CN118112244A - 一种nse抗体包被磁珠的保存液及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种NSE抗体包被磁珠的保存液及制备方法，本发明公开的保存液的组分包括纯化水，水溶性无机盐，保护蛋白，醇乙氧基类表面活性剂，防腐剂，缓冲盐，保存液的pH值为7.0～7.5；本发明的组分中不使用多糖、多元醇、高分子聚合物等物质做增稠剂，可以得到能使磁珠长期分散均匀并长期保持磁珠包被抗体的活性的保存液；将保存液作为作为工作液使用，不仅简化的磁珠使用的操作流程，避免在加热清洗过程中对包被抗体活性的破坏，更重要的是本发明对检测结果的准确性有积极影响，可以提高检测结果的线性相关程度。
Description
技术领域
本发明属于化学发光免疫分析领域，涉及抗体包被磁珠的保存液及制备方法，尤其涉及一种NSE抗体包被磁珠的保存液及制备方法。
背景技术
神经元特异性烯醇化酶(以下简称为“NSE”)是一种参与糖酵解途径的烯醇化酶，存在于神经组织和神经内分泌组织中，其中，NSE在脑组织细胞的活性最高，在外周神经和神经分泌组织中的活性水平居中，最低值见于非神经组织、血清和脊髓液。
NSE被认为是监测小细胞支气管癌的首选标志物，有研究表表明60％～81％小细胞支气管癌病例NSE浓度升高。近年来还发现NSE的检测可用于与神经内分泌组织起源的肿瘤相关，例如NSE是神经母细胞瘤的标志物，其灵敏度高达90％以上，当发病时NSE水平明显升高，有效治疗后降低，复发后又升高。所以，针对血清中NSE的检测对肿瘤的辅助诊断、鉴别诊断、疗效观察、复发监测以及预后评估具有重要的价值。在临床上，常用化学发光免疫分析法进行NSE的检测，特别是磁微粒化学发光法，常用免疫磁珠进行检测。
免疫磁珠，对具有超顺磁性的微粒表面进行化学修饰，使之与特异性抗体牢固结合，成为能捕获特异性抗原的磁珠。在检测时，将免疫磁珠与待测溶液混合，如有相应抗原存在，免疫磁珠就会将其捕获，形成抗原-免疫磁珠复合物，并在适当的磁场条件下分离出来，达到富集目标抗原的目的。因其制备过程较为复杂，无法在检测时现场制备，所以需要将制备好的免疫磁珠在一定条件下保存备用。一般的，为避免磁珠表面干燥导致磁珠聚集，进而导致包被抗体失活，需要将磁珠均匀地分散在保存液中，并于2℃～8℃的温度下保存。
免疫磁珠保存液一般以水作为溶剂，为了使磁珠均匀分散且维持包被抗体的稳定，还需要添加稳定剂、增稠剂、无机盐、缓冲盐等功能性的组分。其中，稳定剂一般常选用牛血清白蛋白、酪蛋白和牛血清等与抗体无关的蛋白，以提高保存液体系中的蛋白浓度(浓度大于1g/L蛋白不易降解)，防止抗体蛋白降解；增稠剂一般需要将氨基酸及蛋白、糖类、多元醇、高分子聚合物及表面活性剂等多类物质混合使用，目的是为了保证在2℃～8℃温度下保存液体系为凝胶状态、半固体状态或固体状态，从而磁珠可以均匀地分散于系统中，避免磁珠团聚。但是，这就为磁珠使用时的分离和清洗带来一定阻碍，甚至在分离过程中还需要加热，一定程度上损害了抗体蛋白的稳定性并影响检测结果的精确度。不仅如此，复杂的配方还提高了保存液的生产成本，进而提高了检验成本。
所以，需要在保证磁珠包被抗体的稳定性的前提下，对保存液的配方和组分进行优化改进，开发一种既可以降低成本，又能够简化磁珠分离操作的保存液。
发明内容
本发明的目的针对NSE抗体包被磁珠的保存液进行配方优化和改进，降低保存液生产成本，简化磁珠在使用时的分离操作。
本发明采用的技术方案提供了一种NSE抗体包被磁珠的保存液，关键在于，上述的保存液的组分包括纯化水，水溶性无机盐，保护蛋白，醇乙氧基类表面活性剂，防腐剂，缓冲盐；上述的保存液的pH值为7.0～7.5。
进一步的，上述的保存液中水溶性无机盐的浓度为15g/L～30g/L。
进一步的，上述的水溶性无机盐由镁盐和钠盐组成：上述的镁盐为氯化镁，上述的保存液中镁盐的浓度为10g/L～20g/L；上述的钠盐为氯化钠，上述的保存液中钠盐的浓度为5g/L～10g/L。
更进一步的，上述的保护蛋白的种类为牛血清白蛋白、酪蛋白水解物、明胶蛋白中的任意一种，上述的保存液中保护蛋白的浓度为5g/L～10g/L。
优选的，上述的醇乙氧基类表面活性剂的型号为Zetasperse179，上述的保存液中醇乙氧基类表面活性剂的浓度为1g/L～5g/L。
优选的，上述的缓冲盐为Tris缓冲盐，上述的保存液中缓冲盐的浓度为40mmol/L～80mmol/L。
更优的，上述的防腐剂由ProClin300和BND-10组成，质量比为1:1～1.5；上述的保存液中防腐剂的浓度为2g/L～5g/L。
具体的，上述的保存液于2℃～8℃的环境下冷藏，用于NSE抗体包被磁珠的保存。
一种NSE抗体包被磁珠的保存液的制备方法，用于制备上述的保存液，关键在于，具体步骤包括：
S1、称取纯化水，水溶性无机盐，保护蛋白，醇乙氧基类表面活性剂，防腐剂，缓冲盐；
S2、向纯化水中加入缓冲盐，搅拌至溶解后，加入水溶性无机盐，加入盐酸调整溶液pH值为7.0～7.5；
S3、依次加入并依次溶解保护蛋白、醇乙氧基类表面活性剂、防腐剂，均速搅拌至混合均匀；
S4、用纯化水定容，得到所述的保存液；
S5、将定容后的保存液用0.45μm的滤膜过滤后，密封放置于2℃～8℃的环境下贮存，待使用时取出。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明的保存液在磁珠的常规贮存条件下，即2℃～8℃，为磁微粒悬浮液，可以使磁珠均匀的悬浮分散在保存液体系中，保存12个月后也不会发生团聚、染菌变质等现象。
本发明保存液的性质稳定，在37℃的加速稳定性条件下，考察7天后检测RLU的偏差仍小于6.0％；在常规贮存条件(以4℃为例进行试验)下考察12个月后，检测RLU的偏差小于4.0％，均能够满足行业标准(《神经元特异性烯醇化酶定量标记免疫分析试剂盒》，标准号为YY/T1262-2015)对检测偏差的要求。
不仅如此，本发明保存液的组分简单，所用的表面活性剂Zetasperse179是一种新型的醇乙氧基类的非离子表面活性剂，70％的活性单体，可在功能性固体化学品的水分散体中提供理想性能，具有很好的消泡性和抑泡性，以空间位阻稳定方式来实现水性分散体的分散稳定，提供显著的润湿和空间稳定效果，使配方达到高水平性能。该表面活性剂目前仅作为涂料的分散剂、湿润剂使用。本发明首次将该类表面活性剂应用于免疫磁珠的保存液中，并选择了适宜的无机盐、保护蛋白，使得本发明的组分中可以不使用多糖、多元醇、高分子聚合物等物质做增稠剂，就可以得到能使磁珠长期分散均匀并长期保持磁珠包被抗体的活性的保存液。
本发明优化了保存液的配方、降低了保存液的生产成本。同时，在使用本品保存的磁珠时，不用经过加热使附着在磁珠上的固体或者凝胶状的保存液融化，也不用反复清洗，可以直接将保存液作为工作液使用，不仅简化的磁珠使用的操作流程，避免在加热清洗过程中对包被抗体活性的破坏，更重要的是本发明对检测结果的准确性有积极影响，可以提高检测结果的线性相关程度。
附图说明
图1是37℃下7天后磁珠在本发明保存液中的状态(以实施例一为例)。
图2是37℃下7天后磁珠在对比例保存液中的状态(以对照品1-1为例)。
附图中1为分散状态良好的磁珠，2为发生团聚的磁珠。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体条件者，可按照常规条件的进行；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例一～实施例四
S1、按表1称取水溶性无机盐即氯化镁和氯化钠，保护蛋白，醇乙氧基类表面活性剂即Zetasperse179(品牌：赢创)，防腐剂即ProClin300和BND-10，Tris缓冲盐，并量取体外诊断试剂用纯化水；
S2、在烧杯中加入体外诊断试剂用纯化水，加入Tris缓冲盐，搅拌至缓冲盐充分溶解后，再加入氯化镁和氯化钠，搅拌至溶解，滴加盐酸将溶液pH值调整到表1中记录的范围；
S3、依次加入保护蛋白、Zetasperse179、ProClin300和BND-10，边加入边均速搅拌，一种物质溶解后再加下一个物质，充分混合；
S4、转移至1L的容量瓶中，用体外诊断试剂用纯化水定容，制备得到保存液样品，记作样品1～4；
S5、将定容后的保存液样品用0.45μm的滤膜过滤后，密封放置于2℃～8℃的环境下贮存，待检测或使用时取出。
表1：各实施例组分配比表
续表1：各实施例组分配比表
如图1所示，所制备的保存液与磁珠构成磁微粒悬浮液，NSE抗体包被磁珠均可以悬浮分散于上述各实施例所制备的保存液中。
对比例一
对比例一的保存液的制备过程同实施例，除不加入醇乙氧基类表面活性剂，其他组分的种类和用量同实施例一。
对比例1-1～1-3中分别加入2g的其他常用表面活性剂，分别为Zetasperse 3800(类型为乙烯基共聚物，品牌：赢创)、Triton X-100、吐温80，制备得到对照品1-1～1-3。
对比例二
对比例二的保存液的制备过程同实施例，除醇乙氧基类表面活性剂的用量不同，其他组分的种类和用量同实施例一。
对比例2-1和2-2中分别加入0.5g和10g的Zetasperse179，制备得到对照品2-1和2-2。
对比例三
对比例三的保存液的制备过程同实施例，除水溶性无机盐的种类和用量不同，其他组分的种类和用量同实施例一。
对比例3-1～3-4中分别加入10g氯化镁，5g氯化镁和3g氯化钠，20g氯化镁和10g氯化钾，20g氯化钠和10g氯化钾，分别制备得到对照品3-1～3-4。
对比例四
对比例四的保存液的制备过程同实施例，除保护蛋白的种类和用量不同，其他组分的种类和用量同实施例一。
对比例4-1和4-2中分别加入20g酪蛋白水解物，1g牛血清白蛋白，制备得到对照品4-1和4-2。
分析及测试
1、针对NSE抗体包被磁珠的保存液稳定性的试验
将待测保存液样品及对照品按表2配制为不同浓度梯度的溶液，第0天测试后，将该试剂混匀分为两组，一组于4℃，另一组于37℃，再在第7天测试，两组进行对比。记录测定的相对光单位(以“RLU”表示)并计算各测试结果相对于0时的偏差，结果参见表2。
将待测保存液样品按表3配制不同浓度梯度的溶液，将该试剂混匀分为四组，放入4℃的恒温箱中进行考察周期为12个月的长期稳定性试验(测试点为0时、3个月、6个月和12个月)，每个测试点使用溶液测试同一样本，记录测定的相对光单位(以“RLU”表示)并计算各测试结果相对于0时的偏差，结果参见表3。
表2：不同浓度的保存液样品及对照品的加速稳定性试验结果
表3：不同浓度的保存液样品的长期稳定性试验结果
注：表3个浓度待测样品相对应的0时的RLU值同表2。
由表2结果可见，本发明各待测样品的保存液在各浓度梯度下进行加速稳定性试验，37℃下7天后检测RLU的偏差均小于6.0％，远低于各对照品，说明保存液在37℃下的稳定性与所加入的表面活性剂种类及浓度，无机盐的种类和浓度以及所用保护蛋白的浓度均有关系，是上述因素协同作用的结果。此外，如图1所示，37℃下7天后本发明的保存液中磁珠分散性仍然很好，没有发生聚集现象，磁珠形态保持好，而对照品中磁珠发生了不同程度的聚集(参见图2)。
由表3结果可见，本发明各待测样品的保存液在各浓度梯度下进行长期稳定性试验，考察12个月时检测RLU的偏差均小于4.0％，可见本发明的保存液的稳定性好，没有出现发光值大幅度下降的问题，保存液在12月后也没有磁珠团聚、染菌变质等现象。
2、保存液的使用效果检测
因本发明制备的保存液为水溶性的悬浮液，在使用时无需通过加热使附着在磁珠上的固体或者凝胶状保存液融化，也无需反复清洗。
为了研究将本发明作为保存液应用后，在使用磁珠时保存液的残留是否对检验产生影响这一问题，将保存液作为NSE抗体包被磁珠的工作液使用，以常用的NSE抗体包被磁珠的工作液作为对照组，从以下角度进行了分析及测试：
常用的NSE抗体包被磁珠的工作液组分为：
MES一水合物(VETEC公司)12.66g/L，氢氧化钠(片状)1.80g/L，氯化钠9.0g/L，酪蛋白钠盐5.0g/L，蔗糖7.0g/L，Triton X-100 20.0g/L，PC-300 1.0g/L。
(1)选用一阴性样本和一临界样本进行测试得试剂信噪比，结果参见表4。
表4：不同浓度的保存液样品的信噪比对比
(2)磁珠试剂为本发明的保存液稀释NSE抗体包被磁珠后的工作液搭配吖啶标记物组成NSE化学发光试剂，进行线性梯度测试，结果参见表5。
表5：不同保存液样品的线性对比
由表4和表5结果可见，将本发明制备的保存液直接作为工作液使用，信噪比结果与常用的工作液接近，均能达到6.3以上；所有样品的线性回归系数均高于0.993，均高于常用工作液，本发明的线性情况优于常用的工作液。可见，可以直接将本发明作为工作液使用，对检验结果的准确度有积极的影响，表现为提高了检验结果的线性。
Claims (9)
1.一种NSE抗体包被磁珠的保存液，其特征在于，所述的保存液的组分包括纯化水，水溶性无机盐，保护蛋白，醇乙氧基类表面活性剂，防腐剂，缓冲盐；所述的保存液的pH值为7.0～7.5。
2.根据权利要求1所述的一种NSE抗体包被磁珠的保存液，其特征在于，所述的保存液中水溶性无机盐的浓度为15g/L～30g/L。
3.根据权利要求1或2任一项所述的一种NSE抗体包被磁珠的保存液，其特征在于，所述的水溶性无机盐由镁盐和钠盐组成：所述的镁盐为氯化镁，所述的保存液中镁盐的浓度为10g/L～20g/L；所述的钠盐为氯化钠，所述的保存液中钠盐的浓度为5g/L～10g/L。
4.根据权利要求1所述的一种NSE抗体包被磁珠的保存液，其特征在于，所述的保护蛋白的种类为牛血清白蛋白、酪蛋白水解物、明胶蛋白中的任意一种，所述的保存液中保护蛋白的浓度为5g/L～10g/L。
5.根据权利要求1所述的一种NSE抗体包被磁珠的保存液，其特征在于，所述的醇乙氧基类表面活性剂的型号为Zetasperse179，所述的保存液中醇乙氧基类表面活性剂的浓度为1g/L～5g/L。
6.根据权利要求1所述的一种NSE抗体包被磁珠的保存液，其特征在于，所述的缓冲盐为Tris缓冲盐，所述的保存液中缓冲盐的浓度为40mmol/L～80mmol/L。
7.根据权利要求1所述的一种NSE抗体包被磁珠的保存液，其特征在于，所述的防腐剂由ProClin300和BND-10组成，质量比为1:1～1.5；所述的保存液中防腐剂的浓度为2g/L～5g/L。
8.根据权利要求1所述的一种NSE抗体包被磁珠的保存液，其特征在于，所述的保存液于2℃～8℃的环境下冷藏，用于NSE抗体包被磁珠的保存。
9.一种NSE抗体包被磁珠的保存液的制备方法，用于制备如权利要求1所述的保存液，其特征在于，具体步骤包括：
S1、称取纯化水，水溶性无机盐，保护蛋白，醇乙氧基类表面活性剂，防腐剂，缓冲盐；
S2、向纯化水中加入缓冲盐，搅拌至溶解后，加入水溶性无机盐，加入盐酸调整溶液pH值为7.0～7.5；
S3、依次加入并依次溶解保护蛋白、醇乙氧基类表面活性剂、防腐剂，均速搅拌至混合均匀；
S4、用纯化水定容，得到所述的保存液；
S5、将定容后的保存液用0.45μm的滤膜过滤后，密封放置于2℃～8℃的环境下贮存，待使用时取出。
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