CN118127027A - Cyfra21-1-a序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物学检测技术领域，具体涉及CYFRA21‑1‑A、CYFRA21‑1‑B、CYFRA21‑1‑C序列及CYFRA21‑1抗原制备方法。利用核心序列串联重复后基因重组，提高了抗原活性，同时利用基因工程的方法在大肠杆菌中高效表达重组蛋白，制备方法简单，产量高，具有成本低廉且批间差可控的优点，同时表达重组蛋白活性高、稳定性好，非常适合用于制备细胞角蛋白19片段抗体的免疫原、筛选原或体外诊断试剂盒中的校准品。

Description

CYFRA21-1-A序列及其应用

技术领域

本发明涉及生物学检测技术领域，具体涉及CYFRA21-1-A序列及其应用。

背景技术

细胞角蛋白(Cytokeratin，CK)是细胞骨架蛋白之一，为细胞体中间丝。除存在于鳞状上皮细胞外，呼吸道、泌尿道、生殖道上皮和腺体导管中均含有不同程度的细胞角蛋白，每一类型上皮及其相应恶性肿瘤组织表达特异的细胞角蛋白。根据其相对分子质量和双向二维电泳中等电点的不同，可以分为20种不同类型，分别命名为CK1-20。根据其等电点的酸碱性可以分为两个亚群：Ⅰ类(酸性蛋白)和Ⅱ类(碱性蛋白)，细胞角蛋白是由Ⅰ类和Ⅱ类角蛋白组成的异聚合体。

细胞角蛋白19(CYK-19)是一分子量约40，000Da的Ⅰ类角蛋白(酸性蛋白),是角蛋白家族中最小的成员，在人类中由KRT19基因编码。与它的相关家族成员不同，这种最小的酸性细胞角蛋白不与上皮细胞中的碱性细胞角蛋白配对。CYK-19广泛分布在正常组织表面,如层状或鳞状上皮中。在恶性上皮细胞中,激活的蛋白酶加速了细胞的降解,使得大量细胞角蛋白片段释放入血以可溶性纤维形态存在,由于其可溶性片段可与两株单克隆抗体KS19.1和BM19.21特异性结合,故称为CYFRA21-1(重组细胞角蛋白19片段)，其分子量约为30，000Da。在恶性肺癌组织中,CYFRA21-1含量丰富,尤其是在肺鳞癌中有高表达，由于其检测阳性率高、特异性强，CYFRA21-1已被证明是非小细胞肺癌(NSCLC)，尤其是鳞状细胞癌最有价值的血清肿瘤标志物。

CYFRA21-1抗原可以作为制备对应抗体的免疫原或筛选原，也可作为体外诊断试剂盒中的校准品使用。目前市面上在售的CYFRA21-1抗原主要有两种来源，一种是通过体外培养肺癌细胞系获得的天然抗原，由于细胞上清中的抗原含量低(10～100ng/mL)、培养周期长(7～14天)、生产成本高，导致天然抗原购买价格昂贵(约40000元/mg)且存在较大的批间差。现有技术有在培养过程中添加小分子激活剂PAC-1来提高CYFRA21-1抗原产量的方法，但其提升后的产量仍难满足工业级生产的需求。另一种途径是通过基因工程的方法在体外表达CYFRA21-1重组蛋白，可以将生产成本大大降低，但是存在抗原活性不高、稳定性差的问题，因此有必要寻求一种抗原活性更高、稳定性更好、批间差可控的基因工程重组蛋白。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有CYFRA21-1抗原产品的缺陷，而提供一种生产成本低、批间差可控、抗原活性高、稳定性好的基因工程重组蛋白及其制备方法。

本发明解决上述技术问题提供的技术方案是：CYFRA21-1-A序列，包括S1序列、S2序列和linker序列，所述S1序列如Seq ID No.1所示，所述S2序列如Seq ID No.2所示，所述linker序列连接所述S1序列与所述S2序列，所述S1序列与S2序列在所述CYFRA21-1-A序列中分别重复2次以上。

进一步地，所述S1序列与S2序列在所述CYFRA21-1-A序列中分别重复2-5次。

更进一步地，所述S1序列与S2序列在所述CYFRA21-1-A序列中分别重复3次。

进一步地，所述linker序列如Seq ID No.3所示，所述linker序列在所述CYFRA21-1-A序列中分别重复2次以上。

进一步地，所示linker序列在所述CYFRA21-1-A序列中重复2-5次。更进一步地，所述linker序列在所述CYFRA21-1-A序列中重复3次。

进一步地，所述CYFRA21-1-A序列具有如下所示的结构：

NH₂-(H)₆-(X1)_a-(linker)_b-(X2)_c-COOH

其中，所述H为组氨酸残基，所述组氨酸残基为组氨酸之间形成肽键后的残基，方便后续通过金属亲和层析纯化目的蛋白。

所述a≥2，b≥2,c≥2；

所述X1与X2均选自S1或S2，且所述X1与X2序列不相同；

优选的，所述2≤a≤5，2≤b≤5，2≤c≤5。

所述a、b、c、可以相等也可以不等。

优选的，a＝b＝c＝3。

本发明另一方面公开了CYFRA21-1-B序列，所述CYFRA21-1-B序列具有如下所示的结构：NH₂-(H)_d-(X3)-(X1)_a-(linker)_b-(X2)_c-(X4)-COOH

其中，所述H为组氨酸残基；

所述a≥2，b≥2、c≥2且所述d为0或6；

所述X1与X2均选自S1或S2，且所述X1与X2序列不相同；

所述X3和X4选自CYFRA21-1抗原除Seq ID No.22之外的全部或部分序列，所述CYFRA21-1抗原的序列如Seq ID No.23所示；

优选的，所述2≤a≤5，2≤b≤5，2≤c≤5；

所述a、b、c、可以相等也可以不等。

进一步地，所述S1序列、S2序列与linker序列均重复3次。

本发明所述CYFRA21-1抗原片段为实现功能的核心片段，所以所述CYFRA21-1-B可以含有天然序列Seq ID No.22之外的序列，不会影响功能的实现。

另一方面，本发明公开了CYFRA21-1-C序列与CYFRA21-1-B序列至少80％的同源性。

进一步地，本发明公开了CYFRA21-1-C序列与CYFRA21-1-B序列至少90％的同源性。

进一步地，所本发明公开了CYFRA21-1-C序列与CYFRA21-1-B序列至少95％的同源性

另一方面，本发明提供了一种表达所述CYFRA21-1抗原的方法，包括如下步骤：

(1)将所述的CYFRA21-1-A序列、CYFRA21-1-B序列或CYFRA21-1-C序列与载体嵌合构建质粒；

(2)将步骤(1)中质粒转入菌株，构建重组菌株；

(3)用IPTG诱导步骤(2)中所述重组菌株，之后破碎、取上清纯化；

所述菌株为BL21(DE3)。

所述诱导可以选择IPTG诱导或乳糖自诱导，本发明对此不做限定，只要能表达出目的蛋白就行。

进一步地，所述载体为pET系列，更进一步优选为pET22b。

有益效果

本发明利用S1、S2、linker序列串联重复，提高了抗原活性，同时利用基因工程的方法在大肠杆菌中高效表达重组蛋白，制备方法简单，产量可达40mg/L，具有成本低廉且批间差可控的优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1、pET22b-CYFRA21-1载体结构示意图

图2、CYFRA21-1抗原纯化后SDS-PAGE电泳结果

具体实施例

现将详细地提供本公开实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本公开。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本公开进行多种修改和变化而不背离本公开的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

实施例1CYFRA21-1基因工程菌的构建

(1)序列合成

所述序列合成为提供CYFRA21-1的表达片段给基因合成公司(擎科生物)合成为其cDNA序列。

为了后续的纯化在序列中添加6个组氨酸标签，所以本实施例中CYFRA21-1序列片段为氨基酸序列【包括CYFRA21-1-A(模式一和模式二)，CYFRA21-1-B(模式三和模式四)】，未添加组氨酸标签；CYFRA21-1表达片段为添加组氨酸标签的氨基酸序列，合成的cDNA翻译出来的氨基酸序列并不会改变。

其中模式一：NH2-(H)6-(S1)a-(GGGGS)b-(S2)c-COOH

模式二：NH2-(H)6-(S2)a-(GGGGS)b-(S1)c-COOH

在模式一中增加其他序列为模式三

在模式二中增加其他序列为模式四

表1CYFRA21-1序列片段

(2)基因工程菌的构建

a.在基因合成公司合成的cDNA序列的5’端和3’端加上NdeI和BamHI限制性内切酶位点；

b.合成后的CYFRA21-1基因通过NdeI和BamHI酶切后克隆到经过相同限制性内切酶线性化之后的pET22b表达载体上，构建的连接产物命名为pET22b-CYFRA21-1，如图1所示；

c.将pET22b-CYFRA21-1转化至Top10感受态细胞中，利用市售试剂盒提取pET22b-CYFRA21-1质粒，测序确保序列的正确性；

d.取1μL pET22b-CYFRA21-1质粒加入到50μL BL21(DE3)感受态细胞中，混匀后冰上放置25分钟，42℃热激90秒，立即放入冰上静置2-3分钟，加入700μL无抗性的LB培养基，37℃、220rpm复苏45分钟，取200μL菌液涂布到含100μg/mL氨苄青霉素抗性的LB平板中，37℃倒置培养过夜；

e.从LB平板上挑取单个的阳性克隆至5mL含100μg/mL氨苄青霉素抗性的LB中，37℃、220rpm培养过夜，将培养过夜的菌液按1：20的比例接种到5mL含100μg/mL氨苄青霉素抗性的新鲜LB中，37℃、220rpm培养2-3小时至OD₆₀₀在0.6-0.8之间，加入诱导剂1M IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至终浓度为0.2mM，16℃、220rpm诱导表达16小时；

f.取1mL诱导后菌液，12000rpm室温离心2分钟收集菌体，加入1mL裂解缓冲液(50mM Tris，300mM NaCl，pH7.4)重悬菌体，用超声破碎菌体(超声2秒，间隔3秒，工作时间2分钟)，12000rpm室温离心2分钟收集上清，沉淀用1mL裂解缓冲液再次重悬，各取20μL上清和沉淀蛋白，加入5μL 5×Loading Buffer，100℃煮沸5-10分钟，12％ SDS-PAGE电泳鉴定蛋白的表达情况，以诱导前的菌液作为阴性对照，目的蛋白以可溶性形式表达；

g.蛋白成功表达后取850μL培养过夜的基因工程菌，加入150μL甘油，混匀后-80℃保存备用。

(3)重组蛋白的制备

a.将实施例1中保存的pET22b-CYFRA21-1/BL21(DE3)基因工程菌接种至180mL含100μg/mL氨苄青霉素抗性的LB培养基中，37℃、220rpm培养过夜，取150mL培养过夜的菌液重新接种至3L含100μg/mL氨苄青霉素抗性的新鲜LB中，按实施例1所述的方法进行培养和诱导重组蛋白表达；

b.9000rpm室温离心15分钟收集全部菌体，共17g，按1：20的比例加入300mL裂解缓冲液重悬菌体，高压均质机反复破碎菌体3次(650±50bar)，9000rpm室温离心15分钟收集上清；

c.将上清用0.22μm滤膜过滤，然后全部上样至用平衡缓冲液(50mM Tris，300mMNaCl，pH7.4)平衡之后的Ni Sepharose excel填料(GE公司)中，填料体积为40mL，柱直径为26mm，流速设置为12mL/分钟，填料的清洗和保存均按使用说明书进行；

d.上样完成后用平衡缓冲液继续冲洗3-5个柱体积至紫外吸收峰低于20mAu，然后用3-5个柱体积的清洗缓冲液(50mM Tris，300mM NaCl，15mM imidazole，pH7.4)洗杂，最后用洗脱缓冲液(50mM Tris，300mM NaCl，100mM imidazole，pH7.4)洗脱目的蛋白，待紫外峰高于20mAu时开始收样，低于20mAu时停止收样；

e.取20μL纯化后的蛋白样品，加入5μL 5×Loading Buffer，100℃煮沸5-10分钟，用12％ SDS-PAGE检测，在约20kDa处有明显的目的蛋白条带，纯度大于90％，如图2所示。

f.透析去除目的蛋白中的咪唑(imidazole)，保存在50mM Tris，300mM NaCl，pH7.4的缓冲溶液中，用BCA法检测蛋白浓度，约1.3mg/mL。

实施例2、CYFRA21-1重组蛋白的活性及稳定性鉴定

利用磁微粒化学发光法检测目的蛋白的活性和稳定性，用外购的天然抗原(购自郑州赛图康生物科技有限公司)进行赋值，结果下表2-表3所示，其中表2是实施例1中序号1的序列重组表达的，表2详细的给出了测量结果，为了简约，序号1-18对结果进行了汇总，均采用理论浓度40ng/mL和200ng/mL进行测量。

所述理论浓度是指根据BCA法测出的蛋白浓度，稀释至40ng/mL、200ng/mL，活性浓度是根据仪器测的RLU值算出来的，比活大于1就说明抗原的活性比用来赋值的抗原(这里指天然抗原)更好，等于1就是活性相当，小于1是活性更低。

本实施例选用磁微粒化学发光检测试剂盒(中元汇吉)，用全自动化学发光免疫分析分析仪EXI 1800(中元汇吉)测量相对吸光值(relative light unit，RLU)，重复两次取平均值，根据平均RLU值反算出活性浓度，活性浓度除以理论浓度即为样品的比活。

从测试结果序号1-13，16-18可以看出，当S1、S2、linker序列重复2-5次效果较好，且无论是变换S1和S2的序列位置，还是S1、S2、linker重复次数不同，甚至是在S1，S2，linker核心序列之外添加其他序列都不会影响效果，得到的CYFRA21-1重组蛋白比天然抗原具有更高的活性，比活值大于1.0，并且在-20℃反复冻融10次和37℃加速7天后的活性偏差都小于10％，证明本发明的重组蛋白具有很好的稳定性，加上重组蛋白的易获得性和成本低廉的优点，本发明比天然抗原具有更好的经济效益。

其中序号16为本发明核心序列替换天然序列中Seq ID No.22序列后与余下序列重新形成的序列。

序列17-18为本发明核心序列替换天然序列中Seq ID No.22序列后与余下天然序列中的部分序列重组形成的序列。

序号14-15可以看出，重复6次以后效果会下降，且序列合成难度增加，因此不做优先考虑。

表2序号1基因表达蛋白性能探究

表3序号1-18基因表达蛋白性能探究

Claims (10)

1.CYFRA21-1-A序列，其特征在于，包括S1序列、S2序列和linker序列，所述S1序列如Seq ID No.1所示，所述S2序列如Seq ID No.2所示，所述linker序列连接所述S1序列与所述S2序列，所述S1序列与S2序列在所述CYFRA21-1抗原片段中分别重复2次以上。

2.如权利要求1所述的CYFRA21-1-A序列，其特征在于，所述S1序列与S2序列在所述CYFRA21-1抗原片段中分别重复2-5次。

3.如权利要求1所述的CYFRA21-1-A序列，其特征在于，所述linker序列如Seq ID No.3所示，所示linker序列在所述CYFRA21-1-A序列中重复2次以上。

4.如权利要求3所述的CYFRA21-1-A序列，其特征在于，所示linker序列在所述CYFRA21-1-A序列中重复2-5次。

5.如权利要求1-4任意一项所述的CYFRA21-1-A序列，其特征在于，所述CYFRA21-1-A序列具有如下所示的结构：

NH₂-(H)₆-(X1)_a-(linker)_b-(X2)_c-COOH

其中，所述H为组氨酸残基；

所述a≥2，b≥2且c≥2；

所述X1与X2均选自S1或S2，且所述X1与X2序列不相同；

优选的，所述2≤a≤5，2≤b≤5，2≤c≤5；

所述a、b、c、可以相等也可以不等。

6.CYFRA21-1-B序列，其特征在于，所述CYFRA21-1-B序列具有如下所示的结构：NH₂-(H)_d-(X3)-(X1)_a-(linker)_b-(X2)_c-(X4)-COOH

其中，所述H为组氨酸残基；

所述a≥2，b≥2、c≥2且所述d为0或6；

所述X1与X2均选自S1或S2，且所述X1与X2序列不相同；

所述X3和X4选自CYFRA21-1抗原除Seq ID No.22之外的全部或部分序列，所述CYFRA21-1抗原的序列如Seq ID No.23所示；

优选的，所述2≤a≤5，2≤b≤5，2≤c≤5；

所述a、b、c、可以相等也可以不等。

7.如权利要求6所述的CYFRA21-1-B序列，其特征在于，所述S1序列、S2序列与linker序列均重复3次。

8.CYFRA21-1-C序列，其特征在于，所述CYFRA21-1-C序列与权利要求6或7所述的CYFRA21-1-B序列至少80％的同源性。

9.一种表达CYFRA21-1抗原的方法，包括如下步骤：

(1)将权利要求1-5任意一项所述的CYFRA21-1-A序列、权利要求6或7所述的CYFRA21-1-B序列或权利要求8所述的CYFRA21-1-C序列与载体嵌合构建质粒；

(2)将步骤(1)中质粒转入菌株，构建重组菌株；

(3)诱导步骤(2)中所述重组菌株，之后破碎、取上清纯化。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述载体为pET系列，所述菌株为BL21(DE3)。