CN118119627A - 用于递送核酸区段的新颖脂质 - Google Patents
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Abstract
本文披露了具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中X1、Y1、X2、Y2、a、b、c、d、e和f如本文中所定义。还披露了脂质纳米颗粒，其包含具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐；药物组合物，其包含多个脂质纳米颗粒，这些脂质纳米颗粒包含具有式(I)的化合物或其药学上可接受的和核酸区段；以及用于递送核算区段的方法，该方法包括施用多个脂质纳米颗粒，该脂质纳米颗粒包含具有式(I)的化合物或其药学上可接受的和核酸区段。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年10月26日提交的美国临时申请号63/271,960的优先权权益，该临时申请出于所有目的通过援引以其全文并入本文。
背景技术
核酸区段诸如寡核苷酸(例如，RNA，例如信使RNA[mRNA]和小干扰RNA[siRNA]、反义寡核苷酸[ASO]和DNA)具有广泛的潜力作为用于多种疾病和障碍的新的治疗性治疗剂。然而，在施用寡核苷酸治疗剂方面仍存在挑战。典型的配制过程包括将寡核苷酸包封到脂质纳米颗粒(LNP)中。LNP制剂通常包括(a)携带叔胺或季胺以包封多阴离子mRNA的可离子化的或阳离子脂质或聚合物材料；(b)类似于细胞膜中的脂质的两性离子脂质；(c)胆固醇以使LNP的脂质双层稳定；以及(d)聚乙二醇(PEG)-脂质以给予纳米颗粒水合层，改善胶体稳定性并减少蛋白质吸收。(参见Kowalski等人，Molecular Therapy[分子疗法],27(4),(2019),710-728)。
在2018年，FDA批准了第一种RNA干扰疗法，patisiran，用于治疗患有遗传性甲状腺素运载蛋白介导的淀粉样变性的人的多发性神经病，其使用掺入可离子化的脂质(DLin-MC3-DMA，[MC3])的LNP静脉递送。然而，MC3可能不会最适用于所有的递送系统，这取决于靶器官、预期的递送途径和所需的治疗窗。从两种毒理学相关测试物种(大鼠和猴)中的研究报告了剂量限制性毒性，其与基于MC3的LNP制剂而不是与所递送的运载物有关。(参见Sedic等人，Vet.Pathol.[兽医病理学]55(2),(2018),341-354)。最近，脂质纳米颗粒技术也已经成功地被应用于产生首次经批准的用于对抗SARS-COV-2病毒的预防性接种的mRNA产品(参见例如L.Schoenmaker等人，International Journal ofPharmaceutics[国际药剂学杂志],601,(2021),5月120586)。然而，仍然需要开发用于在用于递送寡核苷酸治疗剂的脂质纳米颗粒制剂中使用的新的可离子化的脂质。
发明内容
在一些实施例中，披露了具有式(I)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中
a和b各自独立地是3、4或5；
c和d各自独立地是1、2或3；
e和f各自独立地是0、1或2；
X1是亚甲基或
X2是亚甲基或
g和h各自独立地是1、2或3；
i和j各自独立地是0、1或2；
Y1和Y2各自独立地是直链C7-10烷基、直链C7-10烯基或
Z1和Z2各自独立地是直链C7-10烷基、直链C7-10烯基或
R1和R2各自独立地是直链C7-10烷基；并且
R3和R4各自独立地是直链C7-10烷基。
在一些实施例中，披露了脂质纳米颗粒，其包含具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，披露了药物组合物，其包含多个脂质纳米颗粒，这些脂质纳米颗粒包含具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐和核酸区段。
在一些实施例中，披露了治疗受试者的疾病或障碍的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的如本文所描述的药物组合物。
在一些实施例中，披露了如本文所描述的药物组合物，其用于在疾病或障碍的治疗中使用。
附图说明
图1示出了气管内施用包含MC3、MOD5、化合物4和化合物2的LNP制剂之后24小时时大鼠肺中eGFP的表达。
图2示出了气管内施用包含MC3、MOD5、化合物4和化合物2的LNP制剂之后24小时时大鼠BALF中的BALF嗜中性粒细胞浓度。
图3示出了气管内施用包含MC3和化合物1的LNP制剂之后24小时时大鼠肺中eGFP的表达。
图4示出了气管内施用包含MC3和化合物1的LNP制剂之后24小时时大鼠BALF中的BALF嗜中性粒细胞浓度。
图5A和图5B示出了气管内施用包含化合物1的LNP制剂之后eGFP的表达，如IHC在巨噬细胞和1型上皮细胞中所示。
图6示出了吸入施用包含化合物1的LNP制剂之后5和24小时时大鼠肺中的eGFP的水平。
图7示出了吸入施用包含化合物1的LNP制剂之后24小时时大鼠BALF中的BALF嗜中性粒细胞浓度。
图8示出了静脉施用包含MC3、化合物2和化合物3的LNP制剂之后24小时时小鼠肝脏中eGFP的表达。
图9示出了静脉施用包含MC3、化合物2和化合物3的LNP制剂之后24小时时小鼠脾中eGFP的表达。
图10示出了静脉施用包含MC3、化合物2和化合物3的LNP制剂之后24小时时小鼠肺中eGFP的表达。
图11示出了静脉施用包含MC3、化合物2和化合物3的LNP制剂之后24小时时小鼠肾中eGFP的表达。
图12示出了静脉施用包含MC3、化合物2和化合物3的LNP制剂之后24小时时小鼠心脏中eGFP的表达。
图13示出了静脉施用包含MC3、化合物2和化合物3的LNP制剂之后24小时时小鼠肝脏中荧光素酶蛋白质的表达。
图14示出了静脉施用包含MC3、化合物2和化合物3的LNP制剂之后24小时时小鼠心脏、肺、脾和肝脏中IVIS图像。
图15示出了静脉施用包含MC3、化合物2和化合物3的LNP制剂之后6小时时小鼠血浆中的hEPO蛋白质浓度。
图16示出了纹状体内施用包含MOD5和化合物5的LNP制剂之后LoxP Luc报告基因小鼠的皮质和纹状体平均Luc表达。
具体实施方式
在一些实施例中，披露了具有式(I)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中
a和b各自独立地是3、4或5；
c和d各自独立地是1、2或3；
e和f各自独立地是0、1或2；
X1是亚甲基或
X2是亚甲基或
g和h各自独立地是1、2或3；
i和j各自独立地是0、1或2；
Y1和Y2各自独立地是直链C7-10烷基、直链C7-10烯基或
Z1和Z2各自独立地是直链C7-10烷基、直链C7-10烯基或
R1和R2各自独立地是直链C7-10烷基；并且
R3和R4各自独立地是直链C7-10烷基。
在式(I)的一些实施例中，X1和X2都是亚甲基。
在式(I)的一些实施例中，a和b都是4；并且c和d都是2。
在式(I)的一些实施例中，e和f都是0。
在式(I)的一些实施例中，
Y1是直链C7-10烷基或直链C7-10烯基；
Y2是
并且
R1和R2各自独立地是直链C7-10烷基。
在式(I)的一些实施例中，Y1和Y2各自独立地是
并且
R1和R2各自独立地是直链C7-10烷基。
在式(I)的一些实施例中，e和f各自独立地是1或2。在式(I)的一些进一步实施例中，Y1和Y2各自独立地是
并且
R1和R2各自独立地是直链C7-10烷基。
一些实施例中，具有式(I)的化合物是具有式(II)的化合物：
其中
k是0、1或2；
Y1是直链C7-10烷基、直链C7-10烯基或
Y2是
R1和R2各自独立地是直链C7-10烷基。
在式(I)的一些实施例中，
X1是
并且
X2是
在式(I)的一些实施例中，a和b都是4；并且c和d都是2。
在式(I)的一些实施例中，e和f各自独立地是1或2。
在式(I)的一些实施例中，g和h都是2。
在式(I)的一些实施例中，i和j都是1。
在式(I)的一些实施例中，Y1和Y2各自独立地是
并且
R1和R2各自独立地是直链C7-10烷基。
在一些实施例中，具有式(I)的化合物是8-(7-(8-(壬基氧基)-8-氧代辛基)-9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-基)辛酸十七烷-9-基酯或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，具有式(I)的化合物是(Z)-8-(7-(8-(壬-2-烯-1-基氧基)-8-氧代辛基)-9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-基)辛酸十七烷-9-基酯或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，具有式(I)的化合物是8-(7-(8-((3-辛基十一烷基)氧基)-8-氧代辛基)-9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-基)辛酸3-庚基十二烷基酯或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，具有式(I)的化合物是8,8'-(9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3,7-二基)二辛酸双(十七烷-9-基)酯或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，具有式(I)的化合物是3,3',3”,3”'-(((9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3,7-二基)双(丁烷-4,1-二基))双(氮杂三基))四丙酸四(2-辛基癸基)酯或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，具有式(I)的化合物是8-(7-(8-(壬基氧基)-8-氧代辛基)-9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-基)辛酸十七烷-9-基酯。
在一些实施例中，具有式(I)的化合物是(Z)-8-(7-(8-(壬-2-烯-1-基氧基)-8-氧代辛基)-9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-基)辛酸十七烷-9-基酯。
在一些实施例中，具有式(I)的化合物是8-(7-(8-((3-辛基十一烷基)氧基)-8-氧代辛基)-9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-基)辛酸3-庚基十二烷基酯。
在一些实施例中，具有式(I)的化合物是8,8'-(9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3,7-二基)二辛酸双(十七烷-9-基)酯。
在一些实施例中，具有式(I)的化合物是3,3',3”,3”'-(((9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3,7-二基)双(丁烷-4,1-二基))双(氮杂三基))四丙酸四(2-辛基癸基)酯。
如本文所用，术语“Ci-j”表示碳原子数的范围，其中i和j是整数，并且碳原子数的范围包括端点(即i和j)和介于两者之间的每个整数点，并且其中j大于i。例如，C7-10表示七到十个碳原子的范围，包括七个碳原子、八个碳原子、九个碳原子和十个碳原子。
如本文所用，术语“烷基”(无论是作为另一个术语的一部分还是独立地使用)是指饱和烃链。在一个实施例中，上文提到的饱和烃链是直链烷基，其中碳原子以一条没有支链的连续链连接。术语“Ci-j烷基”是指具有i至j个碳原子的烷基。例如，C7-10烷基是指具有7至10个碳原子的烷基。
如本文所用，术语“烯基”(无论是作为另一个术语的一部分还是独立地使用)是指含有至少一个双键的不饱和烃链。在一个实施例中，上文提到的不饱和烃链是直链烯基，其中碳原子以一条没有支链的连续链连接。术语“Ci-j烯基”是指具有i至j个碳原子的烯基。例如，C7-10烯基是指具有7至10个碳原子的烯基。在一个实施例中，C7-10烯基基团含有一个双键。
在一些实施例中，披露了具有式(I)的化合物。在一些实施例中，披露了具有式(I)的化合物的药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”包括保留了具有式(I)的化合物的生物有效性和特性的酸加成盐，并且典型地不是生物学上或其他方面不希望的酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐可以使用无机酸和有机酸来形成，例如，乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、溴化物/氢溴酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、樟脑磺酸盐、氯化物/盐酸盐、胆茶碱(chlortheophyllonate)、柠檬酸盐、乙二磺酸盐(ethanedisulfonate)、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、马尿酸盐、氢碘酸盐/碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘甲酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、十八酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐(palmoate)、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、碱式水杨酸盐、硫酸盐/硫酸氢盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和三氟乙酸盐。可以从中衍生盐的无机酸包括，例如，盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。可以从中衍生盐的有机酸包括，例如，乙酸、丙酸、乙醇酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、三氟乙酸、磺基水杨酸等。
在一些实施例中，披露了脂质纳米颗粒(LNP)，其包含具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，披露了脂质纳米颗粒(LNP)，其包含具有式(I)的化合物。术语“脂质纳米颗粒”包括通过含脂质的乙醇溶液与水溶液的微流体混合所产生的电子致密纳米结构核。本文所披露的脂质纳米颗粒可以由常规纳米颗粒技术中所使用的任何材料构建，例如，可离子化的脂质、中性脂质、固醇和聚合物缀合的脂质，前提是纳米颗粒的净电荷约是零。
在一些实施例中，具有式(I)的化合物是适用于脂质纳米颗粒的可离子化的脂质。可以与脂质纳米颗粒中的具有式(I)的化合物组合的可离子化的脂质的其他非限制性实例包括，例如生理pH范围的酸性标度下含有正电荷的脂质，例如1,2-二亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)、二亚油基甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)(参见例如，美国专利号8,158,601)、2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、Merck-32(参见例如，WO 2012/018754)、Acuitas-5(参见例如，WO 2015/199952)、KL-10(参见例如，美国专利申请公布2012/0295832)、C12-200(参见例如，Love,KT等人，PNAS,107:1864(2009))等。可离子化的脂质可以以相对于脂质纳米颗粒中存在的总脂质范围从约5％至约90％、诸如从约10％至约80％、例如从约25％至约75％、例如从约40％至约60％、从约40％至约50％、诸如约45％或约50％摩尔百分比的量存在。
术语“中性脂质”包括在生理pH下具有零净电荷的脂质，例如，在生理pH下以不带电荷形式或中性两性离子形式存在的脂质，诸如二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)等、以及其组合。中性脂质可以以相对于脂质纳米颗粒中存在的总脂质范围从约1％至约50％、诸如从约5％至约20％、例如7.5％至约12.5％、例如约10％摩尔百分比的量存在。在一些实施例中，中性脂质是DSPC。在一些实施例中，中性脂质是DOPE。在一些实施例中，中性脂质是DPPC。在一些实施例中，中性脂质是DMPC。
术语“固醇”包括胆固醇等。固醇可以以相对于脂质纳米颗粒中存在的总脂质范围从约10％至约90％、诸如从约20％至约50％、例如从约35％-45％、诸如约38.5％摩尔百分比的量存在。在一些实施例中，固醇是胆固醇。
术语“聚合物缀合的脂质”包括包含脂质部分和聚合物部分的脂质，诸如包含脂质部分和聚乙二醇部分的聚乙二醇化脂质。非限制性实例包括二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚(乙二醇)2000(DMPE-PEG2000)、DPPE-PEG2000、DMG-PEG2000、DPG-PEG2000、PEG2000-c-DOMG、PEG2000-c-DOPG等。可以使用的聚(乙二醇)的分子量可以在从约500至约10,000Da、或从约1,000至约5,000Da的范围。在一些实施例中，聚合物缀合的脂质是DMPE-PEG2000。在一些实施例中，聚合物缀合的脂质是DPPE-PEG2000。在一些实施例中，聚合物缀合的脂质是DMG-PEG2000。在一些实施例中，聚合物缀合的脂质是DPG-PEG2000。在一些实施例中，聚合物缀合的脂质是PEG2000-c-DOMG。在一些实施例中，聚合物缀合的脂质是PEG2000-c-DOPG。聚合物缀合的脂质可以以相对于脂质纳米颗粒中存在的总脂质范围从约0％至约20％、例如约0.5％至约5％、诸如约1％至约2％、例如约1.5％摩尔百分比的量存在。
在本披露的至少一个实施例中，脂质纳米颗粒可以通过将多种脂质组分组合来制备。例如，可以将具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、固醇、中性脂质和聚合物缀合的脂质以相对于存在的总脂质50:40-x:10:x的摩尔比组合来制备脂质纳米颗粒。例如，可以将具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、固醇、中性脂质和聚合物缀合的脂质以50:37:10:3(mol/mol)的摩尔比、或例如50:38.5:10:1.5(mol/mol)的摩尔比、或例如50:39.5:10:0.5(mol/mol)、或50:39.75:10:0.25(mol/mol)组合来制备脂质纳米颗粒。
在另一实施例中，脂质纳米颗粒可以使用具有式(I)化合物或其药学上可接受的盐、固醇(诸如胆固醇)、中性脂质(诸如DSPC)和聚合物缀合的脂质(诸如DMPE-PEG2000)以相对于存在的总脂质约50:38.5:10:1.5(mol/mol)的摩尔比来制备。又另一非限制性实例是脂质纳米颗粒，其包含相对于存在的总脂质约47.7:36.8:12.5:3(mol/mol)的摩尔比的具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、固醇(诸如胆固醇)、中性脂质(诸如DSPC)和聚合物缀合的脂质(诸如DMPE-PEG2000)。另一非限制性实例是脂质纳米颗粒，其包含相对于存在的总脂质约52.4:40.4:6.4:0.8(mol/mol)的摩尔比的具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、固醇(诸如胆固醇)、中性脂质(诸如DSPC)和聚合物缀合的脂质(诸如DMPE-PEG2000)。在另一实施例中，非限制性实例是脂质纳米颗粒，其包含相对于存在的总脂质约53.5:41.2:4.6:0.7(mol/mol)的摩尔比的具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、固醇(例如胆固醇)、中性脂质(例如DSPC)和聚合物缀合的脂质(例如DMPE-PEG2000)。另一非限制性实例是脂质纳米颗粒，其包含相对于存在的总脂质约30:50:19:1(mol/mol)的摩尔比的具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、固醇(诸如胆固醇)、中性脂质(诸如DSPC)和聚合物缀合的脂质(诸如DMPE-PEG2000)。
构成脂质纳米颗粒的中性脂质、固醇、和/或聚合物缀合的脂质的选择，以及此类脂质彼此之间的相对摩尔比，可以由所选择的一种或多种脂质的特征、预期靶细胞的性质和待递送的核酸区段的特征来确定。例如，在某些实施例中，相对于存在的总脂质，具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐在脂质纳米颗粒中的摩尔百分比可以大于约10％、大于约20％、大于约30％大于约40％、大于约50％、大于约60％、或大于约70％。相对于存在的总脂质，中性脂质在脂质纳米颗粒中的摩尔百分比可以大于约5％、大于约10％、大于约20％、大于约30％、或大于约40％。相对于存在的总脂质，固醇在脂质纳米颗粒中的摩尔百分比可以大于约10％、大于约20％、大于约30％、或大于约40％。相对于存在的总脂质，聚合物缀合的脂质在脂质纳米颗粒中的摩尔百分比可以大于约0.25％，诸如大于约1％、大于约1.5％、大于约2％、大于约5％、或大于约10％。
根据本披露，脂质纳米颗粒可以以任何期望的有用取向包含具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、中性脂质、固醇、和/或聚合物缀合的脂质中的每一种。例如，纳米颗粒的核可以包含单独或与另一种可离子化的脂质、固醇组合的具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，并且随后包含中性脂质和/或聚合物缀合的脂质的一个或多个层可以包围核。例如，根据一个实施例，脂质纳米颗粒的核可以包含如下核，该核包含以任何特定比率的具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐和固醇(例如胆固醇)，其被任何特定厚度的中性脂质单层(例如DSPC)包围，进一步被任何特定厚度的外部聚合物缀合的脂质单层包围。在此类实例中，可以将核酸区段掺入任何一个核或随后的层中，这取决于预期靶细胞的性质和待递送的核酸区段的特征。核和外层可以进一步包含典型地掺入本领域中已知的脂质纳米颗粒中的其他组分。此外，本领域技术人员应当理解，脂质体是具有不同于如本文所披露的脂质纳米颗粒的多孔结构的递送媒介物。脂质体囊泡由形成包围水相的中空球体的形状的脂质双层组成。例如，脂质体含有层状相，而脂质纳米颗粒具有非层状结构。
此外，可以选择构成脂质纳米颗粒的脂质纳米颗粒的组分(例如，具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、中性脂质、固醇、和/或聚合物缀合的脂质)，以提供整个脂质纳米颗粒的特订物理参数，例如一种或多种脂质的表面积。例如，可以选择构成脂质纳米颗粒的具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、中性脂质、固醇、和/或聚合物缀合的脂质的摩尔百分比，以产生每中性脂质(例如DSPC)的表面积。作为非限制性实例，可以确定具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、中性脂质、固醇、和/或聚合物缀合的脂质的摩尔百分比，以产生约1.0nm2至约2.0nm2(例如约1.2nm2)的每DSPC的表面积。
根据本披露，脂质纳米颗粒可以进一步包含核酸区段，其可以结合在脂质纳米颗粒的表面上和/或包封在相同脂质纳米颗粒内。
术语“核酸区段”应当理解为意指选自反义寡核苷酸、DNA、mRNA、siRNA、Cas9引导RNA复合物、或其组合的任何一种或多种核酸区段。本文的核酸区段可以是野生型或经修饰的。在至少一个实施例中，脂质纳米颗粒可以包含多个不同的核酸区段。在又另一实施例中，核酸区段(野生型或经修饰的)编码目的多肽。经修饰的核酸区段包括对结构的任何部分进行化学修饰的核酸区段，使得核酸区段不是天然存在的。在一些实施例中，核酸区段是RNA。在一些实施例中，核酸区段是mRNA。在一些实施例中，核酸区段是经修饰的mRNA。
如本文所用的术语“治疗有效量”是指足以调节靶组织和/或细胞类型中蛋白质表达的核酸区段的量。在一些实施例中，核酸区段的治疗有效量是足以治疗与由核酸区段所表达的蛋白质相关的疾病或障碍的量。
在至少一个实施例中，总脂质相与核酸区段的重量比在从约40:1至约1:1的范围，诸如约10:1。这对应于约3:1的具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐与核酸单体的近似摩尔比。在又另一实例中，总脂质相与核酸区段的重量比在从约30:1至约1:1的范围，例如约20:1，这对应于约6:1的具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐与核酸单体的近似摩尔比。然而，脂质相和/或脂质相组分与核酸单体的相对摩尔比可以通过预期靶细胞的性质和核酸区段的特征来确定，并且因此，不限于上述确认的实施例的范围。在一些实施例中，具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐与核酸单体的摩尔比是从约2.75:1至6:1。在一些实施例中，具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐与核酸单体的摩尔比是约2.75:1。在一些实施例中，具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐与核酸单体的近似摩尔比是约3:1。在一些实施例中，具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐与核酸单体的摩尔比是约5.5:1。在一些实施例中，具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐与核酸单体近似摩尔比是约6:1。
在一些实施例中，脂质纳米颗粒具有约200nm或更小，例如，小于或等于约100nm，或例如，小于或等于约75nm的z-均粒径(<d>Z)。在本披露的至少一个实施例中，脂质纳米颗粒具有范围从约50nm至约100nm，例如，约60nm至约90nm，从约70nm至约80，诸如约75nm的z-均粒径。
在某些实施例中，脂质纳米颗粒具有约80％或更高，诸如高于约90％，诸如范围从约95％-100％的核酸区段的包封效率(％EE)。如本文所用，术语“包封效率”是指脂质纳米颗粒中包封的核酸区段与通过使用洗涤剂(例如，Triton X-100)裂解脂质纳米颗粒所测量的脂质纳米颗粒组合物中总核酸区段含量的比率。
本披露的药物组合物可以进一步包含至少一种药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括在合理的医学判断的范围，适用于与人和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏响应、或其他问题或并发症，同时具有相称的合理受益/风险比的那些化合物、材料、组合物、和/或剂型。
这些药物组合物可以呈适用于肠胃外施用的形式。例如，合适的肠胃外施用包括但不限于皮下施用、肌内施用和静脉施用。这些药物组合物可以呈适用于气管内滴注、支气管滴注、和/或吸入的形式。可以通过使用惰性气体来雾化药物液体组合物以用于吸入。雾化悬浮液可以从雾化装置直接呼吸，或者可以将该雾化装置连接于面罩，或者连接于间歇性正压呼吸机。
与一种或多种药学上可接受的载体组合以产生单一剂型的核酸区段的量将必然根据所治疗的受试者和具体的施用途径而变化。对于施用途径和给药方案的另外的信息，读者可参考Comprehensive Medicinal Chemistry[综合药物化学数据库](CorwinHansch；编委会主席)的第5卷第25.3章，培格曼出版社(Pergamon Press)1990。
在一个实施例中，本披露提供了用于对有需要的受试者施用药物组合物的方法，该药物组合物包含多个脂质纳米颗粒和治疗有效量的核酸区段，这些脂质纳米颗粒包含具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。
术语“受试者”包括温血哺乳类动物，例如，灵长类、牛、猪、羊、狗、猫、兔、大鼠和小鼠。在一些实施例中，受试者是灵长类动物，例如人。在一些实施例中，受试者需要治疗(例如，受试者将会在生物学上或医学上受益于治疗)。
本文披露的脂质纳米颗粒可以进一步用作用于将核酸区段(例如反义寡核苷酸、DNA、mRNA、siRNA、Cas9-引导RNA复合物)选择性递送至靶细胞和组织的药物递送媒介物。因此，在一个实施例中，是将核酸区段递送至细胞的方法，其包括使细胞在体外或体内与药物组合物接触，该药物组合物包含多个脂质纳米颗粒和治疗有效量的核酸区段，这些脂质纳米颗粒包含具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，核酸区段调节表达，例如，通过增加或减少表达，或通过上调或下调多肽的表达。
另一实施例提供了用于向有需要的受试者递送治疗有效量的核酸区段的方法，其包括向受试者施用药物组合物，该药物组合物包含多个脂质纳米颗粒和治疗有效量的核酸区段，这些脂质纳米颗粒包含具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。
本文披露的包含多个脂质纳米颗粒和核酸区段的药物组合物可以用于治疗多种障碍和疾病，这些脂质纳米颗粒包含具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，这些障碍和疾病的特征在于受试者中多肽的低表达、受试者中多肽的过表达、和/或受试者中多肽的不存在/存在。相应地，披露了治疗患有疾病或障碍的受试者的方法，其包括向受试者施用包含多个脂质纳米颗粒和治疗有效量的核酸区段的药物组合物，这些脂质纳米颗粒包含具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。
进一步披露了包含多个脂质纳米颗粒和治疗有效量的核酸区段的药物组合物用于治疗疾病或障碍的用途，这些脂质纳米颗粒包含具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。
进一步披露了用于在疾病或障碍的治疗中使用的药物组合物，其中该药物组合物包含多个脂质纳米颗粒和治疗有效量的核酸区段，这些脂质纳米颗粒包含具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。
进一步披露了用于调节细胞中的蛋白质表达的方法，这些方法包括向有需要的受试者施用包含多个脂质纳米颗粒和核酸区段的药物组合物，这些脂质纳米颗粒包含具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。在至少一个实施例中，蛋白质表达可以增加约2小时至24小时。在另一个实施例中，蛋白质表达可以增加约3小时至72小时。
实例
一般方法
1H NMR：300MHz；探针：具有ATM+Z PABBO BB-1H/D的5mm宽带液体探针BBFO；磁体：ULTRASHIELDTM300；机箱：AVANCE III 300；自动进样器：SampleXpressTM60；软件：Topspin3。400MHz；探针：具有ATM+Z PABBO BB-1H/D的5mm宽带液体探针BBFO；磁体ASCENDTM400；机箱AVANCE III 300；自动进样器SampleXpressTM60；软件：Topspin 3。所有谱图用TMS作为内标校准。
1H NMR：500MHz；探针：具有ATM+Z PABBO 500S1-BBF-H-D的5mm Bruker Smart探针；磁体：ASCENDTM500；控制台：AVANCE Neo 500；自动进样器：SampleXpressTM60；软件：Topspin 4。质子化学位移以百万分率(ppm，δ标度)表示并且参考NMR溶剂(氯仿m-d：δ7.26，甲醇-d4：δ3.31，DMSO-d6：δ2.50)中的残余氕。
数据表示如下：化学位移，多重性(s＝单峰，d＝二重峰，t＝三重峰，q＝四重峰，dd＝双二重峰，dt＝双三重峰，m＝多重峰，br＝宽峰，app＝表观)，积分和以赫兹(Hz)计的偶合常数(J)。
LCMS：与DAD检测器、ELSD检测器和2020EV MS耦合的仪器Shimadzu LCMS-2020；柱Shim-packXR-ODS C18(50×3.0mm，2.2μm)；洗脱液A水(0.05％TFA)，洗脱液B MeCN(0.05％TFA)；梯度在2.00min内5％-95％B，保持0.70min(方法A)或在1.00min内60％-95％B，保持1.70min(方法B)；流速1.20mL/min；PDA检测(SPD-M20A)190-400nm。以ESI模式的质谱仪。
如下进行UPLC-MS：使用Waters Acquity UPLC和Waters SQD质谱仪(柱温30℃，UV检测＝210-400nm，质谱＝具有正/负切换的ESI)以1mL/min的流速使用2％至98％B的溶剂梯度进行1.5分钟(连同平衡回到起始条件的总运行时间：2分钟)，其中A＝在水中的0.1％甲酸并且B＝在乙腈中的0.1％甲酸(用于酸工作)，或者A＝在水中的0.1％氢氧化铵并且B＝乙腈(用于碱工作)。对于酸分析所使用的柱是Waters Acquity HSS T3，1.8mm，2.1×30mm，对于碱分析所使用的柱是Waters Acquity BEH C18，1.7mm，2.1×30mm。
HPLC：与DAD检测器、CAD检测器耦合的仪器Shimadzu LCMS-2020；柱AscentisExpress C18(100×4.6mm)，2.7μm；流动相A水(0.05％TFA)，流动相B MeCN；梯度在4.00min内10％-95％B，保持8min，或如所指示的，流速1.50mL/min；纯度以面积％计。
制备型HPLC：仪器Waters 2545二元梯度组件，Waters 2767样品管理器，Waters2489UV/可见光检测器，Waters SQ检测器2。方法A：柱XSelect CSH Prep C18 OBD柱，19×250mm，5μm；流动相A水(0.05％TFA)，流动相B MeCN；流速25mL/min，梯度如所指示的。方法B：柱SunFire C18 OBD，19×250mm，5μm；流动相A水(0.05％TFA)，流动相B MeCN；流速60mL/min，梯度如所指示的。
缩写
1,2-DCE 1,2-二氯乙烷
ACN 乙腈
CPME 环戊基甲基醚
DCM 二氯甲烷
DMSO 二甲亚砜
DIEA N,N-二异丙基乙胺
DIPEA N,N-二异丙基乙胺
DMAP N,N-二甲基氨基吡啶
<d>N 数均粒径
<d>Z z-均粒径
EDC 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺
EDCI 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺
EE％ 包封效率
EtOAc 乙酸乙酯
HPLC 高效液相色谱法
KI 碘化钾
MC3 4-(二甲基氨基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯
NMP N-甲基-2-吡咯烷酮
PDI 多分散性指数
PE 石油醚(30-50)
PBS 磷酸盐缓冲盐水
rt 室温
TEA 三乙胺
THF 四氢呋喃
UPLC 超高效液相色谱法
Z-pot ζ-电位
实例1.化合物1的合成
试剂a)EDC、DIPEA、DMAP、DCM；b)K2CO3、KI、ACN；c)4M盐酸二氧六环溶液；d)EDC、DIPEA、DMAP、DCM；e)DIPEA、KI、ACN
中间体1：8-溴辛酸十七烷-9-基酯
步骤a：
在氩气下，将EDC(0.785g，4.09mmol)一次性添加至8-溴辛酸(0.522g，2.34mmol)、十七烷-9-醇(0.5g，1.95mmol)、DMAP(0.048g，0.39mmol)和DIPEA(1.396ml，7.99mmol)在DCM(15mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在室温下搅拌16小时。将该反应混合物在减压下浓缩至干燥，并且再溶解于EtOAc(50mL)中，并且用饱和NaHCO3水溶液(50mL)和饱和NaCl水溶液(50mL)依次洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩至干燥以得到粗产物。将所得残余物通过快速二氧化硅色谱法(洗脱梯度为己烷中的0至20％EtOAc)纯化。将产物级分在减压下浓缩至干燥以得到呈无色油状物的8-溴辛酸十七烷-9-基酯(0.714g，79％)。1H NMR(500MHz,氯仿-d,27℃)0.89(6H,t),1.27-1.70(36H,m),1.77-1.94(2H,m),2.21-2.37(2H,t),3.41(2H,t),4.78-4.95(1H,m)。
中间体2：7-(8-(十七烷-9-基氧基)-8-氧代辛基)-9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-甲酸叔丁基酯
步骤b：
在氩气下，将8-溴辛酸十七烷-9-基酯(0.808g，1.75mmol)(中间体1)滴加至9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-甲酸叔丁基酯盐酸盐(0.386g，1.46mmol)、碳酸钾(0.423g，3.06mmol)和碘化钾(0.048g，0.29mmol)在乙腈(10mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在80℃下搅拌16小时。将该反应混合物在减压下浓缩至干燥，并且再溶解于EtOAc(100mL)中，并且用饱和Na2CO3水溶液(100mL)和饱和NaCl水溶液(100mL)依次洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩至干燥以得到粗产物。将所得残余物通过快速二氧化硅色谱法(洗脱梯度为在DCM中的0至100％的(在DCM中的20％MeOH和1％NH4OH))纯化。将产物级分在减压下浓缩至干燥以得到呈浅黄色油状物的7-(8-(十七烷-9-基氧基)-8-氧代辛基)-9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-甲酸叔丁基酯(0.747g，84％)。1H NMR(500MHz,氯仿-d,22℃)0.88(6H,t),1.20-1.67(47H,m),2.02-2.19(2H,m),2.22-2.31(2H,t),2.35-2.49(2H,m),2.77-2.96(2H,m),3.18-3.38(2H,m),3.68-3.83(2H,m),3.92-4.17(2H,m),4.87(1H,m)。
中间体3：8-(9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-基)辛酸十七烷-9-基酯二盐酸盐
步骤c：
在0℃下，在氩气下，将二氧六环中的HCl(2.250ml，9.00mmol)滴加至7-(8-(十七烷-9-基氧基)-8-氧代辛基)-9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-甲酸叔丁基酯(0.548g，0.90mmol)(中间体2)在二氧六环(10mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物加热并且在室温下搅拌4小时。将该反应在减压下浓缩至干燥，并且用二氧六环(3×50mL)洗涤以得到呈浅黄色油状物的8-(9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-基)辛酸十七烷-9-基酯二盐酸盐(0.472g，96％)。1H NMR(500MHz,甲醇-d4,27℃)0.90(6H,t),1.29(38H,m),2.24-2.39(2H,t),3.49-3.59(3H,t),4.85-4.91(1H,m)。
中间体4：8-溴辛酸壬基酯
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步骤d：
将EDC(2.79g，14.56mmol)一次性添加至8-溴辛酸(2.320g，10.40mmol)、壬烷-1-醇(1.205ml，6.93mmol)、DMAP(0.169g，1.39mmol)和DIPEA(2.54ml，14.56mmol)在DCM(15mL)中的搅拌溶液中。将所得混合物在室温下搅拌16小时。将该反应混合物在减压下浓缩至干燥，并且再溶解于EtOAc(100mL)中，并且用饱和NaHCO3水溶液(100mL)和饱和NaCl水溶液(100mL)依次洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩至干燥以得到粗产物。将所得残余物通过快速二氧化硅色谱法(洗脱梯度为己烷中的0至20％EtOAc)纯化。将产物级分在减压下浓缩至干燥以得到呈无色油状物的8-溴辛酸壬基酯(1.580g，65.2％)。1HNMR(500MHz,氯仿-d,27℃)0.82-0.95(3H,t),1.23-1.51(18H,m),1.56-1.69(4H,m),1.80-1.92(2H,m),2.30(2H,t),3.33-3.48(2H,t),4.07(2H,t)。
化合物1：8-(7-(8-(壬基氧基)-8-氧代辛基)-9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-基)辛酸十七烷-9-基酯
步骤e：
在氩气下，将8-溴辛酸壬基酯(0.144g，0.41mmol)(中间体4)滴加至8-(9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-基)辛酸十七烷-9-基酯二盐酸盐(0.2g，0.34mmol)(中间体3)和DIPEA(0.486ml，2.78mmol)在乙腈(5mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在80℃下搅拌16小时。将该反应混合物在减压下浓缩至干燥并且再溶解于EtOAc(50mL)，并且用饱和NaHCO3水溶液(50mL)和饱和NaCl水溶液(50mL)依次洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩至干燥以得到粗产物。将所得残余物通过快速二氧化硅色谱法(洗脱梯度为在DCM中的0％至100％的(在DCM中的20％MeOH和1％NH4OH))纯化两次。将产物级分在减压下浓缩至干燥以得到呈淡黄色油状物的8-(7-(8-(壬基氧基)-8-氧代辛基)-9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-基)辛酸十七烷-9-基酯(0.119g，44.5％)。1H NMR(500MHz,甲醇-d4,27℃)0.90(9H,t),1.23-1.43(48H,m),1.48-1.68(14H,m),2.24-2.34(8H,m),2.41-2.52(4H,br d),2.87(4H,br d),3.83-3.92(2H,m),4.07(2H,s),4.88(1H,m)。UPLC,ms检测(ES+)([M+H]+)＝777.8Da；RT ELSD＝1.91min。
实例2.化合物2的合成
试剂.a)4M盐酸二氧六环溶液；b)EDC、DIPEA、DMAP、DCM；c)DIPEA、KI、ACN
中间体1：9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷二盐酸盐
步骤a：
在氩气下，将HCl(2ml，65.83mmol)滴加至9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-甲酸叔丁基酯盐酸盐(0.3g，1.13mmol)在1,4-二氧六环(8mL)中的搅拌混合物中。将该反应在室温下搅拌过夜直至形成沉淀物。将该反应混合物在减压下浓缩至干燥以得到呈白色粉末的9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷(0.220g，97％)。1H NMR(500MHz,甲醇-d4,27℃)3.51(8H,m),4.41(2H,br t)。
中间体2：8-溴辛酸十七烷-9-基酯
步骤b：
在氩气下，将EDC(0.785g，4.09mmol)一次性添加至8-溴辛酸(0.522g，2.34mmol)、十七烷-9-醇(0.5g，1.95mmol)、DMAP(0.048g，0.39mmol)和DIPEA(1.396ml，7.99mmol)在DCM(15mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在室温下搅拌16小时。将该反应混合物在减压下浓缩至干燥，并且再溶解于EtOAc(50mL)中，并且用饱和NaHCO3水溶液(50mL)和饱和NaCl水溶液(50mL)依次洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩至干燥以得到粗产物。将所得残余物通过快速二氧化硅色谱法(洗脱梯度为己烷中的0至20％EtOAc)纯化。将产物级分在减压下浓缩至干燥以得到呈无色油状物的8-溴辛酸十七烷-9-基酯(0.714g，79％)。1H NMR(500MHz,氯仿-d,27℃)0.89(6H,t),1.27-1.70(36H,m),1.77-1.94(2H,m),2.21-2.37(2H,t),3.41(2H,t),4.78-4.95(1H,m)。
化合物2：8,8'-(9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3,7-二基)二辛酸双(十七烷-9-基)酯
步骤c：
在25℃下，在氩气下，将8-溴辛酸十七烷-9-基酯(0.285g，0.62mmol)(中间体2)滴加至9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷二盐酸盐(0.04g，0.20mmol)(中间体1)、DIPEA(0.142ml，0.82mmol)和碘化钾(6.60mg，0.04mmol)在乙腈(5mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在80℃下搅拌16小时。将该反应混合物在减压下浓缩至干燥，并且再溶解于EtOAc(50mL)中，并且用饱和Na2CO3水溶液(50mL)和饱和NaCl水溶液(50mL)依次洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩至干燥以得到粗产物。将所得残余物通过快速二氧化硅色谱法(洗脱梯度为在DCM中的0至100％的(在DCM中的20％MeOH和1％NH4OH))纯化。将产物级分在减压下浓缩至干燥以得到呈淡黄色油状物的8,8'-(9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3,7-二基)二辛酸双(十七烷-9-基)酯(0.062g，34.9％)。1H NMR(500MHz,氯仿-d,27℃)0.89(12H,t),1.15-1.72(76H,m),2.28(8H,m),2.41-2.50(4H,m),2.76-2.84(4H,m),3.88(2H,br s),4.87(2H,m)。UPLC,ms检测(ES+)([M+H]+)＝890.2；RT ELSD＝2.27min。
实例3.化合物3的合成
试剂.a)NaH、DMF；b)LiCl、H2O、DMSO；c)LiAlH4、THF；d)丙烯酰氯、TEA、DCM；e)DIPEA、KI、ACN；f)盐酸二氧六环溶液；g)TEA、IPA。
中间体1：2,2-二辛基丙二酸二甲基酯
步骤a：
在氮气下，将氢化钠(3.48g，87.05mmol)缓慢悬浮在干燥的DMF中，并且将该混合物冷却至0℃。依次添加DMF(每次25mL)中的丙二酸二甲基酯(4.33ml，37.85mmol)和1-溴辛烷(19.61ml，113.54mmol)，并且将该混合物在室温下搅拌3h。在反应之后，添加水(250mL)，并且用(Et2O)(3×100mL)萃取该水层。将合并的有机层用水(100mL)和饱和NaCl水溶液(100mL)依次洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩至干燥以得到粗产物。将所得残余物通过快速二氧化硅色谱法(洗脱梯度为己烷中的0至50％EtOAc)纯化。将产物级分在减压下浓缩至干燥以得到呈淡黄色油状物的2,2-二辛基丙二酸二甲基酯(8.89g，65.9％)。1H NMR(500MHz,氯仿-d,27℃)0.85-0.92(6H,3),1.27(24H,m),1.77-1.93(4H,m),3.62-3.77(6H,s)。
中间体2：2-辛基葵酸甲基酯
步骤b：
将2,2-二辛基丙二酸二甲基酯(9.2g，25.80mmol)(中间体1)、氯化锂(1.422g，33.54mmol)和水(0.604g，33.54mmol)在DMSO(80mL)中的混合物在回流下搅拌24h。在冷却至室温之后，添加水(150mL)以淬灭该反应。将该反应混合物用(Et2O)(3×50mL)萃取。将合并的有机层用水(3×50mL)依次洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩至干燥以得到粗产物。将所得残余物通过快速二氧化硅色谱法(洗脱梯度为己烷中的0至50％EtOAc)纯化。将产物级分在减压下浓缩至干燥以得到呈黄色液体的2-辛基葵酸甲基酯(7.30g，95％)。1H NMR(500MHz,氯仿-d,27℃)0.89(6H,t),1.18-1.71(28H,m),2.28-2.39(1H,m),3.68(3H,s)。
中间体3：2-辛基癸烷1-醇
步骤c：
在0℃下，将氢化铝锂(14.67ml,29.35mmol)滴加至2-辛基葵酸甲基酯(7.3g，24.45mmol)(中间体2)在THF(100mL)中的溶液中。接着将该反应加热并且在室温下搅拌24h。完成之后，添加3M HCl(50mL)以淬灭该反应。将该反应混合物用水(100mL)和DCM(100mL)稀释。分离各层，并且将水层用(DCM)(3×50mL)萃取。将合并的有机层用饱和NaCl水溶液(100mL)洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩至干燥以得到粗产物。将所得残余物通过快速二氧化硅色谱法(洗脱梯度为己烷中的0至40％EtOAc)纯化。将产物级分在减压下浓缩至干燥以得到呈黄色液体的2-辛基癸烷1-醇(4.56g，68.9％)。1H NMR(500MHz,氯仿-d,27℃)0.89(6H,t),1.16-1.39(28H,m),1.42-1.50(1H,m),3.55(2H,brs)。
中间体4：丙烯酸2-辛基癸基酯
步骤d：
在0℃下，在氩气下，将丙烯酰氯(0.358ml，4.44mmol)滴加至2-辛基癸烷-1-醇(1g，3.70mmol)(中间体3)和TEA(2.113ml，15.16mmol)在DCM(20mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在室温下搅拌16小时。该反应混合物在减压下浓缩，并且用DCM(100mL)稀释，并且用饱和NaCl水溶液(100mL)洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩至干燥以得到粗产物。将所得残余物通过快速二氧化硅色谱法(洗脱梯度为己烷中的0至100％EtOAc)纯化。将产物级分在减压下浓缩至干燥以得到呈淡黄色油状物的丙烯酸2-辛基癸基酯(0.850g，70.8％)。1HNMR(500MHz,氯仿-d,27℃)0.89(6H,t),1.23-1.35(28H,m),1.61-1.75(1H,m),4.07(2H,d),5.82(1H,d),6.13(1H,dd),6.40(1H,d)。
中间体5：((9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3,7-二基)双(丁烷-4,1-二基))二氨基甲酸二-叔丁基酯
步骤e：
在氮气下，将(4-溴丁基)氨基甲酸叔丁基酯(0.502g，1.99mmol)一次性添加至9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷二盐酸盐(0.1g，0.50mmol)、DIPEA(0.521ml，2.98mmol)和碘化钾(0.017g，0.10mmol)在乙腈(5mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在80℃下搅拌16小时。将该反应混合物在减压下浓缩至干燥，并且再溶解于EtOAc(50mL)中，并且用饱和NaHCO3水溶液(50mL)和饱和NaCl水溶液(50mL)依次洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩至干燥以得到粗产物。将所得残余物通过快速二氧化硅色谱法(洗脱梯度为在DCM中的0至100％的(在DCM中的20％MeOH和1％NH4OH))纯化。将产物级分在减压下浓缩至干燥以得到呈淡黄色油状物的((9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3,7-二基)双(丁烷-4,1-二基))二氨基甲酸二-叔丁基酯(0.095g，40.6％)。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δppm1.4(18H,s)1.5-1.6(8H,m)2.3(4H,m)2.4-2.6(4H,m)3.0-3.1(8H,m)3.8-3.9(2H,m)4.8(2H,m)。
中间体6：4,4'-(9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3,7-二基)双(丁烷-1-胺)四盐酸盐
步骤f：
在惰性气氛下，将HCl在二氧六环(4M，10.30mmol，2.58mL)中的溶液添加至((9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3,7-二基)双(丁烷-4,1-二基))二氨基甲酸二-叔丁基酯(0.097g，0.21mmol)(中间体5)中，并且在室温下搅拌16小时。旋转蒸发之后，将该反应残余物用二氧六环(4mL)稀释，并且将溶剂在减压下去除两次。将该固体在减压下浓缩至干燥以得到呈白色固体的4,4'-(9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3,7-二基)双(丁烷-1-胺)四盐酸盐。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δppm 1.7(4H,m)1.7-1.8(4H,m)2.7-2.8(4H,m)2.9-3.0(8H,m)3.3-3.3(2H,m)3.5(4H,br d)4.1(2H,br s)。
化合物3：3,3',3”,3”'-(((9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3,7-二基)双(丁烷-4,1-二基))双(氮杂三基))四丙酸四(2-辛基癸基)酯
步骤g：
将丙烯酸2-辛基癸基酯(0.468g，1.44mmol)(中间体4)一次性添加至4,4'-(9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3,7-二基)双(丁烷-1-胺)四盐酸盐(0.05g，0.12mmol)(中间体5)和TEA(0.134ml，0.96mmol)在iPrOH(4mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在80℃下搅拌3天。将该反应混合物在减压下浓缩至干燥，并且再溶解于EtOAc(50mL)中，并且用饱和NaHCO3水溶液(50mL)和饱和NaCl水溶液(50mL)依次洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩至干燥以得到粗产物。将所得残余物通过快速二氧化硅色谱法(洗脱梯度为在DCM中的0至100％的(在DCM中的20％MeOH和NH4OH))纯化。将产物级分在减压下浓缩至干燥以得到呈橙色油状物的3,3',3”,3”'-(((9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3,7-二基)双(丁烷-4,1-二基))双(氮杂三基))四丙酸四(2-辛基癸基)酯(0.027g，14.06％)。1HNMR(500MHz,甲醇-d4,27℃)0.84-0.99(24H,t),1.21-1.41(116H,m),1.46-1.56(4H,m),1.66(8H,m),2.43-2.52(10H,m),2.73-2.82(10H,m),2.98-3.08(4H,m),3.42-3.52(4H,m),4.00(8H,d),4.18(2H,br s)。MS检测(ES+)([M+H]+)＝1568.4。
实例4.化合物4的合成
试剂a)EDC、DIPEA、DMAP、DCM；b)K2CO3、KI、ACN；c)4M盐酸二氧六环溶液；d)EDC、DIPEA、DMAP、DCM；e)DIPEA、KI、ACN
中间体1：8-溴辛酸十七烷-9-基酯
步骤a：
在氩气下，将EDC(0.785g，4.09mmol)一次性添加至8-溴辛酸(0.522g，2.34mmol)、十七烷-9-醇(0.5g，1.95mmol)、DMAP(0.048g，0.39mmol)和DIPEA(1.396ml，7.99mmol)在DCM(15mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在室温下搅拌16小时。将该反应混合物在减压下浓缩至干燥，并且再溶解于EtOAc(50mL)中，并且用饱和NaHCO3水溶液(50mL)和饱和NaCl水溶液(50mL)依次洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩至干燥以得到粗产物。将所得残余物通过快速二氧化硅色谱法(洗脱梯度为己烷中的0至20％EtOAc)纯化。将产物级分在减压下浓缩至干燥以得到呈无色油状物的8-溴辛酸十七烷-9-基酯(0.714g，79％)。1H NMR(500MHz,氯仿-d,27℃)0.89(6H,t),1.27-1.70(36H,m),1.77-1.94(2H,m),2.21-2.37(2H,t),3.41(2H,t),4.78-4.95(1H,m)。
中间体2：7-(8-(十七烷-9-基氧基)-8-氧代辛基)-9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-甲酸叔丁基酯
步骤b：
在氩气下，将8-溴辛酸十七烷-9-基酯(0.808g，1.75mmol)(中间体1)滴加至9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-甲酸叔丁基酯盐酸盐(0.386g，1.46mmol)、碳酸钾(0.423g，3.06mmol)和碘化钾(0.048g，0.29mmol)在乙腈(10mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在80℃下搅拌16小时。将该反应混合物在减压下浓缩至干燥，并且再溶解于EtOAc(100mL)中，并且用饱和Na2CO3水溶液(100mL)和饱和NaCl水溶液(100mL)依次洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩至干燥以得到粗产物。将所得残余物通过快速二氧化硅色谱法(洗脱梯度为在DCM中的0至100％的(在DCM中的20％MeOH和1％NH4OH))纯化。将产物级分在减压下浓缩至干燥以得到呈浅黄色油状物的7-(8-(十七烷-9-基氧基)-8-氧代辛基)-9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-甲酸叔丁基酯(0.747g，84％)。1H NMR(500MHz,氯仿-d,22℃)0.88(6H,t),1.20-1.67(47H,m),2.02-2.19(2H,m),2.22-2.31(2H,t),2.35-2.49(2H,m),2.77-2.96(2H,m),3.18-3.38(2H,m),3.68-3.83(2H,m),3.92-4.17(2H,m),4.87(1H,m)。
中间体3：8-(9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-基)辛酸十七烷-9-基酯二盐酸盐
步骤c：
在0℃下，在氩气下，将二氧六环中的HCl(2.250ml，9.00mmol)滴加至7-(8-(十七烷-9-基氧基)-8-氧代辛基)-9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-甲酸叔丁基酯(0.548g，0.90mmol)(中间体2)在二氧六环(10mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物加热并且在室温下搅拌4小时。将该反应在减压下浓缩至干燥，并且用二氧六环(3×50mL)洗涤以得到呈浅黄色油状物的8-(9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-基)辛酸十七烷-9-基酯二盐酸盐(0.472g，96％)。1H NMR(500MHz,甲醇-d4,27℃)0.90(6H,t),1.29(38H,m),2.24-2.39(2H,t),3.49-3.59(3H,t),4.85-4.91(1H,m)。
中间体4：8-溴辛酸(Z)-壬-2-烯-1-基酯
步骤d：
在氩气下，将EDC(2.83g，14.76mmol)一次性添加至8-溴辛酸(2.353g，10.55mmol)、DIPEA(3.68ml，21.09mmol)、(Z)-壬-2-烯-1-醇(1g，7.03mmol)和DMAP(0.172g，1.41mmol)在DCM(15mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在室温下搅拌16小时。将该反应混合物在减压下浓缩至干燥，并且再溶解于EtOAc(100mL)中，并且用饱和NaHCO3水溶液(100mL)和饱和NaCl水溶液(100mL)依次洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩至干燥以得到粗产物。将所得残余物通过快速二氧化硅色谱法(洗脱梯度为己烷中的0至100％EtOAc)纯化。将产物级分在减压下浓缩至干燥以得到呈淡黄色油状物的8-溴辛酸(Z)-壬-2-烯-1-基酯(1.930g，79％)。1H NMR(500MHz,氯仿-d,27℃)0.79-0.95(3H,t),1.21-1.50(14H,m),1.58-1.69(2H,m),1.72-1.93(2H,m),2.11(2H,m),2.31(2H,t),3.31-3.65(2H,t),4.63(2H,d),5.48-5.73(2H,m)。
化合物4：(Z)-8-(7-(8-(壬-2-烯-1-基氧基)-8-氧代辛基)-9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-基)辛酸十七烷-9-基酯
步骤e：
在20℃，在氮气下，添加溶解于比例为1:1的乙腈/CPME(10mL)和DIPEA(0.212mL，1.21mmol)中的8-(9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-基)辛酸十七烷-9-基酯二盐酸盐(中间体3)。将所得混合物在20℃下搅拌30分钟。在氮气下，将该8-溴辛酸(Z)-壬-2-烯-1-基酯(0.123g，0.35mmol)(中间体4)滴加至该搅拌溶液。将所得混合物加热至80℃，并且在氮气下搅拌超过18小时的时间段。将该反应混合物在减压下浓缩至干燥并且再溶解于EtOAc(50mL)，并且用饱和NaHCO3水溶液(50mL)和饱和氯化钠水溶液(50mL)依次洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩至干燥以得到粗产物。将所得残余物通过快速二氧化硅色谱法(洗脱梯度为在DCM中的0至100％的(在DCM中的20％MeOH和1％NH4OH))纯化。将产物级分在减压下浓缩以得到呈淡黄色油状物的(Z)-8-(7-(8-(壬-2-烯-1-基氧基)-8-氧代辛基)-9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-基)辛酸十七烷-9-基酯(0.214g，93％)。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)0.86-1.00(9H,t),1.23-1.46(44H,m),1.56(8H,m),1.64(4H,m),2.15(2H,q),2.24-2.38(8H,m),2.51(4H,br d),2.92(4H,br d),3.91(2H,br s),4.64(2H,d),4.88-4.93(1H,m),5.49-5.71(2H,m)。UPLC,ms检测(ES+)([M+H]+)＝776.0Da；RT ELSD＝1.88min。
实例5.化合物5的合成
试剂a)三乙基磷乙酸、NaH、THF；b)Pt(IV)O2、H2、CHCl3/MeOH；c)LiAlH4、THF；d)EDC、DIPEA、DMAP、DCM；e)DIPEA、KI、ACN
中间体1：3-辛基十一-2-烯酸乙基酯
步骤a：
在0℃下，在氮气下，将膦酰基乙酸三乙酯(12.59ml，62.88mmol)缓慢添加至氢化钠(2.51g，62.88mmol)在THF(50mL)中的搅拌溶液中。将所得混合物在0℃下搅拌30分钟。在氮气下，将十七烷-9-酮(2g，7.86mmol)添加至该搅拌混合物中，并且加热至30℃。将所得混合物在回流下搅拌18小时。在冷却至室温之后，将该反应混合物用水(100mL)淬灭，用EtOAc(3×50mL)萃取，将合并的有机层经MgSO4干燥，过滤并且在减压下浓缩至干燥以得到黄色油状物。将所得残余物通过快速二氧化硅色谱法(洗脱梯度为己烷中的0至40％EtOAc)纯化。使用1H NMR测定每个级分的纯度。将合并的产物级分在减压下浓缩至干燥以得到呈无色油状物的3-辛基十一-2-烯酸乙基酯(1.850g，72.5％)。1H NMR(500MHz,氯仿-d)0.89(6H,t),1.21-1.53(27H,m),2.13(2H,t),2.53-2.65(2H,t),4.15(2H,q),5.62(1H,s)。
中间体2：3-辛基十一酸乙基酯
步骤b：
在氢气囊下，在大气压下，将在CHCl3/MeOH(5:1)(30mL)中的3-辛基十一-2-烯酸乙基酯(2.0g，6.16mmol)(中间体1)和氧化铂(IV)(0.028g，0.12mmol)搅拌16小时。将反应混合物通过硅藻土过滤。将所得残余物通过快速二氧化硅色谱法(洗脱梯度为己烷中的0至40％EtOAc)纯化。因为与十七烷-9-酮起始材料重叠，分离十分困难。使用1H NMR测定每个级分的纯度。将合并的产物级分在减压下浓缩至干燥以得到呈无色油状物的3-辛基十一酸乙基酯(1.540g，77％)。1H NMR(500MHz,氯仿-d,27℃)0.83-0.95(6H,t),1.16-1.39(31H,m),1.79-1.92(1H,brt),2.22(2H,d),4.13(2H,q)。
中间体3：3-辛基十一烷-1-醇
步骤c：
在0℃下，在氮气下，将氢化铝锂(7.75ml，7.75mmol)缓慢添加至3-辛基十一酸乙基酯(2.3g，7.04mmol)(中间体2)在THF(20mL)中的搅拌溶液中。将所得混合物在室温下搅拌18小时。完成之后，将该反应冷却至0℃，并且用3M HCl(100mL)淬灭，用EtOAc(3×50mL)萃取，将合并的有机层经MgSO4干燥，过滤并且在减压下浓缩至干燥以得到黄色油状物。将所得残余物通过快速二氧化硅色谱法(洗脱梯度为己烷中的0至40％EtOAc)纯化。将产物级分在减压下浓缩至干燥以得到呈无色油状物的3-辛基十一烷-1-醇(1.354g，67.6％)。1HNMR(500MHz,氯仿-d,27℃)0.89(6H,t),1.18-1.36(28H,m),1.38-1.46(1H,br t),1.53(2H,q),3.67(2H,t)。
中间体4：8-溴辛酸3-辛基十一烷基酯
步骤d：
在氩气下，将EDC(0.707g，3.69mmol)一次性添加至8-溴辛酸(0.470g，2.11mmol)、DIPEA(0.645ml，3.69mmol)、3-辛基十一烷-1-醇(0.5g，1.76mmol)(中间体3)和DMAP(0.043g，0.35mmol)在DCM(10mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在室温下搅拌16小时。该反应混合物在减压下浓缩至干燥并且再溶解于EtOAc(50mL)中，并用饱和NaHCO3水溶液(100mL)和饱和NaCl水溶液(50mL)依次洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩至干燥以得到粗产物。将所得残余物通过快速二氧化硅色谱法(洗脱梯度为己烷中的0至100％EtOAc)纯化。将产物级分在减压下浓缩至干燥以得到呈淡黄色油状物的8-溴辛酸3-辛基十一烷基酯(0.545g，63.3％)。1H NMR(500MHz,氯仿-d,27℃)0.83-0.98(6H,t),1.20-1.49(35H,m),1.53-1.70(4H,m),1.79-1.92(2H,m),2.30(2H,t),3.41(2H,t),4.03-4.15(2H,t)。
化合物5：8,8'-(9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3,7-二基)二辛酸双(3-辛基十一烷基)酯
步骤e：
在25℃下，在氩气下，将8-溴辛酸3-辛基十一烷基酯(0.302g，0.62mmol)(中间体4)滴加至9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷二盐酸盐(0.04g，0.20mmol)、DIPEA(0.142ml，0.82mmol)和碘化钾(6.60mg，0.04mmol)在乙腈(5mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在80℃下搅拌16小时。将该反应混合物在减压下浓缩至干燥，并且再溶解于EtOAc(50mL)中，并且用饱和Na2CO3水溶液(50mL)和饱和NaCl水溶液(50mL)依次洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩至干燥以得到粗产物。将所得残余物通过快速二氧化硅色谱法(洗脱梯度为在DCM中的0至100％的(在DCM中的20％MeOH和1％NH4OH))纯化。将产物级分在减压下浓缩至干燥以得到呈淡黄色油状物的8,8'-(9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3,7-二基)二辛酸双(3-辛基十一烷基)酯(0.054g，28.6％)。1HNMR(500MHz,氯仿-d,27℃)0.89(12H,t),1.16-1.69(80H,m),1.73-1.85(2H,m),2.20-2.26(4H,br t),2.26-2.31(4H,t),2.40-2.52(4H,m),2.82(4H,br d),3.82-3.94(2H,brt),4.09(4H,t)。UPLC,ms检测(ES+)([M+H]+)＝945.7；RT ELSD＝2.43min。
实例6.含有eGFP mRNA的脂质纳米颗粒(LNP)制剂的制备
使用微流控装置，即NanoAssemblr(精度纳米系统公司(Precision NanoSystemsInc.))制备LNP。简而言之，将液体储备液溶解于乙醇中，并且以适合的摩尔比混合以获得12.5mM的脂质浓度。使用来自马尔文仪器有限公司(Malvern Instruments Ltd)的ZetasizerNano ZS，通过DLS测量来确定LNP的尺寸。使用1.45的颗粒折射率计算数均粒度分布值。LNP的表征如表1所示。用四种不同的脂质组分制备在乙醇(99.5％)中的脂质溶液：可离子化的脂质，即MC3、MOD5、化合物1、化合物2或化合物4；胆固醇(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))；DSPC(二硬脂酰磷酯酰胆碱，阿凡提极性脂质公司(Avanti PolarLipids))；和聚合物缀合的脂质。所有实验中脂质的比率是可离子化的脂质/胆固醇/DSPC/聚合物缀合的脂质(50/38.5/10/1.5mol％)。在所有实验中，脂质的总浓度为12.5mM。MOD5是具有如下所示的结构的可离子化的脂质，并且在Sabnis等人，Mol Therapy[分子疗法],第26卷,6,2018,1509-1519中可见更加详细的描述。
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通过将溶解在MilliQ-水中的mRNA、100mM柠檬酸盐缓冲液(pH 3)和MilliQ-水混合以得到50mM柠檬酸盐溶液，制备eGFP mRNA(购自TriLink生物技术公司(TriLinkBiotechnologies))在柠檬酸盐缓冲液中的溶液。将mRNA和脂质溶液在NanoAssemblr(精度纳米系统公司，温哥华(Vancouver)，不列颠哥伦比亚省(BC)，加拿大)微流体混合系统中以Aq:EtOH＝3:1的混合比和12mL/min的恒定流速混合。制备在柠檬酸缓冲液溶液中的mRNA，使得在混合时可离子化的脂质上的氮原子与mRNA链上的磷原子的比率(N/P比率)是3:1或5:1(参见表1)。使用来自赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)的Slide-A-Lyzer G2透析盒和10K的分子量截留，用500倍样品体积对LNP透析过夜。
弃去制备的第一个0.2-0.35mL和最后0.05-0.1mL的LNP悬浮液，同时收集剩余体积作为样品级分。使用来自马尔文仪器有限公司的ZetasizerNano ZS，通过动态光散射测量来确定mRNA脂质纳米颗粒的尺寸，直接给出z-均粒径。使用1.45的颗粒折射率计算数均粒度分布和平均值。
使用Ribo-Green测定法来确定mRNA的包封和浓度。所有样品中的包封通常是90％-99％。使用破坏LNP的Triton-X100，通过Quant-it Ribogreen测定试剂盒(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific Inc.))测量最终mRNA浓度和包封效率百分比(％EE)。根据以下等式确定mRNA包封效率：
表1总结了包含MC3、MOD5、化合物1、化合物2或化合物4的LNP制剂的表征。
表1.LNP制剂的表征
DMPE-PEG2000是二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚(乙二醇)2000(获得自日本油脂株式会社(NOF Corporation))。
DMG-PEG2000是1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油基-3-甲氧基聚乙二醇-2000。
实例7.对大鼠在体内气管内施用LNP-eGFP mRNA制剂
体内研究是在哥德堡(Gothenburg)的动物伦理委员会批准(编号82-2015)下，在AAALAC认可的动物设施(阿斯利康(AstraZeneca)，哥德堡(Gothenburg)，瑞典(Sweden))中进行的。购入雄性Wistar Han大鼠(查士利华德国有限公司(Charles River GermanyLimited))，并且到达时以4只一组，置于木屑上、配备饮食(R70大鼠和小鼠食物(斯德哥尔摩(Stockholm)，瑞典(Sweden))关入笼中，并且提供任意量的自来饮用水。在开始给药时，动物大约10周大。将环境维持在19℃–24℃的目标温度和40％–70％的相对湿度下，进行12小时光照/黑暗循环。在任何实验程序前至少5天使动物适应居住环境。开始给药前，通过逐渐增加暴露于限制装置(restraint)程序的持续时间(直至回顾性研究中预期的最长持续时间)，使接受了吸入剂量的动物进一步习惯于吸入限制装置程序持续5天。
通过以0.02mg/kg eGFP的目标肺剂量单一吸入施用或通过单一气管内施用，施用eGFP mRNA的化合物1LNP制剂。使用相同尺寸的组作为安慰剂对照，其中通过吸入或气管内滴注，将动物暴露在磷酸盐缓冲生理盐水中。气管内施用之后24小时时大鼠肺中的eGFP的表达水平如图3所示，并且气管内施用之后24小时时大鼠BALF中的BALF嗜中性粒细胞浓度如图4所示。吸入施用之后5小时和24小时时大鼠肺中的eGFP的表达水平如图6所示，并且吸入施用之后24小时时大鼠BALF中的BALF嗜中性粒细胞浓度如图7所示。此外，免疫组织化学(IHC)测试显示不仅在巨噬细胞中还在1型上皮细胞中表达eGFP(见图5A和图5B)。
通过以0.1mg/kg eGFP的目标肺剂量单一气管内施用，分别施用如实例6所描述的eGFP mRNA的MC3、MOD5、化合物2和化合物4LNP制剂。使用相同尺寸的组作为安慰剂对照，其中通过气管内滴注，将动物暴露在磷酸盐缓冲生理盐水中。24小时时大鼠肺中的eGFP的表达水平如图1所示，并且24小时时大鼠BALF中的BALF嗜中性粒细胞浓度如图2所示。
吸入给药
使用Aerogen Solo振动网雾化器(爱尔兰戈尔韦(Galway))产生气溶胶。将5.6mL媒介物或在LNP制剂中的eGFP mRNA装入雾化器，并且以60μl/min在给药的整段时间内进行雾化。将大鼠放置在啮齿类动物限制装置中，并且接着放置在阿斯利康(AstraZeneca)设计的吸入给药系统中。在给药之后，在不具有显著的体重上的临床观测结果或异常变化的情况下，通过实验程序监测动物任何不良影响的体征。最终给药之后的24小时时，通过异氟醚麻醉的镇静作用、接着切断大静脉并且摘除心脏来杀死大鼠。
气管内给药
用异氟醚混合物(空气/氧气和3.5％异氟醚)将大鼠麻醉，将其以30-40°角度的仰卧位放置，并且使用在顶部具有推注球(bolus-bulb)的改良金属套管滴注在LNP制剂中的eGFP mRNA、或媒介物。在给药之后，将大鼠以仰卧位放置在笼中，其头部朝上直至恢复意识。在给药之后，在不具有显著的体重上的临床观测结果或异常变化的情况下，通过实验程序监测动物任何不良影响的体征。最终给药之后的24小时时，通过异氟醚麻醉的镇静作用、接着切断大静脉并且摘除心脏来杀死大鼠。
BAL取样
通过手动灌注全肺进行支气管-肺泡灌洗(BAL)。在气管暴露之后，插入聚乙烯管(PE120)并用1-0丝线扎紧。将管连接至注射器，在室温下用4ml的PBS预填充，并且将PBS缓慢注射到肺中。通过缓慢的抽吸将流体重新收集到注射器中。将此程序进行两次。将最终的BAL液转移到试管(4ml，聚丙烯[PP])中。
称量含有BAL样品的管(假设1g等于1ml)。将BAL冰冷却直至离心(HettichROTANTA 46R，1200rpm，10分钟，4℃)。离心之后，收集上清液，并且将其在96孔板(0.15mL/孔，5板)上分开，并且将其保持在干冰(0.1ml/孔)上。将板在最低温度为-75℃下贮藏，用于任何进一步分析。将细胞沉淀重新悬浮在0.5ml的PBS中，保持在冰上并且立即处理至细胞计数。用自动SYSMEX XT-1800i Vet(希森美康株式会社(Sysmex)，日本神户)计数细胞的总数和差异数。
器官采集
将右肺叶系紧并切下来，将其从非肺组织中剪除，除去血块并且用生理盐水漂洗。使用缝线将右叶切除，并且将其切散，并且用PBS漂洗以除去任何血液污染。称量上叶和中叶，并且收集在7mL precellys管中用于eGFP mRNA分析。称量下叶和下腔静脉叶，并且收集在7mL precellys管中用于eGFP蛋白质分析。在液氮中，将所有右叶样品骤冻。将样品在最低温度为-80℃下保存和贮藏，直至进一步分析处理。将左叶用福尔马林膨胀，并且将其放入在具有塑料盖子的容器中的过量福尔马林中。
实例8.对小鼠在体内静脉施用LNP-eGFP mRNA制剂
遵照欧盟指令(EUDirective)2010/63/EU，所有工作的进行都应遵守英国内政部(Home Office U.K.)伦理与监管标准(ethical and husbandry standards)，并且受英国项目许可证(UK Project license)的管辖，由动物福利伦理审查机构(Animal Welfareand Ethical Review Body(AWERB))审查和批准。从查士利华(Charles River)，英国(UK)购入野生型雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)，并且存放在阿斯利康(AstraZeneca)动物设施中。向所有小鼠注射100μl的MC3、化合物2和化合物3LNP制剂，这些LNP制剂是通过在实例6中描述的相似程序制备，并且表征如表2所示。LNP制剂含有0.4mg/kg eGFP mRNA，通过静脉尾静脉注射。在施用24小时后，将小鼠安乐死，并且提取以下器官：肝脏、脾、肺、肾和心脏。将器官收集在冷冻小瓶中并骤冻。在24小时时，在小鼠器官中的eGFP表达水平如图8(肝脏)、图9(脾)、图10(肺)、图11(肾)和图12(心脏)所示。
表2.LNP制剂的表征
组织匀浆化
器官/组织匀浆化和细胞裂解在ELISA前进行。简而言之，将器官/组织在冰上解冻，并且用1x DPBS漂洗以除去任何血液。将器官/组织切成大约100-200mg切片，并且转移至含有具有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(赛默飞世尔公司(ThermoFisher)78445)的0.5-1mL用冰冷却的1X细胞提取缓冲液PTR(来自ELISA试剂盒ab171581)和5mm不锈钢珠(凯杰公司(Qiagen))的2mL管中。在设置为频度为301/s的组织研磨仪(Tissue Lyser II)(凯杰公司)中，将器官/组织样品匀浆化3分钟，并且接着将其转移至干净管中，并且在冰上孵育20分钟。接着在4℃下，在18000x g下，将样品离心20分钟，并且将澄清匀浆转移至干净管中，将其等分并在-80℃下贮藏直至进一步使用。
通过体外ELISA量化在器官中的eGFP
根据制造商说明使用GFP SimpleStep试剂盒(ab171581)测量在肝脏、脾、肺、肾和心脏中的eGFP表达水平。在使用前，所有试剂平衡至室温。制备如下缓冲液：具有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(赛默飞世尔公司78445)的1X细胞提取缓冲液PTR、1X洗涤缓冲液PT、1X抗体稀释剂、抗体混合物和EGFP标准曲线。其中需要将组织匀浆进一步稀释，在用冰冷却的1x细胞提取缓冲液PTR中进行。接着，将50μl稀释的样品和eGFP标准品添加至相应孔中，随后添加50μl抗体混合物。接着将板密封，并且在室温下在设置为400rpm的板振荡器中孵育1h。孵育之后，将每个孔用350μl的1X洗涤缓冲液PT洗涤3次。最终洗涤步骤之后，通过用干净纸巾吸干板，将过量脂质除去。接着将100μl的TMB底物添加至每个孔中，并且将板用铝箔覆盖并在设置为400rpm的板振荡器中孵育10分钟。最终，将100μl终止液添加至每个孔中，将板振荡1分钟，并且使用Envision微孔板检测仪(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))记录450nm处的吸光度。使用GraphPad Prism 9将eGFP标准曲线拟合至S形的4PL曲线，并且从该曲线外推ng eGFP蛋白质。
通过总组织蛋白将eGFP数量归一化，如按照制造商说明书通过BCA测定法(Pierce23225)确定的。简而言之，将25μl稀释的组织匀浆或BSA标准品添加至相应孔中，随后将200μl工作试剂添加至每个孔中，并且在板振荡器中将内容物快速混合30s。接着将板覆盖并在37℃下孵育30分钟。将板冷却至室温之后，使用Envision微孔板检测仪(珀金埃尔默公司)记录562nm处的吸光度。从BSA标准曲线外推总蛋白(mg)。以平均ng eGFP/mg组织蛋白±SD记录数据。
实例9.对小鼠在体内静脉施用hEPO和荧光素酶mRNA的LNP组合制剂
含有hEPO和荧光素酶mRNA的脂质纳米颗粒(LNP)制剂的制备：
通过将溶解在无核酸酶水中的mRNA、100mM柠檬酸盐缓冲液(pH 3)和无核酸酶水混合以得到50mM柠檬酸盐溶液，将hEPO(人类EPO)mRNA和荧光素酶mRNA(购自TriLink生物技术公司)溶液以1:1比例在柠檬酸盐缓冲液中混合。通过在实例6中描述的相似程序，用四种不同的脂质组分制备乙醇中的脂质溶液(99.5％)：可离子化的脂质，即MC3或化合物2或化合物3；胆固醇(西格玛-奥德里奇公司)；DSPC(二硬脂酰磷酯酰胆碱，阿凡提极性脂质公司(Avanti Polar Lipids))；和DMPE-PEG2000(二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚(乙二醇)2000，日本油脂株式会社(NOF Corporation))。LNP的表征如表3所示。在所有实验中，脂质的总浓度为12.5mM。将mRNA和脂质溶液在NanoAssemblr(精度纳米系统公司，温哥华，不列颠哥伦比亚省，加拿大)微流体混合系统中以Aq:EtOH＝3:1的混合比和12mL/min的恒定流速混合。在混合时，可离子化的脂质和mRNA链上的磷原子的摩尔比等于6。弃去制备的第一个0.2-0.35mL和最后0.05-0.1mL的LNP悬浮液，同时收集剩余体积作为样品级分。将样品体积立即转移到Slide-a-lyzer G2透析盒(10000MWCO，赛默飞世尔科技公司)，并在4℃对PBS(pH 7.4)透析过夜。PBS缓冲液的体积为样品级分体积的500-1000倍。次日，用注射器和针头将样品从盒中取出。接着用0.2um注射器过滤器替换针头，并且在无菌管中将样品过滤消毒。从这一样品中将10μl用990μl PBS缓冲液(pH7.4)稀释，并用于测量Malvern ZetaSizer(ZetaSizer Nano ZS，马尔文仪器有限公司，韦斯特伯鲁(Westborough)，马萨诸塞州(MA)，美国(USA))上的强度平均粒度、和多分散指数(PDI)。使用破坏LNP的Triton-X100，通过Quant-it Ribogreen测定试剂盒(赛默飞世尔科技公司)测量最终mRNA浓度和包封效率百分比(％EE)。
表3.LNP制剂的表征
动物实验：
实验在野生型(WT)和LDLr基因敲除(KO)小鼠中进行。所有实验都是根据瑞典动物福利进行的，并且由瑞典哥德堡(Gothenburg,Sweden)的实验动物伦理委员会批准。内部培育相同数量的雄性和雌性C57bl6 LDLR-/-小鼠和其野生型同窝出生的幼仔。研究包括20只C57bl6 LDLR-/-小鼠和40只WT小鼠(对于每组，N≥5)。在平均体重为25g时使用动物。将动物置于限制装置中并静脉注射上文所述的在LNP中组合配制的0.15mg/kg hEPO mRNA+0.15mg/kg Luc mRNA(0.3mg/kg总mRNA)或者注射PBS作为对照。在处死前，在t＝6h时通过尾静脉出血，并在t＝24h时通过眼眶神经丛出血，在EDTA管中收集血液样品。在杀死小鼠前20分钟时，对小鼠皮下注射5mg/kg荧光素底物(来自珀金埃尔默公司(PerkinElmer)的RediJect D-荧光素生物发光底物)。杀死小鼠之后立即收集心脏、肺、脾和肝脏，并且使用IVIS Spectrum(珀金埃尔默公司)成像。使用LivingImage(珀金埃尔默公司)将来自每个器官的总发光量化。所得IVIS成像如图14所示。在hEPO分析中，将血液样品旋转沉降，并且使用人类促红细胞生成素Quantikine IVD ELISA试剂盒(R&D系统公司(R&DSystem))以分析血浆。数据记录为hEPO(单位为ng/ml)，并且将样品一式三份进行分析。图13显示了静脉施用包含MC3、化合物2和化合物3的LNP制剂之后24小时时WT和KO小鼠肝脏中荧光素酶蛋白质的表达，同时图15显示了静脉施用包含MC3、化合物2和化合物3的LNP制剂之后6小时时WT和KO小鼠血浆中hEPO蛋白质浓度。
实例10.对小鼠在体内纹状体内施用荧光素酶mRNA的LNP制剂
通过在实例6和9中描述的相似程序，制备含有荧光素酶mRNA的MOD5和化合物5(AZ8608)LNP制剂，其中脂质组分是MOD5/胆固醇/DSPC/DMPE-PEG＝50/38.5/10/1.5mol％；和化合物5/胆固醇/DSPC/DMPE-PEG＝42.5/40/16/1.5mol％。LNP的表征如表4所示。
通过标准随机整合基因添加基因转移，产生含有环化重组酶(Cre)可诱导的荧光素酶表达盒的内部产生的报告基因小鼠(LoxP Luc)。施用LNP前，用异氟醚4.0/1.5O2 i将LoxP Luc报告基因小鼠麻醉。在颈皮肤下，用胰岛素注射器(BD U-100)，对小鼠皮下注射2单元(20μl)稀释的Comforion Vet(10mg/ml；100μg/小鼠)。接下来将毛皮刮除，并且在将动物放置在具有加热垫的立体定位台之前，用Descutan拭子(4％氯己定)洗涤颅骨。将小鼠适当固定，将颅骨调节至水平位置，并且将其用在颅骨上方具有开孔的塑料薄膜覆盖。在手术期间，在计算正确坐标之后，干燥前囟点周围区域，然后将钻放置在这一位置，在颅骨正中线进行6-8mm的切割。在正中线的每一侧，在颅骨骨骼上钻出一个或两个小洞，并且用Hamilton注射器将泵固定至立体定位仪(stereotax)。将注射器放置在钻孔上方，缓慢下降至合适深度，并且以0.5μl/min流量注入泵速率将5μl的LNP溶液注入每个孔中。通过2次注射(5mL/小鼠)，对小鼠局部脑纹状体(每半球注射一次)中给药1.7mg RNA(Cas9 mRNA/gRNA1/gRNA250/25/25w/w)。每次注射之后，在缓慢升高注射器并移除泵和注射器之前，将注射器保持3分钟。为了闭合钻孔上的皮肤，使用2-3缝线(缝线Polysorb 6-0)和沿着切口放置的组织胶。每日观察和称量动物。对其恢复过程和伤口愈合密切关注3-5天。7天之后，进行两个半球的体外脑荧光素酶分析。图16示出了纹状体内施用包含MOD5和化合物5的LNP制剂之后LoxP Luc报告基因小鼠的皮质和纹状体平均Luc表达水平。
表4.LNP制剂的表征
蛋白质提取和荧光素酶测定法
施用LNP一周后，将LoxP Luc报告基因小鼠处死，将完整的脑解剖，并且将纹状体和皮质分离、称量并放置在单独的管中，并将其冰冻直至进一步分析。为了测量LNP介导的功能递送水平，参照制造商建议使用凯杰(Qiagen)TissueLyser，从小鼠脑组织中提取蛋白质。用研杵将组织压碎并匀浆化，驱动并离心以从悬浮液中除去不可溶的组织碎屑。将上清液转移到分离管中，并且通过考马斯亮蓝(Bradford)测定实验确定蛋白质浓度。对于荧光素酶测定法，将20μl每份上清液添加至微量培养板(白色OptiPlate-96)中，并且将100μl的D-荧光素添加至每个孔中。将样品混合，并在发光计中测量所得发光信号。将该发光信号归一化至组织重量。
Claims (30)
1.一种具有式(I)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中a和b各自独立地是3、4或5；c和d各自独立地是1、2或3；e和f各自独立地是0、1或2；X1是亚甲基或
X2是亚甲基或
g和h各自独立地是1、2或3；
i和j各自独立地是0、1或2；
Y1和Y2各自独立地是直链C7-10烷基、直链C7-10烯基或
Z1和Z2各自独立地是直链C7-10烷基、直链C7-10烯基或
R1和R2各自独立地是直链C7-10烷基；并且
R3和R4各自独立地是直链C7-10烷基。
2.如权利要求1所述的化合物，其中X1和X2都是亚甲基。
3.如权利要求1或2所述的化合物，其中a和b都是4；并且c和d都是2。
4.如权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中e和f都是0。
5.如权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中
Y1是直链C7-10烷基或直链C7-10烯基；
Y2是
并且
R1和R2各自独立地是直链C7-10烷基。
6.如权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中Y1和Y2各自独立地是
并且
R1和R2各自独立地是直链C7-10烷基。
7.如权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中e和f各自独立地是1或2。
8.如权利要求7所述的化合物，其中Y1和Y2各自独立地是
并且
R1和R2各自独立地是直链C7-10烷基。
9.如权利要求1至6和8中任一项所述的化合物，该化合物具有式(II)：
其中
k是0、1或2；
Y1是直链C7-10烷基、直链C7-10烯基或
Y2是
R1和R2各自独立地是直链C7-10烷基。
10.如权利要求1所述的化合物，其中X1是
并且
X2是
11.如权利要求10所述的化合物，其中a和b都是4；并且c和d都是2。
12.如权利要求10或11所述的化合物，其中e和f各自独立地是1或2。
13.如权利要求10至12中任一项所述的化合物，其中g和h都是2。
14.如权利要求10至13中任一项所述的化合物，其中i和j都是1。
15.如权利要求10至14中任一项所述的化合物，其中Y1和Y2各自独立地是
并且
R1和R2各自独立地是直链C7-10烷基。
16.如权利要求1所述的化合物，该化合物选自：
8-(7-(8-(壬基氧基)-8-氧代辛基)-9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-基)辛酸十七烷-9-基酯；
(Z)-8-(7-(8-(壬-2-烯-1-基氧基)-8-氧代辛基)-9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-基)辛酸十七烷-9-基酯；
8-(7-(8-((3-辛基十一烷基)氧基)-8-氧代辛基)-9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-基)辛酸3-庚基十二烷基酯；
8,8'-(9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3,7-二基)二辛酸双(十七烷-9-基)酯；并且
3,3',3”,3”'-(((9-氧杂-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3,7-二基)双(丁烷-4,1-二基))双(氮杂三基))四丙酸四(2-辛基癸基)酯；
或其药学上可接受的盐。
17.一种脂质纳米颗粒，其包含如权利要求1至16中任一项所述的化合物，或其药学上可接受的盐。
18.如权利要求17所述的脂质纳米颗粒，进一步包含至少一种中性脂质、至少一种固醇以及至少一种聚合物缀合的脂质。
19.如权利要求18所述的脂质纳米颗粒，其中该中性脂质选自二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)或其组合。
20.如权利要求18或19所述的脂质纳米颗粒，其中该固醇是胆固醇。
21.如权利要求18、19和20中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中该聚合物缀合的脂质选自DMPE-PEG2000、DPPE-PEG2000、DMG-PEG2000、DPG-PEG2000、PEG2000-c-DOMG、PEG-C-DOPG或其组合。
22.如权利要求17至21中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中该脂质纳米颗粒进一步包含二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇、以及DMPE-PEG2000。
23.如权利要求17至22中任一项所述的脂质纳米颗粒，其进一步包含治疗剂。
24.如权利要求23所述的脂质纳米颗粒，其中该治疗剂是核酸区段。
25.如权利要求24所述的脂质纳米颗粒，其中该核酸区段是RNA。
26.如权利要求25所述的脂质纳米颗粒，其中该RNA是经修饰的mRNA。
27.一种药物组合物，其包含多个如权利要求23至26中任一项所述的脂质纳米颗粒。
28.一种用于治疗受试者的疾病或障碍的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的如权利要求27所述的药物组合物。
29.如权利要求28所述的药物组合物用于治疗疾病或障碍的用途。
30.如权利要求27所述的药物组合物，用于在治疗疾病或障碍中使用。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US63/271960 | 2021-10-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118119627A true CN118119627A (zh) | 2024-05-31 |
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| PB01 | Publication |