CN118104640A - 一种组织冻存保护液及其使用方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种组织冻存保护液及其使用方法与应用。本发明保护液，以质量百分数数计，包括：无酶水20％‑40％、甘油30％‑55％、DMSO5％‑15％和胎牛血清5％‑30％。本发明针对需特殊处理或需要严格取样时间等操作导致的无法活体寄送的样本，提供一种优于常规速冻保存和运输的方法，利用冻存保护液对组织细胞核及RNA进行一定程度的保护，方便下游单细胞核转录组测序使用及应用，不仅可以一定程度保持组织细胞核核膜完整性，还能够保护RNA，减轻冻融带来的RNA降解情况，得到高质量的植物单细胞转录组数据。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种组织冻存保护液及其使用方法与应用。
背景技术
随着单细胞转录组测序技术的发展，该技术在人和动物为主的医学领域已经得到广泛应用。现在，越来越多的植物领域的研究人员也陆续的开始将该技术应用于植物组织异质性、图谱、发育、抗逆、以及育种等方面的研究，但是
单细胞(原生质体)悬液制备的高要求限制性了该技术在植物组织领域的发展。很多需特殊处理或需要严格取样时间等操作导致无法活体寄送的样本，由于难以制备或无法制备高质量的单细胞(原生质体)悬液，而无法运用单细胞转录组技术解决生物学问题。
为此，植物单细胞核转录组技术应运而生，目前针对无法活体寄送样本问题的主流解决方法是常规速冻，但常规速冻时产生的冰晶会一定程度上破坏细胞核结构，特别是在含水量较多的植物组织中，导致植物组织细胞核核膜完整性降低，RNA大量泄漏最终导致数据背景偏高，细胞捕获数异常等一系列问题，影响最终数据分析结果。
发明内容
本发明提供一种组织冻存保护液及其使用方法与应用，用以解决现有技术中常规速冻会破坏植物组织细胞核结构的缺陷。
本发明提供一种保护液，以质量百分数数计，包括：无酶水20％-40％、甘油30％-55％、DMSO5％-15％和胎牛血清5％-30％。
优选的，包括甘油50％。
优选的，包括胎牛血清10％-30％。
优选的，所述保护液为冻存保护液。
根据所述的保护液，以质量百分数数计，包括：无酶水25％-35％、甘油45％-55％、DMSO 5％-15％和胎牛血清5％-15％；
优选的，包括无酶水26％-34％、甘油46％-54％、DMSO 8％-12％和胎牛血清8％-12％。
本发明还提供所述保护液的制备方法，无酶水20％-40％、甘油30％-50％、DMSO5％-15％和胎牛血清10％-30％，以上物质无顺序添加，轻度摇晃混合均匀。配置完成后-20℃保存，使用前4℃预冷。
本发明还提供所述保护液的使用方法，将新鲜组织与3.8-4.2℃，优选为4℃，的所述保护液混合。此处为保持样本在一种低温环境，减轻可能出现的RNA降解情况。
根据所述保护液的使用方法，将新鲜组织洗净后再与所述保护液混合，冰上孵育5分钟。
根据所述保护液的使用方法，利用无菌PBS或生理盐水洗净。
根据所述保护液的使用方法，将植物去掉保护液后(使用移液枪尽量吸除保护液，可以有少量剩余)，液氮速冻30min以上，再转移到-80℃保存或干冰寄送。
优选的，在样本常规速冻前，将其剪碎至0.5cm3的组织块，浸没在预冷的冻存保护液中，立即液氮速冻30min以上，再转移到-80℃保存或干冰寄送，样本经该方法处理后，细胞核膜完整性相对常规速冻有明显的提升，RNA降解水平较低。
优选的，本发明提供一种植物组织冻存保护液速冻保存或运输的方法，包括以下步骤：
A新鲜组织从活体取下，要求组织量至少为400mg；
B去除周围的非目标组织，用预冷的无菌PBS或生理盐水清洗2遍，尽可能清洗掉杂质；
C将清洗干净的目标组织样本放置在预冷的所述冻存保护液中剪碎，剪切成约0.5cm3的组织块，不足0.5cm3的从中间切开即可；
D将组织分成两个备份，其中300mg用来提取细胞核，100mg用来提取RNA(要求RIN≥7)；
E立即液氮速冻30min以上，再转移到-80℃保存或干冰寄送，确保组织寄送到实验室后为冷冻状态。常规速冻组织提核后核膜完整性普遍低于单细胞规定80％的要求，本发明采用特定的冻存保护液对植物组织细胞核进行保护，在一定程度上提高了提核后的核膜完整性，同时还能一等程度上减轻RNA因冻融而降解的情况，提高数据质量。
优选的，所述方法还包括判定核膜完整性或判定RNA降解水平。
优选的，所述判定核膜完整性包括：
采用PI或DAPI对提取好的细胞核悬液染色，通过荧光显微镜观察随机3个视野中完整的细胞核占比，最终结果取平均值。
进一步地，所述判定RNA降解水平包括：
同一物种同一部位，采集常规速冻和冻存保护液速冻后的组织提取RNA，通过RIN值大小比对直接判断降解水平；同一物种同一部位，采集常规速冻和冻存保护液速冻后的组织提取细胞核后，投入一致的细胞数，保持一致的反转录及cDNA回收纯化操作及试剂，通过cDNAqubit浓度大小比对及质检峰图中800bp-3000bp占比比对综合判断RNA降解水平。
本发明还提供所述保护液在制备组织保护试剂中的应用。
根据所述应用，所述保护液用于动物组织或植物组织；
优选的，用于植物组织。
本发明还提供所述保护液在以下任一项中的应用：
1)提高利用植物组织或动物组织提取细胞核的质量；
优选的，提高核膜完整性；
2)提高利用植物组织或动物组织提取RNA的质量；
优选的，减轻RNA因冻融而降解的情况；
3)提高植物组织或动物组织冻存保护的质量；
优选的，所述冻存包括液氮冻存。
4)提高植物单细胞核转录组数据的质量。
本发明具备如下有益效果：
本发明涉及样本准备的方法优化，在进行冻存保护液速冻后，植物单细胞核提取后的完整性显著提升，不仅可以极大的降低单细胞数据中背景占比，提高细胞捕获数等数据，还能够显著减小RNA因反复冻融而产生的降解情况，提升数据质量，能够很好地满足植物单细胞转录组测序的要求，进而在扩增和测序后得到高质量的转录组数据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例。
图1是本发明实施例1提供的常规速冻组织细胞核荧光镜检图。
图2是本发明实施例1提供的冻存保护液速冻组织细胞核荧光镜检图。
图3是本发明实施例1提供的常规速冻组织的单细胞cDNA峰图质检结果。
图4是本发明实施例1提供的冻存保护液速冻组织的单细胞cDNA峰图质检结果。
图5是本发明实施例1提供的常规速冻样品的样品数据图。
图6是本发明实施例1提供的冻存保护液速冻的样品数据图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中的甘油购自SIGMA、DMSO购自SIGMA、胎牛血清购自英潍捷基。
实施例1
1.1常规速冻组织/冻存保护液速冻组织细胞核提取后镜检
本实施例冻存保护液，以体积数计，包括：无酶水3mL、甘油5mL、DMSO1mL和胎牛血清1mL。
本实施例冻存保护液的制备方法为：将以上物质按各自体积于15mL离心管中，颠倒混合10次至均匀，碎冰上放置待用。
本实施例冻存保护液的使用方法为：
A番茄叶片新鲜组织从活体取下，要求组织量至少为400mg；
B去除周围的非目标组织，用预冷的无菌PBS清洗2遍，尽可能清洗掉杂质；
C将清洗干净的目标组织样本放置在预冷的所述冻存保护液中剪碎，剪切成约0.5cm3的组织块，不足0.5cm3的从中间切开即可；
D将组织分成两个备份，其中300mg用来提取细胞核，100mg用来提取RNA(要求RIN≥7)。
E使用移液枪尽量吸除保护液后，立即液氮速冻30min以上，再转移到-80℃保存24h
本实施例常规冻存的方法为：
A番茄叶片新鲜组织从活体取下，要求组织量至少为400mg；
B去除周围的非目标组织，用预冷的无菌PBS清洗2遍，尽可能清洗掉杂质；
C立即液氮速冻30min以上，再转移到-80℃保存24h。
本实施例提取细胞核的步骤为：
将-80℃保存24h后的样本取出后，迅速放入培养皿中，加入细胞核裂解液，手术刀片切割3分钟，过30um细胞筛，所得即为细胞核粗提液。
常规速冻组织细胞核镜检结果：
视野1：完整细胞核数/所有细胞核数42/68；视野2：完整细胞核数/所有细胞核数50/84；视野3：完整细胞核数/所有细胞核数49/75；综合核膜完整性62.11％。
冻存保护液速冻组织细胞核镜检结果：
视野1：完整细胞核数/所有细胞核数67/82；视野2：完整细胞核数/所有细胞核数62/73；视野3：完整细胞核数/所有细胞核数75/91；综合核膜完整性82.92％。
1.2常规速冻组织/冻存保护液速冻组织细胞核提取后上机单细胞，反转录及cDNA回收纯化质检；常规速冻组织/冻存保护液速冻组织RNA质检
表1
测序分析结果如下表：
表2单细胞测序常规速冻样品数据和冻存保护液速冻样品数据
从细胞核镜检结果可以看出冻存保护液速冻组织提出来82.92％的完整细胞核的结果明显优于常规速冻组织所提出来62.11％的完整细胞核的结果，符合单细胞对细胞核完整性的要求。且从单细胞测序结果也可以看出，用冻存保护液速冻的组织所得到的各项数据也明显优于常规速冻组织的数据。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例的冻存保护液，以体积数计，包括：无酶水4mL、甘油4mL、DMSO1.5mL和胎牛血清3.5mL。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例的冻存保护液，以体积数计，包括：无酶水3.5mL、甘油4.5mL、DMSO0.5mL和胎牛血清0.5mL。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种保护液，其特征在于，以质量百分数数计，包括：无酶水20％-40％、甘油30％-55％、DMSO5％-15％和胎牛血清5％-30％。
2.根据权利要求1所述的保护液，其特征在于，以质量百分数数计，包括：无酶水25％-35％、甘油45％-55％、DMSO 5％-15％和胎牛血清5％-15％；
优选的，包括无酶水26％-34％、甘油46％-54％、DMSO 8％-12％和胎牛血清8％-12％。
3.一种权利要求1或2所述保护液的制备方法，其特征在于，将各原料混合均匀。
4.权利要求1或2所述保护液的使用方法，其特征在于，将新鲜组织与3.8-4.2℃(优选为4℃)的权利要求1或2所述保护液混合。
5.根据权利要求4所述保护液的使用方法，其特征在于，将新鲜组织洗净后再与所述保护液混合。
6.根据权利要求5所述保护液的使用方法，其特征在于，利用无菌PBS或生理盐水洗净。
7.根据权利要求4-6任一项所述保护液的使用方法，其特征在于，去掉保护液，液氮速冻30min以上，再转移到-80℃保存或干冰寄送。
8.权利要求1或2所述保护液在制备组织保护试剂中的应用。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述保护液用于动物组织或植物组织；
优选的，用于植物组织。
10.权利要求1或2所述保护液在以下任一项中的应用：
1)提高利用植物组织或动物组织提取细胞核的质量；
优选的，提高核膜完整性；
2)提高利用植物组织或动物组织提取RNA的质量；
优选的，减轻RNA因冻融而降解的情况；
3)提高植物组织或动物组织冻存保护的质量；
优选的，所述冻存包括液氮冻存；
4)提高植物单细胞核转录组数据的质量。
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| PB01 | Publication | ||
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