CN118127034A - PtoMYB113基因在紫叶毛白杨育种中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物育种技术领域，具体为一种PtoMYB113基因在紫叶毛白杨育种中的应用，所述PtoMYB113基因在NCBI中基因序列号为：MW762689.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。过表达PtoMYB113转基因毛白杨具有较高的花青素积累，叶片呈现紫色，生长受抑制，茎粗变细，为培育紫叶景观杨树提供了重要的基因资源，具有广阔的应用前景和研究价值。
Description
技术领域
本发明涉及植物育种领域，具体涉及一种杨树PtoMYB113基因在紫叶毛杨树育种中的应用。
背景技术
毛白杨(Populus tomentosa)适应性强，能够在多种土壤和环境条件下生长。它在中国北方地区尤为常见，被广泛用于城市绿化和造林。毛白杨的木材质地坚硬，是造纸和人造板材的重要原料。此外，由于其生长迅速和广泛的适应性，毛白杨也是遗传改良和基因工程研究的一个重要对象，通过科学技术的应用，可以进一步提高其经济和环保价值。对毛白杨进行基因研究和改良，不仅可以增强其抗逆性和适应性，还可以为林业可持续发展和生态环境保护提供重要支撑。
植物在正常生长发育过程中会遇到多种生物胁迫(病原体和害虫等)和环境因子非生物胁迫(干旱、盐分、低温、高温等)的影响。这些胁迫因子会影响植物的生长、发育、产量和生存能力。在植物生长发育和适应环境变化的过程中，花青素的生物合成和积累受到多层次的调控。其中MYB转录因子与bHLH转录因子及WD40蛋白共同构成一个调控复合物，影响花青素生物合成相关基因的表达。这些转录因子通过调控花青素生物合成途径的特定基因来控制植物中从红色到蓝色的花青素的产生。环境因子如植物激素、光照和温度等对花青素生物合成具有显著影响。脱落酸可以诱导某些MYB转录因子的表达，从而促进花青素的合成；并且光照和温度通过影响MYB转录因子的活性，进而改变花青素的合成和积累。
花青素是类黄酮的一类重要次生代谢产物，在植物中广泛存在。它们主要负责植物花、果实、叶等器官的颜色形成，还具有抗氧化、抗病等生物学功能。花青素赋予花朵鲜艳的颜色，吸引蜂鸟、昆虫等传粉者。这些传粉者被颜色吸引到花朵上，从而帮助植物进行繁殖。在果实中，花青素的存在通常表明果实已成熟。这种颜色变化吸引动物食用果实，并帮助植物的种子传播。花青素还可以保护植物免受强烈光照的伤害。在强光照下，过多的光能可能对植物造成损害，花青素通过吸收这些光线来降低潜在的损伤。植物中的花青素可以根据环境条件(特别是pH值)改变其色彩，这种适应性变化可能与生态位、环境条件或其他生存策略相关。
因此，本发明意图通过对调控花青素合成的相关基因进行研究，以获得一种新的毛白杨品种，为毛白杨的选育提供新的发展思路。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种紫叶景观杨树PtoMYB113的基因在紫叶毛白杨育种中的应用。
本发明提供一种PtoMYB113基因在紫叶毛白杨育种中的应用，所述PtoMYB113基因在NCBI中基因序列号为：MW762689.1，所述PtoMYB113基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，通过过表达PtoMYB113来提高毛白杨中花青素含量。MYB113过表达毛白杨的叶片明显变红，生长受到抑制。
优选地，通过过表达PtoMYB113来提高花青素合成基因的表达量。
优选地，通过过表达PtoMYB113来促进花青素合成基因Pto4CL1、Pto4CL2、PtoCHS1、PtoDFR1、PtoDFR2或PtoUFGT1的表达。
优选地，通过过表达PtoMYB113来获得矮化毛白杨。MYB113过表达毛白杨的株高和茎粗均减小。
优选地，紫叶毛白杨育种过程包括以下步骤：
扩增PtoMYB113基因；
将扩增得到的PtoMYB113基因的全长CDS序列连接到表达载体上，得到过表达载体；
将所述过表达载体转化至农杆菌感受态细胞，利用得到的含有过表达载体的农杆菌感受态细胞侵染植株，培养，得到转基因毛白杨植株。
优选地，扩增PtoMYB113基因的引物对为：
OE-MYB113-F：5’-CGGGATCCATGGTAGGCTCATTAGGAGTAAG-3’；
OE-MYB113-R：5’-GGAATTC TTATAGAATAAAGTCCTTCTCAGGTT-3’。
优选地，扩增PtoMYB113基因时采用的PCR反应程序为：98℃预变性3min，98℃变性15sec，58℃退火15sec，72℃延伸10sec，34个循环，72℃彻底延伸5min。
优选地，扩增PtoMYB113基因时采用的PCR反应体系为：5×Primer STAR MAX 25μL、10μM F-Primer 1μL、10μM R-Primer 1μL、模板DNA 2μL、ddH2O 24μL
优选地，所述表达载体为pBI121。
优选地，采用BamHI和EcoR I两个限制性内切酶分别对所述PtoMYB113基因及表达载体酶切后进行连接。连接完成后直接转化大肠杆菌E.coli DH5α，然后通过PCR鉴定出阳性菌株。
优选地，酶切体系为：10×Green Buffer 5μL、SacⅠ2μL、BamHⅠ2μL、质粒/目的片段20μL、ddH2O 21μL。
优选地，连接体系为：10×T4 DNA Ligase Buffer 1μL、T4 DNA Ligase 1μL、酶切载体3μL、酶切目的片段5μL。
优选地，所述农杆菌感受态细胞为EHA105农杆菌。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明以毛白杨为研究材料，克隆了毛白杨PtoMYB113基因。通过生物信息学分析、诱导表达分析、目的基因过表达以及对花青素合成相关基因的分析，对PtoMYB113在花青素合成过程中的功能进行了研究。主要结果如下：
(1)进化树构建结果显示毛白杨PtoMYB113与PeMYB113同源性最高；序列比对表明MYB113是典型的R2R3-MYB转录因子，其N端区域为相对保守的功能保守区，包括一个56个氨基酸的R2功能域和一个50个氨基酸的R3功能域。
(2)对PtoMYB113过表达毛白杨的形态观察表明，将PtoMYB113基因的在毛白杨中过表达之后，对比转基因株系的生长表型和颜色表型：和WT相比，MYB113过表达材料的叶片明显变红，生长受到抑制，花青素含量测定表明，MYB113过表达材料的总花青素含量明显上升。
(3)在对类黄酮合成途径的标志基因Pto4CL1、Pto4CL2、PtoCHS1、PtoDFR1、PtoDFR2、PtoUFGT1表达水平进行检测。结果表明，与野生型相比，类黄酮合成途径中Pto4CL1、Pto4CL2、PtoCHS1、PtoDFR1、PtoDFR2、PtoUFGT1的表达量上升，其中PtoDFR1和PtoDFR2基因的表达量上调超过50倍。由以上结果可以得出，PtoMYB113可以通过促进类黄酮合成，促进花青素积累。
(4)采用转基因的方法，将MYB113基因整合到毛白杨基因组中去，改变了毛白杨的株高、茎粗、花青素含量积累。
综上，毛白杨的MYB113基因能够极大地促进毛白杨叶片中花青素积累，使得杨树叶片呈现紫色，为城市景观园林提供了一种紫叶景观杨树。并且MYB113基因的过表达会使植物生长受到抑制、叶片变红等，为基因工程选育景观植物提供了思路。
附图说明
图1为不同物种中MYB113的进化树比对；
图2为不同物种中MYB113的氨基酸序列比对；其中，表示R2功能域；/>表示R3功能域；
图3为MYB113基因表达量鉴定；与WT组相比，***P<0.001；
图4为MYB113过表达表型分析，其中，(a)为MYB113过表达植株的成苗表型，(b)为MYB113过表达植株的花青素含量，(c)为MYB113过表达植株的株高；(d)为MYB113过表达植株的茎粗统计；与WT组相比，*P<0.05，***P<0.001；
图5为MYB113过表达类黄酮合成途径基因表达量分析。
注：WT代表野生型毛白杨。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1
1、MYB113基因家族生物信息学分析
(1)MYB113蛋白进化树及同源性分析
使用NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、Phytozome数据库(https://phytozome.jgi.doe.gov/)查找不同物种中MYB113的氨基酸序列，利用MEGA11(http://www.megasoftware.net/mega.html)对杨树中MYB113基因进行系统发育树的构建，如图1所示。并利用DNAMAN 8.0将杨树MYB113的氨基酸序列与不同物种中MYB113的氨基酸序列进行多重比对，如图2所示。
2、目的基因的扩增
为了详细鉴定MYB113在毛白杨中具有的功能，克隆了毛白杨中MYB113基因的同源基因，在拟南芥Tair数据库(https://www.arabidopsis.org/)中查找出AtMYB113基因的CDS序列，利用杨树Phytozome数据库blast毛果杨(Populus trichocarpa)的PtrMYB113基因的CDS并在NCBI数据库中blast银白杨(Populus alba)的MYB113同源基因的CDS序列，最后采用Snapgene将银白杨和毛果杨MYB113进行序列比对，在同源区设计UTR区的特异性引物，PtoMYB113的序列为：
ATGGTAGGCTCATTAGGAGTAAGGAAAGGCGCATGGACGGAGGAGGAA
GATATACTTCTAAGGAAGTGCGTTGAGAAATATGGTGAAGCAAGATGGT
ATGAAGTTCCTTCCAGAGCAGGCTTGAATCGATGCAGGAAGAGCTGCAG
AATGAGGTGGTTGAATTATCTTAAGCCAAATATCAAGAGAGGACAGTTT
TCCGAGGACGAAGTGGACTTGATTATCAGACTACACAAGTTGCTTGGCA
ATAGGTGGTCATTGATAGCTGGTAGACTTTCAGGAAGAACAGCGAATGA
TGTAAAGAATTATTGGAACTCAAACCAGCGTAAGAAGGTGATTTCTAGC
ACTGATGAAGTTCGATCAAAACCAGAAGCAAAATCAATCACAAGAGAC
AACATAATAAAGCCTCGACCTTGGAAGTTCAGAAATTTATTCTGGTTAG
GAGGAAAAAGCACTCCACTTATTAACGTTGGTTCTCAACATGGGAACGA
TCTTTGTAAGCCATGTTATTCAACAGTATCGCCACCTTCCGACATTAATG
AAGTTTTAAGTTTATGGTGGGAAAGCTCGTTAGATGACAAAGAAATTAA
TCAAACGATCAACAGCAGTTGTCTGGGTTCTGCAGGTTCAGCAGCAGCA
GCTTACCTAGAGTCCAACGAAAGTCATCTTGTAGAGAACAACGAACCAG
GAGGGATCAAAACTGGGGATGTGTTCTATGAACAAGCTGGACAAAATT
GTTGGAGTGACATTTCTCTGGATGCAGACCTCTGGAATCTAATCAATGCAGAACTAGATCAACAACAACCTGAGAAGGACTTTATTCTATAA，记为SEQ ID NO.1。
PtoMYB113编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：
MVGSLGVRKGAWTEEEDILLRKCVEKYGEARWYEVPSRAGLNRCRKSCRMRWLNYLKPNIKRGQFSEDEVDLIIRLHKLLGNRWSLIAGRLSGRTANDVKNYWNSNQRKKVISSTDEVRSKPEAKSITRDNIIKPRPWKFRNLFWLGGKSTPLINVGSQHGNDLCKPCYSTVSPPSDINEVLSLWWESSLDDKEINQTINSSCLGSAGSAAAAYLESNESHLVENNEPGGIKTGDVFYEQAGQNCWSDISLDADLWNLINAELDQQQPEKDFIL
以毛白杨的cDNA作为模板，按照表1中PCR反应体系对MYB113基因进行扩增，获得毛白杨MYB113基因的CDS序列，50μL反应体系如表2所示。
表1PCR反应体系
| 5×PrimerSTARMAX | 25μL |
| F-Primer(10μM) | 1μL |
| R-Primer(10μM) | 1μL |
| 模板DNA | 2μL |
| ddH2O | 24μL |
表2PCR反应程序
PCR反应结束后采用1％琼脂糖凝胶电泳检测，并且采用胶回收试剂盒(天根生化科技公司)进行回收，得到PtoMYB113基因序列。
实施例2
1、过表达植株MYB113-pBI121的获得
为了详细鉴定PtoMYB113在毛白杨中具有的功能，设计克隆过表达基因的引物OE-MYB113-F/R，送于华大基因生物公司合成，将扩增得到的PtoMYB113基因的全长CDS序列连接到植物表达载体pBI121上，构建过表达载体。对PtoMYB113以及表达载体pBI121采用双酶切BamHI和EcoR I两个限制性内切酶进行酶切，50μL酶切体系如表3所示。
OE-MYB113-F(BamHⅠ)：5’-CGGGATCC ATGGTAGGCTCATTAGGAGTAAG-3’，如SEQ IDNO.3所示；
OE-MYB113-R(EcoRⅠ)：5’-GGAATTC TTATAGAATAAAGTCCTTCTCAGGTT-3’，SEQ IDNO.4所示。
表3酶切体系
| 10×GreenBuffer | 5μL |
| SacⅠ | 2μL |
| BamHⅠ | 2μL |
| 质粒/目的片段 | 20μL |
| ddH2O | 21μL |
37℃恒温培养箱孵育1h，按照上述的胶回收方法进行回收；将回收的线性化pBI121同MYB113进行连接，10μL连接体系如表4所示：
表4连接体系
| 10×T4DNALigaseBuffer | 1μL |
| T4DNALigase | 1μL |
| 酶切载体 | 3μL |
| 酶切目的片段 | 5μL |
用枪头轻轻吹打混匀，并于16℃连接3h。连接完成后直接转化大肠杆菌E.coliDH5α，然后通过PCR鉴定出阳性菌株，测序验证正确性。得到MYB113-pBI121载体。
2、MYB113-pBI121载体转化EHA105农杆菌
将MYB113-pBI121载体质粒转化EHA105农杆菌，从超低温冰箱取出事先制备好的EHA105农杆菌感受态细胞，并于冰上融化吸取2μL纯化的重组质粒DNA，转入100ml农杆菌感受态细胞，并置于冰上孵育40min。冰浴完成后，将含有重组DNA质粒的农杆菌感受态细胞经液氮速冻1min。速冻完成后迅速置于37℃恒温水浴锅保温5min。保温结束后，将800μL SOC培养基加入EP管，并在28℃，200rpm的恒温的摇床上斜置孵育3h。5000rpm离心4min，在超净工作台中，弃上清至100μL，重悬菌体并涂于LB固体筛选培养基上。在28℃恒温培养箱中倒置培养2天。
菌落PCR鉴定：将阳性的含有重组质粒DNA的农杆菌菌液接到含有利福平和卡那霉素的LB液体培养基中，在28℃，200rpm的恒温的摇床上斜置孵育1～2d，待到菌液变成橙黄色，保存菌液。
实施例3
1、表达转基因毛白杨的获得及鉴定
(1)过表达转基因毛白杨的获得
重新将重组质粒DNA的农杆菌菌液接到含有利福平和抗生素的LB液体培养基中，并加入乙酰丁香酮AS(100μmol/mL)，在28℃摇床振荡培养至菌液变成橙黄色，吸取10mL菌液6000rpm离心4min，用于毛白杨的遗传转化。
在超净工作台内，将离心好的农杆菌弃掉上清，并用5mLWPM浸染液(事先加入100μmol/mLAS)重悬，备用，将无菌的野生型幼苗的尖端幼嫩叶片在WPM浸染液中切成正方形的小块。加入3mL农杆菌重悬液浸染10min。浸染结束后，用镊子将小方块叶片夹出至无菌的滤纸板上，吸干菌液。将滤纸板上的叶块小心夹出，放置共培养基WPM培养基+1mg/LNAA+2mg/LZT上，并用保鲜膜封闭。
将放有叶块的WPM共培养基在25℃的黑暗培养箱中培养两天。黑暗共培养两天后，将叶块转移至WPM诱导培养基(WPM培养基+1mg/LNAA+2mg/L ZT+25mg/Lkana+200mg/LTMT)上，并在25℃的黑暗条件下培养一周。将诱导出愈伤组织的叶块转移至WPM分化培养基(WPM培养基+1.5mg/LZT+25mg/L kana+200mg/LTMT)上，并在光照条件下培养。每一周更换一次培养基。培养两周后，将愈伤组织转移培养瓶中，每瓶放置四个愈伤组织，每两周更换一次培养基。当愈伤组织分化出的不定芽长至1～2cm时，用无菌的剪刀将芽从愈伤组织上剪下，并去除多余的叶片，将不定芽垂直扦插至生根培养基上。生根培养至幼苗长至约10cm并根系较为发达，大约需要培养35d。对转基因的杨树幼苗进行阳性鉴定。选取表达量高的阳性苗进行扩繁，具体步骤与上述组织培养方法一致。用镊子将生根的阳性幼苗从培养瓶中拔出，并用清水洗净根部培养基，将幼苗移植到装有蛭石的黑色小黑盆。幼苗在温度为25℃，光照时间为16h，光合有限辐射130μmol m-2·s-1的生长条件下培养。每一周更换一次二分之一Hogland营养液。
(2)过表达转基因毛白杨的鉴定
选择植物新鲜组织在液氮中速冻，并在液氮中使用研钵研磨成分装，采用多糖多酚总RNA提取试剂盒(BSC65S1B，BIOER)。具体步骤见试剂盒说明书。提取完成使用微孔分光光度计检测RNA浓度、纯度，并电泳检测RNA是否降解。
RNA的反转采用全式金Trans ScriptAll-in-One First-Strand cDNA SynthesisSuper Mix for qPCR试剂盒，具体步骤见说明书。反转录获得的cDNA保存于-20℃冰箱。
设计特异性的定量引物，选用Perfect Start Green qPCR Super Mix荧光定量试剂盒，以杨树的cDNA作为模板，按照说明书检测MYB113基因的表达量，得到过表达株系L21和L24，如图3所示。
10μL反应体系如表5所示：
表5 10μL反应体系
反应程序如表6所示：
表6反应程序
2、过表达PtoMYB113毛白杨表型分析
对比转基因株系的生长表型和颜色表型：和WT相比，MYB113过表达材料的叶片明显变红，生长受到抑制，花青素含量测定表明，MYB113过表达材料的总花青素含量明显上升，如图4所示。
对转基因材料的生长进行观察分析：和WT相比，MYB113过表达材料的株高和茎粗都减小，如图4所示。
3、过表达PtoMYB113对毛白杨花青素合成基因的影响分析
对过表达PtoMYB113进行类黄酮合成途径中相关基因进行定量分析，结果发现，在过表达PtoMYB113后，类黄酮合成途径中相关基因的表达量大部分有上调趋势，其中PtoDFR1和PtoDFR2基因的表达量上调超过50倍，如图5所示。
综上所述，本研究采用转基因的方法，将MYB113基因整合到毛白杨基因组中去，改变了毛白杨的株高、茎粗、花青素含量积累。呈现出一种紫叶毛白杨的生长表型，为城市植物园林增加了新的选项。
需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (9)
1.一种PtoMYB113基因在紫叶毛白杨育种中的应用，其特征在于，所述PtoMYB113基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过过表达PtoMYB113来提高毛白杨中花青素含量。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过过表达PtoMYB113来提高花青素合成基因的表达量。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过过表达PtoMYB113来促进花青素合成基因Pto4CL1、Pto4CL2、PtoCHS1、PtoDFR1、PtoDFR2或PtoUFGT1的表达。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过过表达PtoMYB113来获得矮化毛白杨。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，紫叶毛白杨育种过程包括以下步骤：
扩增PtoMYB113基因；
将扩增得到的PtoMYB113基因的全长CDS序列连接到表达载体上，得到过表达载体；
将所述过表达载体转化至农杆菌感受态细胞，利用得到的含有过表达载体的农杆菌感受态细胞侵染植株，培养，得到转基因毛白杨植株。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，扩增PtoMYB113基因的引物对为：
OE-MYB113-F：5’-CGGGATCCATGGTAGGCTCATTAGGAGTAAG-3’；
OE-MYB113-R：5’-GGAATTC TTATAGAATAAAGTCCTTCTCAGGTT-3’。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，扩增PtoMYB113基因采用的PCR反应程序为：98℃预变性3min，98℃变性15sec，58℃退火15sec，72℃延伸10sec，34个循环，72℃彻底延伸5min。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述表达载体为pBI121。
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