CN118127129A - 一种双链dna识别探针rp1-rp2、生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种双链DNA识别探针RP1‑RP2、生物传感器及其制备方法和应用。所述生物传感器包括双链DNA识别探针RP1‑RP2，所述双链DNA识别探针RP1‑RP2包括RP1链和RP2链；所述RP1链的序列如SEQ ID NO.1所示；所述RP2链的序列如SEQ ID NO.2所示。本发明提供的免标记的生物传感器制备方法简单、灵敏度较高，具有良好的特异性，适用于医疗领域对UDG活性的检测。
Description
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种双链DNA识别探针RP1-RP2、生物传感器及其制备方法和应用。
背景技术
尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)是一种高度保守的DNA修复酶，负责维持遗传的稳定性和完整性。UDG可以通过切割糖苷键来识别和去除基因组DNA中突变的尿嘧啶碱基，产生无尿嘧啶/无嘧啶(AP)位点，以便进一步修复基因组。正常的UDG活性对DNA损伤修复和基因组完整性至关重要。而UDG活性异常可导致尿嘧啶切除不平衡，最终导致神经退行性疾病、衰老、人类免疫缺陷、布鲁姆综合征、癌症等多种疾病。研究证据表明，UDG的异常表达与肿瘤的发生有直接关系，且UDG的异常表达通常发生在肿瘤发生之前。因此，UDG活性可作为早期诊断肿瘤的潜在标志物和癌症治疗的预后指标。
UDG传统的检测方法主要包括凝胶电泳结合放射性同位素32P标记、质谱法、表面增强拉曼散射法和比色法等，这些方法虽然有效，但往往存在放射性危害、灵敏度差、操作复杂、设备昂贵和检测时间长的问题，极大限制了其广泛应用。
近年来，基于生物传感的荧光策略引起关注，虽然目前的荧光生物传感器解决了传统的检测方法存在的灵敏度差、操作复杂及检测时间长的问题，但其往往需要设计复杂的荧光标记探针，容易产生错误信号，难以准确检测复杂真实样品中的低表达UDG。
因此，开发一种简单、免标记的生物传感器来检测UDG非常有必要。
发明内容
为开发一种简单、免标记的生物传感器，本发明提供了一种双链DNA识别探针RP1-RP2、生物传感器及其制备方法和应用。
本发明提供了一种双链DNA识别探针RP1-RP2，其特征在于，所述双链DNA识别探针RP1-RP2包括RP1链和RP2链；
所述RP1链为含有尿嘧啶碱基序列与部分切刻核酸内切酶识别序列的嵌合共轭链，所述RP2链为抑制链；
所述RP1链的序列如SEQ ID NO.1所示；
所述RP2链的序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种所述双链DNA识别探针RP1-RP2的制备方法，所述双链DNA识别探针RP1-RP2由RP1和RP2链以1:2的比例混合后，在95℃下加热5min，退火后形成部分互补的双链DNA识别探针RP1-RP2。
本发明还提供了一种包含所述的双链DNA识别探针RP1-RP2的生物传感器，所述生物传感器还包括DNA发夹信号探针HP；
所述DNA发夹信号探针HP为5’端含有G四链体序列的发夹型信号探针；
所述DNA发夹信号探针HP的序列如SEQ ID NO.3所示。
优选的，所述生物传感器还包括Nt.BbvCI、CutsmartTM缓冲液、NMM和KCl。
本发明还提供了所述的生物传感器检测UDG的方法，将UDG与所述生物传感器孵育后荧光检测。
优选的，所述的生物传感器检测UDG的方法，包括以下步骤：
将UDG与双链DNA识别探针RP1-RP2在UDG反应缓冲液中混合，在37℃下孵育，去除尿嘧啶碱基；
孵育后添加DNA发夹信号探针HP、Nt.BbvCI和CutsmartTM缓冲液，在37℃下反应；
反应后再加入NMM和KCl，并在37℃下再次孵育，得最终反应产物；
最后使用荧光分光光度计检测最终反应产物的荧光强度。
优选的，所述双链DNA识别探针RP1-RP2的浓度为1-2μM。
优选的，所述DNA发夹信号探针的浓度为1.5-2.5μM。
本发明还提供了所述的双链DNA识别探针RP1-RP2或所述的生物传感器在制备UDG活性检测试剂中的应用。
本发明还提供了所述的双链DNA识别探针RP1-RP2或所述的生物传感器在UDG抑制剂筛选中的应用。
本发明生物传感器的工作原理如下：
本发明原理如图1所示，RP1链为含有尿嘧啶碱基序列与部分切刻核酸内切酶识别序列的嵌合共轭链，RP2链为抑制链，RP1和RP2链经加热退火后形成部分互补的双链DNA识别探针RP1-RP2；
根据切刻核酸内切酶识别位点以及RP1链的序列，本发明设计了一个5’端含有G四链体序列的发夹型信号探针(HP)，用于构建切刻核酸内切酶驱动的免标记生物传感器的运行部分，HP经加热退火后获得DNA发夹信号探针HP；
当UDG加入到含有双链DNA识别探针RP1-RP2和DNA发夹信号探针HP的传感系统时，UDG特异性识别并切割RP1链上的尿嘧啶碱基从而生成AP位点，从而导致双链DNA识别探针RP1-RP2的Tm值降低发生解旋作用，释放出单链RP1和RP2；
释放出的含部分切刻核酸内切酶识别序列的单链RP1可以特异性识别DNA发夹信号探针HP并将其打开，从而形成含有完整切刻核酸内切酶识别位点的DNA双链RP1-HP；
再将切刻核酸内切酶Nt.BbvCI引入传感系统，Nt.BbvCI特异性识别并切割含有完整切刻核酸内切酶识别位点的DNA双链RP1-HP，从而释放出RP1链和富含G-四链体的DNA片段；
释放的RP1链可以继续打开下一个DNA发夹信号探针HP，触发新一轮Nt.BbvCI的切割作用，形成了一个完整闭合的环路，不断地释放富含G-四链体的DNA片段，直至将体系中的DNA发夹信号探针HP消耗殆尽；
而富含G-四链体序列的DNA片段在单价阳离子(K+)的辅助下折叠成G4结构，随后与荧光染料N-甲基中卟啉IX(NMM)结合能生成带有荧光信号的NMM-G4复合物。因此，可以通过荧光光谱检测该荧光信号从而实现对UDG活性的检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明设计了一个含尿嘧啶碱基和部分切刻核酸内切酶识别序列的双链DNA识别探针RP1-RP2，用于UDG的识别和信号传导；设计了一个5’端含有G四链体序列的DNA发夹信号探针HP，用于构建切刻核酸内切酶驱动的生物传感器的运行部分以及信号的输出。
(2)本发明以切刻内切酶为驱动力，构建了免荧光标记的DNA环路用于尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)的检测。
(3)本发明以酶切反应为驱动力，加快了反应速度，缩短了反应时间；免荧光标记减少了背景荧光信号的干扰以及降低了成本。
(4)本发明的生物传感器整体操作简单易行，避免了繁琐的操作过程。
(5)本发明的生物传感器制备方法简单、避免复杂且昂贵的荧光标记、灵敏度较高(检出限为0.0006U/mL)，重复性好(0.01U/mLUDG的日内RSD为1.01％，日间RSD为1.74％)，具有特异性，适用于医疗领域对UDG活性的检测。
(6)本发明提供的生物传感器不仅能用于制备宫颈癌等相关诊断产品，也能用于科研上，例如通过检测UDG筛选UDG抑制剂等。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明中UDG检测过程原理图；
图2为本发明中荧光强度随Nt.BbvCI浓度的变化图；
图3为本发明中荧光强度随Nt.BbvCI反应时间的变化图；
图4为本发明中荧光强度随双链DNA识别探针RP1-RP2浓度的变化图；
图5为本发明中荧光强度随DNA发夹信号探针HP浓度的变化图；
图6为本发明中荧光强度随NMM浓度的变化图；
图7为本发明中荧光强度随UDG反应时间的变化图；
图8为本发明中不同混合物的典型荧光光谱：
其中，a为RP1-RP2+Nt.BbvCI+NMM+CutsmartTM缓冲液+KCl的荧光光谱；
b为HP+Nt.BbvCI+NMM+CutsmartTM缓冲液+KCl的荧光光谱；
c为RP1-RP2+HP+Nt.BbvCI+NMM+CutsmartTM缓冲液+KCl的荧光光谱；
d为RP1-RP2+HP+UDG+Nt.BbvCI+NMM+CutsmartTM缓冲液+KCl的荧光光谱。
图9为本发明中不同浓度UDG的荧光光谱图；
图10为本发明中不同浓度UDG产生的荧光强度；
插图为FI与UDG浓度对数在0.001至1.25U/mL范围内呈线性关系。
图11为本发明中不同目标物的荧光强度图；
图12为本发明中不同浓度UGI下UDG的相对活性；
图13为本发明中NP-40裂解缓冲液、HeLa细胞裂解液+UGI及HeLa细胞裂解液的荧光光谱。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实验试剂和仪器：
本发明所用到的实验试剂和仪器如下：
1、实验试剂：DNA寡核苷酸(如表1)由生工生物工程股份有限公司(中国，上海)合成和纯化；尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)和UDG反应缓冲液(1×，20mM Tris-HCl，1mM DTT，1mMEDTA，pH＝8)，切刻核酸内切酶(Nt.BbvCI)，8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)、人单链选择性单功能UDG(hSMUG1)、核酸外切酶I(Exo I)、核酸外切酶III(Exo III)、尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)购自纽英伦生物技术有限公司(中国，北京)；N-甲基中卟啉IX(NMM)购自J&KScientific Ltd.(中国，北京)；其他化学品为分析纯，由标准试剂供应商提供；本发明使用的缓冲液均采用超纯水(>18.25MΩ·cm)制备。
2、实验仪器：荧光分光光度计(HitaciF-7000)。
实施例1：双链DNA识别探针RP1-RP2和DNA发夹信号探针HP的制备。
一、双链DNA识别探针RP1-RP2
将RP1和RP2分别用1×TE缓冲溶液(10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)，1mM亚氨基二乙酸二钠盐(Na2EDTA)，pH＝8)稀释至适当浓度，然后将RP1链和RP2链以1:2的比例混合，将混合物在95℃下加热5min，缓慢降温至室温，得到双链DNA识别探针RP1-RP2。其中，RP1链为含有尿嘧啶碱基序列与部分切刻核酸内切酶识别序列的嵌合共轭链，RP2链为抑制链，RP1和RP2的核苷酸序列如表1。
二、DNA发夹信号探针HP
将5’端含有G四链体序列的HP链用1×TE缓冲溶液(10mM Tris-HCl，1mM Na2EDTA，pH＝8)稀释至适当浓度，然后在95℃下加热5min，然后缓慢降至室温，获得DNA发夹信号探针HP。HP的核苷酸序列如表1。
表1：DNA寡核苷酸序列
以上制备获得的双链DNA识别探针RP1-RP2、DNA发夹信号探针HP、Nt.BbvCI、CutsmartTM缓冲液、NMM和KCl组合称为生物传感器。
实施例2：Nt.BbvCI量、Nt.BbvCI反应时间、双链DNA识别探针RP1-RP2浓度、DNA发夹信号探针HP浓度、NMM浓度和UDG反应时间对荧光强度的影响。
一、荧光强度随Nt.BbvCI浓度的变化
1、实验方法
将0.1U/mL UDG与1.5μL双链DNA识别探针RP1-RP2(1.5μM)加入到10μLUDG反应缓冲液中混合，并在37℃下孵育40min；
孵育40min后添加5μL DNA发夹信号探针HP(2μM)、分别加入2U、4U、5U、6U、8U的Nt.BbvCI和CutsmartTM缓冲液，得到体系的终体积为50μL，在37℃下反应80min；
反应80min后再加入5μLNMM(5μM)和5μLKCl(2M)，并在37℃下再次孵育30min，得最终反应产物；
最后使用荧光分光光度计对最终反应产物进行荧光测定。
2、实验结果
检测结果见图2，从图中可以看出，随着Nt.BbvCI量的增加，荧光强度不断增强，在Nt.BbvCI量达到6U之后，荧光强度达到平台期。因此，6U是Nt.BbvCI的最佳剂量。
二、荧光强度随Nt.BbvCI反应时间的变化
1、实验方法
将0.1U/mL UDG与1.5μL双链DNA识别探针RP1-RP2(1.5μM)加入到10μLUDG反应缓冲液中混合，并在37℃下孵育40min；
孵育40min后添加5μL DNA发夹信号探针HP(2μM)、加入6U Nt.BbvCI和CutsmartTM缓冲液，得到体系的终体积为50μL，在37℃下分别反应20、30、40、60、80、90、100min；
反应完成后再加入5μLNMM(5μM)和5μLKCl(2M)，并在37℃下再次孵育30min，得最终反应产物；
最后使用荧光分光光度计对最终反应产物进行荧光测定。
2、实验结果
检测结果见图3，从图中可以看出，随着反应时间的增加，荧光强度不断增强，在80min之后，荧光强度基本不变。因此，Nt.BbvCI的最佳反应时间为80min。
三、荧光强度随双链DNA识别探针RP1-RP2浓度的变化
1、实验方法
将0.1U/mL UDG与1.5μL双链DNA识别探针RP1-RP2(0.2μM、0.5μM、1μM、1.25μM、1.5μM、1.75μM、2μM)分别加入到10μLUDG反应缓冲液中混合，并在37℃下孵育40min；
孵育40min后添加5μL DNA发夹信号探针HP(2μM)、加入6U Nt.BbvCI和CutsmartTM缓冲液，得到体系的终体积为50μL，在37℃下分别反应80min；
反应完成后再加入5μLNMM(5μM)和5μLKCl(2M)，并在37℃下再次孵育30min，得最终反应产物；
最后使用荧光分光光度计对最终反应产物进行荧光测定。
2、实验结果
检测结果见图4，从图中可以看出，随着双链识别探针量的增加，荧光强度不断增强，在双链识别探针量达到1.5μM之后，荧光强度基本不变。因此，1.5μM为双链识别探针的最佳实验浓度。
四、荧光强度随DNA发夹信号探针HP浓度的变化
1、实验方法
将0.1U/mL UDG与1.5μL双链DNA识别探针RP1-RP2(1.5μM)加入到10μLUDG反应缓冲液中混合，并在37℃下孵育40min；
孵育40min后分别添加5μL DNA发夹信号探针HP(0.5μM、1.0μM、1.5μM、2.0μM、2.25μM、2.5μM、2.75μM)、加入6UNt.BbvCI和CutsmartTM缓冲液，得到体系的终体积为50μL，在37℃下分别反应80min；
反应完成后再加入5μLNMM(5μM)和5μLKCl(2M)，并在37℃下再次孵育30min，得最终反应产物；
最后使用荧光分光光度计对最终反应产物进行荧光测定。
2、实验结果
检测结果见图5，从图中可以看出，随着DNA发夹信号探针量的增加，荧光强度不断增强，发夹信号探针量达到2μM时，荧光强度最大。因此，2μM为发夹信号探针的最佳实验浓度。
五、荧光强度随NMM浓度的变化
1、实验方法
将0.1U/mL UDG与1.5μL双链DNA识别探针RP1-RP2(1.5μM)加入到10μLUDG反应缓冲液中混合，并在37℃下孵育40min；
孵育40min后添加5μL DNA发夹信号探针HP(2μM)、加入6U Nt.BbvCI和CutsmartTM缓冲液，得到体系的终体积为50μL，在37℃下分别反应80min；
反应完成后再分别加入5μLNMM(1.0μM、2.0μM、2.5μM、4μM、5μM、7.5μM、10μM)和5μLKCl(2M)，并在37℃下再次孵育30min，得到最终反应产物；
最后使用荧光分光光度计对最终反应产物进行荧光测定。
2、实验结果
检测结果见图6，从图中可以看出，随着NMM量的增加，荧光强度不断增强，在NMM量达到5μM时，荧光强度最大。
六、荧光强度随UDG反应时间的变化
1、实验方法
将0.1U/mL UDG与1.5μL双链DNA识别探针RP1-RP2(1.5μM)加入到10μLUDG反应缓冲液中混合，并在37℃下分别孵育20min、25min、30min、35min、40min、45min和50min；
孵育完成后添加5μL DNA发夹信号探针HP(2μM)、加入6UNt.BbvCI和CutsmartTM缓冲液，得到体系的终体积为50μL，在37℃下分别反应80min；
反应完成后再分别加入5μLNMM(5μM)和5μLKCl(2M)，并在37℃下再次孵育30min，得最终反应产物；
最后使用荧光分光光度计对最终反应产物进行荧光测定。
2、实验结果
检测结果见图7，从图中可以看出，在20-40min内，荧光强度随时间的推进逐渐增加。因此，UDG的最佳反应时间为40min。
实施例3：利用实施例1提供的生物传感器检测UDG活性的方法。
生物传感器由实施例1制备获得的双链DNA识别探针RP1-RP2、DNA发夹信号探针HP、Nt.BbvCI、CutsmartTM缓冲液、NMM和KCl组成。
将0.1U/mL UDG与1.5μL双链DNA识别探针RP1-RP2(1.5μM)加入到10μLUDG反应缓冲液中混合，并在37℃下孵育40min，去除尿嘧啶碱基；
孵育40min后添加5μL DNA发夹信号探针HP(2μM)、6U Nt.BbvCI和CutsmartTM缓冲液，得到体系的终体积为50μL，在37℃下反应80min；
反应80min后再加入5μLNMM(5μM)和5μL KCl(2M)，并在37℃下再次孵育30min，得反应产物；
最后使用荧光分光光度计对反应产物进行荧光测定，参数设置为：激发波长(Ex)＝399nm，荧光发射波长(Em)＝560-680nm，光电倍增管电压(PMT)＝400V，激发狭缝(ExSlit)＝2nm，发射狭缝(Em Slit)＝2nm；
UDG反应缓冲液的组成为：20mM三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)、1mM二硫苏糖醇(DTT)、1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，pH＝8；
CutsmartTM缓冲液的组成为：50mM醋酸钾(KAc)、20mM三羟甲基氨基甲烷醋酸盐(Tris-Ac)、10mM醋酸镁(Mg(Ac)2)、100μg/ml牛血清白蛋白(BSA)。
实施例4：利用实施例1提供的生物传感器检测UDG活性的方法。
生物传感器由实施例1制备获得的双链DNA识别探针RP1-RP2、DNA发夹信号探针HP、Nt.BbvCI、CutsmartTM缓冲液、NMM和KCl组成。
将0.1U/mL UDG与1.5μL双链DNA识别探针RP1-RP2(1μM)加入到10μLUDG反应缓冲液中混合，并在37℃下孵育30min，去除尿嘧啶碱基；
孵育40min后添加5μL DNA发夹信号探针HP(1.5μM)、4U Nt.BbvCI和CutsmartTM缓冲液，得到体系的终体积为50μL，在37℃下反应60min；
反应80min后再加入5μLNMM(3μM)和5μLKCl(2M)，并在37℃下再次孵育30min，得反应产物；
最后使用荧光分光光度计对反应产物进行荧光测定，参数设置、UDG反应缓冲液的组成和CutsmartTM缓冲液的组成与实施例3中的相同。
实施例5：利用实施例1提供的生物传感器检测UDG活性的方法。
生物传感器由实施例1制备获得的双链DNA识别探针RP1-RP2、DNA发夹信号探针HP、Nt.BbvCI、CutsmartTM缓冲液、NMM和KCl组成。
将0.1U/mL UDG与1.5μL双链DNA识别探针RP1-RP2(2μM)加入到10μLUDG反应缓冲液中混合，并在37℃下孵育50min，去除尿嘧啶碱基；
孵育40min后添加5μL DNA发夹信号探针HP(2.5μM)、8U Nt.BbvCI和CutsmartTM缓冲液，得到体系的终体积为50μL，在37℃下反应100min；
反应80min后再加入5μLNMM(10μM)和5μL KCl(2M)，并在37℃下再次孵育30min，得反应产物；
最后使用荧光分光光度计对反应产物进行荧光测定，参数设置、UDG反应缓冲液的组成和CutsmartTM缓冲液的组成与实施例3中的相同。
对比例1：利用实施例1提供的生物传感器检测不存在UDG时的方法。
生物传感器由实施例1制备获得的双链DNA识别探针RP1-RP2、DNA发夹信号探针HP、Nt.BbvCI、CutsmartTM缓冲液、NMM和KCl组成。
将1.5μL双链DNA识别探针RP1-RP2(1.5μM)加入到UDG反应缓冲液中混合，在37℃下孵育40min，孵育40min添加5μL DNA发夹信号探针HP(2μM)、6U Nt.BbvCI和CutsmartTM缓冲液，在37℃下反应80min，反应后再加入5μLNMM(5μM)和5μLKCl(2M)，并在37℃下孵育30min，得最终反应产物，最后使用荧光分光光度计对最终反应产物进行荧光测定。参数设置、UDG反应缓冲液的组成和CutsmartTM缓冲液的组成与实施例3中的相同
对比例2：利用实施例1提供的不含有DNA发夹信号探针HP的生物传感器检测不存在UDG时的方法。
生物传感器由实施例1制备获得的双链DNA识别探针RP1-RP2、Nt.BbvCI、CutsmartTM缓冲液、NMM和KCl组成。
将单独的1.5μL双链DNA识别探针RP1-RP2(1.5μM)加入到UDG反应缓冲液中混合，在37℃下孵育40min，孵育后添加6UNt.BbvCI和CutsmartTM缓冲液，在37℃下反应80min，反应后再加入5μLNMM(5μM)和5μL KCl(2M)，并在37℃下孵育30min，得最终反应产物，最后使用荧光分光光度计对最终反应产物进行荧光测定。参数设置、UDG反应缓冲液的组成和CutsmartTM缓冲液的组成与实施例3中的相同。
对比例3：利用实施例1提供的不含有双链DNA识别探针RP1-RP2的生物传感器检测不存在UDG时的方法。
生物传感器由实施例1制备获得的DNA发夹信号探针HP、Nt.BbvCI、CutsmartTM缓冲液、NMM和KCl组成。
将单独的5μL DNA发夹信号探针HP(2μM)加入到UDG反应缓冲液中混合，在37℃下孵育40min，孵育后添加6UNt.BbvCI和CutsmartTM缓冲液，在37℃下反应80min，反应后再加入5μLNMM(5μM)和5μLKCl(2M)，并在37℃下孵育30min，得最终反应产物，最后使用荧光分光光度计对最终反应产物进行荧光测定。参数设置、UDG反应缓冲液的组成和CutsmartTM缓冲液的组成与实施例3中的相同。
如图8，从实施例4和对比例1-3可以看到，单独的双链识别探针(a)、单独的DNA发夹信号探针(b)和不存在UDG时的双链识别探针与DNA发夹信号探针(c)只显示出微弱的荧光强度，这是因为在体系中没有发生构象的变化，整个传感系统没有被触发。然而，当UDG存在时(d)，荧光强度显著增加，这表明UDG能够移除双链识别探针中的尿嘧啶碱基而释放出单链(RP1)进而触发系统的运行。因此，实验结果表明本发明的生物传感器可用于UDG活性的检测。
实施例7：生物传感器的性能分析。
一、实验方法
将不同浓度(0.001U/mL、0.0025U/mL、0.005U/mL、0.01U/mL、0.05U/mL、0.1U/mL、0.5U/mL、1U/mL、1.25U/mL)UDG分别与1.5μL双链DNA识别探针RP1-RP2(1.5μM)加入到10μLUDG反应缓冲液中混合，后续的步骤与实施例4中UDG的活性检测方法相同。
二、生物传感器对不同浓度UDG的荧光响应
如图9所示，随着UDG浓度从0.001U/mL增加到1.25U/mL，荧光响应逐渐加强，这表明随着UDG浓度的增加，更多的DNA回路被启动，最终生成了更多免标记的荧光信号NMM-G4复合物。
三、生物传感器的检测UDG活性的灵敏度
如图10所示，在0.001-1.25U/mL范围内，荧光强度与UDG浓度的对数具有线性关系，回归方程为FI＝2652.6+689.7lgC(R＝0.994)，其中FI表示荧光强度，C表示相应的UDG浓度。根据三倍标准差原理，计算出本发明的检测方法的检出限为0.0006U/mL，说明本发明的生物传感器具有良好的灵敏度。
四、生物传感器的检测UDG活性的重复性和再现性
为了检验该方法的重复性和重现性，对UDG浓度分别为0.01U/mL、0.1U/mL和1U/mL的同一批次样品进行了日内和日间检测。从表2可以看出，日内相对标准偏差(RSD)分别为1.01％、1.57％和2.86％，从表3可以看出，日间RSD分别为1.74％、1.97％和3.08％。这些结果表明，本发明所提出的生物传感器表现出可接受的重复性和再现性。
表2UDG检测方法的日内精密度结果
| Sample1(FI) | Sample2(FI) | Sample3(FI) | Average | RSD | |
| 1U/mL | 2732 | 2678 | 2699 | 2703 | 1.01％ |
| 0.1U/mL | 1854 | 1886 | 1913 | 1884.33 | 1.57％ |
| 0.01U/mL | 1227 | 1232 | 1207 | 1238.67 | 2.86％ |
表3UDG检测方法的日间精密度结果
| Sample1(FI) | Sample2(FI) | Sample3(FI) | Average | RSD | |
| 1U/mL | 2732 | 2710 | 2642 | 2694.67 | 1.74％ |
| 0.1U/mL | 1854 | 1824 | 1897 | 1858.33 | 1.97％ |
| 0.01U/mL | 1277 | 1203 | 1258 | 1246 | 3.08％ |
五、生物传感器的检测UDG活性的特异性
将8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)、人单链选择性单功能UDG(hSMUG1)、核酸外切酶I(Exo I)和核酸外切酶III(Exo III)分别与1.5μL双链DNA识别探针RP1-RP2(1.5μM)加入到10μLUDG反应缓冲液中混合，后续的步骤与实施例4中UDG的活性检测方法相同，测定荧光信号；
以不添加UDG时作为空白体系，空白体系的实验步骤与对比例1中的检测方法相同，测定荧光信号。
结果如图11所示，在相同的反应条件下，UDG存在时检测到明显的荧光信号，而hOGG1、hSMUG1、Exo I以及Exo III只得到与空白体系相当的低的荧光强度。这些结果表明，本发明的生物传感器对检测UDG活性具有良好的特异性。
实施例8：抑制剂的筛选。
一、实验方法
将不同浓度(0U/mL、0.2U/mL、0.5U/mL、1.0U/mL、1.5U/mL、2.0U/mL、2.5U/mL)的UGI溶液与10U UDG混合，在37℃下孵育40min，随后的操作与实施例4中检测UDG活性的步骤相同，所有实验进行三次，然后计算不同浓度的UGI下UDG的相对活性。
二、实验结果
如图12，随着UGI浓度的增加，UDG的相对活性降低。因此，该结果证明了本发明在UDG抑制剂研究和抑制剂筛选中的潜在作用。
实施例9：生物样本分析。
一、HeLa细胞裂解液的制备及检测
首先，将宫颈癌(HeLa)细胞加入离心管中，离心(3000rpm，5min)，弃上清液，然后将20mL 10mM Tris-HCl低渗缓冲液加入离心管中，并用移液枪吹气以破裂HeLa细胞，得到混合物，随后将混合物在冰浴中孵育30min，在此期间每10分钟进行一次涡旋(30s，3000rpm)，再将混合物离心(30min，12000rpm)以获得上清液，在0.45μm膜下进行过滤，得到HeLa细胞裂解液。
利用实施例1中的生物传感器对HeLa细胞裂解液进行检测。
二、实验结果分析
如图13，相较于NP-40裂解缓冲液中观察到微弱的荧光信号(a)，HeLa细胞裂解液则出现一个显著增强的荧光信号(c)。然而，在HeLa细胞裂解液加入UGI(UDG抑制剂)后，由于UGI对UDG活性的特异性抑制，荧光强度又显著降低，基本与裂解缓冲液的荧光强度持平(b)。这些结果表明，本发明的生物传感器可以作为生物样本中检测UDG活性的潜在工具。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种双链DNA识别探针RP1-RP2，其特征在于，所述双链DNA识别探针RP1-RP2包括RP1链和RP2链；
所述RP1链的序列如SEQ ID NO.1所示；
所述RP2链的序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种权利要求书1所述的双链DNA识别探针RP1-RP2的制备方法，其特征在于，所述双链DNA识别探针RP1-RP2由RP1和RP2链经加热退火后形成部分互补的双链DNA识别探针RP1-RP2。
3.一种包含权利要求1所述的双链DNA识别探针RP1-RP2的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器还包括DNA发夹信号探针HP；
所述DNA发夹信号探针HP的序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求3所述的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器还包括Nt.BbvCI、CutsmartTM缓冲液、NMM和KCl。
5.利用权利要求3-4任一项所述的生物传感器检测UDG的方法，其特征在于，将UDG与所述生物传感器孵育后进行荧光检测。
6.根据权利要求5所述的生物传感器检测UDG的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将UDG与双链DNA识别探针RP1-RP2在UDG反应缓冲液中混合，孵育；
孵育后添加DNA发夹信号探针HP、Nt.BbvCI和CutsmartTM缓冲液，反应；
反应后再加入NMM和KCl，孵育，得最终反应产物；
最后检测最终反应产物的荧光强度。
7.根据权利要求6所述的生物传感器检测UDG的方法，其特征在于，所述双链DNA识别探针RP1-RP2的浓度为1-2μM。
8.根据权利要求6所述的生物传感器检测UDG的方法，其特征在于，所述DNA发夹信号探针的浓度为1.5-2.5μM。
9.一种权利要求1所述的双链DNA识别探针RP1-RP2或权利要求3-4任一项所述的生物传感器在制备UDG活性检测试剂中的应用。
10.一种权利要求1所述的双链DNA识别探针RP1-RP2或权利要求3-4任一项所述的生物传感器在UDG抑制剂筛选中的应用。
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| CN118127129A true CN118127129A (zh) | 2024-06-04 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication |