CN118126134A - 一种多肽和nk细胞培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多肽和NK细胞培养基。本发明提供了一种多肽，该多肽的氨基酸序列为：GEAVKVVGLGRDE。该多肽不仅可以提高NK细胞增殖活力，还可以提高NK细胞杀伤力。因此，本发明提供的多肽可以用于制备既能提高NK细胞增殖活力又能提高NK细胞杀伤力的NK细胞培养基。
Description
技术领域
本发明属于多肽领域，涉及新型多肽及应用，具体涉及一种多肽和NK细胞培养基。
背景技术
细胞免疫治疗(CIT)是免疫治疗的一种，开始于20世纪70年代，1997年被美国食品药品监督管理局(FDA)批准正式纳入美国药品法规接受监管，CIT原理是将人体内的抗肿瘤免疫细胞采集后，经过体外培养扩增后回输患者，以增强人体免疫系统，从而达到抗肿瘤的目的。自然杀伤细胞(NK细胞)是机体除T细胞之外的另一抗肿瘤利器，本身具有广谱的肿瘤杀伤能力。NK细胞数量减少或者功能受损与各种类型癌症的进展相关。在应用NK细胞作为过继性免疫治疗的细胞时，NK细胞的主要来源是外周血，但外周血单个核细胞中NK细胞的数量仅占10％～15％，因此NK细胞的体外扩增培养十分重要。
多肽是一种与生物体内各种细胞功能都相关的生物活性物质，它的分子结构介于氨基酸和蛋白质之间，是由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成的化合物。多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质的总称，常常被应用于功能分析、抗体研究、尤其是药物研发等领域。
新型多肽的发现及用于细胞培养是细胞培养的热门研究方向。基于该方面的研究结果，特此提出本发明创造。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多肽和NK细胞培养基。
本发明上述目的通过如下技术方案实现：
一种多肽，氨基酸序列如Sequence NO.1所示。
一种NK细胞培养基，含有上述Sequence NO.1所示的多肽。
优选地，所述NK细胞培养基在基础培养基基础上添加Sequence NO.1所示的多肽得到。
有益效果：
1、本发明提供了一种多肽G，其序列为：GEAVKVVGLGRDE。该多肽序列没有被报道过，为新型多肽。
2、本发明提供的多肽G不仅可以提高NK细胞增殖活力，还可以提高NK细胞杀伤力，可以用于制备既能提高NK细胞增殖活力又能提高NK细胞杀伤力的NK细胞培养基。
附图说明
图1为各组NK细胞杀伤力关键蛋白Granzyme B、Perforin的表达水平；5、10μg/mL组NK细胞中Granzyme B、Perforin蛋白表达水平呈现剂量依赖性地上调，说明5、10μg/mL多肽G可以剂量依赖性地显著提高NK细胞杀伤力。
具体实施方式
下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
一、实验材料
人外周血NK细胞购自武汉益普生物科技有限公司。
NK细胞培养基购自武汉赛奥斯生物科技有限公司。
FBS、双抗、CCK8试剂、Westernblot试剂购自碧云天。
二、实验方法
1、多肽的合成
多肽G序列为：GEAVKVVGLGRDE(Sequence NO.1)。氨基酸和羧基端未修饰。
多肽G委托杭州专肽生物技术有限公司使用固相合成技术合成，即采用芴甲氧羰基(Fmoc)N端保护策略，按照树脂固相合成方法依次连接各氨基酸，期间依次脱去Fmoc-保护基团，然后切肽，获得粗品，粗品用C18反相硅胶柱分离纯化，HPLC纯度99.5％。计算摩尔质量为1327.71，质谱实测摩尔质量为1327.73。
2、CCK8法检测NK细胞增殖活力
取生长状态良好的NK细胞，用含有10％FBS、1％双抗的NK细胞培养基(完全培养基)重悬制成细胞密度为5×104/mL的细胞悬浮液，接种于96孔板中，每孔100μL，置于37℃、5％CO2条件下培养。12h后，更换为含有0、5、10μg/mL多肽G完全培养基，置于37℃、5％CO2条件下继续培养。继续培养48h后，每孔加入20μL的CCK8溶剂，继续培养4h，用酶标仪于450nm处测定各孔OD值，以0μg/mL组NK细胞增殖活力为1，以5、10μg/mL组OD值与0μg/mL组OD值的比值计算5、10μg/mL组NK细胞增殖活力。
3、Westernblot法检测NK细胞杀伤力
取生长状态良好的NK细胞，用含有10％FBS、1％双抗的NK细胞培养基(完全培养基)重悬制成细胞密度为5×104/mL的细胞悬浮液，接种于24孔板中，每孔1mL，置于37℃、5％CO2条件下培养。12h后，更换为含有0、5、10μg/mL多肽G完全培养基，置于37℃、5％CO2条件下继续培养。继续培养48h后，收集细胞，洗涤，裂解，BCA法测蛋白浓度。各组取等量总蛋白上样进行SDS-PAGE电泳，转膜、封闭后，加入Granzyme B、Perforin、β-actin一抗，于4℃孵育过夜，加入二抗，室温避光孵育2h，PBST洗涤，用化学发光显色后进行图像分析，采用Image J软件对显影的条带进行灰度分析。
4、统计学分析
使用GraphPad Prism软件进行数据统计学分析。数据采用均数±标准差表示，两组数据间比较采用t检验，P＜0.05表示差异显著。
三、实验结果
1、NK细胞增殖活力
各组NK细胞增殖活力如表1所示。从表1结果可以看出，5、10μg/mL多肽G可以有效促进NK细胞增殖，显著优于不添加多肽G的0μg/mL组，且具有剂量依赖性。
表1NK细胞增殖活力
| 0μg/mL | 5μg/mL | 10μg/mL | |
| 增殖活力 | 1.00±0.03 | 1.42±0.04 | 1.95±0.03 |
2、NK细胞杀伤力
Granzyme B、Perforin是NK细胞发挥杀伤力的关键蛋白，Granzyme B、Perforin表达水平高低可以体现NK细胞杀伤力高低。Western blot结果如图1所示。从图1可以看出，5、10μg/mL组NK细胞中Granzyme B、Perforin蛋白表达水平呈现剂量依赖性地上调。由此可见，5、10μg/mL多肽G可以剂量依赖性地显著提高NK细胞杀伤力。
上述实验结果表明，多肽G不仅可以提高NK细胞增殖活力，还可以提高NK细胞杀伤力。因此，多肽G可以用于制备既能提高NK细胞增殖活力又能提高NK细胞杀伤力的NK细胞培养基。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。
Claims (3)
1.一种多肽，其特征在于：氨基酸序列如Sequence NO.1所示。
2.一种NK细胞培养基，其特征在于：含有权利要求1所述的多肽。
3.根据权利要求2所述的NK细胞培养基，其特征在于：在基础培养基基础上添加权利要求1所述的多肽得到。
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