することなく、そ
れに対してさまざまな変更を行えることが理解されよ
う。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＣＦ遺伝子のヌクレオチド配列およびＣＦＴＲ
タンパク質の前記アミノ酸配列である。図２は、ＣＦ遺
伝子の制限地図および前記遺伝子への染色体歩行および
ジャンピングに使用された略手段である。図３は、前記
ＣＦ遺伝子を含みかつ取り囲む領域のパルスフィールド
ゲル電気泳動地図である。図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃは、
種間ハイブリダイゼーションによる保存されたヌクレオ
チド配列類の検出を示している。図４Ｄは、プローブ類
Ｅ４．３およびＨ１．６の重複するセグメント類の制限
地図である。図５は、ゲノムおよびｃＤＮＡプローブ類
を用いたＲＮＡブロットハイブリダイゼーション解析で
ある。繊維芽細胞、気管（正常およびＣＦ）、膵、肝、
ＨＬ６０、Ｔ８４、および脳ＲＮＡへのハイブリダイゼ
ーションを示している。図６は、前記ＣＦ遺伝子の５’
末端におけるＥ４．３クローニング領域のメチル化状況
である。図７は、ｃＤＮＡのゲノムＤＮＡ断片類への配
列を示したＣＦＴＲ ｃＤＮＡの制限地図である。図８
は、ＣＦＴＲ ｃＤＮＡ（クローン１０−１）の部分に
よる６．５ｋｂのｍＲＮＡ転写体への種々のヒト組織中
におけるハイブリダイゼーションを示したＲＮＡゲルブ
ロット解析である。図９は、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ
ＩＩＩで消化したゲノムＲＮＡへのＣＦＴＲ ｃＤＮＡ
クローン類によるハイブリダイゼーションを示したＤＮ
Ａブロットハイブリダイゼーション解析である。図１０
は、ＣＦＴＲ ｃＤＮＡの５’および３’末端を特性解
析したプライマー延長実験である。図１１は、ヒドロパ
シープロフィールであり、かつ、ＣＦＴＲの予測２次構
造を示している。図１２は、予測されたＣＦＴＲポリペ
プチド中における内部相同性のドットマトリックス解析
である。図１３は、予測されたＣＦＴＲタンパク質の略
モデルである。図１４は、ＣＦ遺伝子に緊密に連結した
制限断片長多形性（ＲＦＬＰ類）の略図であり、その中
で、倒立三角形は、Ｆ５０８ ３塩基対欠失の位置を示
している。図１５は、正常配列を検出するプローブＮお
よびＣＦ変異配列を検出するプローブＦによるオリゴヌ
クレオチドハイブリダイゼーションによるＦ５０８変異
の検出を示したものである。図１６は、ＣＦＴＲの延長
ＮＢＦ類の最もよく保存されたセグメント類と他のタン
パク質類の匹敵する領域類との配列を示したものであ
る。図１７は、Ｆ５０８欠失周辺のＤＮＡ配列である。
図１８は、Ｆ５０８欠失におけるＤＮＡ配列を示したヌ
クレオチド配列決定ゲルを示したものである。図１９ａ
および１９ｂは、ｐＧＥＸプラスミド類によって形質転
換された細菌溶解物（ＪＭ１０１）からのタンパク質の
電気泳動後クーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｉｅ Ｂｌ
ｕｅ）染色ポリアクリルアミドゲル類である。図２０
は、２匹の異なるウサギから得た免疫前および免疫血清
による融合タンパク質＃１含有細菌溶解物のイムノブロ
ットである。図２１は、図２０のウサギ＃１からの免疫
血清を用いたＴ−８４膜類のイムノブロットである。図
２２は、表８のペプチド＃２とＫＬＨとの結合物で免疫
したウサギ由来免疫前血清および免疫血清で探索したイ
ムノブロットである。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年１２月２８日（２００１．１２．
２８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】 のアミノ酸残基位置１から１４８０までに対応するＤＮ
Ａ配列、（ｂ）上記配列１のアミノ酸残基位置１から１
４８０までの配列を有する正常な嚢胞性線維症膜通過伝
導率制御タンパク質（ＣＦＴＲ）をコードするＤＮＡ配
列、（ｃ）上記配列１のアミノ酸残基位置１と１４８０
の間にある少なくとも１６個の連続するヌクレオチドか
らなる一部分のＤＮＡ配列、（ｄ）少なくとも１６個の
ヌクレオチドからなり、上記配列１のアミノ酸配列の部
分断片をコードするＤＮＡ配列および（ｅ）上記配列１
のアミノ酸残基位置１と１４８０の間の少なくとも１８
個の連続するヌクレオチドによってコードされるエピト
ープを含む以下の部分：アミノ酸残基２０４〜２４９の
配列、アミノ酸残基３４７〜６９８の配列、アミノ酸残
基７１０〜７５７の配列、アミノ酸残基７５８〜７９６
の配列、アミノ酸残基１１８８〜１４８０の配列、アミ
ノ酸残基２８〜４５の配列、アミノ酸残基５８〜７５の
配列、アミノ酸残基１０４〜１１７の配列、アミノ酸残
基１３９〜１５３の配列、アミノ酸残基２７９〜２９４
の配列、アミノ酸残基５００〜５１２の配列、アミノ酸
残基７２５〜７３９の配列、アミノ酸残基９３３〜９４
６の配列またはアミノ酸残基１０６６〜１０８４の配列
をコードするＤＮＡ配列；及び（ｆ）前記（ａ）、
（ｂ）または（ｃ）の精製ＤＮＡ分子であって、更にヒ
ト体細胞内で発現した際に嚢胞性線維症に関連する細胞
機能の変化に関係するＤＮＡ配列の変化、欠損または非
機能性変異部分を含み、該ＤＮＡの変化、欠損または非
機能性変異部分が、前記配列１におけるアミノ酸残基位
置５０８のフェニルアラニン残基をコードするヌクレオ
チドの欠失を含む精製ＤＮＡ分子；から選択された精製
ＤＮＡ分子を含むことを特徴とする正常または変異ＣＦ
ＴＲタンパク質の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図３３
【補正方法】追加
【補正内容】
【図３３】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図３４
【補正方法】追加
【補正内容】
【図３４】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図３５
【補正方法】追加
【補正内容】
【図３５】
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図３６
【補正方法】追加
【補正内容】
【図３６】 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１４年５月１７日（２００２．５．１
７）
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２３
【補正方法】追加
【補正内容】
【図２３】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２４
【補正方法】追加
【補正内容】
【図２４】
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２５
【補正方法】追加
【補正内容】
【図２５】
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２６
【補正方法】追加
【補正内容】
【図２６】
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＣＦ遺伝子のヌクレオチド配列および
ＣＦＴＲタンパク質の前記アミノ酸配列である。
【図２】図２は、ＣＦ遺伝子の制限地図および前記遺伝
子への染色体歩行およびジャンピングに使用された略手
段である。
【図３】図３は、前記ＣＦ遺伝子を含みかつ取り囲む領
域のパルスフィールドゲル電気泳動地図である。
【図４】図４Ａ、４Ｂ及び４Ｃは、種間ハイブリダイゼ
ーションによる保存されたヌクレオチド配列類の検出を
示している。図４Ｄは、プローブ類Ｅ４．３およびＨ
１．６の重複するセグメント類の制限地図である。
【図５】図５は、ゲノムおよびｃＤＮＡプローブ類を用
いたＲＮＡブロットハイブリダイゼーション解析であ
る。繊維芽細胞、気管（正常およびＣＦ）、膵、肝、Ｈ
Ｌ６０、Ｔ８４、および脳ＲＮＡへのハイブリダイゼー
ションを示している。
【図６】図６は、前記ＣＦ遺伝子の５’末端におけるＥ
４．３クローニング領域のメチル化状況である。
【図７】図７は、ｃＤＮＡのゲノムＤＮＡ断片類への配
列を示したＣＦＴＲ ｃＤＮＡの制限地図である。
【図８】図８は、ＣＦＴＲ ｃＤＮＡ（クローン１０−
１）の部分による６．４ｋｂのｍＲＮＡ転写体への種々
のヒト組織中におけるハイブリダイゼーションを示した
ＲＮＡゲルブロット解析である。
【図９】図９は、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIで消化
したゲノムＲＮＡへのＣＦＴＲｃＤＮＡクローン類によ
るハイブリダイゼーションを示したＤＮＡブロットハイ
ブリダイゼーション解析である。
【図１０】図１０は、ＣＦＴＲ ｃＤＮＡの５’および
３’末端を特性解析したプライマー延長実験である。
【図１１】図１１は、ヒドロパシープロフィールであ
り、かつ、ＣＦＴＲの予測２次構造を示している。
【図１２】図１２は、予測されたＣＦＴＲポリペプチド
中における内部相同性のドットマトリックス解析であ
る。
【図１３】図１３は、予測されたＣＦＴＲタンパク質の
略モデルである。
【図１４】図１４は、ＣＦ遺伝子に緊密に連結した制限
断片長多形（ＲＦＬＰ類）の略図であり、その中で、倒
立三角形は、Ｆ５０８ ３塩基対欠失の位置を示してい
る。
【図１５】図１５は、正常配列を検出するプローブＮお
よびＣＦ変異配列を検出するプローブＦによるオリゴヌ
クレオチドハイブリダイゼーションによるＦ５０８変異
の検出を示したものである。
【図１６】図１６は、ＣＦＴＲの延長ＮＢＦ類の最もよ
く保存されたセグメント類と他のタンパク質類の匹敵す
る領域類との配列を示したものである。
【図１７】図１７は、Ｆ５０８欠失周辺のＤＮＡ配列で
ある。
【図１８】図１８は、Ｆ５０８欠失におけるＤＮＡ配列
を示したヌクレオチド配列決定ゲルを示したものであ
る。
【図１９】図１９ａおよび１９ｂは、ｐＧＥＸプラスミ
ド類によって形質転換された細菌培養物（ＪＭ１０１）
からのタンパク質の電気泳動後クーマシーブルー（Ｃｏ
ｏｍａｓｉｅ Ｂｌｕｅ）染色ポリアクリルアミドゲル
類である。
【図２０】図２０は、２匹の異なるウサギから得た免疫
前および免疫血清による融合タンパク質＃１含有細菌溶
解物のイムノブロットである。
【図２１】図２１は、図２０のウサギ＃１からの免疫血
清を用いたＴ−８４膜類のイムノブロットである。
【図２２】図２２は、表８のペプチド＃２とＫＬＨとの
結合物で免疫したウサギ由来免疫前血清および免疫血清
で探索したイムノブロットである。
【図２３】図２３は、ＣＦ遺伝子のヌクレオチド配列及
びＣＦＴＲタンパク質の前記アミノ酸配列である。
【図２４】図２４は、ＣＦ遺伝子のヌクレオチド配列及
びＣＦＴＲタンパク質の前記アミノ酸配列である。
【図２５】図２５は、ＣＦ遺伝子のヌクレオチド配列及
びＣＦＴＲタンパク質の前記アミノ酸配列である。
【図２６】図２６は、ＣＦ遺伝子のヌクレオチド配列及
びＣＦＴＲタンパク質の前記アミノ酸配列である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 5/00 Ａ６１Ｐ 11/00 11/00 Ｃ０７Ｋ 1/22 Ｃ０７Ｋ 1/22 14/47 14/47 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ ＺＮＡ Ａ (71)出願人 501422288 ザ ボード オブ リージェンツ アクテ ィング フォー アンド オン ビハーフ オブ ザ ユニヴァーシティー オブ ミシガン ＴＨＥ ＢＯＡＲＤ ＯＦ ＲＥＧＥＮＴ Ｓ ａｃｔｉｎｇ ｆｏｒ ａｎｄ ｏｎ ｂｅｈａｌｆ ｏｆ ＴＨＥ ＵＮＩＶ ＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＭＩＣＨＩＧＡＮ 米国 48109−1248 ミシガン州 アン アーボー ルーム 2354 イー． ジェフ ァーソン 475 (72)発明者 ラプ−チー ツイ カナダ国 エム９アール ３ゼット４ オ ンタリオ州 トロント ウィローリッジ ロード 94 (72)発明者 ジョン アール． リオルダン カナダ国 エム５アール ２ケイ７ オン タリオ州 トロント ベドフォード ロー ド 137 (72)発明者 フランシス エス． コリンズ 米国 48103 ミシガン州 アン アーボ ー スィーオ チャーチ ロード 4340 (72)発明者 ジョアンナ エム． ローメンズ カナダ国 エム２エヌ １エル１ オンタ リオ州 ウィローデイル ボガート アベ ニュー 199 (72)発明者 マイケル シー． イアヌッツィ 米国 48103 ミシガン アン アーボー チャーサー ストリート 2073 (72)発明者 バト−シェヴァ カーレム カナダ国 エム６ビー １ビー１ オンタ リオ州 トロント エーピーティー． 817 エルム リッジ ドライヴ 140 (72)発明者 ミッチェル エル． ドラム 米国 48103 ミシガン州 アン アーボ ーパインクレスト ストリート 2431 (72)発明者 マニュアル バックワルド カナダ国 エム４ケー １エム６ オンタ リオ州 トロント ベアーボーン アベニ ュー 15 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA12 BA41 BA44 CA04 DA02 DA06 EA02 EA03 EA04 GA05 GA11 GA18 HA12 HA17 4B064 AG01 BA16 CA10 CA19 DA01 DA13 4B065 AA26X AA91X AA93X AA93Y AA98X AB01 AB10 BA02 BA23 BA25 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 BA01 BA22 CA56 DC50 NA14 ZA592 ZA662 ZC012 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA09 CA40 DA50 DA76 EA28 EA50 FA72 FA74

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 正常または変異嚢胞性線維症膜通過伝導
    率制御タンパク質（ＣＦＴＲ）の製造法であって、
    （ａ）請求項６のベクターでトランスフェクションされ
    た宿主細胞を培地中で正常または変異ＣＦＴＲタンパク
    質の発現に好ましい条件下で培養し、（ｂ）発現された
    正常または変異ＣＦＴＲタンパク質を単離する過程を有
    する正常または変異ＣＦＴＲタンパク質の製造方法。
    ９．約１７０，０００ダルトンのペプチド分子量、およ
    び細胞膜透過イオンコンダクタンス作用活性を有し、請
    求項１に記載の配列１におけるアミノ酸残基１〜１４８
    ０のアミノ酸配列を有する精製された正常な嚢胞性線維
    症膜通過伝導率制御タンパク質。
  2. 【請求項２】 約１７０，０００ダルトンのペプチド分
    子量、および細胞膜透過イオンコンダクタンス作用活性
    を有し、図１に配列におけるアミノ酸残基１〜１４８０
    のアミノ酸配列（配列１）を有する精製された正常な嚢
    胞性線維症膜通過伝導率制御タンパク質の変異体であっ
    て、アミノ酸残基位置５０８のフェニルアラニンの欠失
    を含み、ヒト細胞中での嚢胞性線維形成活性を有する、
    精製された変異嚢胞性線維症膜通過伝導率制御タンパク
    質。
  3. 【請求項３】 図１に配列におけるアミノ酸残基１〜１
    ４８０のアミノ酸配列（配列１）をコードするＤＮＡ配
    列、配列１のアミノ酸残基位置１から１４８０までの配
    列を有する正常な嚢胞性線維症膜通過伝導率制御タンパ
    ク質（ＣＦＴＲ）をコードするＤＮＡ配列、または配列
    １のアミノ酸残基位置１と１４８０の間にある少なくと
    も１６個の連続するヌクレオチドからなる一部分のＤＮ
    Ａ配列によってコードされ、正常または変異嚢胞性線維
    症膜通過伝導率制御タンパク質（ＣＦＴＲ）の免疫学的
    または生物学的活性を示すポリペプチド。
  4. 【請求項４】 請求項３の正常または変異ＣＦＴＲタン
    パク質を該タンパク質を含む細胞から単離する方法であ
    って、（ａ）該正常または変異ＣＦＴＲタンパク質が発
    現している細胞の選択された細胞膜にあるタンパク質を
    可溶化して、該ＣＦＴＲタンパク質の溶液を提供し、
    （ｂ）基体に固定された該正常または変異ＣＦＴＲタン
    パク質に対する抗体に、該溶液を接触させて、該溶液か
    ら該ＣＦＴＲタンパク質を分離し、（ｃ）該基体を洗浄
    して該抗体に結合しなかったタンパク質を除去し、
    （ｄ）該抗体から該ＣＦＴＲタンパク質を離して、該Ｃ
    ＦＴＲタンパク質を単離し、（ｅ）該ＣＦＴＲタンパク
    質を精製して、他の残留している哺乳動物性タンパク質
    を除去する過程を有する正常または変異ＣＦＴＲタンパ
    ク質の単離方法。
  5. 【請求項５】 請求項３または４に記載の正常または変
    異ＣＦＴＲタンパク質に特異的なモノクローナル抗体を
    生産するハイブリドーマ。
  6. 【請求項６】 図１に配列におけるアミノ酸残基１〜１
    ４８０のアミノ酸配列（配列１）をコードするＤＮＡ配
    列、配列１のアミノ酸残基位置１から１４８０までの配
    列を有する正常な嚢胞性線維症膜通過伝導率制御タンパ
    ク質（ＣＦＴＲ）をコードするＤＮＡ配列、または配列
    １のアミノ酸残基位置１と１４８０の間にある少なくと
    も１６個の連続するヌクレオチドからなる一部分のＤＮ
    Ａ配列を有する組換えクローニングベクターを含む異種
    細胞系を有し、該ベクターが嚢胞性線維症の症候を誘導
    するものであるヒトを除く動物。
  7. 【請求項７】 嚢胞性線維症の徴候を示すトランスジェ
    ニックマウス。
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