CN118104690A - 一种包含蜡样芽孢杆菌BcSc和茶饼粉的组合物及其应用 - Google Patents
一种包含蜡样芽孢杆菌BcSc和茶饼粉的组合物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种包含蜡样芽孢杆菌BcSc和茶饼粉的组合物，包含如下重量分的成分：蜡样芽孢杆菌BcSc 100‑300份、茶饼粉150‑450份；所述蜡样芽孢杆菌BcSc菌种保藏号为CGMCC NO.28028。所述组合物能有效提高花生出苗率，预防花生苗期病害和地下害虫效果。茶饼粉与蜡样芽孢杆菌孢子完全相容，对孢子萌发无影响，茶饼粉中含有脂肪、蛋白、茶皂素等成分，可提高蜡样芽孢杆菌粉剂施用时在靶标上的润湿性能、附着性能，同时为蜡样芽孢杆菌的孢子萌发提供营养物质，提高蜡样芽孢杆菌在花生种上的附着率，从而提高预防效果。
Description
技术领域
本发明属于农业领域，具体涉及一种包含蜡样芽孢杆菌BcSc和茶饼粉的组合物及其应用。
背景技术
蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)是一种对植物真菌、细菌性病害有抑制作用的病原细菌，可广泛应用于植物根、茎、叶、花以及果蔬上病害防治，代谢产物吲哚乙酸能促进植物生长，由于蜡样芽孢杆菌对病害的防治效果较为良好，且不会对环境和人体造成危害，因此越来越受到人们的重视。目前国内登记的以蜡样芽孢杆菌为有效成分的农药品种有10个，应用于水稻、番茄、西瓜、黄瓜、烟草、草莓等多种作物的真菌、细菌性病害的防治。
与化学农药相比，生物制剂剂型单一且生物活性易受环境影响，工作效率低等缺点。孢子在生产和保存过程中存在消解或使用时无法充分萌发等风险，从而导致产品生物制剂防效低、效果不稳定等。茶饼粉中含有11-13％的皂苷类物质、11-17wt％的粗蛋白、5-7wt％的粗脂肪、3-5wt％的矿物质和24-35wt％的易水解多糖，是一种天然的表面活性剂，具有湿润速度快，分散能力强的特性，可提高孢子在植物上附着力，增加芽孢杆菌对某些植物细菌、真菌病害的防效。
根腐病是花生苗期上主要病害，由花生种子和土壤带菌，从苗期到结荚期均能发病，引起植株萎蔫死亡。根腐病是我国花生主要病害之一，也是我国花生低产重要原因之一。地下害虫在花生苗期至收获期均能造成危害，严重影响了花生的产量和质量。目前国内花生种衣剂仍以化学农药为主，国内也有报道选用解淀粉芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、真菌生防菌+化学农药杀虫剂对花生进行拌种防治根腐病。
本领域开发的蜡样芽孢杆菌BcSc+茶饼粉是一种单纯的花生生物种衣剂，具有良好的安全性，并且具有较高的防效。
发明内容
本发明涉及一种包含蜡样芽孢杆菌BcSc和茶饼粉的组合物及其应用。本发明所述蜡样芽胞杆菌分离自舒城县茶园土壤，经过室内毒力测定发现了对花生根腐病及蛴螬、地老虎等地下害虫具有一定的生物活性的蜡质芽孢杆菌菌株，命名为BcSc，于2023年7月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号为CGMCC NO.28028。
该菌株由安徽省合肥高尔生命健康科学研究院有限公司药效室团队从舒城县茶园土壤里分离鉴定获得。具体测序结果如下：
ITS序列：
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ACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATC
TCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGA
ATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACA
CACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTT
TGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGA
针对筛选到的高效菌株，以提高该蜡质芽孢杆菌孢子萌发、提高孢子在作物上的附着性和有效定殖为基本目的，添加茶饼粉，制备成稳定的蜡质芽孢杆菌BcSc粉剂，从而提高蜡质芽孢杆菌BcSc粉剂对花生病虫害的防治效果，应用于预防和防治花生根腐病和地下害虫，用于促进花生种子发芽、提高花生出苗率、提高花生鲜重和保苗率的用途。
针对现有技术的不足，本申请的目的之一是提供一种促进种子发芽、预防花生苗期根腐病和地下害虫的方法，具体技术方案如下：
(1)将蜡样芽孢杆菌BcSc粉剂和茶饼粉分散在水中得到种衣剂；蜡样芽孢杆菌BcSc粉剂和茶饼粉在水中的分散比例使得所述种衣剂中，蜡样芽孢杆菌BcSc与茶饼粉组合物拌100Kg花生种子用量(a)蜡样芽孢杆菌BcSc100-300g+茶饼粉200g/100Kg花生种,(b)蜡样芽孢杆菌BcSc150 g+茶饼粉250-450g/100Kg花生种。
(2)将所述生物种衣剂均匀拌在花生种子表面。
本申请提供的促进种子发芽预防花生苗期根腐病和地下害虫的方法中，利用蜡样芽孢杆菌产生的孢子萌发分布到花生种子表面中起到占位作用，阻止土壤中根腐病菌丝对花生种子浸染，抑制花生种子上的根腐病孢子萌发，而茶饼粉中含有脂肪、蛋白、茶皂素等成分，其能够提高所述蜡样芽孢杆菌在种子上的附着性，同时为蜡样芽孢杆菌孢子萌发提供营养物质，茶皂素对地下害虫也有一定的防效。
需要说明的是，本领域中，高浓度、高纯度的茶皂素对于细菌、真菌和地下害虫具有抑制作用，而以茶饼粉的方式加入茶皂素等皂苷类物质，则不会带来对蜡样芽孢杆菌的抑制，反而能够提高蜡样芽孢杆菌的杀菌活性。这可能是因为，一方面茶皂素的浓度和纯度被茶饼粉其他物质稀释了，降低了其对于蜡样芽孢杆菌的抑制性；另一方面，茶饼粉的蛋白、脂肪等营养物质为蜡样芽孢杆菌提供了生长环境，也抵消了皂苷类物质的抑制作用；第三，皂苷类物质增加了的分散性和附着性，使其在种子表面均匀性提高，提高了对根腐病的防控效果。
优选地，所述蜡样芽孢杆菌BcSc粉剂孢子浓度为100亿孢子/克等。
优选地，所述蜡样芽孢杆菌BcSc粉剂通过固体发酵所得。
本申请所述的蜡样芽孢杆菌粉剂通过下述方法获得。
优选地，所述蜡样芽孢杆菌BcSc通过如下方法制备得到：
(a)从舒城县舒茶镇“九一六”茶园采集土壤，在马铃薯、葡萄糖、玉米粉、黄豆粉、琼脂培养基上进行分离培养，获得蜡样芽孢杆菌的菌株；
(b)对蜡样芽孢杆菌菌株进行扩繁培养，得到蜡样芽孢杆菌二级菌种。所述粉剂培养基新鲜马铃薯20％，15％玉米粒、15％的黄豆粉，5％蔗糖，水45％，高温消毒冷却后，培养料放到经过消毒的容器中；一层二级菌种铺一层培养料，然后放到培养箱发酵，发酵温度36-37℃，湿度80％，时间72小时。需要说明的是，本申请所述分离培养后，蜡样芽孢杆菌BcSc固体培养的蜡样芽孢杆菌粉剂孢子在100亿孢子/克以上。
优选地，所述分离培养分离培养温度为36-37℃，分离培养时间为72h。
优选地，所述茶饼粉通过将油茶茶饼粉碎得到。
优选地，所述茶饼粉的颗粒为1-10μm。
优选地，将油茶籽仁进行热榨或冷榨后得到油茶粕，将所述油茶粕压饼脱水后得到所述油茶茶饼。
热榨或冷榨后得到油茶粕，压饼之后的茶饼含有的粗蛋白、粗脂肪含量更高，更容易作为蜡样芽孢杆菌的萌生或孢子生长的营养。
优选地，所述油茶茶饼粉中含有11-13wt％的皂苷类物质、11-17wt％的粗蛋白、5-7wt％的粗脂肪、3-5wt％的矿物质和24-35wt％的易水解多糖。
上述油茶茶饼粉的组成既能够提高蜡样芽孢杆菌BcSc的分散性，又能够促进所述蜡样芽孢杆菌BcSc的孢子产出和菌丝生长，且皂苷类物质对蜡样芽孢杆菌BcSc的抑制性也不明显。
作为优选技术方案，步骤(1)“将蜡样芽孢杆菌BcSc扩增液和茶饼粉分散在水中，得到种衣剂”可以按照如下步骤进行：
(1a)将茶饼粉分散在少量水中，得到茶饼粉水分散液；
(1b)将茶饼粉水分散液加入蜡样芽孢杆菌粉剂，得到种衣剂。
优选地，步骤(1a)茶饼粉水分散液先进行超声预处理，然后进行步骤(1b)。
优选方案中，将茶饼粉水分散液在超声条件下进行预处理，可以将蛋白的二级或三级结构展开，暴露出亲油基团和亲水基团，提高茶饼粉中蛋白的水分散性，尤其是在茶饼粉中还含有部分的皂苷类物质，在超声作用下更加提高了蛋白的分散性，进而提高蜡样芽孢杆菌对蛋白的利用率；此外，由于处理后的茶饼粉水分散液中的蛋白也暴露了亲油基团，能够提高与脂肪的结合性，即一定程度上也增加了脂肪的水溶性，且能够拉近脂肪和蛋白的距离，也能够提高蜡样芽孢杆菌菌对脂肪和蛋白的利用率。选用超声对茶饼粉水分散液进行预处理，然后与从土壤中分离培养的蜡样芽孢杆菌BcSc复配，配制成花生种衣剂，经室外试验，能有效控制花生根腐病和地下害虫发生为害，具有明显的保苗效果。
优选地，在步骤(1)完成后，1d以内进行步骤(2)。
步骤(1)完成后，较快进行步骤(2)，上述生物种衣剂拌好种子后，室内凉干下地，减少种衣剂水分和皂苷类物质挥发，提高芽孢杆菌孢子萌发率，以及皂苷类物质对地下害虫防控效果。
本申请目的之二是提供一种蜡样芽孢杆菌的培养方法，所述培养方法包括如下步骤：
(a)从茶园采集土壤，在马铃薯、蔗糖、玉米粉、黄豆粉、琼脂培养基上进行分离培养，获得蜡样芽孢杆菌的菌株；
(b)对蜡样芽孢杆菌BcSc的菌株进行扩繁培养，得到蜡样芽孢杆菌BcSc二级菌种。所述粉剂培养基为新鲜马铃薯20％，15％玉米粒、15％的黄豆粉，5％蔗糖，45％的水，高温消毒冷却后，培养料放到经过消毒的容器中，一层二级菌种铺一层培养料，然后放到培养箱发酵，发酵温度36-37℃，湿度80％，时间72小时。优选地，分离、发酵培养温度为36-37℃，培养时间为72h。
本申请提供的蜡样芽孢杆菌BcSc的培养方法获得的蜡样芽孢杆菌扩繁料对花生种子发芽、幼苗生长和防控根腐病具有特异性作用。
与现有技术相比，本申请具有如下有益效果：
(1)本申请提供的花生种子生物种衣剂，利用蜡样芽孢杆菌BcSc发酵中产生的腐殖酸、吲哚乙酸等多种促进植物生长物质，可提高种子萌发率，促进幼苗生长作用。花生种子表面上芽孢杆菌孢子萌发起到占位作用，阻隔土壤里根腐病对花生侵染，抑制了种子根腐病孢子萌发。而茶饼粉中含有脂肪、蛋白、茶皂素等成分，其能够提高所述蜡样芽孢杆菌在水中的分散性和在种子表面附着性，同时为蜡样芽孢杆菌的萌发提供营养物质，茶皂素本身具有杀虫防病作用，本申请提供的蜡样芽孢杆菌BcSc+茶饼粉作为花生种衣剂，室内花生发芽率到达90％以上，室外花生出苗率达85％以上，花生出苗后30d，对花生保苗率达到90％以上。
(2)本申请提供的蜡样芽孢杆菌BcSc的培养方法获得的蜡样芽孢杆菌扩繁料对花生发芽、幼苗生长、保苗具有特异性作用。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明的技术方案做进一步地的解释说明但应该说明的是，具体实施方式只是对本发明技术方案实质的一种具体化的实施和解释，不应该理解为是对本发明保护范围的一种限制。
实施例所用试剂和仪器均可以从市售商品购买，检测方法为本领域所熟知的常规方法。
培养例1
一种蜡样芽孢杆菌BcSc的培养方法，包括如下步骤：
(a)从茶园土壤中采样，在马铃薯、葡萄糖、玉米粉、黄豆粉、琼脂培养基上进行分离培养，获得蜡样芽孢杆菌的菌株；培养箱的光照强度≤5×104lx，培养温度为36-37℃，培养72h；
(b)对蜡样芽孢杆菌的菌株BcSc进行扩繁培养，得到蜡样芽孢杆菌二级菌种；液体发酵培养基按照20％新鲜马铃薯液、5％蔗糖、5％玉米粉、5％黄豆粉加1L水比例高温消毒，冷却后接分离菌种，在摇床上发酵培养，发酵培养温度36-37℃，转速156-159/s，二级菌种。所述扩繁的蜡样芽孢杆菌BcSc二级菌孢子浓度约为10亿孢子/mL。
培养例2
一种蜡样芽孢杆菌生物制剂的培养方法，包括如下步骤：
蜡样芽孢杆菌BcSc粉剂制备方法；扩繁料为扩繁培养基为新鲜马铃薯20％、15％玉米粒、15％的黄豆粉、5％蔗糖、45％的水高温消毒冷却后，培养料放到经过消毒的容器中，方法；一层二级菌种铺一层培养料，然后放到培养箱发酵，发酵温度36-37℃，湿度80％，时间72小时。所述扩繁培养在光照强度低于5×104lx的条件下进行。所述蜡样芽孢杆菌BcSc扩繁料中，孢子浓度约为100亿孢子/克。
实施方法
(1)室内发芽试验；实施花生品种；鲁花9号。把经过高温消毒的土放入D40×17cm塑料盆中，厚度12cm，土壤含水量60％。每个塑料盆摆放经过拌种的花生种子，每盆播100粒种子，用吸水纸覆盖种子表面，每天对吸水纸喷洒少量的水使其保持湿润状态。每个处理3个重复，然后放在室内培养，室温24-26±0.5℃，播种后第3天、4天、5天、6天调查每天发芽数，第7天调查总发芽数即发芽率，第10天调查每个处理的苗高、根长、鲜重。
(2)室外发芽与保苗效果试验
各处理拌好种子后凉干，然后室外播种，采用条播方式，每小区播300粒种子，每个处理三个重复，随机排列。播种20天后调查出苗率，30天后调查保苗效果。
实施例1
本发明的花生生物制剂种衣剂配方，每100Kg花生种子按下述方法配比：
制备方法：
(1)所述的蜡样芽孢杆菌BcSc孢子粉(100亿/克)，经固体发酵、粉碎，100目过筛所得。
(2)所述茶饼粉通过将冷榨的油茶茶饼粉碎，然后超声粉碎至2-8μm得到，经测定其中含有12.5wt％的皂苷类物质、16.5wt％的粗蛋白、6.8wt％的粗脂肪、4.2wt％的矿物质和28.2wt％的易水解多糖；
(3)将无菌水+琼脂煮沸，等琼脂完全溶化后，待温度降到35℃以下，将所得的茶饼粉水分散液、蜡样芽孢杆菌BcSc孢子粉倒入无菌水+琼脂溶液中，充分搅拌得花生生物种衣剂。
(4)每100Kg花生种子+1.5L清水，再加上述配比的生物种衣剂并充分均匀搅拌，凉干后播种。
实施例2
本发明的花生生物制剂种衣剂配方，每100Kg花生种子按下述方法配比
制备方法同实施例1。
实施例3
本发明的花生生物制剂种衣剂配方，每100Kg花生种子按下述方法配比
制备方法同实施例1。
实施例4
本发明的花生生物制剂种衣剂配方，每100Kg花生种子按下述方法配比
制备方法同实施例1。
实施例5
本发明的花生生物制剂种衣剂配方，每100Kg花生种子按下述方法配比
制备方法同实施例1。
实施例6
本发明的花生生物制剂种衣剂配方，每100Kg花生种子按下述方法配比
制备方法同实施例1。
对比例1
本发明的蜡样芽孢杆菌BcSc种衣剂配方，每100Kg花生种子按下述方法配比
蜡样芽孢杆菌BcSc孢子粉(100亿/克) 200克
琼脂 4.5克
无菌水 850ml
制备方法同实施例1(1.3.4)方法。
对比例2
植物源花生生物种衣剂配方，每100Kg花生种子按下述方法配比
茶饼粉 200克
琼脂 4.5克
无菌水 850ml
制备方法同实施例1(2.3.4)方法。
对比例3
植物源花生生物种衣剂配方，每100Kg花生种子按下述方法配比
制备方法参考培养例2和实施例1；
其中，蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)NY3，为已知菌株，参见专利文献CN106190932B，其菌种保藏号CGMCC NO.11962。
对比例4
以1.5L清水作为空白对照。
测试结果
1室内发芽试验：实施例(1-6)生物制剂和对比例(1-4)发芽试验，采用《农作物种子检验规程》(GB/T-3543.4－1959)中的方法进行，检测其室内发芽率和活力指数，试验结果见表1。
表1实施例和对比例对室内花生发芽的影响
从表1可以看出，本申请实施例提供的花生生物种衣剂，各实施例室内花生发芽率均达97％-98.67％，而对比例1-4室内发芽率分别为94.00％、90.67％、93.33％、89.67％。实施例提供的生物种衣剂活力指数均达129.55-146.79，而对比例1-4活力指数分别为123.98、115.35、118.10、110.08。说明生物种衣剂对花生发芽有明显的促进作用，尤其实例2发芽率为98.67％，活力指数为146.79，优于各实施例。
对各实施例的鲜重进行调查发现，实施例2的鲜重最高为5.05g，显著高于对比例和对比例；而生物种衣剂各实施例在苗长和根长方面无显著差异。综上所述，本方法中各实施例对花生发芽和鲜重具有一定的促进作用，明显对比例1-3农药种衣剂。
2室外发芽和保苗试验；参照《农药对作物安全性评价准则》(NY/T-1965.3－2013)对实施例生物制剂和对比制剂播种后15天调查出苗率，40天调查幼苗死亡株数，计算保苗率。试验结果见表2。
表2实施例和对比例室外花生出苗和保苗效果
从表2可以看出，本申请实施例提供的花生生物种衣剂，各实施例室外花生出苗率均达到86.00-92.33％，其中实施例2的出苗率为92.33％，高于其它各实施例；各实施例苗高在13.46-15.95cm之间，其中实施例2苗高为15.95cm，高于其它各实施例苗高；各实例保苗率均在93.21-95.86％之间，高于各对比例，其中实施例2和实施例3保苗率分别为96.68％和96.86％，高于其它各实施例、对比例保苗率，表明本方法中各实施例对花生的具有一定的保苗效果。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (5)
1.一种包含蜡样芽孢杆菌BcSc和茶饼粉的组合物，其特征在于，包含如下重量分的成分：蜡样芽孢杆菌BcSc 100-300份、茶饼粉150-450份；
所述蜡样芽孢杆菌BcSc的孢子量为100亿孢子/克；
所述蜡样芽孢杆菌BcSc于2023年7月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号为CGMCC NO.28028。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，组合物的剂型为种衣剂，还包含琼脂和无菌水。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述蜡样芽孢杆菌BcSc通过固体发酵得到。
4.根据权利要求1-3任一项所述的组合物用于促进作物种子发芽、提高作物鲜重和保苗率的用途，其特征在于，所述的作物为花生。
5.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，提高花生出苗率，预防花生苗期病害和地下害虫发生。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410137001.4A CN118104690A (zh) | 2024-01-31 | 2024-01-31 | 一种包含蜡样芽孢杆菌BcSc和茶饼粉的组合物及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
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