CN1181420A - 高血压相关基因 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新的大鼠和人的高血压相关基因(HRG－1),包括大鼠高血压相关基因互补脱氧核糖核酸(cDNA)的序列和编码蛋白质的氨基酸序列。该基因编码的蛋白质是蛋白激酶A(PKA)的底物,可以通过抑制丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)的活性,而抑制血管平滑肌细胞和肿瘤细胞的增殖与生长,可用于肿瘤和心血管病的治疗,也可用于筛选治疗心血管病和肿瘤的新药物,并可作为一种临床诊断的指标。
Description
本发明为一种新的大鼠和人的高血压相关基因(HRG-1)及用途，涉及生物医学高技术领域。
高血压相关基因有多种，目前已克隆出并公布的基因有血管紧张素原、血管紧张素转移酶、内皮素、一氧化氮合成酶等。高血压是一种多基因疾病，涉及到许多基因的变化，有些基因甚至更重要的基因尚待克隆。目前世界各国都在大力寻找和克隆新相关基因。克隆这些基因，不仅具有重要理论意义，而且对寻找新高血压药物，进行临床治疗亦具有重要价值。
本发明的目的在于：寻找和克隆一种新的高血压和细胞增殖相关基因和编码蛋白质。
本发明的内容是应用分子克隆、聚合酶链式反应(PCR)、核苷酸测定技术及5′和3′核苷酸延伸等技术克隆大鼠高血压相关基因互补脱氧核糖核酸(cDNA)全长序列、大鼠高血压相关基因的蛋白质序列以及人高血压相关基因的cDNA和编码蛋白质序列。
该基因达到的技术指标为：
(1)大鼠HRG-1全长cDNA为4160bp，其阅读框架为1983bp，可编码661氨基酸，其全长cDNA和编码氨基酸见表1。
(2)人HRG-1编码cDNA长约1983bp，可编码661氨基酸，其cDNA和编码氨基酸序列见表2。和大鼠的HRG-1有96％的同源性见表3。
(3)人和大鼠HRG-1纯化蛋白质的分子量为66KDa，等电点为5.99，它含有蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC)的结合位点，以及多个糖基化位点。PKA可使其磷酸化。
(4)人和大鼠HRG-1不仅存在于VSMC中，亦分布在心、肝、脑、肾、肺等组织中。它在正常细胞和组织中高表达，在高血压和增生的平滑肌细胞(VSMC)及一些肿瘤细胞中低表达。
本发明的优点及用途如下：
(1)将HRG-1导入增生平滑肌细胞(VSMC)和肿瘤细胞可以明显抑制细胞的增殖和DNA合成。
(2)丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)是细胞内一个新的信息传递体，一些细胞因子和生物活性物质可以促进和调节其表达。HRG-1是PKA的底物，可抑制MAPK的活性，因而具有抑制细胞增殖和肿瘤细胞生长的作用，在心血管疾病和肿瘤发病中可能具有重要意义。
(3)本基因及其相关cDNA编码蛋白质，是一种细胞内新的信息传递体，是PKA磷酸化的底物，可以抑制MAPK的活性。
(4)本基因及其相关cDNA和编码蛋白质，可以抑制血管平滑肌细胞和肿瘤细胞的增殖和生长，在细胞增殖和分化中具有重要作用。可发展成为临床心血管病和肿瘤的新的诊断和检验指标。
(5)本基因及其相关cDNA的编码蛋白质在心血管疾病发病和肿瘤生长中具有重要作用。可用于包括动脉粥样硬化、高血压、再狭窄等以VSMC增生为主要病理基础的心血管病，和一些肿瘤的基因治疗、生物治疗和药物治疗。
(6)本基因及其相关cDNA和编码蛋白质是一种与细胞增殖、生长相关的重要的细胞内新的信息传递体。一些药物、内源性活性物质可以诱导或抑制其表达，可作为筛选治疗心血管病和肿瘤的一个指标，用于筛选新药物。
实施例：
(1)取培养自发性高血压大鼠(SHR)和正常血压大鼠(WKY)的血管平滑肌细胞，提取总RNA，进行差异筛选(RNA mapping)。
(2)选择SHR/WKY RNA mapping有差异的条带，进行克隆和核苷酸序列测定。
(3)将测序结果送国际基因数据库(GenBank)查询，选择无同源性序列，作为探针(Probe)，在大鼠主动脉的cDNA文库中，筛选阳性克隆，进行测序。最先获得1450个bp的部分cDNA。
(4)应用克隆到的部分cDNA为模板，采用5′和3′核苷酸延伸技术(RACESystem)逐级向3′和5′延伸，获得全长cDNA(rHRG-1)和编码氨基酸序列。
(5)以大鼠HRG-1部分序列，从人肾cDNA文库中，应用分子克隆方法提取和克隆人的HRG的cDNA，并获得编码序列。
(6)应用人和大鼠编码核苷酸序列，根据基因克隆方法，构建原核和真核表达载体，在大肠杆菌中表达出蛋白质，并经层析和纯化，获得人的HRG-1蛋白质，并免疫兔，制备出多克隆抗体。
(7)应用HRG-1真核表达载体及其纯化的蛋白质和抗体，转导血管平滑肌细胞、肿瘤细胞，研究其功能。
(8)应用获得的rHRG-1和hHRG-1的cDNA作为探针，进行Northern blot分析，研究该基因在体内的分布，及其在心血管系统、肿瘤组织中的表达，观察它在心血管病和肿瘤发病中的作用。
表1Complete Sequence of rHRG-1 cDNA
10 20 30 40 50 60
| | | | |1 CGCGAGGCCGGGAAGGTGAAGTTCAGACAGGTGGAGTCAACACCATCAGTAGCCAATCTG61 GACCTGAATCGGCACAGAGGAGACCTCAAGTTCTTTTCATCTTTTTGACTCCAGCCATGT121 CCATGATGCCCAACCTGTGAAGGTCCCTTACCAGCTAGAAACGAGATGTCCCTGCTCTTT181 TCTCGATGCAACTCCATCGTCACCGTCAAGAAGGATAAGCGACACATGGCTGAGGTGAAT241 GCTTCCCCTCTCAAGCACTTTGTCACTGCCAAGAAAAAGATCAATGGCATCTTTGAGCAG301 CTGGGGGCCTACATCCAAGAGAGTGCCGGCTTCCTTGAAGACACCCACAGGAATACAGAA361 CTGGACCCAGTTACTACAGAAGAGCAGGTCCTGGATGTCAAAGGGTACTGTCCAAGGTCA421 GGGGAATCAGCGAGGTGCTGGCCAGGCGGCACATGAAGGTGGCTTTTTTTGGCCGGACGA481 GCAATGGGAAGAGCACCGTGATCAATGCCATGCTTTGGGACAAAGTTCTGCCATCTGGGA541 TTGGCCACACCACCAATTGCTTCCTGCGGGTTGGGGGCACGGATGGCCACGAGGCCTTCC601 TCCTCACGGAGGGCTCAGAAGAGAAGAAGAGTGTCAAGACCGTGAACCAGCTAGCCCATG661 CCCTCCATCAGGATGAGCAGCTGCATGCAGGCAGCCTGGTGAGTGTGATGTGGCCCAACT721 CCAAGTGTCCACTTCTGAAGGATGACCTCGTGCTGATGGACAGCCCTGGGATCGATGTCA781 CCACGGAGCTGGACAGCTGGATTGATAAGTTTTGCCTGGATGCTGATGTGTTTGTACTGG841 TGGCCAACTCAGAGTCCACGCTGATGCAGACGGAGAAGCAGTTCTTCCACAAAGTGAGTG901 AGCGTCTCTCCCGGCCCAACATCTTCATCCTGAACAACCGCTGGGATGCGTCTGCCTCGG961 AGCCTGAGTACATGGAGGAGGTGCGGCGGCAGCACATGGAACGCTGCACCAGCTTTCTGG1021 TGGATGAGCTAGGCGTGGTGGATCGAGCTCAGGCCGGGGACCGGATCTTCTTTGTGTCTG1081 CCAAGGAGGTGCTCAGTGCCAGGGTCCAGAAAGCCCAGGGCATGCCAGAAGGAGGTGGCG1141 CTCTTGCAGAAGGTTTTCAAGTGAGGATGTTTGAGTTTCAGAATTTCGAGAGGCGATTTG1201 AGGAGTGCATTTCCCAGTCTGCAGTAAAGACCAAATTTGAGCAGCACACAGTCCGGGCCA1261 AGCAGATTGCAGAGGCCGTCCGTCTCATCATGGATTCCCTGCACATTGCGGCTCAGGAGC1321 AGCGGGTTTATTGTCTTGAAATGCGGGAAGAGCGGCAAGACCGGCTGAGATTCATTGACA1381 AGCAGCTGGAGCTCCTGGCTCAAGACTATAAGCTACGGATTAAGCAGATGACAGAGGAAG1441 TGGAAAGGCAGGTGTCCACAGCCATGGCTGAAGAGATCAGGCGCCTCTCTGTGCTGGTTG1501 ACGAGTACCAGATGGACTTTCACCCATCCCCAGTTGTCCTCAAGGTTTATAAGAATGAAC1561 TGCACCGCCATATAGAGGAAGGCCTGGGACGAAACATGTCTGACCGCTGCTCCACAGCCA1621 TTGCCAGTTCACTGCAGACTATGCAGCAAGACATGATAGACGGCTTGAAGCCCTTCTTCC1681 TGTGTCTGTGCGGAATCAGATAGACATGCTGGTCCCTCGACAGTGTTTCTCCCTCAGCTA1741 TGACCTGAACTGTGACAAGCTGTGCGCTGACTTTCAGGAGGACATCGAATTCCATTTCTC1801 CCTTGGATGGACTATGCTAGTGAATAGGTTCCTGGGCCCTAAGAATAGCCGGCGGGCCTT1861 GCTGGGCTACAATGATCAGGTTCAGCGTCCTCTCCCTCTGACACCTGCCAACCCCAGCAT1921 GTCCACCCTTGCCACAGGGCTCCCTCACCCAGGAGGAGCTCATGGTCTCCATGGTTACTG1981 GCCTGGCCTCTCTGACTTCCAGGACCTCTATGGGCATTCTCGTGGTCGGAGGAGTGGTGT2041 GGAAGGCAGTGGGCTGGAGACTCATCGCCCTCTCCTTTGGACTGTATGGCCTCCTGTACG2101 TGTATGAGCGGCTGACCTGGACCACCAGAGCCAAGGAGAGGGCCTTCAAGCGCCAGTTTG2161 TGGAGTATGCCAGTGAGAAGCTGCAGCTCATTATCAGTTATACCGGCTCTAACTGCAGCC2221 ACCAAGTTCAGCAAGAATTGTCTGGGACATTTGCTCATCTGTGCCAGCAAGTTGACATCA2281 CCCGGGATAATCTGGAGCAGGAAATTCTGGGATGAACAAGAAAGTTGAGGCTCTGGATTC2341 ACTTCAGAGCCAAAGCCAAATTGCTCAGGAATAAAGCTGGCTGGTTGGACAGCGAACTCA2401 ACATGTTCATACACCAGTACCTGCAGCCCAGCAGATAGTGGGCAGCCAGGGCGGACCTGC2461 ACCGAGAAGAGGCAGGGCCGCACCTCCCATCAGCTCTAGTCCTTGGCTGCTGCAGAGAGA2521 AAGAAAGCACCCACTGTCTTGTACCAGTTACTCCCTACCCCCTGCAGGAAGACCCCCAGC2581 TCATACCCAGTGGAGACCAACAAGGACTGGACAGCTCAGCCCCAAGGAGTCATGCATGTG2641 TCTGTGTCTGCTCATCATGCTCAGTCGGTTGGAAGTCACTGTGCATTTGATAAGGTCTTC2701 CTCAGGATGCCATCCTGCAGAACGACTGATGGGCGCCTTCACAGGCATCAGGCAGGCACT2761 CCTTTCAGCCCGAGTACACCTACAGAGAGAGAATGTTGGGGGTGACTGGACTCCCCAGAA2821 AAGTTCAGGGTACTGAAGAACTTGTGTCTTGCATTTGGCCCTCAGCTTTAGCACTTTTTC2881 CCACTTGCAGAGTCTTTCAGTTGTGCTTGGTGGCCAGGCTCACACACCCTGGGCTTTAGA2941 CTCAACCAGCTTATAGGGAAAGCTGGAGACCCTTGCCAGCCAGAGCAAAGTAAGAGCTCA3001 GGGGACGGTATGTGAACTAGGGTGTCCGATGTGGTAGTGAGGTTGGTGTCTGGCATTGTG3061 ATGACAAGGGACTCGCCTCCCTTCTTGCAAGTTTGCTCCAGGTGGTTAAAGGATGTTGCA3121 GGAGGAATGGTGGAAGATGGGAGCTGCCCGGGTTAGTACAGAAGAGGTCTCTCTATCTGA3181 CCTAGCACTGAGTGGCTCACAAACCTGTAAGGCTCACCTTGCTAATTTGAGCTCATCCCT3241 GCCTTGGTACAAGCTCCCTGTGGCCACCGTTCTCTGGACTGGATTGTGCCGATGACTGCA3301 GCTGGTTACAAAACGACAGGAGAAGCCTGGCGGCTGTTCTCCTTCTGCCCCAACCCTCAA3361 GCCTCCTCCTCTTCTGCTCCTGAAGCCTCCTGCTGCTTGCTTCGCCTCATGTCAACGCTG3421 AACTTCTTACTGTTAAGTGTTGAAATTGTTAATGGTCAAAACAGGGAGGATTTCAGTCAC3481 CAAGGTTGATTGTCTTGGAAGAGCAGTTTTAGAGTGATGAATCCTTTGTAGGACAGGTAG3541 AGTTAGAGATAAAGCACTGGGCTCCAGCCCCTCCCAGAAGCCCACAACCAGGAGCTCTCT3601 GTGGGACCCATGGGCCATGTCCTCTCCTGCCCATGCCTGTGTGTCACTTCCCCTCAGTCT3661 ACCCTTTGTGCTGGGACAGTGCTGGTCTTGGCCAAGGTCAGCGTGAATGGAAAGACATAG3721 TGCATTGCCAGGCTGGACGGGGTCATCTCACAGTGGGTCATTGCCAGGCTGGACGGGGTC3781 ATCTCACAGTGGGTCAGGACACATCAGTGTCGTGTAATCCCAATGAGTGTTATGTGCTTT3841 TTTTTTGGGGGGGGGGTAGAATAAACTCAAATTCTTTTTCTGTATAGCCCTTGAGTAATG3901 AATCGAATTTTGAGCTTATATAAGTAAAGATTCATTTATACCACCAGGGAGAGCCTGTAT3961 CTGAGAGACGTTTAGCAGAGAGCACTTTAGTTTCTTGCTGCTAATTGTTGTGTGATCCTT4021 TGCTGCGGTGTAGAAGGCACCAGACACAGTGTGTTTGCTTCTGGTATATATAGGTGATGC4081 ATCTGCCTGGGTTACTTGTATCTCTGCCGATAGTATTGGAACCTAAAATAAAGCCCCAGT4141 TGTGACCCTGAAAAAAAAAA表2
Coding and Amino Acid Sequences of hHRG-1 cDNA
10 20 30 40 50 60
| | | | | |
cDNA ATGAAGGTGGCTTTTTTTGGCCGGACGAGCAATGGGAAGAGCACCGTGATCAATGCCATG
aa M K V A F F G R T S N G K S T V I N A M
CTCTGGGACAAAGTTCTGCCCTCTGGGATTGGCCACACCACCAATTGCTTCCTGCGGGTA
L W D K V L P S G I G H T T N C F L R V
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A K T V N Q L A H A L H Q D K Q L H A G
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L M D S P G I D V T T E L D S W I D K F
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E K H F F H K V S E R L S R P N I F I L
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K A A W F D S E L N T F I Q Q Y L Q P S
AGATAG cDNA
R - aa表3Com parison of hHRG-1 and rHRG-1
Amino Acid SequencesHHRG1AA -MKVAFFGRTSNGKSTVINAMLWDKVLPSGIGHTTNCFLRVEGTDGHEAFL -50
:::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: :::::::::RHRG1AA -MKVAFFGRTSNGKSTVINAMLWDKVLPSGIGHTTNCFLRVGGTDGHEAFL -50HHRG1AA -LTEGSEEKRSAKTVNQLAHALHQDKQLHAGSLVSVMWPNSKCPLLKDDLV -100
:::::::: : ::::::::::::: :::::::::::::::::::::::::RHRG1AA -LTEGSEEKKSVKTVNQLAHALHQDEQLHAGSLVSVMWPNSKCPLLKDDLV -100HHRG1AA -LMDSPGIDVTTELDSWIDKFCLDADVFVLVANSESTLMQTEKHFFHKVSE -150
:::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: :::::::RHRG1AA -LMDSPGIDVTTELDSWIDKFCLDADVFVLVANSESTLMQTEKQFFHKVSE -150HHRG1AA -RLSRPNIFILNNRWDASASEPEYMEEVRRQHMERCTSFLVDELGVVDRSQ -200
:::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: :RHRG1AA -RLSRPNIFILNNRWDASASEPEYMEEVRRQHMERCTSFLVDELGVVDRAQ -200HHRG1AA -AGDRIFFVSAKEVLNARIQKAQGMPEGGGALAEGFQVRMFEFQNFERRFE -250
:::::::::::::: :: ::::::::::::::::::::::::::::::::RHRG1AA -AGDRIFFVSAKEVLSARVQKAQGMPEGGGALAEGFQVRMFEFQNFERRFE -250HHRG1AA -ECISQSAVKTKFEQHTVRAKQIAEAVRLIMDSLHMAAREQQVYCEEMREE -300
:::::::::::::::::::::::::::::::::: :: :: ::: :::::RHRG1AA -ECISQSAVKTKFEQHTVRAKQIAEAVRLIMDSLHIAAQEQRVYCLEMREE -300HHRG1AA -RQDRLKFIDKQLELLAQDYKLRIKQITEEVERQVSTAMAEEIRRLSVLVD -350
::::: ::::::::::::::::::: ::::::::::::::::::::::::RHRG1AA -RQDRLRFIDKQLELLAQDYKLRIKQMTEEVERQVSTAMAEEIRRLSVLVD -350HHRG1AA -DYQMDFHPSPVVLKVYKNELHRHIEEGLGRNMSDRCSTAITNSLQTMQQD -400
::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ::::::::RHRG1AA -EYQMDFHPSPVVLKVYKNELHRHIEEGLGRNMSDRCSTAIASSLQTMQQD -400HHRG1AA -MIDGLKPLLPVSVRNQIDMLVPRQPFSLNYDLNCDKLCADFQEDIEFHFS -450
:::::::::::::::::::::::: ::: :::::::::::::::::::::RHRG1AA -MIDGLKPLLPVSVRNQIDMLVPRQCFSLSYDLNCDKLCADFQEDIEFHFS -450HHRG1AA -LGWTMLVNRFLGPKNSRRALMGYNDQVQRPIPLTPANPSMPPLPQGSLTQ -500
:::::::::::::::::::: ::::::::: :::::::::::::::::::RHRG1AA -LGWTMLVNRFLGPKNSRRALLGYNDQVQRPLPLTPANPSMPPLPQGSLTQ -500HHRG1AA -EEFMVSMVTGLASLTSRTSMGILVVGGVVWKAVGWRLIALSFGLYGLLYV -550
:: :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::RHRG1AA -EELMVSMVTGLASLTSRTSMGILVVGGVVWKAVGWRLIALSFGLYGLLYV -550HHRG1AA -YERLTWTTKAKERAFKRQFVEHASEKLQLVISYTGSNCSHQVQQELSGTF -600
:::::::: :::::::::::: ::::::: ::::::::::::::::::::RHRG1AA -YERLTWTTRAKERAFKRQFVEYASEKLQLIISYTGSNCSHQVQQELSGTF -600HHRG1AA -AHLCHQVVITRDNLDQEIAAMNKKVDALDSLHSKAKFLSNKAAWFDSELN -650
:::: :: :::::: :::::::::: ::::: :::: : ::: : :::::RHRG1AA -AHLCQQVDITRDNLEQEIAAMNKKVEALDSLQSKAKLLRNKAGWLDSELN -650HHRG1AA -TFIQQYLQPSR -661
:: :::::::RHRG1AA -MFIHQYLQPSR -661
Claims (4)
1.本发明涉及一种高血压相关基因，其特征在于：大鼠高血压相关基因(HRG-1)互补脱氧核糖核酸(cDNA)全长为4160bp，其阅读框架为1983bp，可编码661个氨基酸组成蛋白质。人HRG-1 cDNA阅读框架为1983bp，可编码661个氨基酸组成蛋白质。人和大鼠HRG-1有高度同源性。
2.根据权利要求1所述之高血压相关基因，其特征在于：人和大鼠HRG-1纯化蛋白质的分子量为66KDa，等电点为5.7-6.2。
3.根据权利要求1、2所述之高血压相关基因，其特征在于：含有蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC)的结合位点，以及多个糖基化位点。
4.根据权利要求1、2、3所述之高血压相关基因，其特征在于：该基因可抑制血管平滑肌细胞(VSMC)和肿瘤细胞的增殖和生长，可用于包括动脉粥样硬化、高血压、再狭窄等以VSMC增生为主要病理基础的心血管病以及肿瘤的基因治疗、生物治疗和药物治疗。也可用于筛选新的药物。可用于心血管及肿瘤的诊断及检验指标。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 97121655 CN1181420A (zh) | 1997-11-21 | 1997-11-21 | 高血压相关基因 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 97121655 CN1181420A (zh) | 1997-11-21 | 1997-11-21 | 高血压相关基因 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1181420A true CN1181420A (zh) | 1998-05-13 |
Family
ID=5176353
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 97121655 Pending CN1181420A (zh) | 1997-11-21 | 1997-11-21 | 高血压相关基因 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1181420A (zh) |
-
1997
- 1997-11-21 CN CN 97121655 patent/CN1181420A/zh active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C01 | Deemed withdrawal of patent application (patent law 1993) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |