CN118103070A - 解偶联t细胞介导的肿瘤细胞毒性与促炎细胞因子释放的蛋白质 - Google Patents
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Abstract
本公开总体上涉及靶向肿瘤细胞杀伤的蛋白质，其包括：特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物，以及特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物。在一些实施方式中，本申请提供特异性结合ROR1的抗体。在一些实施方式中，本申请还提供了使用此类蛋白质治疗癌症的治疗方法。
Description
相关申请的交叉引用
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技术领域
本公开总体上涉及能够诱导肿瘤细胞的T细胞细胞毒性的双特异性蛋白质，及其用于治疗癌症的用途。
背景技术
ROR1是一种细胞表面酪氨酸激酶，主要在胚胎发育过程中表达。ROR1在血液肿瘤细胞(包括慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞和套细胞白血病(MCL)细胞)和包括卵巢、肺、胃、胰腺、子宫、乳腺和前列腺的实体瘤上表达。ROR1在正常成人组织(例如，脂肪组织、前B细胞、胰岛)上表现出有限的表达，因此被认为是相对肿瘤特异性的肿瘤相关抗原(“TAA”)。ROR1特异性抗体药物偶联物(ADC)在早期临床试验中已显示出有希望的疗效和可控的不良事件(AE)概况。然而，实体瘤中细胞表面ROR1表达的低密度和异质性对许多免疫治疗模式(包括介导抗体依赖性细胞毒性的单特异性抗体和ADC)提出了挑战。
ADC的功效依赖于ADC内化的程度。ROR1 ADC在治疗ROR1+血液恶性肿瘤(包括CLL和MCL)的早期临床试验中似乎非常有效，但这可能至少部分归因于：(1)与需要ADC穿透的实体瘤相比，ADC更容易接触到血液肿瘤，以及(2)与实体瘤相比，血液肿瘤中ROR1的表达频率更高且更均质。
CD3双特异性抗体(bsAb)需要最小的受体占用来介导有效的功能活性。当TAA-CD3bsAb在T细胞上的CD3和肿瘤细胞上的靶TAA表位之间桥接时，TAA-CD3 bsAb会激活所有CD3+淋巴细胞，包括αβT细胞、γδT细胞、NK-T细胞、调节性T细胞(Treg)、粘膜相关不变T(MAIT)细胞及其表型亚群。在实体瘤中，CD3+淋巴细胞(包括CD8+细胞毒性T细胞)相对于肿瘤细胞的相对频率较低(每个CD8+T细胞的肿瘤细胞通常>10)，即使在高度免疫原性和发炎的肿瘤(例如黑色素瘤)中也是如此。因此，CD3 bsAb的功效取决于单个CD8+T细胞杀死超过一个肿瘤细胞的能力，这一过程称为连续杀伤。
TCR/CD3复合物经由该bsAb桥的交联优先激活细胞毒性T细胞亚群以介导表达TAA的细胞(其中大部分被推测为肿瘤细胞)的杀伤并释放能够将肿瘤微环境(TME)从免疫抑制转变到免疫受纳的促炎细胞因子。在Treg的背景下，CD3 bsAb可以激活Treg以分泌免疫抑制细胞因子，例如TGFβ。这一机制是影响贝林妥欧单抗(blinatumomab)，一种靶向CD19的CD3 bsAb，用于治疗血液恶性肿瘤)疗效的重要因素。
然而，CD3 bsAb与潜在致命的AE相关，包括细胞因子释放综合征(CRS)和神经毒性。因此，某些bsAb治疗性候选药物旨在将肿瘤细胞毒活性与促炎细胞因子(例如IFNγ、TNFα、IL-2)释放解偶联(参见，例如Zuch de Zafra等(2019)Clin Cancer Res.；25(13):3921-3933.；Trinklein等(2019)MAbs.；11(4):639-652.；和Hernandez-Hoyos等(2016)MolCancerTher.；15(9):2155-65)。
迫切需要具有有效的肿瘤细胞靶向杀伤活性、最小的脱靶毒性、扩大的实体瘤和/或血液肿瘤的治疗窗口以及可控的AE概况的新疗法。
发明内容
本公开总体上涉及能够诱导针对肿瘤细胞的强烈T细胞细胞毒性的双特异性蛋白质，及其用于治疗癌症的用途。
在一方面，本公开总体上提供了诱导和/或能够诱导针对某些表达TAA的细胞的强烈T细胞细胞毒性的双特异性蛋白质，及其用于治疗癌症的用途。在一些实施方式中，本公开提供了诱导和/或能够诱导针对ROR1+肿瘤细胞的强烈T细胞细胞毒性的双特异性蛋白质，及其用于治疗癌症的用途。
在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质不诱导显著量的细胞因子释放。在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质诱导针对某些表达TAA细胞的强烈T细胞细胞毒性，但不诱导显著量的细胞因子释放。
在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质诱导针对表达TAA细胞的强烈T细胞细胞毒性，但不诱导显著量的细胞因子释放，所述双特异性蛋白质包括两个臂，第一臂和第二臂，第一臂包含位于其N端的第一组分和位于其C端的第二组分，所述第一组分特异性结合TAA，所述第二组分特异性结合相同的TAA，第二臂包含位于其N端的组分，所述组分特异性结合CD3。
在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质诱导针对某些表达TAA细胞的强烈T细胞细胞毒性，但不诱导显著量的细胞因子释放，其包含：(i)第一臂，从N端到C端包含：第一组分，其包含特异性结合TAA的多肽或两种或更多种多肽的复合物，第一铰链多肽，SEED形式免疫球蛋白Fc结构域的第一多肽，和第二组分，所述第二组分包含特异性结合TAA的多肽或两种或更多种多肽的复合物；和(ii)第二臂，其从N端到C端包含特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，第二铰链多肽和SEED形式免疫球蛋白Fc结构域的第二多肽，其中SEED形式免疫球蛋白Fc结构域的第一和第二多肽二聚化。
在一些实施方式中，本公开的蛋白质包含：特异性结合RORl的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其连接至桥接部分末端；以及特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其连接至桥接部分的相反端。
在一些实施方式中，特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物连接至桥接部分的C端，特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物连接至桥接部分的N端。
在一些实施方式中，所述蛋白质还包含连接至桥接部分的N端的特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物。
在一些实施方式中，所述桥接部分包含两个多肽臂，其中特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物以及特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物分别连接至同一多肽臂的C端和N端，并且其中特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物连接至第二多肽臂的N端。
在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质诱导针对某些表达TAA的肿瘤细胞的强烈T细胞细胞毒性，但不诱导显著量的细胞因子释放，其包含：(i)第一臂，从N端到C端包含：第一组分，其包含特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物，第一铰链多肽，SEED形式免疫球蛋白Fc结构域的第一多肽，和第二组分，所述第二组分包含特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物；和(ii)第二臂，其从N端到C端包含特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，第二铰链多肽和SEED形式免疫球蛋白Fc结构域的第二多肽，其中SEED形式免疫球蛋白Fc结构域的第一和第二多肽二聚化。
在一些实施方式中，特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物连接至桥接部分的N端，特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物连接至桥接部分的C端。
在一些实施方式中，所述蛋白质还包含连接至桥接部分的N端的特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物。
在一些实施方式中，所述桥接部分包含两个多肽臂，其中特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物以及特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物分别连接至样品多肽臂的N端和C端，并且其中特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物连接至第二多肽臂的N端。
在一些实施方式中，特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物选自下组：单链可变片段(scFv)、Fab、Fab’、F(ab’)2、微型抗体(minibody)和纳米抗体(VHH)。在一些实施方式中，特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物是scFv。
在一些实施方式中，特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物选自下组：scFv、Fab、Fab’、F(ab’)2、微型抗体(minibody)和VHH。在一些实施方式中，特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物是scFv。
在一些实施方式中，特异性结合RORl的多肽或两种或更多种多肽的复合物，或者特异性结合RORl的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含：(i)重链互补决定区1(VHCDR1)，其包含氨基酸序列GFTFTSYA(SEQ ID NO:8)或氨基酸序列GFSITTSGVS(SEQ IDNO:23)；(ii)重链互补决定区2(VHCDR2)，其包含氨基酸序列ISGSGGGT(SEQ ID NO:9)或氨基酸序列IYWDDDK(SEQ ID NO:24)；(iii)重链互补决定区3(VHCDR3)，其包含氨基酸序列AQGSSIFDY(SEQ ID NO:10)或氨基酸序列AHAPRYTPGGYFDY(SEQ ID NO:25)；(iv)轻链互补决定区1(VLCDR1)，其包含氨基酸序列QSVSSY(SEQ ID NO:11)或氨基酸序列QSVSSN(SEQ IDNO:26)；(v)轻链互补决定区2(VLCDR2)，其包含氨基酸序列DAS或GAS；和(vi)轻链互补决定区3(VLCDR3)，其包含氨基酸序列QQRSNWPPXT(SEQ ID NO:13)，其中X是F、S、C、R、Q、I、L、Y或V，或氨基酸序列QQYKNWPPA(SEQ ID NO:28)。
在一些实施方式中，特异性结合RORl的多肽或两种或更多种多肽的复合物，或者特异性结合RORl的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含：包含氨基酸序列GFTFTSYA(SEQ ID NO:8)的VHCDR1；包含氨基酸序列ISGSGGGT(SEQ ID NO:9)的VHCDR2；包含氨基酸序列AQGSSIFDY(SEQID NO:10)的VHCDR3；包含氨基酸序列QSVSSY(SEQ ID NO:11)的VLCDR1；包含氨基酸序列DAS的VLCDR2；和包含氨基酸序列QQRSNWPPFT(SEQ ID NO:14)的VLCDR3。
在一些实施方式中，特异性结合RORl的多肽或两种或更多种多肽的复合物，或者特异性结合RORl的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含：包含氨基酸序列GFTFTSYA(SEQ ID NO:8)的VHCDR1；包含氨基酸序列ISGSGGGT(SEQ ID NO:9)的VHCDR2；包含氨基酸序列AQGSSIFDY(SEQID NO:10)的VHCDR3；包含氨基酸序列QSVSSY(SEQ ID NO:11)的VLCDR1；包含氨基酸序列DAS的VLCDR2；和包含氨基酸序列QQRSNWPPST(SEQ ID NO:15)的VLCDR3。
在一些实施方式中，特异性结合RORl的多肽或两种或更多种多肽的复合物，或者特异性结合RORl的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含：包含氨基酸序列GFSITTSGVS(SEQ ID NO:23)的VHCDR1；包含氨基酸序列IYWDDDK(SEQ ID NO:24)的VHCDR2；包含氨基酸序列AHAPRYTPGGYFDY(SEQ ID NO:25)的VHCDR3；包含氨基酸序列QSVSSN(SEQID NO:26)的VLCDR1；包含氨基酸序列GAS的VLCDR2；和包含氨基酸序列QQYKNWPPA(SEQ IDNO:28)的VLCDR3。
在一些实施方式中，特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物或特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含(根据IMGT独特编号方案)VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，其各自包含对应于本公开所列的重链可变结构域和轻链可变结构域的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3序列的氨基酸序列。
在一些实施方式中，特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物或特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含：与SEQ ID NO:29或SEQ IDNO:39具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的序列，和与SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:31、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:40具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的序列。
在一些实施方式中，特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物或特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含：与SEQ ID NO:29具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的序列，和与SEQ ID NO:30具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的序列。
在一些实施方式中，特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物或特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含：与SEQ ID NO:29具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的序列，和与SEQ ID NO:31具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的序列。
在一些实施方式中，特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物或特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含：与SEQ ID NO:39具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的序列，和与SEQ ID NO:40具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的序列。
在一些实施方式中，特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物或特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其各自包含对应于本申请中公开的重链可变结构域和轻链可变结构域的重链可变结构域和轻链可变结构域序列的氨基酸序列。
在一些实施方式中，特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物或特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含接头多肽，其包含(GGGGS)n(SEQ ID NO:1)序列，其中n是1-12。
在一些实施方式中，特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物或特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含：与SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:49或SEQ ID NO:59具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的序列。
在一些实施方式中，特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物或特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含：与SEQ ID NO:41具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的序列。
在一些实施方式中，特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物或特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含：与SEQ ID NO:42具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的序列。
在一些实施方式中，特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物或特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含：与SEQ ID NO:59具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的序列。
在一些实施方式中，特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物或特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含scFv，所述scFv包含对应于本公开中所列scFv的氨基酸序列。
在一些实施方式中，特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物选自下组：Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、微型抗体(minibody)和VHH。在一些实施方式中，特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物是Fab。
在一些实施方式中，特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含：(i)重链互补决定区1(VHCDR1)，其包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:61)；(ii)重链互补决定区2(VHCDR2)，其包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:62)；(iii)重链互补决定区3(VHCDR3)，其包含氨基酸序列VRHGNFGX1X2YVSWFAY(SEQ ID NO:67)，其中X1是N、A或E，且X2是S或A；(iv)轻链互补决定区1(VLCDR1)，其包含氨基酸序列TGAVTTSN(SEQ ID NO:64)；(v)轻链互补决定区2(VLCDR2)，其包含氨基酸序列GT；和(vi)轻链互补决定区3(VLCDR3)，其包含氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:66)。
在一些实施方式中，特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含：包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:61)的VHCDR1；包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ IDNO:62)的VHCDR2；包含氨基酸序列VRHGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:63)的VHCDR3；包含氨基酸序列TGAVTTSN(SEQ ID NO:64)的VLCDR1；包含氨基酸序列GT的VLCDR2；和包含氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:66)的VLCDR3。
在一些实施方式中，特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含：包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:61)的VHCDR1；包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ IDNO:62)的VHCDR2；包含氨基酸序列VRHGNFGASYVSWFAY(SEQ ID NO:68)的VHCDR3；包含氨基酸序列TGAVTTSN(SEQ ID NO:64)的VLCDR1；包含氨基酸序列GT的VLCDR2；和包含氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:66)的VLCDR3。
在一些实施方式中，特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含(根据IMGT独特编号方案)：VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，其各自分别包含对应于本公开所列的重链可变结构域和轻链可变结构域的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3序列的氨基酸序列。
在一些实施方式中，特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含：与SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:80具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的序列，和与SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ IDNO:78、SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:81具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的序列。
在一些实施方式中，特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含：与SEQ ID NO:72具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的序列，和与SEQ ID NO:81具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的序列。
在一些实施方式中，特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含：与SEQ ID NO:71具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的序列，和与SEQ ID NO:76具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的序列。
在一些实施方式中，特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，根据IMGT独特编号方案，其包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域各自包含分别对应于本发明所列出的重链可变结构域和轻链可变结构域的重链可变结构域和轻链可变结构域序列的氨基酸序列。
在一些实施方式中，特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含：与SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:83具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的序列，和与SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:85具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的序列。
在一些实施方式中，特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，根据IMGT独特编号方案，其包含重链和轻链，所述重链和轻链各自包含分别对应于本发明所列出的重链和轻链的重链和轻链序列的氨基酸序列。
在一些实施方式中，桥接部分是功能性的或非功能性的。
在一些实施方式中，桥接部分包括链交换工程改造的结构域(SEED)形式Fc结构域或其功能性片段、免疫球蛋白Fc结构域或其功能性片段、多肽接头或多肽铰链。
在一些实施方式中，SEED形式Fc结构域包含一种或多于一种效应子功能沉默突变。
在一些实施方式中，SEED形式Fc结构域包含：包含与SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:117或SEQ ID NO:88具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的序列的多肽，和包含与SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:118或SEQ ID NO:89具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的序列的多肽。
在一些实施方式中，桥接部分包含免疫球蛋白Fc结构域。在一些实施方式中，免疫球蛋白Fc结构域包含两个多肽臂，每个多肽臂包含一个或多于一个促进异二聚化的突变。
在一些实施方式中，免疫球蛋白Fc结构域包含第一多肽臂和第二多肽臂，各自包含分别对应于本公开中列出的第一多肽臂和第二多肽臂的第一多肽臂和第二多肽臂序列的氨基酸序列。
在一些实施方式中，桥接部分在其N端还包含铰链。
在一些实施方式中，铰链包含多肽臂，所述多肽臂包含含有SEQ ID NO:92的氨基酸序列。
在一些实施方式中，铰链还包含第二多肽臂，所述第二多肽臂包含含有SEQ IDNO:90或SEQ ID NO:92的氨基酸序列。
在一些实施方式中，铰链包含多肽臂，所述多肽臂包含本公开所列出的氨基酸序列。在一些实施方式中，铰链还包含第二多肽臂，所述第二多肽臂包含本公开所列出的氨基酸序列。
在一些实施方式中，特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物通过接头多肽连接至桥接部分的C端。在一些实施方式中，特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物通过接头多肽连接至桥接部分的C端。在一些实施方式中，接头多肽包含(GGGGS)n(SEQ ID NO:1)序列，其中n是1-12。
在一些实施方式中，本公开的蛋白质包含：(i)特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含：重链互补决定区1(VHCDR1)，其包含氨基酸序列GFTFTSYA(SEQID NO:8)或氨基酸序列GFSITTSGVS(SEQID NO:23)，重链互补决定区2(VHCDR2)，其包含氨基酸序列ISGSGGGT(SEQID NO:9)或氨基酸序列IYWDDDK(SEQ ID NO:24)，重链互补决定区3(VHCDR3)，其包含氨基酸序列AQGSSIFDY(SEQ ID NO:10)或氨基酸序列AHAPRYTPGGYFDY(SEQ ID NO:25)，轻链互补决定区1(VLCDR1)，其包含氨基酸序列QSVSSY(SEQ ID NO:11)或氨基酸序列QSVSSN(SEQ ID NO:26)，轻链互补决定区2(VLCDR2)，其包含氨基酸序列DAS或GAS，和轻链互补决定区3(VLCDR3)，其包含氨基酸序列QQRSNWPPXT(SEQ ID NO:13)，其中X是F、S、C、R、Q、I、L、Y或V，或氨基酸序列QQYKNWPPA(SEQID NO:28)；(ii)特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含：包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:61)的VHCDR1，包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:62)的VHCDR2，包含氨基酸序列VRHGNFGX1X2YVSWFAY(SEQ ID NO:67)的VHCDR3，其中X1是N、A或E，且X2是S或A，包含氨基酸序列TGAVTTSN(SEQ ID NO:64)的VLCDR1，包含氨基酸序列GT的VLCDR2和包含氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ IDNO:66)的VLCDR3；以及(iii)连接特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物和特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物的桥接部分，其中所述桥接部分包含：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:90和SEQ IDNO:86或SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:86的多肽臂，和(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:87，或SEQ IDNO:92和SEQ ID NO:87的第二多肽臂。
在一些实施方式中，本公开的蛋白质包含连接至桥接部分的N端的特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物。在一些实施方式中，特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含：VHCDR1，其包含氨基酸序列GFTFTSYA(SEQ ID NO:8)或氨基酸序列GFSITTSGVS(SEQ ID NO:23)，VHCDR2，其包含氨基酸序列ISGSGGGT(SEQ ID NO:9)或氨基酸序列IYWDDDK(SEQ ID NO:24)，VHCDR3，其包含氨基酸序列AQGSSIFDY(SEQ ID NO:10)或氨基酸序列AHAPRYTPGGYFDY(SEQ ID NO:25)，VLCDR1，其包含氨基酸序列QSVSSY(SEQ ID NO:11)或氨基酸序列QSVSSN(SEQ ID NO:26)，VLCDR2，其包含氨基酸序列DAS或GAS，和VLCDR3，其包含氨基酸序列QQRSNWPPXT(SEQ ID NO:13)，其中X是F、S、C、R、Q、I、L、Y或V，或氨基酸序列QQYKNWPPA(SEQ ID NO:28)。
在一些实施方式中，本公开的蛋白质包含：(i)特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含：包含氨基酸序列GFTFTSYA(SEQ IDNO:8)的VHCDR1、包含氨基酸序列ISGSGGGT(SEQ ID NO:9)的VHCDR2、包含氨基酸序列AQGSSIFDY(SEQ ID NO:10)的VHCDR3、包含氨基酸序列QSVSSY(SEQ ID NO:11)的VLCDR1、包含氨基酸序列DAS的VLCDR2和包含氨基酸序列QQRSNWPPST(SEQ ID NO:15)的VLCDR3；(ii)特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含：包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:61)的VHCDR1、包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:62)的VHCDR2、包含氨基酸序列VRHGNFGNSYVSWFAY(SEQID NO:63)的VHCDR3、包含氨基酸序列TGAVTTSN(SEQ ID NO:64)的VLCDR1、包含氨基酸序列GT的VLCDR2和包含氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:66)的VLCDR3；(iii)将特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物的N端与特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物的C端连接的桥接部分，其中所述桥接部分包含：(a)包含氨基酸序列SEQIDNO:90和SEQ ID NO:86的多肽臂，和(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:87的第二多肽臂；以及(iv)连接至桥接部分N端的特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物，其包含：包含氨基酸序列GFTFTSYA(SEQ ID NO:8)的VHCDR1、包含氨基酸序列ISGSGGGT(SEQID NO:9)的VHCDR2、包含氨基酸序列AQGSSIFDY(SEQ ID NO:10)的VHCDR3、包含氨基酸序列QSVSSY(SEQ ID NO:11)的VLCDR1、包含氨基酸序列DAS的VLCDR2和包含氨基酸序列QQRSNWPPST(SEQ ID NO:15)的VLCDR3。
在一些实施方式中，本公开的蛋白质包含：(i)特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含：包含氨基酸序列GFTFTSYA(SEQ IDNO:8)的VHCDR1、包含氨基酸序列ISGSGGGT(SEQ ID NO:9)的VHCDR2、包含氨基酸序列AQGSSIFDY(SEQ ID NO:10)的VHCDR3、包含氨基酸序列QSVSSY(SEQ ID NO:11)的VLCDR1、包含氨基酸序列DAS的VLCDR2和包含氨基酸序列QQRSNWPPFT(SEQ ID NO:14)的VLCDR3；(ii)特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含：包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:61)的VHCDR1、包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:62)的VHCDR2、包含氨基酸序列VRHGNFGNSYVSWFAY(SEQID NO:63)的VHCDR3、包含氨基酸序列TGAVTTSN(SEQ ID NO:64)的VLCDR1、包含氨基酸序列GT的VLCDR2和包含氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:66)的VLCDR3；(iii)将特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物的N端与特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物的C端连接的桥接部分，其中所述桥接部分包含：(a)包含氨基酸序列SEQIDNO:90和SEQ ID NO:86的多肽臂，和(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:87的第二多肽臂；以及(iv)连接至桥接部分N端的特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物，其包含：包含氨基酸序列GFTFTSYA(SEQ ID NO:8)的VHCDR1、包含氨基酸序列ISGSGGGT(SEQID NO:9)的VHCDR2、包含氨基酸序列AQGSSIFDY(SEQ ID NO:10)的VHCDR3、包含氨基酸序列QSVSSY(SEQ ID NO:11)的VLCDR1、包含氨基酸序列DAS的VLCDR2和包含氨基酸序列QQRSNWPPFT(SEQ ID NO:14)的VLCDR3。
在一些实施方式中，本公开的蛋白质包含：(i)特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含：包含氨基酸序列GFSITTSGVS(SEQID NO:23)的VHCDR1、包含氨基酸序列IYWDDDK(SEQ ID NO:24)的VHCDR2、包含氨基酸序列AHAPRYTPGGYFDY(SEQ ID NO:25)的VHCDR3、包含氨基酸序列QSVSSN(SEQ ID NO:26)的VLCDR1、包含氨基酸序列GAS的VLCDR2和包含氨基酸序列QQYKNWPPA(SEQ ID NO:28)的VLCDR3；(ii)特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含：包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:61)的VHCDR1、包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:62)的VHCDR2、包含氨基酸序列VRHGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:63)的VHCDR3、包含氨基酸序列TGAVTTSN(SEQ ID NO:64)的VLCDR1、包含氨基酸序列GT的VLCDR2和包含氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:66)的VLCDR3；(iii)将特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物的C端与特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物的N端连接的桥接部分，其中所述桥接部分包含：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:86的多肽臂，和(b)包含氨基酸序列SEQ IDNO:92和SEQ ID NO:87的第二多肽臂；以及(iv)特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物，其包含：包含氨基酸序列GFSITTSGVS(SEQ ID NO:23)的VHCDR1、包含氨基酸序列IYWDDDK(SEQ ID NO:24)的VHCDR2、包含氨基酸序列AHAPRYTPGGYFDY(SEQ IDNO:25)的VHCDR3、包含氨基酸序列QSVSSN(SEQ ID NO:26)的VLCDR1、包含氨基酸序列GAS的VLCDR2和包含氨基酸序列QQYKNWPPA(SEQ ID NO:28)的VLCDR3。
在一些实施方式中，本公开的蛋白质包含：(i)特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含：包含氨基酸序列GFSITTSGVS(SEQID NO:23)的VHCDR1、包含氨基酸序列IYWDDDK(SEQ ID NO:24)的VHCDR2、包含氨基酸序列AHAPRYTPGGYFDY(SEQ ID NO:25)的VHCDR3、包含氨基酸序列QSVSSN(SEQ ID NO:26)的VLCDR1、包含氨基酸序列GAS的VLCDR2和包含氨基酸序列QQYKNWPPA(SEQ ID NO:28)的VLCDR3；(ii)特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含：包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:61)的VHCDR1、包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:62)的VHCDR2、包含氨基酸序列VRHGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:63)的VHCDR3、包含氨基酸序列TGAVTTSN(SEQ ID NO:64)的VLCDR1、包含氨基酸序列GT的VLCDR2和包含氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:66)的VLCDR3；(iii)将特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物的C端与特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物的N端连接的桥接部分，其中所述桥接部分包含：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:86的多肽臂，和(b)包含氨基酸序列SEQ IDNO:92和SEQ ID NO:87的第二多肽臂；以及(iv)连接至桥接部分N端的特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物，其包含：包含氨基酸序列GFSITTSGVS(SEQ IDNO:23)的VHCDR1、包含氨基酸序列IYWDDDK(SEQ ID NO:24)的VHCDR2、包含氨基酸序列AHAPRYTPGGYFDY(SEQ ID NO:25)的VHCDR3、包含氨基酸序列QSVSSN(SEQ ID NO:26)的VLCDR1、包含氨基酸序列GAS的VLCDR2和包含氨基酸序列QQYKNWPPA(SEQ ID NO:28)的VLCDR3。
在一些实施方式中，本公开的蛋白质包含：(i)特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，所述重链可变结构域(VH)包含氨基酸序列SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:39，所述轻链可变结构域(VL)包含氨基酸序列SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:34、SEQID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:40；(ii)特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含VH和VL，所述VH包含氨基酸序列SEQ IDNO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQID NO:75或SEQ ID NO:80，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:76、SEQ IDNO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:81；以及(iii)将特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物与特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物连接的桥接部分，其中所述桥接部分包含：(a)多肽臂，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:86或SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:86，以及(b)第二多肽臂，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:87或SEQ ID NO:92和SEQID NO:87。
在一些实施方式中，特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，所述重链可变结构域(VH)包含氨基酸序列SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:39，所述轻链可变结构域(VL)包含氨基酸序列SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:40。
在一些实施方式中，本发明的蛋白质包含：(i)特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:29的VH，和含有氨基酸序列SEQ IDNO:31的VL；(ii)特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:71的VH，和含有氨基酸序列SEQ ID NO:76的VL；(iii)将特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物的N端与特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物C端连接的桥接部分，其中所述桥接部分包含：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:92的位于其N端的两个多肽，和(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:86的多肽和包含氨基酸序列SEQID NO:87的多肽，其中所述桥接部分包含：(1)多肽臂，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:86，和(2)第二多肽臂，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:87；以及(iv)连接至桥接部分N端的特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:29的VH和含有氨基酸序列SEQID NO:31的VL。
在一些实施方式中，本公开的蛋白质包含：(i)特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:29的VH，和含有氨基酸序列SEQ IDNO:30的VL；(ii)特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:71的VH，和含有氨基酸序列SEQ ID NO:76的VL；(iii)将特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物的N端与特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物C端连接的桥接部分，其中所述桥接部分包含：(a)多肽臂，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:90和SEQ ID NO:86，和(b)第二多肽臂，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:87；和(iv)连接至桥接部分N端的特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:29的VH和含有氨基酸序列SEQ ID NO:30的VL。
在一些实施方式中，本公开的蛋白质包含：(i)特异性结合ROR1的scFv，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:42；(ii)特异性结合CD3的Fab，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:83的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:85的轻链；(iii)将特异性结合ROR1的scFv的N端与特异性结合CD3的Fab的C端连接的桥接部分，其中所述桥接部分包含：(a)包含氨基酸序列SEQID NO:90和SEQ ID NO:86的多肽臂，和(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:92和SEQ IDNO:87的第二多肽臂；以及连接至桥接部分N端的特异性结合ROR1的第二scFv，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:42。
在一些实施方式中，本公开的蛋白质包含：(i)特异性结合ROR1的scFv，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:41；(ii)特异性结合CD3的Fab，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:83的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:85的轻链；(iii)将特异性结合ROR1的scFv的N端与特异性结合CD3的Fab的C端连接的桥接部分，其中所述桥接部分包含：(a)包含氨基酸序列SEQID NO:90和SEQ ID NO:86的多肽臂，和(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:92和SEQ IDNO:87的第二多肽臂；以及(iv)连接至桥接部分N端的特异性结合ROR1的第二scFv，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:41。
在一些实施方式中，本公开的蛋白质包含第一重链、第二重链和轻链，其各自包含分别对应于本公开列出的第一重链的序列、第二重链的序列和轻链的序列的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本公开的蛋白质对于CD3结合的KD为10nM至50nM，或15nM至20nM，如在生物层干涉试验中测得的。
在一些实施方式中，在使用活化的T细胞的CD3结合试验中，本公开的蛋白质的EC50为20nM至50nM、或25nM至35nM。在一些实施方式中，本公开的蛋白质结合ROR1的Ig样结构域。在一些实施方式中，本公开的蛋白质不结合ROR1的卷曲(Frizzled)和/或Kringle结构域。
在一些实施方式中，本公开的蛋白质对于结合TAA的KD为80nM至120nM、95nM至105nM、1nM至10nM或3nM至5nM，如在生物层干涉试验中测得的。在一些实施方式中，本公开的蛋白质对于ROR1结合的KD为80nM至120nM、95nM至105nM、1nM至10nM或3nM至5nM，如在生物层干涉试验中测得的。
在一些实施方式中，在使用表达约3.5X 104TAA分子/细胞的细胞的TAA结合试验中，本公开的蛋白质的EC50为80nM至120nM、90nM至110nM、1nM至10nM或2nM至5nM。在一些实施方式中，在使用表达约3.5X 104ROR1分子/细胞的细胞的ROR1结合试验中，本公开的蛋白质的EC50为80nM至120nM、90nM至110nM、1nM至10nM或2nM至5nM。
在一些实施方式中，本公开的蛋白质用于治疗实体瘤。在一些实施方式中，本公开的蛋白质用于治疗血液肿瘤。
在一些实施方式中，本公开的蛋白质诱导T细胞裂解性颗粒脱颗粒。在一些实施方式中，对于在T细胞/肿瘤细胞共培养杀伤试验中所测量的T细胞介导的表达TAA的细胞的细胞毒性，本公开的蛋白质的EC50为160pM至200pM、165pM至190pM、25pM至50pM或30pM至40pM。
在一些实施方式中，对于在T细胞/肿瘤细胞共培养杀伤试验中所测量的T细胞介导的表达ROR1的细胞的细胞毒性，本公开的蛋白质的EC50为160pM至200pM、165pM至190pM、25pM至50pM或30pM至40pM。在一些实施方式中，当以足以诱导T细胞介导的细胞毒性的浓度给予培养物时，本公开的蛋白质不诱导T细胞促炎细胞因子的产生和/或释放的显著增加。
在一些实施方式中，如在T细胞/肿瘤细胞共培养IFNγ产生试验中所测量的，本公开的蛋白质的EC50为1000pM至2000pM、1400pM至1800pM、200pM至600pM或300pM至500pM。
在一些实施方式中，如在T细胞/肿瘤细胞共培养IFNγ产生试验中所测量的，与参考T细胞结合物(binder)相比，本公开的蛋白质具有20％至60％、35％至45％、或45％至55％的C最大。
在一些实施方式中，当给予新鲜分离的外周单核细胞(PBMC)培养物或以高密度预培养48小时的PBMC时，本公开的蛋白质不诱导显著水平的TNFα或IL2释放。
在一些实施方式中，如在T细胞/肿瘤细胞共培养杀伤试验和IFNγ产生试验中所测量的，用参考T细胞结合物标准化，本公开的蛋白质细胞因子释放与杀伤解偶联比率为1:2至1:4、1:2.2或1:2.9。
在一些实施方式中，如在T细胞/肿瘤细胞共培养杀伤试验中测量的，本公开的蛋白质诱导的肿瘤连续杀伤指数为3至5、3.4至3.6或3.8至4.2。在一些实施方式中，本公开的蛋白质与食蟹猴CD3交叉反应但不与小鼠CD3交叉反应。在一些实施方式中，本公开的蛋白质与食蟹猴TAA和小鼠TAA交叉反应。在一些实施方式中，本公开的蛋白质与食蟹猴ROR1和小鼠ROR1交叉反应。
本公开还提供了包含本发明的蛋白质和药学上可接受的运载体的制剂。
本公开还提供了编码本发明蛋白质的核酸。
本公开提供了包含一种或多种编码本发明的蛋白质的核酸的细胞。
本公开提供了治疗患者的癌症的方法，包括向患者给予本发明的蛋白质或制剂。在一些实施方式中，癌症是血液癌症或实体瘤癌症。在一些实施方式中，癌症选自下组：慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、肺癌、支气管癌、结肠癌、直肠癌、黑素瘤、肾癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、乳腺癌、口腔癌、咽癌、毛细胞白血病、肝癌、肝内胆管癌和甲状腺癌。
在本公开的一些实施方式中，抗体或其功能性片段，按照IMGT独特编号方案，其包含：重链可变互补决定区1(VHCDR1)，其包含氨基酸序列GFTFTSYA(SEQ ID NO:8)，重链可变互补决定区2(VHCDR2)，其包含氨基酸序列ISGSGGGT(SEQ ID NO:9)，重链可变互补决定区3(VHCDR3)，其包含氨基酸序列AQGSSIFDY(SEQ ID NO:10)，轻链可变互补决定区1(VLCDR1)，其包含氨基酸序列QSVSSY(SEQ ID NO:11)，轻链可变互补决定区2(VLCDR2)，其包含氨基酸序列DAS，以及轻链可变互补决定区3(VLCDR3)，其包含氨基酸序列QQRSNWPPFT(SEQ ID NO:14)。
在一些实施方式中，抗体包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO:29至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:30至少90％相同(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的氨基酸序列。
在一些实施方式中，按照IMGT独特编号方案，本公开的抗体包含：重链可变互补决定区1(VHCDR1)，其包含氨基酸序列GFTFTSYA(SEQ ID NO:8)，重链可变互补决定区2(VHCDR2)，其包含氨基酸序列ISGSGGGT(SEQ ID NO:9)，重链可变互补决定区3(VHCDR3)，其包含氨基酸序列AQGSSIFDY(SEQID NO:10)，轻链可变互补决定区1(VLCDR1)，其包含氨基酸序列QSVSSY(SEQ ID NO:11)，轻链可变互补决定区2(VLCDR2)，其包含氨基酸序列DAS，以及轻链可变互补决定区3(VLCDR3)，其包含氨基酸序列QQRSNWPPST(SEQ ID NO:15)。在一些实施方式中，抗体包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含与SEQID NO:39至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:40至少90％相同(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的氨基酸序列。在一些实施方式中，抗体是人IgG1抗体。
本公开的其他实施方式和详细内容可见后文。
附图简要说明
图1A和1B提供了双特异性T细胞接合器(TCE)的蛋白质设计的示意图，其包含桥接部分、特异性结合肿瘤相关抗原(“TAA”)(例如，ROR1)的第一scFv、特异性结合CD3的Fab和特异性结合ROR1的第二scFv。图1A是“1A形式”的示例性双特异性TCE的示意图，其中特异性结合TAA(例如，ROR1)的第一scFv连接至桥接部分的C端，特异性结合CD3的Fab连接至桥接部分的N端，并且特异性结合TAA(例如，ROR1)的第二scFv连接至桥接部分的N端。图1B是“1B形式”的示例性双特异性TCE的示意图，其中特异性结合TAA(例如，ROR1)的第一scFv连接至桥接部分的N端，特异性结合CD3的Fab连接至桥接部分的C端，并且特异性结合TAA(例如，ROR1)的第二scFv连接至桥接部分的N端。
图2A至2D是显示1A形式和1B形式的69A02和/或82H02双特异性TCE、人IgG1同种型对照(hIgG2)、参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)或结合ROR1卷曲结构域的1A形式或1B形式参考TCE(Ref.结合Frz的TCE)的结合CD3的多肽臂对于Jurkat T细胞上的(图2A)、食蟹猴泛(pan-)T细胞(图2B)、从敲入了人CD3的C57BL/6小鼠分离的T细胞(图2C)或敲除了人CD3的Jurkat T细胞(图2D)上的人或食蟹猴CD3的表观结合亲和力的图。
图3A至3D是显示1A形式和1B形式的69A02和/或82H02双特异性TCE、人IgGl同种型对照(同种型对照)以及参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)或结合ROR1卷曲结构域的1A形式或1B形式参考TCE(Ref.结合Frz的TCE)的结合ROR1的多肽臂对于hROR1+MDA-MB-231细胞(图3A)、hROR1-T47D细胞(图3B)、经工程改造以过表达人ROR1的4T1细胞(图3C)或经工程改造以过表达鼠ROR1的4T1细胞(图3D)上的人ROR1的表观结合亲和力的图。
图4A和4B是显示1A形式或1B形式的69A02和/或82H02双特异性TCE、参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)或结合ROR1卷曲结构域的1A形式参考TCE(Ref.结合Frz的TCE 1A)在与hROR1+MDA-MB-231肿瘤细胞(图4A)或hROR1-T47D肿瘤细胞(图4B)共培养24小时的新鲜分离的外周血单核细胞(PBMC)上诱导细胞毒性活性的滴定的图。图4C和4C是显示1A形式或1B形式的69A02和/或82H02双特异性TCE、参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)或结合ROR1卷曲结构域的1A形式参考TCE(Ref.结合Frz的TCE 1A)在与hROR1+MDA-MB-231肿瘤细胞(图4C)或hROR1-T47D肿瘤细胞(图4D)共培养24小时的新鲜分离的外周血单核细胞(PBMC)上诱导IFNγ释放的滴定的图。图4E是显示1A形式或1B形式的69A02或82H02双特异性TCE或结合ROR1卷曲结构域的1A形式参考TCE(Ref.结合Frz的TCE 1A)对细胞毒性活性的诱导与促炎细胞因子释放的诱导解偶联的程度，由参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)所得值标准化的柱状图。
图5A是显示1A形式或1B形式的69A02或82H02双特异性TCE、参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)或结合ROR1卷曲结构域的1A形式参考TCE(Ref.结合Frz的TCE 1A)，在与hROR1+MDA-MB-231肿瘤细胞共培养24小时的CD8+T细胞上诱导细胞毒性活性的滴定的图。图5B是显示1A形式或1B形式的69A02或82H02双特异性TCE、参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)或结合ROR1卷曲结构域的1A形式参考TCE(Ref.结合Frz的TCE 1A)，在与hROR1+MDA-MB-231肿瘤细胞共培养24小时的CD8+T细胞上诱导IFNγ产生的滴定的图。图5C和图5D是显示1A形式或1B形式的69A02双特异性TCE或结合ROR1卷曲结构域的1A形式参考TCE(Ref.结合Frz的TCE)在分别与MCF-7肿瘤细胞和T47D细胞共培养24小时的CD8+T细胞上诱导IFNγ产生的滴定的图。
图6A是显示在1A形式或1B形式的69A02或82H02双特异性TCE、参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)或结合ROR1卷曲结构域的1A形式或1B形式参考TCE(Ref.结合Frz的TCE)存在下，对从三阴性乳腺癌(TNBC)活检扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)对hROR1+NCI-H1975肿瘤细胞的连续杀伤频率的柱状图。图6B是显示在1A形式或1B形式的69A02或82H02双特异性TCE、参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)或结合ROR1卷曲结构域的1A形式或1B形式参考TCE(Ref.结合Frz的TCE)存在下，对从TNBC活检扩增的TIL对hROR1-T47D肿瘤细胞的连续杀伤频率的柱状图。
图7A是显示1A形式的82H02双特异性TCE(82H02 TCE 1A)或参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)在与hROR1+Du-145、A549、NCI-H1975、MDA-MB-231、NCCIT肿瘤细胞或hROR1-MCF-7肿瘤细胞共培养24小时的新鲜分离的外周血单核细胞(PBMC)上诱导的细胞毒性活性的滴定的图。图7B是显示1A形式的82H02双特异性TCE(82H02 TCE 1A)或参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)在与hROR1+Du-145、A549、NCI-H1975、MDA-MB-231、NCCIT肿瘤细胞或hROR1-MCF-7肿瘤细胞共培养24小时的新鲜分离的外周血单核细胞(PBMC)上诱导的IFNγ释放的滴定的图。图7C是显示1B形式的82H02双特异性TCE(82H02 TCE 1B)或参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)在与hROR1+Du-145、A549、NCI-H1975、MDA-MB-231、NCCIT肿瘤细胞或hROR1-MCF-7肿瘤细胞共培养24小时的新鲜分离的外周血单核细胞(PBMC)上诱导的细胞毒性活性的滴定的图。图7D是显示1B形式的82H02双特异性TCE(82H02 TCE 1B)或参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)在与hROR1+Du-145、A549、NCI-H1975、MDA-MB-231、NCCIT肿瘤细胞或hROR1-MCF-7肿瘤细胞共培养24小时的新鲜分离的外周血单核细胞(PBMC)上诱导的IFNγ释放的滴定的图。图7E是显示结合ROR1卷曲结构域的1A形式参考TCE(Ref.结合Frz的TCE)或参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)在与hROR1+Du-145、A549、NCI-H1975、MDA-MB-231、NCCIT肿瘤细胞或hROR1-MCF-7肿瘤细胞共培养24小时的新鲜分离的外周血单核细胞(PBMC)上诱导的细胞毒性活性的滴定的图。图7F是显示结合ROR1卷曲结构域的1A形式参考TCE(Ref.结合Frz的TCE)或参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)在与hROR1+Du-145、A549、NCI-H1975、MDA-MB-231、NCCIT肿瘤细胞或hROR1-MCF-7肿瘤细胞共培养24小时的新鲜分离的外周血单核细胞(PBMC)上诱导的IFNγ释放的滴定的图。
图8A和8B是显示1A形式或1B形式的82H02双特异性TCE、参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)或结合ROR1卷曲结构域的1A形式或1B形式参考TCE(Ref.结合Frz的TCE)在与hROR1+MDA-MB-231肿瘤细胞共培养24小时的人CD8+T细胞(图8)或食蟹猴CD8+T细胞(图8B)上诱导细胞毒性活性的滴定的图。图8C和8D是显示1A形式或1B形式的82H02双特异性TCE、参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)或结合ROR1卷曲结构域的1A形式或1B形式参考TCE(Ref.结合Frz的TCE)在与hROR1+MDA-MB-231肿瘤细胞共培养24小时的人CD8+T细胞(图8C)或食蟹猴CD8+T细胞(图8D)上诱导IFNγ释放的滴定的图。
图9A和9C是显示1A形式或1B形式的82H02双特异性TCE、参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)或结合ROR1卷曲结构域的1A形式或1B形式参考TCE(Ref.结合Frz的TCE)在与人ROR1+4T1肿瘤细胞(图9A)或鼠ROR1+4T1肿瘤细胞(图9C)共培养24小时的敲入人CD3ε的小鼠中新鲜分离的脾细胞上诱导细胞毒性活性的滴定的图。图9B和9D是显示1A形式或1B形式的82H02双特异性TCE、参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)或结合ROR1卷曲结构域的1A形式或1B形式参考TCE(Ref.结合Frz的TCE)在与人ROR1+4T1肿瘤细胞(图9B)或鼠ROR1+4T1肿瘤细胞(图9D)共培养24小时的敲入人CD3ε的小鼠中新鲜分离的脾细胞上诱导IFNγ释放的滴定的图。图9E和9F是显示1A形式或1B形式的82H02双特异性TCE或结合ROR1卷曲结构域的1A形式或1B形式参考TCE(Ref.结合Frz的TCE)对hROR-1+4T1肿瘤细胞(图9E)或mROR1+4T1肿瘤细胞(图9F)的细胞毒性活性的诱导与促炎细胞因子释放的诱导解偶联的程度，由参考T细胞结合物(参考T细胞结合物)所得值标准化的柱状图。图10A至图10D是1A形式或1B形式的82H02双特异性TCE、OKT3α-CD3阳性对照(OKT3)、hIgG1同种型对照(hIgG1)、参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)或结合ROR1卷曲结构域的1A形式或1B形式参考TCE(Ref.结合Frz的TCE)，在以1.0X 107个细胞/ml的细胞密度培养的来自健康人供者的新鲜分离的PBMC上诱导IFNγ(图10A)、TNFα(图10B)、IL-10(图10C)或IL-2(图10D)释放的滴定的图。
图11A至图11D是1A形式或1B形式的82H02双特异性TCE、OKT3α-CD3阳性对照(OKT3)、hIgG1同种型对照(hIgG1)、参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)或结合ROR1卷曲结构域的1A形式或1B形式参考TCE(Ref.结合Frz的TCE)，在以1X 107个细胞/ml的细胞密度预培养48小时的来自健康人供者的PBMC上诱导IFNγ(图11A)、TNFα(图11B)、IL-10(图11C)或IL-2(图11D)释放的滴定的图。
图12A和12B是显示四种序列优化的1A形式82H02双特异性TCE(82H02TCE#1、82H02TCE#2、82H02 TCE#3、82H02 TCE#4)、人IgG1同种型对照(hIgG1)或参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)，对于人CD8+细胞(图12A)或食蟹猴泛-T细胞(图12B)的结合CD3的多肽臂的表观结合亲和力。
图13A至13D是显示序列优化的1A形式82H02双特异性TCE(图13A；82H02#1，82H02#2，图13B；82H02#3，82H02#4)、人IgG1同种型对照(hIgG1)或参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)的结合ROR1的多肽臂对于MDA-MB-231肿瘤细胞(图13A和图13B)或mROR1+4T1肿瘤细胞(图13C和图13D)的表观结合亲和力的图。
图14A是显示四种序列优化的1A形式的82H02双特异性TCE(82H02TCE#1、82H02TCE#2、82H02 TCE#3、82H02 TCE#4)或参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)在与hROR1+MDA-MB-231肿瘤细胞共培养24小时的新鲜分离的外周血单核细胞(PBMC)上诱导的细胞毒性活性的滴定的图。图14B是显示四种序列优化的1A形式的82H02双特异性TCE(82H02 TCE#1、82H02 TCE#2、82H02 TCE#3、82H02 TCE#4)或参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)在与hROR1+MDA-MB-231肿瘤细胞共培养24小时的新鲜分离的外周血单核细胞(PBMC)上诱导的IFNγ释放的滴定的图。图14C是显示四种序列优化的1A形式82H02双特异性TCE(82H02TCE#1、82H02 TCE#2、82H02 TCE#3、82H02 TCE#4)对细胞毒性活性的诱导与对促炎细胞因子释放的诱导解偶联的程度的，由参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)所得值标准化的柱状图。图15是显示在四个序列优化的1A形式82H02双特异性TCE(82H02 TCE#1、82H02 TCE#2、82H02 TCE#3、82H02 TCE#4)或参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)存在的情况下，由从三阴性乳腺癌(TNBC)活检扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)对hROR1+NCI-H1975肿瘤细胞的连续杀伤频率的柱状图。
图16A至16F是显示四种序列优化的1A形式的82H02双特异性TCE(82H02 TCE#1、82H02 TCE#2、82H02 TCE#3、82H02 TCE#4)或参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)在与MDA-MB-231肿瘤细胞共培养24小时的新鲜分离的外周血单核细胞(PBMC)上诱导的细胞毒性活性的滴定的图，所述MDA-MB-231肿瘤细胞具有约7X 106个分子/细胞(图16A)、1.3X 106个分子/细胞(图16B)、6X 105个分子/细胞(图16C)、4X 105个分子/细胞(图16D)、2X 105个分子/细胞(图16E)的hROR1表达的细胞表面密度，或为hROR1敲除细胞(图16F)。
图17A至17F是显示四种序列优化的1A形式的82H02双特异性TCE(82H02 TCE#1、82H02 TCE#2、82H02 TCE#3、82H02 TCE#4)或参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)在与MDA-MB-231肿瘤细胞共培养24小时的新鲜分离的外周血单核细胞(PBMC)上诱导的IFNγ释放的滴定的图，所述MDA-MB-231肿瘤细胞具有约7X 106个分子/细胞(图17A)、1.3X 106个分子/细胞(图17B)、6X 105个分子/细胞(图17C)、4X 105个分子/细胞(图17D)、2X 105个分子/细胞(图17E)的hROR1表达的细胞表面密度，或为hROR1敲除细胞(图17F)。
图18是显示四种序列优化的1A形式82H02双特异性TCE(82H02 TCE#1、82H02 TCE#2、82H02 TCE#3、82H02 TCE#4)对针对MDA-MB-231肿瘤细胞的细胞毒性活性的诱导与对促炎细胞因子释放的诱导解偶联的程度的，由参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)所得值标准化的柱状图，所述MDA-MB-231肿瘤细胞具有约2X 105、4X 105、6X 105、1.3X 106或7X 106个分子/细胞的hROR1表达的细胞表面密度。图19是显示用本公开的scFv-Fc形式的结合ROR1的克隆(82H02 scFv-Fc和69A02 scFv-Fc)、scFv形式参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物scFv-Fc)或结合卷曲的scFv-Fc形式参考克隆(Ref.结合Frz的scFv-Fc)预处理，然后与Alexa Fluor 647-偶联的Zenon片段标记的82H02 scFv-Fc一起孵育，在竞争性结合试验中，NCCIT细胞培养物的平均荧光强度(MFI)的图。
具体实施方式
本申请提供了双特异性蛋白，其结合肿瘤细胞表面上的TAA(例如，RORl)和T细胞表面上的CD3，并且能够诱导针对ROR1+肿瘤细胞的有效T细胞细胞毒活性。这种抗肿瘤细胞毒性诱导活性与其诱导促炎细胞因子产生的能力解偶联。在一些实施方式中，本申请还提供了使用此类蛋白质来治疗癌症的治疗方法。本申请所述的双特异性蛋白质的各个方面如下文中分节阐述；然而，一个特定章节中描述的蛋白质的各方面并不限于任何特定章节。本申请还提供了特异性结合ROR1的Ig样结构域的抗体。
定义
为了便于理解本申请，下面定义了多项术语和短语。
文中所用术语“一个”、“一种”和“该”旨在表示“一个/种或多个/种”并且包括复数，除非与上下文不合适。
如本文所用，术语“抗原结合位点”指免疫球蛋白(Ig)分子中参与抗原结合的部分。在人抗体中，抗原结合位点由重(“H”)链和轻(“L”)链的N端可变(“V”)结构域的氨基酸残基形成。重链和轻链的V区中三个高度分化的分支(被称作“高变区”)位于更保守的侧翼分支(被称作“框架区”或“FR”)之间。因此，术语“FR”表示免疫球蛋白中在天然情况下存在于高变区之间或邻近高变区的氨基酸序列。在人抗体分子中，轻链的3个高变区和重链的3个高变区在三维空间中彼此相对设置以形成抗原-结合表面。抗原结合表面与抗原结合位点特异性结合的抗原的三维表面互补，且每条重链和轻链的三个高变区均被称作“互补决定区”或“CDR”。在某些动物，例如骆驼和软骨鱼中，抗原结合位点由“单域抗体”提供的单个抗体链形成。抗原结合位点可以存在于完整抗体中、保留抗原结合表面的抗体的抗原结合片段中(例如，Fab、Fab'、F(ab')2或重组多肽中，例如scFv，使用肽接头将单个多肽、微型抗体或纳米抗体(VHH)中的重链可变结构域连接到轻链可变结构域。
如本文所用，术语“其功能片段”是指保持执行整个蛋白质或多肽的生物学功能的能力的蛋白质或多肽的一部分。例如，本申请的多肽或蛋白质的功能性片段保持其结合其同源结合伴侣或配体的能力。
如本文所用，术语“对象”和“患者”是指待通过本文描述的方法和组合物治疗的生物体。此类生物体优选包括但不限于哺乳动物(例如鼠、猿、马、牛、猪、犬、猫等)，更优选包括人。
如本文所用，术语“有效量”是指足以实现有益或期望结果的化合物(例如，本申请的双特异性蛋白质或抗体)的量。有效量可以在一种或多种施用、应用或剂量中给予并且不旨在限于特定制剂或给予途径。如本文所用，术语“治疗”包括导致病症、疾病、病况等改进或改善其症状的任何效果，例如减轻、降低、调节、改善或消除。
如本文所用，“显著地”或“显著的”是指可测量参数的变化或改变达到根据适当的统计相关测试确定的统计显著的程度。例如，在一些实施方式中，如果根据例如斯氏t检验、卡方检验或曼惠特尼检验具有统计学显著性，则变化或改变是显著的。
如本文所用，RORl或ROR-1指的是SEQ ID NO:268的蛋白质及其相关同种型和直向同源物。
ROR1氨基酸序列：
MHRPRRRGTRPPLLALLAALLLAARGAAAQETELSVSAELVPTSSWNISSELNKDSYLTLDEPMNNITTSLGQTAELHCKVSGNPPPTIRWFKNDAPVVQEPRRLSFRSTIYGSRLRIRNLDTTDTGYFQCVATNGKEVVSSTGVLFVKFGPPPTASPGYSDEYEEDGFCQPYRGIACARFIGNRTVYMESLHMQGEIENQITAAFTMIGTSSHLSDKCSQFAIPSLCHYAFPYCDETSSVPKPRDLCRDECEILENVLCQTEYIFARSNPMILMRLKLPNCEDLPQPESPEAANCIRIGIPMADPINKNHKCYNSTGVDYRGTVSVTKSGRQCQPWNSQYPHTHTFTALRFPELNGGHSYCRNPGNQKEAPWCFTLDENFKSDLCDIPACDSKDSKEKNKMEILYILVPSVAIPLAIALLFFFICVCRNNQKSSSAPVQRQPKHVRGQNVEMSMLNAYKPKSKAKELPLSAVRFMEELGECAFGKIYKGHLYLPGMDHAQLVAIKTLKDYNNPQQWTEFQQEASLMAELHHPNIVCLLGAVTQEQPVCMLFEYINQGDLHEFLIMRSPHSDVGCSSDEDGTVKSSLDHGDFLHIAIQIAAGMEYLSSHFFVHKDLAARNILIGEQLHVKISDLGLSREIYSADYYRVQSKSLLPIRWMPPEAIMYGKFSSDSDIWSFGVVLWEIFSFGLQPYYGFSNQEVIEMVRKRQLLPCSEDCPPRMYSLMTECWNEIPSRRPRFKDIHVRLRSWEGLSSHTSSTTPSGGNATTQTTSLSASPVSNLSNPRYPNYMFPSQGITPQGQIAGFIGPPIPQNQRFIPINGYPIPPGYAAFPAAHYQPTGPPRVIQHCPPPKSRSPSSASGSTSTGHVTSLPSSGSNQEANIPLLPHMSIPNHPGGMGITVFGNKSQKPYKIDSKQASLLGDANIHGHTESMISAEL(SEQ ID NO:268)
如本文所用，CD3是指包含CD3ε(SEQ ID NO:269)、CD3γ(SEQ ID NO:270)、CD3δ(SEQ ID NO:271)和CD3ξ(SEQ ID NO:96)多肽的蛋白质，其与T细胞受体α/β和γ/δ异二聚体一起形成T细胞受体-CD3复合物。
CD3ε序列：
MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI(SEQ ID NO:269)
CD3γ序列：
MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATISGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGQDGVRQSRASDKQTLLPNDQLYQPLKDREDDQYSHLQGNQLRRN(SEQ ID NO:270)
CD3δ序列：
MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIATLLLALGVFCFAGHETGRLSGAADTQALLRNDQVYQPLRDRDDAQYSHLGGNWARNK(SEQ ID NO:271)
CD3ξ序列：
MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:96)
对于本文中呈现的具有信号肽的序列，应理解，蛋白质的成熟形式表达没有信号肽。
在本文中，当蛋白质被描述为具有、包括或包含特定组分时，或者当过程和方法被描述为具有、包括或包含特定步骤时，应进一步设想基本由或由所列举的组分组成的本发明所述蛋白质，以及基本由或由所列举的处理步骤组成的本发明过程和方法。
I.蛋白质
本申请提供特异性结合TAA的双特异性蛋白质。
在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质诱导针对某些表达TAA细胞的强烈T细胞细胞毒性，但不诱导显著量的细胞因子释放。
在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质诱导针对表达TAA的细胞的强烈T细胞细胞毒性，但不诱导显著量的细胞因子释放，所述双特异性蛋白质包括两个臂，第一臂和第二臂，第一臂包含位于其N端的第一组分和位于其C端的第二组分，所述第一组分特异性结合TAA，所述第二组分特异性结合相同的TAA，第二臂包含位于其N端的组分，所述组分特异性结合CD3。
例如，在一些实施方式中，本申请的双特异性蛋白以二价方式特异性结合癌细胞上表达的RORl的Ig样结构域。与高亲和力和/或单价抗体相比，本申请的蛋白质具有基于ROR1表面密度区分靶肿瘤细胞和脱靶非肿瘤细胞的更强能力。此外，通过桥接靶肿瘤细胞表面上的ROR1和T细胞表面上的CD3，本申请的蛋白质激活CD8+T细胞的细胞毒活性并诱导T细胞连续杀伤表达ROR1的肿瘤细胞。这种细胞毒活性与T细胞细胞因子释放的诱导解偶联。
本公开的双特异性蛋白质包含两个臂，每个臂包含至少一个组分(例如，多肽或两种或更多种多肽的复合物)，其中第一臂包含位于其N端或C端的特异性结合RORl的第一组分。在一些实施方式中，第二臂包含位于其N端或C端的特异性结合CD3的组分，并且第一臂还包含位于第一组分相反端的特异性结合ROR1的第二组分。在其他实施方式中，第二臂包含位于其N端或C端的特异性结合CD3的组分，并且还包含特异性结合ROR1的第二组分，所述第二组分位于第二臂的特异性结合CD3组分的相反端。在一些实施方式中，特异性结合ROR1的第一和第二组分可包含单一多肽。在一些实施方式中，特异性结合CD3的组分可包含两种或更多种多肽的复合物。在一些实施方式中，特异性结合CD3的组分的两种或更多种多肽的复合物可以通过一个或多于一个共价连接(例如二硫键)和/或一个或多于一个非共价相互作用(例如离子或疏水相互作用)连接。下文提供了示例性双特异性蛋白质的进一步说明。
本公开的双特异性蛋白质包含第一组分和第二组分，其是特异性结合RORl的多肽或两种或更多种多肽的复合物。在一些实施方式中，第一组分和第二组分可以是但不限于一个或多个抗原结合位点，例如，单链可变片段(scFv)、抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、微型抗体或纳米抗体(VHH)。
本公开的双特异性蛋白质包含为特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物的组分。在一些实施方式中，该组分可以是但不限于一个或多个抗原结合位点，例如，Fab、抗体、Fab’、F(ab’)2、单链可变片段(scFv)、微型抗体或纳米抗体(VHH)。
在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质另外包含桥接部分，所述桥接部分可包括但不限于：链交换工程改造的结构域(SEED)形式免疫球蛋白Fc结构域或其功能性片段、免疫球蛋白Fc结构域或其功能性片段、多肽接头或多肽铰链。在一些实施方式中，桥接部分包含一个或多于一个促进蛋白质的两个臂异二聚化的突变。在一些实施方式中，桥接部分是包含第一和第二多肽的SEED形式免疫球蛋白Fc结构域。在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质还包含紧邻SEED形式免疫球蛋白Fc结构域的第一和第二多肽各自的N端的铰链多肽。
在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质还包含接头多肽，其将特异性结合RORl的第一组分或第二组分、或特异性结合CD3的组分连接至桥接部分的N端或C端。
在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质诱导针对某些表达TAA细胞的强烈T细胞细胞毒性，但不诱导显著量的细胞因子释放，其包含：(i)第一臂，从N端到C端包含：第一组分，其包含特异性结合TAA的多肽或两种或更多种多肽的复合物，第一铰链多肽，SEED形式免疫球蛋白Fc结构域的第一多肽，和第二组分，所述第二组分包含特异性结合TAA的多肽或两种或更多种多肽的复合物；和(ii)第二臂，其从N端到C端包含特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，第二铰链多肽和SEED形式免疫球蛋白Fc结构域的第二多肽，其中SEED形式免疫球蛋白Fc结构域的第一和第二多肽二聚化。
本文所述的双特异性蛋白质可以采取多种形式/型(format)。例如，一种双特异性蛋白质形式/型包含：(i)第一臂，从N端到C端包含：第一组分，其包含特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物，第一铰链多肽，SEED形式免疫球蛋白Fc结构域的第一多肽，和第二组分，所述第二组分包含特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物；和(ii)第二臂，其从N端到C端包含特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，第二铰链多肽和SEED形式免疫球蛋白Fc结构域的第二多肽，其中SEED形式免疫球蛋白Fc结构域的第一和第二多肽二聚化。在此形式中，特异性结合ROR1的第一和第二组分是抗原结合位点(例如，scFv、抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、微型抗体或VHH)，并且特异性结合CD3的组分是抗原结合位点(例如，Fab、scFv、抗体、Fab’、F(ab’)2、微型抗体或VHH)。在一些实施方式中，特异性结合ROR1的第一和第二组分是scFv，且特异性结合CD3的组分是Fab(图1A)。在一些实施方式中，特异性结合CD3的组分包含Fab，其中部分铰链(例如，具有SEQ ID NO:133序列的多肽)被连接至Fab重链(HC)CH1结构域的C端并与Fab轻链(LC)形成二硫键。这种形式的双特异性蛋白质还可以任选地包含将SEED形式免疫球蛋白Fc结构域的第一多肽的C端连接到特异性结合ROR1的第二组分的N端的接头多肽。
另一种双特异性蛋白质形式包含：(i)第一臂，从N端到C端包含：第一组分，其包含特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物，第一铰链多肽，SEED形式免疫球蛋白Fc结构域的第一多肽，和包含特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的组分；和(ii)第二臂，其从N端到C端包含：第二组分，其包含特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物，第二铰链多肽和SEED形式免疫球蛋白Fc结构域的第二多肽，其中SEED形式免疫球蛋白Fc结构域的第一和第二多肽二聚化。在此形式中，特异性结合ROR1的第一和第二组分是抗原结合位点(例如，scFv、抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、微型抗体或VHH)，并且特异性结合CD3的组分是抗原结合位点(例如，Fab、scFv、抗体、Fab’、F(ab’)2、微型抗体或VHH)。在一些实施方式中，特异性结合ROR1的第一和第二组分是scFv，且特异性结合CD3的组分是Fab(图1B)。在一些实施方式中，特异性结合CD3的组分包含Fab，其中部分铰链(例如，具有SEQID NO:133序列的多肽)被连接至Fab重链(HC)CH1结构域的C端并与Fab轻链(LC)形成二硫键。这种形式的双特异性蛋白质还可以任选地包含将SEED形式免疫球蛋白Fc结构域的第一多肽的C端连接到特异性结合CD3的组分的N端的接头多肽。
在另一种形式中，双特异性蛋白质包含：(i)第一臂，从N端到C端包含：第一组分，其包含特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物，第一铰链多肽，免疫球蛋白Fc结构域的第一多肽，和第二组分，所述第二组分包含特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物；和(ii)第二臂，其从N端到C端包含特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，第二铰链多肽和免疫球蛋白Fc结构域的第二多肽，其中免疫球蛋白Fc结构域的第一和第二多肽各自包含一个或多于一个促进第一臂和第二臂异二聚化的突变。在此形式中，特异性结合ROR1的第一和第二组分是抗原结合位点(例如，scFv、抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、微型抗体或VHH)，并且特异性结合CD3的组分是抗原结合位点(例如，Fab、scFv、抗体、Fab’、F(ab’)2、微型抗体或VHH)。在一些实施方式中，特异性结合ROR1的第一和第二组分是scFv，且特异性结合CD3的组分是Fab(图1A)。在一些实施方式中，特异性结合CD3的组分包含Fab，其中部分铰链(例如，具有SEQ ID NO:133序列的多肽)被连接至Fab重链(HC)CH1结构域的C端并与Fab轻链(LC)形成二硫键。这种形式的双特异性蛋白质还可以任选地包含将免疫球蛋白Fc结构域的第一多肽的C端连接到特异性结合ROR1的第二组分的N端的接头多肽。
在又一种形式中，双特异性蛋白质包含：(i)第一臂，从N端到C端包含：第一组分，其包含特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物，第一铰链多肽，免疫球蛋白Fc结构域的第一多肽，和第二组分，所述第二组分包含特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物；和(ii)第二臂，其从N端到C端包含：包含特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物的第二组分，第二铰链多肽，和免疫球蛋白Fc结构域的第二多肽，其中免疫球蛋白Fc结构域的第一和第二多肽各自包含一个或多于一个促进第一臂和第二臂异二聚化的突变。在此形式中，特异性结合ROR1的第一和第二组分是抗原结合位点(例如，scFv、抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、微型抗体或VHH)，并且特异性结合CD3的组分是抗原结合位点(例如，Fab、scFv、抗体、Fab’、F(ab’)2、微型抗体或VHH)。在一些实施方式中，特异性结合ROR1的第一和第二组分是scFv，且特异性结合CD3的组分是Fab(图1B)。在一些实施方式中，特异性结合CD3的组分包含Fab，其中部分铰链(例如，具有SEQ ID NO:133序列的多肽)被连接至Fab重链(HC)CH1结构域的C端并与Fab轻链(LC)形成二硫键。这种形式的双特异性蛋白质还可以任选地包含将免疫球蛋白Fc结构域的第一多肽的C端连接到特异性结合CD3的组分的N端的接头多肽。
下文更详细地描述蛋白质的各个组分。
I.A特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物
特异性结合肿瘤细胞表面上的RORl的多肽或两种或更多种多肽的复合物发挥将本公开的双特异性蛋白质靶向血液肿瘤细胞的作用，所述血液肿瘤细胞例如慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞和套细胞白血病(MCL)细胞，以及实体瘤细胞，例如卵巢、肺、胃、前列腺、子宫和乳腺肿瘤细胞。尽管ROR1在细胞表面以相对较低的密度表达，但它被认为是相对特异性的TAA。因此，本公开的结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物对正常、非癌性、成体组织具有有限的结合。在一些实施方式中，与本领域已知的结合ROR1高亲和力和/或单价抗体相比，本公开的结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物具有相对较低的结合亲和力。在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质包含两种较低亲和力的结合的ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物，从而使其能够更强地区分具有不同表面ROR1表达密度的细胞。
如本文所用，特异性结合RORl的多肽或两种或更多种多肽的复合物是结合具有序列SEQ ID NO:268和相关同种型和直向同源物的蛋白质的多肽或两种或更多种多肽的复合物。在一些实施方式中，结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物特异性结合ROR1胞外结构域上的一个或多于一个表位。在一些实施方式中，结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物特异性结合ROR1的远端Ig样结构域(SEQ ID NO:99)。在一些实施方式中，本公开的结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物不结合ROR1的卷曲结构域或Kringle结构域(分别为SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:105)。
ROR1 Ig-样结构域：
PTSSWNISSELNKDSYLTLDEPMNNITTSLGQTAELHCKVSGNPPPTIRWFKNDAPVVQEPRRLSFRSTIYGSRLRIRNLDTTDTGYFQCVATNGKEVVSSTGVLF(SEQ ID NO:99)
ROR1卷曲结构域：
EEDGFCQPYRGIACARFIGNRTVYMESLHMQGEIENQITAAFTMIGTSSHLSDKCSQFAIPSLCHYAFPYCDETSSVPKPRDLCRDECEILENVLCQTEYIFARSNPMILMRLKLPNCEDLPQPESPEAANCIRI(SEQ IDNO:102)
ROR1 Kringle结构域：
KCYNSTGVDYRGTVSVTKSGRQCQPWNSQYPHTHTFTALRFPELNGGHSYCRNPGNQKEAPWCFTLDENFKSDLCDIPAC(SEQ ID NO:105)
在一些实施方式中，特异性结合RORl的多肽或两种或更多种多肽的复合物包括但不限于单链可变片段(scFv)、抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、微型抗体或纳米抗体(VHH)。例如，在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质包含各自特异性结合ROR1的Ig样结构域的两个scFv多肽。
在一些实施方式中，特异性结合RORl的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。表1列出了VH和VL互补决定区(CDR)，它们组合起来能够特异性结合ROR1。在一些实施方式中，特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含选自表1中列出的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3序列的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3序列，前述是根据IMGT独特编号方案、Kabat(参见Kabat等,(1991)具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest),NIH公开号91-3242,Bethesda)、Chothia(参见，例如，ChothiaC&Lesk A M,(1987),J.Mol.Biol.196:901-917)、MacCallum(参见MacCallum R M等,(1996)J.Mol.Biol.262:732-745)或本领域已知的任何其他CDR确定方法确定的。
除非另有说明，表1中提供的CDR序列是根据IMGT独特编号方案确定的。
表1：特异性结合RORl的多肽或两种或更多种多肽的复合物的VHCDR和VLCDR序列
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在一些实施方式中，特异性结合RORl的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含：(i)VHCDRl，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:23；(ii)VHCDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:24；(iii)VHCDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:25；(iv)VLCDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:26；(v)VLCDR2，其包含氨基酸序列DAS或GAS；和(vi)VLCDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:28。例如，在一些实施方式中，特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含VLCDR3，所述VLCDR3包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
在一些实施方式中，特异性结合RORl的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含：(i)VHCDRl，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:8；(ii)VHCDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:9；(iii)VHCDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:10；(iv)VLCDR1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:11；(v)VLCDR2，其包含氨基酸序列DAS；和(vi)VLCDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:14。
在一些实施方式中，特异性结合RORl的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含：(i)VHCDRl，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:8；(ii)VHCDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:9；(iii)VHCDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:10；(iv)VLCDR1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:11；(v)VLCDR2，其包含氨基酸序列DAS；和(vi)VLCDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:15。
在一些实施方式中，特异性结合RORl的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含：(i)VHCDRl，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:23；(ii)VHCDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:24；(iii)VHCDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:25；(iv)VLCDR1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:26；(v)VLCDR2，其包含氨基酸序列GAS；和(vi)VLCDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:28。
表2列出了示例性VH和VL结构域的氨基酸序列，其组合能够特异性结合RORl。在一些实施方式中，本公开的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含VH和VL，所述VH和VL与表2中所列出的VH结构域和VL序列具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性。在某些实施方式中，表2中所公开的VH和VL序列的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3和VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3序列是根据IMGT独特编号方案、Kabat(参见Kabat等,(1991)具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest),NIH公开号91-3242,Bethesda)、Chothia(参见，例如，Chothia C&Lesk A M,(1987),J.Mol.Biol.196:901-917)、MacCallum(参见MacCallum R M等,(1996)J.Mol.Biol.262:732-745)或本领域已知的任何其他CDR确定方法确定。
除非另有说明，表2中提供的CDR序列是根据IMGT独特编号方案确定的。
表2：特异性结合RORl的多肽或两种或更多种多肽的复合物的VH和VL序列
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在一些实施方式中，特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含：(i)与SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:39具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的VH，和(ii)与SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:40具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的VL。
在一些实施方式中，特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含：(i)与SEQ ID NO:29具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的VH；和(ii)与SEQ IDNO:30具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的VL。
在一些实施方式中，特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含：(i)与SEQ ID NO:29具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的VH；和(ii)与SEQ IDNO:31具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的VL。
在一些实施方式中，特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含：(i)与SEQ ID NO:39具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的VH；和(ii)与SEQ IDNO:40具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的VL。
在一些实施方式中，特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物是scFv形式。在一些实施方式中，本公开的结合ROR1的scFv包含连接VH结构域和VL结构域的接头多肽。在一些实施方式中，接头多肽包含序列(GGGGS)n(SEQ ID NO:1)，其中n是1-12。例如，在一些实施方式中，结合ROR-1的scFv从N端到C端包含VL结构域、接头多肽和VH结构域。在其他实施方式中，结合ROR-1的scFv从N端到C端包含VH结构域、接头多肽和VL结构域。
表3列出了示例性的结合ROR1的scFv的氨基酸序列。在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质包含两个scFv，其包含的scFv序列至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)与表3中所列出的scFv序列相同。
表3：示例性的结合ROR1的scFv氨基酸序列
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在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质包含特异性结合ROR1的scFv，其包含：与SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:49或SEQ ID NO:59具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质包含特异性结合ROR1的两个scFv，其各自包含：与SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:59具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质包含特异性结合RORl的scFv，其包含与SEQ ID NO:41具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质包含两个特异性结合RORl的scFv，其各自包含与SEQ ID NO:41具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质包含特异性结合RORl的scFv，其包含与SEQ ID NO:42具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质包含两个特异性结合RORl的scFv，其各自包含与SEQ ID NO:42具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质包含特异性结合RORl的scFv，其包含与SEQ ID NO:59具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质包含两个特异性结合RORl的scFv，其各自包含与SEQ ID NO:59具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的氨基酸序列。
I.B特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物
本公开的双特异性蛋白质包含特异性结合T细胞表面上的CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物。在一些实施方式中，多肽或两种或更多种多肽的复合物特异性结合CD3/T细胞受体复合物的CD3ε链，其广泛表达于所有成熟T淋巴细胞上，例如αβT细胞、γδT细胞、NK-T细胞、粘膜相关不变T(MAIT)细胞及其表型亚群。在一些实施方式中，CD3ε链的结合在桥接到ROR1时诱导T细胞的活化。
如本文所用，特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物是特异性结合CD3ε(SEQ ID NO:269)的多肽或两种或更多种多肽的复合物。
在一些实施方式中，特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物包括但不限于Fab、抗体、Fab’、F(ab’)2、单链可变片段(scFv)、微型抗体或纳米抗体(VHH)。
在一些实施方式中，特异性结合RORl的多肽或两种或更多种多肽的复合物包括但不限于单链可变片段(scFv)、抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、微型抗体或纳米抗体(VHH)。例如，在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质包含各自特异性结合ROR1的Ig样结构域的两个scFv多肽。
在一些实施方式中，特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含VH结构域和VL结构域。表4列出了VH和VL CDR，它们组合起来能够特异性结合CD3。在一些实施方式中，特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含选自表4中列出的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3序列的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3序列，前述是根据IMGT独特编号方案、Kabat(参见Kabat等,(1991)具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),NIH公开号91-3242,Bethesda)、Chothia(参见，例如，Chothia C&Lesk A M,(1987),J.Mol.Biol.196:901-917)、MacCallum(参见MacCallum R M等,(1996)J.Mol.Biol.262:732-745)或本领域已知的任何其他CDR确定方法确定的。
除非另有说明，表4中提供的CDR序列是根据IMGT独特编号方案确定的。
表4：特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物的VHCDR和VLCDR序列
在一些实施方式中，特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含：(i)VHCDRl，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:61；(ii)VHCDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:62；(iii)VHCDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:67；(iv)VLCDR1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:64；(v)VLCDR2，其包含氨基酸序列GT；和(vi)VLCDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:66。例如，在一些实施方式中，特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含VHCDR3，所述VHCDR3包含SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70的氨基酸序列。
在某些实施方式中，特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含：(i)VHCDRl，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:61；(ii)VHCDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:62；(iii)VHCDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:63；(iv)VLCDR1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:64；(v)VLCDR2，其包含氨基酸序列GT；和(vi)VLCDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:66。
在一些实施方式中，特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含：(i)VHCDRl，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:61；(ii)VHCDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:62；(iii)VHCDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:68；(iv)VLCDR1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:64；(v)VLCDR2，其包含氨基酸序列GT；和(vi)VLCDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:66。
表5列出了示例性VH和VL结构域的氨基酸序列，其组合能够特异性结合CD3。在一些实施方式中，本公开的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含VH和VL，所述VH和VL与表5中所列出的VH结构域和VL序列具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性。在某些实施方式中，1A形式或1B形式中所公开的VH和VL序列的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3和VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3序列是根据IMGT独特编号方案、Kabat(参见Kabat等,(1991)具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences ofProteins of Immunological Interest),NIH公开号91-3242,Bethesda)、Chothia(参见，例如，Chothia C&Lesk A M,(1987),J.Mol.Biol.196:901-917)、MacCallum(参见MacCallum R M等,(1996)J.Mol.Biol.262:732-745)或本领域已知的任何其他CDR确定方法确定的。
除非另有说明，表5中提供的CDR序列是根据IMGT独特编号方案确定的。
表5：特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物的VH和VL序列
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在一些实施方式中，特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含：(i)与SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75或SEQ IDNO:80具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的VH；和(ii)与SEQ ID NO:76、SEQ IDNO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:81具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的VL。
在一些实施方式中，特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含：(i)与SEQ ID NO:72具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的VH；和(ii)与SEQ IDNO:81具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的VL。
在一些实施方式中，特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含：(i)与SEQ ID NO:71具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的VH；和(ii)与SEQ IDNO:76具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的VL。
在一些实施方式中，特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物是Fab形式。表6列出了组合后能够特异性结合CD3的重链(HC)和轻链(LC)的多肽序列。在一些实施方式中，重链和轻链以Fab形式排列，其具有与表6中所列出的HC和LC序列至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的HC和LC序列。
表6：特异性结合CD3的Fab形式的抗原结合位点的重链和轻链序列
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在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质包含特异性结合CD3的Fab，所述Fab包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:83具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的氨基酸序列，所述轻链包含与SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:85具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质包含特异性结合CD3的Fab，所述Fab包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO:82具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的氨基酸序列，所述轻链包含与SEQ ID NO:84具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质包含特异性结合CD3的Fab，所述Fab包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO:83具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的氨基酸序列，所述轻链包含与SEQ ID NO:85具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，部分铰链(例如，具有EPKSC(SEQ ID NO:133)序列的多肽)被连接至特异性结合CD3的Fab重链(HC)CH1结构域的C端并与特异性结合CD3的Fab轻链(LC)形成二硫键。
I.C桥接部分
在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质进一步包括桥接部分。在某些实施方式中，桥接部分可以是非功能性的，即仅充当结构连接和/或附属物并且不执行生物学功能或具有生物学目的。在其他实施方式中，桥接部分是功能性的并且在蛋白质的背景下具有生物学功能。
在一些实施方式中，桥接部分的N端连接至特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物的C端，并且桥接部分的C端连接至特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物的N端。在一些实施方式中，桥接部分的N端进一步连接至特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物的C端。在一些实施方式中，桥接部分包含两个多肽臂，其中第一多肽臂的N端连接至特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物的C端，第二多肽臂的C端连接至特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物的N端，并且第二多肽臂的N端连接至特异性结合ROR1的多肽的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物的C端。
在一些实施方式中，桥接部分的N端连接至特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物的C端，并且桥接部分的C端连接至特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物的N端。在一些实施方式中，桥接部分的N端进一步连接至特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物的C端。在一些实施方式中，桥接部分包含两个多肽臂，其中第一多肽臂的N端连接至特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物的C端，第一多肽臂的C端连接至特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物的N端，并且第二多肽臂的N端连接至特异性结合ROR1的多肽的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物的C端。
在一些实施方式中，桥接部分包括但不限于链交换工程改造的结构域(SEED)形式Fc结构域或其功能性片段、免疫球蛋白Fc结构域或其功能性片段、多肽接头或多肽铰链。
SEED形式Fc结构域
在某些实施方式中，桥接部分包含SEED形式的Fc结构域或其功能性片段，其包含两个不对称、互补的多肽臂，指定为AG和GA，每个臂包含IgA和IgG CH3结构域的交替序列。在一些实施方式中，SEED形式Fc结构域的AG和GA多肽臂包含人IgA和IgG CH3结构域的交替序列。在一些实施方式中，SEED形式Fc结构域促进AG/GA异二聚化并且不利于AG和GA同二聚体。
在Fc结构域内，CD16结合由铰链区和CH2结构域介导。例如，在人IgG1中，与CD16的相互作用主要集中在CH2结构域中的氨基酸残基Asp 265–Glu269、Asn 297–Thr 299、Ala327–Ile 332、Leu 234–Ser 239和碳水化合物残基N-乙酰基-D-葡糖胺(参见，Sondermann等,Nature,406(6793):267-273)，根据Kabat中的EU索引编号。基于已知的结构域，可以选择突变来增强或降低与CD16的结合亲和力，例如通过使用噬菌体展示文库或酵母表面展示的cDNA文库，或者可以基于已知相互作用的三维结构设计突变。因此，在某些实施方式中，SEED形式Fc结构域或其功能性部分包含铰链多肽和CH2结构域。
在一些实施方式中，在SEED形式Fc结构域的第一和/或第二多肽臂中，SEED形式AG多肽臂和GA多肽臂各自包含一个或多个突变以减少与Fcγ受体(例如，FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA或FcγRIIIB)或补体组分(例如，C1q)的结合。此类突变可用于降低效应子功能。例如，本公开的双特异性蛋白质包括LALA(L234A和L235A)突变、LALAPA(L234A、L235A和P329A)突变、LALAPG(L234A、L235A和P329G)突变或LALEGAASPS(L234A、L235E、G237A、A330S和P331S)突变。在一些实施方式中，SEED形式Fc结构域的末端赖氨酸残基被突变(K447A)或缺失(K447Δ)。在一些实施方式中，可以突变位置322、330、331、355和358中任一个或多个位置处的氨基酸。除非另有说明，氨基酸取代的位置均按照Kabat中的EU索引编号。
表7列出了SEED形式AG和GA多肽臂的多肽序列，它们在各自的CH3结构域处彼此异二聚化。在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质包含：(i)AG多肽臂，其具有与表7中所列出的AG多肽臂序列至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列；和(ii)GA多肽臂，其具有与表7中所列出的GA多肽臂序列至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。
表7：示例性SEED形式Fc结构域序列
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在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质包含桥接部分，其包含SEED形式AG多肽臂和SEED形式GA多肽臂，所述SEED形式AG多肽臂包含与SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:117或SEQ ID NO:88具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的氨基酸序列，所述SEED形式GA多肽臂包含与SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:118或SEQ ID NO:89具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质包含桥接部分，该桥接部分包含SEED形式AG多肽臂和SEED形式GA多肽臂，所述SEED形式AG多肽臂包含与SEQ ID NO:86具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的氨基酸序列，所述SEED形式GA多肽臂包含与SEQID NO:87具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列相同性的氨基酸序列。
IgGFc异二聚体
在某些实施方式中，桥接部分包括免疫球蛋白Fc结构域。例如，在一些实施方式中，桥接部分包括IgG、IgM、IgA、IgD或IgE Fc结构域。在某些实施方式中，桥接部分包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc结构域。在某些实施方式中，桥接部分包括IgG1 Fc结构域。在某些实施方式中，桥接部分包括人IgG1 Fc结构域。在某些实施方式中，免疫球蛋白Fc结构域桥接部分包含彼此二聚化的免疫球蛋白Fc结构域的第一多肽臂和免疫球蛋白Fc结构域的第二多肽臂。
在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质包括第一免疫球蛋白Fc结构域多肽臂和第二免疫球蛋白Fc结构域多肽臂，它们都是包含一个或多个促进彼此异二聚化的突变的IgGl Fc结构域多肽。在一些实施方式中，促进异二聚化的一个或多个突变位于IgG1 Fc结构域的CH3内。例如，免疫球蛋白Fc结构域可以被工程改造为使用但不限于“杵臼”形式、duobody形式、非对称(azymetric)形式、电荷对形式、crossMab形式、静电转向形式或HA-TF形式进行异二聚化。例如，如果Fc结构域衍生自人IgGl的Fc，则Fc结构域可包含与人IgGl抗体的氨基酸234-332至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，并且在一个或多个位置处不同，所述位置选自根据EU编号法的E345、Q347、Y349、T350、L351、S354、E356、E357、K360、S364、T366、L368、K370、K392、T394、D399、F405、Y407和K409。
在某些实施方式中，免疫球蛋白Fc结构域或其功能性部分包含铰链多肽和CH2结构域。
在某些实施方式中，在人IgGl Fc结构域的第一和/或第二多肽臂中，桥接部分包含人IgGl Fc结构域，其包含一个或多个突变以减少与Fcγ受体(例如，FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA或FcγRIIIB)或补体组分(例如，C1q)的结合。此类突变可用于降低效应子功能。例如，本公开的双特异性蛋白质包括LALA(L234A和L235A)突变、LALAPA(L234A、L235A和P329A)突变、LALAPG(L234A、L235A和P329G)突变或LALEGAASPS(L234A、L235E、G237A、A330S和P331S)突变。在一些实施方式中，人IgG1 Fc结构域的末端赖氨酸残基被突变(K447A)或缺失(K447Δ)。在一些实施方式中，可以突变位置322、330、331、355和358中任一个或多个位置处的氨基酸。除非另有说明，氨基酸取代的位置均按照Kabat中的EU索引编号。
表8列出了彼此异二聚化的免疫球蛋白Fc结构域多肽臂的多肽序列。在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质包含：(i)免疫球蛋白Fc结构域的第一多肽臂，其具有与表8中所列出的第一多肽臂序列至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列；和(ii)免疫球蛋白Fc结构域的第二多肽臂，其具有与表8中所列出的第二多肽臂序列至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。
表8：示例性人免疫球蛋白Fc结构域异二聚体化序列
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铰链多肽
在一些实施方式中，桥接部分包括铰链多肽臂的至少一部分。铰链多肽臂可以是源自免疫球蛋白重链例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其他类。优选地，铰链多肽臂源自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。更优选地，铰链多肽臂源自人IgG1重链。
在一些实施方式中，铰链多肽臂的至少一部分连接至SEED形式Fc结构域的AG多肽臂和GA多肽臂的重链恒定结构域2(CH2)的N端，或人免疫球蛋白Fc结构域的第一多肽臂和第二多肽臂。
在一些实施方式中，铰链多肽臂将特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物的C端连接至SEED形式Fc结构域AG或GA多肽臂的CH2结构域的N端，或免疫球蛋白Fc结构域第一多肽臂或第二多肽臂的CH2结构域的N端。在一些实施方式中，铰链多肽臂将特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物的C端连接至SEED形式Fc结构域AG或GA多肽臂的CH2结构域的N端，或免疫球蛋白Fc结构域第一多肽臂或第二多肽臂的CH2结构域的N端。
在一些实施方式中，铰链多肽臂将特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物的C端连接至SEED形式Fc结构域AG或GA多肽臂的CH2结构域的N端，或免疫球蛋白Fc结构域第一多肽臂或第二多肽臂的CH2结构域的N端。在一些实施方式中，铰链多肽臂将特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物的C端连接至SEED形式Fc结构域AG或GA多肽臂的CH2结构域的N端，或免疫球蛋白Fc结构域第一多肽臂或第二多肽臂的CH2结构域的N端。
在一些实施方式中，在人IgG1的铰链多肽臂中，突变C220、E233、L234或L235位中的任何一个或多个位置上的氨基酸。除非另有说明，氨基酸取代的位置均按照Kabat中的EU索引编号。
表9列出了示例性铰链多肽臂序列。在某些实施方式中，本发明的桥接部分包含铰链多肽臂，其包含与表9中列出的铰链多肽臂序列至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。
表9：示例性铰链多肽臂序列
| 铰链 | 氨基酸序列 |
| 亲本 | EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(SEQ ID NO:91) |
| 亲本C220S | EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGG(SEQ ID NO:193) |
| 82H02(LALA) | EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG(SEQ ID NO:90) |
| 82H02(LALA)(2) | EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGG(SEQ ID NO:92) |
| 69A02(LALA) | EPKSCDKTHTCPPCPAPPVAG(SEQ ID NO:115) |
| 69A02(LALA)(2) | EPKSSDKTHTCPPCPAPPVAG(SEQ ID NO:116) |
在某些实施方式中，本公开的桥接部分包含(i)铰链多肽臂，其包含与SEQID NO:92至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸；和第二铰链多肽臂，其包含与SEQ IDNO:90至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸。
在某些实施方式中，本公开的桥接部分包含(i)铰链多肽臂，其包含与SEQ ID NO:92至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸；和第二铰链多肽臂，其包含与SEQ IDNO:92至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸。
I.D接头
在一些实施方式中，特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物的N端通过接头多肽连接至桥接部分的C端。在其他实施方式中，特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物的N端通过接头多肽连接至桥接部分的C端。
关于接头多肽的氨基酸组成，选择具有赋予柔性性质，并且对本申请中描述的蛋白质的其他结构域和/或多肽的结构和功能的干扰最小的接头多肽序列。还选择能够抵抗蛋白水解裂解的接头多肽序列。例如，甘氨酸和丝氨酸残基通常提供蛋白酶抗性。
在某些实施方式中，本文所述的双特异性蛋白质包含(GlyGlyGlyGlySer)4((G4S)4)接头(SEQ ID NO:249)。接头(例如，柔性接头)的长度可以是“短的”，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸残基，或“长的”，例如，至少13个氨基酸残基。在某些实施方式中，接头长度为10-50、10-40、10-30、10-25、10-20、15-50、15-40、15-30、15-25、15-20、20-50、20-40、20-30或20-25个氨基酸残基。
在某些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质包含一个或多个多肽接头，所述多肽接头包含表10中列出的氨基酸序列或由表10中列出的氨基酸序列组成。
表10：示例性接头多肽
I.E示例性双特异性蛋白质
下文列出的是本发明的双特异性蛋白质的实例，其包括：特异性结合TAA(例如，ROR1)的多肽或两种或更多种多肽的复合物，以及特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物。
在另一方面，本公开的双特异性蛋白质诱导针对表达TAA的细胞的强烈T细胞细胞毒性，但不诱导显著量的细胞因子释放，所述双特异性蛋白质包括两个臂，第一臂和第二臂，第一臂包含位于其N端的第一组分和位于其C端的第二组分，所述第一组分特异性结合TAA，所述第二组分特异性结合相同的TAA，第二臂包含位于其N端的组分，所述组分特异性结合CD3。
在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质诱导针对某些表达TAA细胞的强烈T细胞细胞毒性，但不诱导显著量的细胞因子释放，其包含：(i)第一臂，从N端到C端包含：第一组分，其包含特异性结合TAA的多肽或两种或更多种多肽的复合物，第一铰链多肽，SEED形式免疫球蛋白Fc结构域的第一多肽，和第二组分，所述第二组分包含特异性结合TAA的多肽或两种或更多种多肽的复合物；和(ii)第二臂，其从N端到C端包含特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，第二铰链多肽和SEED形式免疫球蛋白Fc结构域的第二多肽，其中SEED形式免疫球蛋白Fc结构域的第一和第二多肽二聚化。
在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质诱导针对某些表达TAA的肿瘤细胞的强烈T细胞细胞毒性，但不诱导显著量的细胞因子释放，其包含：(i)第一臂，从N端到C端包含：第一组分，其包含特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物，第一铰链多肽，SEED形式免疫球蛋白Fc结构域的第一多肽，第二组分，所述第二组分包含特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物；和(ii)第二臂，其从N端到C端包含特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，第二铰链多肽和SEED形式免疫球蛋白Fc结构域的第二多肽，其中SEED形式免疫球蛋白Fc结构域的第一和第二多肽二聚化。
在一些实施方式中，特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含抗原结合位点(例如：单链可变片段(scFv)；抗体，Fab；Fab’，F(ab’)2，微型抗体；或纳米抗体(VHH))。例如，特异性结合ROR1的抗原结合位点可包含scFv，所述scFv包含选自表1中列出的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3序列、表2中列出的VH和VL序列和/或表3中列出的scFv序列中的任一个的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3序列。
如上所述，本发明的双特异性蛋白质可包含桥接部分。在一些实施方式中，特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物在其N端连接至桥接部分的C端，并且特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物在其C端连接至桥接部分的N端。在一些实施方式中，特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物的C端连接至桥接部分的N端。在其他实施方式中，特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物在其C端连接至桥接部分的N端，并且特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物在其N端连接至桥接部分的C端。在一些实施方式中，特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物的C端连接至桥接部分的N端。
如上所述，桥接部分可以是链交换工程改造的结构域(SEED)形式Fc结构域或其功能性片段、免疫球蛋白Fc结构域或其功能性片段、多肽接头或多肽铰链。例如，桥接部分可包含表7中列出的SEED形式Fc结构域多肽臂的任何AG和GA对。在其他实施方式中，桥接部分可包含含有表8中列出的任何第一多肽臂和第二多肽臂对的免疫球蛋白Fc结构域。桥接部分还可以包含铰链多肽，在其N端任选地包含一个或多个突变，例如选自表9中列出的序列中的任一个的序列。
还如上所述，特异性结合RORl的多肽或两种或更多种多肽的复合物，或特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，可以通过接头多肽连接至桥接部分的C端。例如，接头多肽可以包含含有选自表10中所列序列中任一序列的序列的多肽。
本发明的蛋白质可以包含第一重链、第二重链和轻链。例如，本发明的第一重链从N端到C端可包含：(i)特异性结合CD3的Fab的重链可变(VH)结构域和重链恒定结构域1(CH1)；和(ii)桥接部分，其在其N端处包含至少部分的铰链多肽以及SEED形式Fc结构域的AG或GA多肽臂。本发明的第二重链从N端到C端可包含：(i)特异性结合ROR1的scFv；(ii)桥接部分，其在其N端包含至少部分的铰链多肽以及SEED形式Fc结构域的GA或AG多肽臂；(iii)接头多肽；和(iv)特异性结合ROR1的第二scFv。本发明的轻链从N端到C端可包含：(i)特异性结合CD3的Fab的轻链可变(VL)结构域和轻链恒定(CL)结构域。
在其他实施方式中，本发明的第一重链从N端到C端可包含：(i)特异性结合CD3的Fab的VH结构域和CH1结构域；和(ii)桥接部分，其在其N端处包含至少部分的铰链多肽，以及包含一个或多于一个促进异二聚化的突变的免疫球蛋白Fc结构域的第一或第二多肽臂。本发明的第二重链从N端到C端可包含：(i)特异性结合ROR1的scFv；(ii)桥接部分，其在其N端包含至少部分的铰链多肽，以及包含一个或多于一个促进异二聚化的突变的免疫球蛋白Fc结构域的第二或第一多肽臂；(iii)接头多肽；和(iv)特异性结合ROR1的第二scFv。本发明的轻链从N端到C端可包含：(i)特异性结合CD3的Fab的VL结构域和CL结构域。
在一些实施方式中，本发明的第一重链从N端到C端可包含：(i)特异性结合ROR1的scFv；(ii)桥接部分，其在其N端包含至少部分的铰链多肽以及SEED形式Fc结构域的AG或GA多肽臂；(iii)接头多肽；和(iv)特异性结合CD3的Fab的VH结构域和CH1结构域。本发明的第二重链从N端到C端可包含：(i)特异性结合ROR1的scFv；(ii)桥接部分，其在其N端包含至少部分的铰链多肽以及SEED形式Fc结构域的GA或AG多肽臂。本发明的轻链从N端到C端可包含：(i)特异性结合CD3的Fab的VL结构域和CL结构域。第一重链还可在CH1结构域的C端包含部分IgGl铰链序列(例如，包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列的多肽)，其包含能够与CL中的半胱氨酸残基形成二硫键的半胱氨酸残基。
在其他实施方式中，本发明的第一重链从N端到C端可包含：(i)特异性结合ROR1的scFv；(ii)桥接部分，其在其N端包含至少部分的铰链多肽，以及包含一个或多于一个促进异二聚化的突变的免疫球蛋白Fc结构域的第一或第二多肽臂；(iii)接头多肽；和(iv)特异性结合CD3的Fab的VH结构域和CH1结构域。本发明的第二重链从N端到C端可包含：(i)特异性结合ROR1的scFv；和(ii)桥接部分，其在其N端包含至少部分的铰链多肽，以及包含一个或多于一个促进异二聚化的突变的免疫球蛋白Fc结构域的第二或第一多肽臂。本发明的轻链从N端到C端可包含：(i)特异性结合CD3的Fab的VL结构域和CL结构域。第一重链还可在CH1结构域的C端包含部分IgGl铰链序列(例如，包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列的多肽)，其包含能够与CL中的半胱氨酸残基形成二硫键的半胱氨酸残基。
表11列出了本发明的双特异性蛋白质的示例性第一重链、第二重链和轻链序列。在组合中，如表11中所列的第一重链和轻链或第二重链和轻链缔合，例如通过二硫键连接，并且可以特异性结合CD3。如本发明的双特异性蛋白质中所考虑的，SEED形式Fc结构域的AG多肽臂的铰链多肽和/或CH3结构域可促进与SEED形式Fc结构域的GA多肽臂的铰链多肽和/或CH3结构域的二聚化，产生包含第一和第二重链以及轻链的双特异性蛋白质。如其他实施方式中所考虑的，包含一个或多于一个突变的免疫球蛋白Fc结构域的第一多肽臂的铰链多肽和/或CH2结构域可以促进与包含一个或多于一个突变的免疫球蛋白Fc结构域的第二多肽臂的铰链多肽和/或CH2结构域的异二聚化，产生包含第一和第二重链以及轻链的双特异性蛋白质。
表11示例性第一重链、第二重链和轻链序列
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本文还提供了第一或第二重链在制备双特异性蛋白质中的用途，其中所述第一或第二重链分别包含选自表11中列出的第一或第二重链氨基酸序列中任一个的序列，其中第一重链或第二重链与以下相关联：(i)与选自表11中列出的任何轻链氨基酸序列的轻链(例如，通过二硫键)；和(ii)第二重链，或第一重链，其包含选自表11中列出的第二或第一重链氨基酸序列的任一个的序列。另外，本文提供了编码第一或第二重链的核酸在制备双特异性蛋白质中的用途，其中所述第一或第二重链分别包含选自表11中列出的第一或第二重链氨基酸序列中任一个的序列，其中第一重链或第二重链与以下相关联：(i)与选自表11中列出的任何轻链氨基酸序列的轻链(例如，通过二硫键)；和(ii)第二重链，或第一重链，其包含选自表11中列出的第二或第一重链氨基酸序列的任一个的序列。可以使用标准生物信息学方法对编码本文公开的双特异性蛋白质的核酸进行密码子优化以实现最佳表达。还考虑了包含一种或多种编码本发明双特异性蛋白质的核酸的细胞，并且可以通过标准转染或转导方法(例如，电穿孔、氯化钙转染、脂质转染、慢病毒递送或腺相关病毒递送)产生该细胞。
I.F蛋白质的特征
在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质诱导针对表达TAA的细胞的强烈T细胞细胞毒性，但不诱导显著量的细胞因子释放，所述双特异性蛋白质包括两个臂，第一臂和第二臂，第一臂包含位于其N端的第一组分和位于其C端的第二组分，所述第一组分特异性结合TAA，所述第二组分特异性结合相同的TAA，第二臂包含位于其N端的组分，所述组分特异性结合CD3。在一些实施方式中，本公开提供了能够特异性结合ROR1和CD3的双特异性蛋白质。
在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质特异性结合ROR1的Ig样结构域。在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质不结合ROR1的卷曲(Frizzled)和/或Kringle结构域。在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质特异性结合CD3的CD3ε(SEQ ID NO:269)、CD3γ(SEQ ID NO:270)、CD3δ(SEQ ID NO:271)或CD3ξ(SEQ ID NO:96)多肽。例如，在某些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质特异性结合CD3的CD3ε多肽。
在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质以高亲和力结合TAA和CD3二者，如通过本领域已知的多种试验中的任一种(例如，如实施例2中描述的结合试验)所测量的。在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质以高亲和力结合ROR1和CD3二者，如通过本领域已知的多种试验中的任一种(例如，如实施例2中描述的结合试验)所测量的。在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质对于ROR1结合的KD为1nM至10nM，例如2nM至8nM、或3nM至5nM或4nM至6nM，如在生物层干涉试验中测得的。例如，在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质对于ROR1结合的KD为3nM至5nM(例如3.0nM、3.2nM、3.4nM、3.6nM、3.8nM、4.0nM、4.2nM、4.4nM、4.6nM、4.8nM或5.0nM)，如在生物层干涉试验中测得的。在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质对于CD3结合的KD为1nM至10nM(例如1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM、9nM或10nM)，如在生物层干涉试验中测得的。例如，在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质对于CD3结合的KD为4.0nM至6.0nM(例如4.0nM、4.2nM、4.4nM、4.6nM、4.8nM、5.0nM、5.2nM、5.4nM、5.6nM、5.8nM或6.0nM)，如在生物层干涉试验中测得的。
在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质以低亲和力结合TAA并以高亲和力结合CD3，如通过细胞结合试验(例如，如实施例2中所述的细胞结合试验)测量的。在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质以低亲和力结合ROR1并以高亲和力结合CD3，如通过细胞结合试验(例如，如实施例2中所述的细胞结合试验)测量。在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质对于ROR1结合的KD为75nM至150nM，例如80nM至120nM、85nM至115nM、90nM至110nM或95至105nM，如在生物层干涉试验中测得的。在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质对于CD3结合的KD为1nM至10nM(例如1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM、9nM或10nM)，如在生物层干涉试验中测得的。例如，在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质对于CD3结合的KD为4.0nM至6.0nM(例如4.0nM、4.2nM、4.4nM、4.6nM、4.8nM、5.0nM、5.2nM、5.4nM、5.6nM、5.8nM或6.0nM)，如在生物层干涉试验中测得的。
在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质以高亲和力结合TAA并以低亲和力结合CD3，如通过细胞结合试验(例如，如实施例2中所述的细胞结合试验)测量的。在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质以高亲和力结合ROR1并以低亲和力结合CD3，如通过细胞结合试验(例如，如实施例2中所述的细胞结合试验)测量。在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质对于ROR1结合的KD为1nM至10nM，例如2nM至8nM、或3nM至5nM或4nM至6nM，如在生物层干涉试验中测得的。例如，在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质对于ROR1结合的KD为3nM至5nM(例如3.0nM、3.2nM、3.4nM、3.6nM、3.8nM、4.0nM、4.2nM、4.4nM、4.6nM、4.8nM或5.0nM)，如在生物层干涉试验中测得的。在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质对于CD3结合的KD为10nM至100nM，例如，10nM至80nM、10nM至60nM、10nM至50nM、10nM至40nM、20nM至60nM、30nM至50nM、35nM至45nM、15nM至80nM、15nM至60nM、15nM至40nM或15nM至20nM，如在生物层干涉试验中测得的。
在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质以低亲和力结合TAA并以低亲和力结合CD3，如通过细胞结合试验(例如，如实施例2中所述的细胞结合试验)测量的。在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质以低亲和力结合ROR1并以低亲和力结合CD3，如通过细胞结合试验(例如，如实施例2中所述的细胞结合试验)测量。在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质对于ROR1结合的KD为75nM至150nM，例如80nM至120nM、85nM至115nM、90nM至110nM或95至105nM，如在生物层干涉试验中测得的。在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质对于CD3结合的KD为10nM至100nM，例如，10nM至80nM、10nM至60nM、10nM至50nM、10nM至40nM、20nM至60nM、30nM至50nM、35nM至45nM、15nM至80nM、15nM至60nM、15nM至40nM或15nM至20，如在生物层干涉试验中测得的。
在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质以高亲和力结合TAA和CD3两者，如在基于流式细胞术的结合试验(例如，如实施例2中所述的基于流式细胞术的结合试验)中测量的。在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质以高亲和力结合ROR1和CD3两者，如在基于流式细胞术的结合试验(例如，如实施例2中所述的基于流式细胞术的结合试验)中测量的。在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质对于ROR1结合的EC50为0.1nM至10nM，例如，0.1nM至1nM、0.2nM至8nM、0.4nM至6nM、0.6nM至4nM、0.8nM至2nM、0.1nM至1nM、0.2nM至1nM、0.4nM至1nM、0.6nM至1nM、0.8nM至1nM、1nM至10nM、2nM至10nM、6nM至10nM、8nM至10nM、2nM至4nM、2nM至5nM、2nM至6nM、2nM至8nM或2nM至10nM，如在基于流式细胞术的ROR1结合试验中测量的。例如，在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质对于ROR1结合的EC50为0.1nM至1nM(例如，0.1nM、0.2nM、0.3nM、0.4nM、0.5nM、0.6nM、0.7nM、0.8nM、0.9nM或1nM)，如在基于流式细胞术的ROR1结合试验中使用表达约3.5X 104ROR1分子/细胞的细胞测量的。在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质对于ROR1结合的EC50为1nM至10nM(例如，1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM、9nM或10nM)，如在基于流式细胞术的ROR1结合试验中使用表达约3.5X 104ROR1分子/细胞的细胞测量的。在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质对于ROR1结合的EC50为2nM至5nM(例如，2nM、3nM、4nM或5nM)，如在基于流式细胞术的ROR1结合试验中使用表达约3.5X 104ROR1分子/细胞的细胞测量的。在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质对于CD3结合的EC50为1nM至10nM(例如，1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM、9nM或10nM)，如在使用活化的T细胞的基于流式细胞术的CD3结合试验(例如，如实施例2中所述的CD3结合试验)中测量的。例如，在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质对于CD3结合的EC50为2nM至4nM(例如，2.0nM、2.2nM、2.4nM、2.6nM、2.8nM、3.0nM、3.2nM、3.4nM、3.6nM、3.8nM或4.0nM)，如在基于流式细胞术的CD3结合试验中使用活化的T细胞测得的。
在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质以高亲和力结合TAA，以低亲和力结合CD3，如在基于流式细胞术的结合试验(例如，如实施例2中所述的基于流式细胞术的结合试验)中测量的。在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质以高亲和力结合ROR1，以低亲和力结合CD3，如在基于流式细胞术的结合试验(例如，如实施例2中所述的基于流式细胞术的结合试验)中测量的。在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质对于ROR1结合的EC50为0.1nM至10nM，例如，0.1nM至1nM、0.2nM至8nM、0.4nM至6nM、0.6nM至4nM、0.8nM至2nM、0.1nM至1nM、0.2nM至1nM、0.4nM至1nM、0.6nM至1nM、0.8nM至1nM、1nM至10nM、2nM至10nM、6nM至10nM、8nM至10nM、2nM至4nM、2nM至5nM、2nM至6nM、2nM至8nM或2nM至10nM，如在基于流式细胞术的ROR1结合试验中测量的。例如，在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质对于ROR1结合的EC50为0.1nM至1nM(例如，0.1nM、0.2nM、0.3nM、0.4nM、0.5nM、0.6nM、0.7nM、0.8nM、0.9nM或1nM)，如在基于流式细胞术的ROR1结合试验中使用表达约3.5X 104ROR1分子/细胞的细胞测量的。在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质对于ROR1结合的EC50为1nM至10nM(例如，1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM、9nM或10nM)，如在基于流式细胞术的ROR1结合试验中使用表达约3.5X 104ROR1分子/细胞的细胞测量的。在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质对于ROR1结合的EC50为2nM至5nM(例如，2nM、3nM、4nM或5nM)，如在基于流式细胞术的ROR1结合试验中使用表达约3.5X 104ROR1分子/细胞的细胞测量的。在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质对于CD3结合的EC50为10nM至100nM、10nM至90nM、10nM至80nM、10nM至70nM、10nM至60nM、10nM至50nM、10nM至40nM、10nM至30nM、10nM至20nM、20nM至100nM、20nM至90nM、20nM至80nM、20nM至70nM、20nM至60nM、20nM至50nM、25nM至75nM、25nM至65nM、25nM至55nM、25nM至45nM或25nM至35nM，如在基于流式细胞术的CD3结合试验中使用活化的T细胞测量的。
在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质以低亲和力结合TAA，以高亲和力结合CD3，如在基于流式细胞术的结合试验(例如，如实施例2中所述的基于流式细胞术的结合试验)中测量的。在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质以低亲和力结合ROR1，以高亲和力结合CD3，如在基于流式细胞术的结合试验(例如，如实施例2中所述的基于流式细胞术的结合试验)中测量的。在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质对于ROR1结合的EC50为50nM至220nM、60nM至220nM、70nM至220nM、80nM至220nM、90nM至220nM、100nM至220nM、110nM至220nM、120nM至220nM、130nM至220nM、140nM至220nM、150nM至220nM、175nM至220nM、200nM至220nM、50nM至200nM、60nM至200nM、70nM至200nM、80nM至200nM、90nM至200nM、100nM至200nM、110nM至200nM、120nM至200nM、130nM至200nM、140nM至200nM、150nM至200nM、50nM至180nM、60nM至180nM、70nM至180nM、80nM至180nM、90nM至180nM、100nM至180nM、110nM至180nM、120nM至180nM、130nM至180nM、140nM至180nM、150nM至180nM、50nM至160nM、60nM至160nM、70nM至160nM、80nM至160nM、90nM至160nM、100nM至160nM、110nM至160nM、120nM至160nM、130nM至160nM、140nM至160nM、150nM至160nM、50nM至140nM、60nM至140nM、70nM至140nM、80nM至140nM、90nM至140nM、100nM至140nM、110nM至140nM、120nM至140nM、130nM至140nM、50nM至120nM、60nM至120nM、70nM至120nM、80nM至120nM、90nM至120nM、100nM至120nM、110nM至120nM、50nM至110nM、60nM至110nM、70nM至110nM、80nM至110nM、90nM至110nM、100nM至110nM、50nM至100nM、60nM至100nM、70nM至100nM、80nM至100nM或90nM至100nM，如在基于流式细胞术的ROR1结合试验中测量的。例如，在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质对于ROR1结合的EC50为80nM至120nM或90nM至110nM，如在基于流式细胞术的ROR1结合试验中使用表达约3.5X 104ROR1分子/细胞的细胞测量的。在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质对于ROR1结合的EC50为1nM至10nM(例如，1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM、9nM或10nM)，如在基于流式细胞术的ROR1结合试验中使用表达约3.5X 104ROR1分子/细胞的细胞测量的。在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质对于ROR1结合的EC50为2nM至5nM(例如，2nM、3nM、4nM或5nM)，如在基于流式细胞术的ROR1结合试验中使用表达约3.5X 104ROR1分子/细胞的细胞测量的。在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质对于CD3结合的EC50为1nM至10nM(例如，1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM、9nM或10nM)，如在使用活化的T细胞的基于流式细胞术的CD3结合试验(例如，如实施例2中所述的CD3结合试验)中测量的。例如，在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质对于CD3结合的EC50为2nM至4nM(例如，2.0nM、2.2nM、2.4nM、2.6nM、2.8nM、3.0nM、3.2nM、3.4nM、3.6nM、3.8nM或4.0nM)，如在基于流式细胞术的CD3结合试验中使用活化的T细胞测得的。
在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质以低亲和力结合TAA，以高亲和力结合CD3，如在基于流式细胞术的结合试验(例如，如实施例2中所述的基于流式细胞术的结合试验)中测量的。在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质以低亲和力结合ROR1，以高亲和力结合CD3，如在基于流式细胞术的结合试验(例如，如实施例2中所述的基于流式细胞术的结合试验)中测量的。在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质对于ROR1结合的EC50为50nM至220nM、60nM至220nM、70nM至220nM、80nM至220nM、90nM至220nM、100nM至220nM、110nM至220nM、120nM至220nM、130nM至220nM、140nM至220nM、150nM至220nM、175nM至220nM、200nM至220nM、50nM至200nM、60nM至200nM、70nM至200nM、80nM至200nM、90nM至200nM、100nM至200nM、110nM至200nM、120nM至200nM、130nM至200nM、140nM至200nM、150nM至200nM、50nM至180nM、60nM至180nM、70nM至180nM、80nM至180nM、90nM至180nM、100nM至180nM、110nM至180nM、120nM至180nM、130nM至180nM、140nM至180nM、150nM至180nM、50nM至160nM、60nM至160nM、70nM至160nM、80nM至160nM、90nM至160nM、100nM至160nM、110nM至160nM、120nM至160nM、130nM至160nM、140nM至160nM、150nM至160nM、50nM至140nM、60nM至140nM、70nM至140nM、80nM至140nM、90nM至140nM、100nM至140nM、110nM至140nM、120nM至140nM、130nM至140nM、50nM至120nM、60nM至120nM、70nM至120nM、80nM至120nM、90nM至120nM、100nM至120nM、110nM至120nM、50nM至110nM、60nM至110nM、70nM至110nM、80nM至110nM、90nM至110nM、100nM至110nM、50nM至100nM、60nM至100nM、70nM至100nM、80nM至100nM或90nM至100nM，如在基于流式细胞术的ROR1结合试验中测量的。例如，在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质对于ROR1结合的EC50为80nM至120nM或90nM至110nM，如在基于流式细胞术的ROR1结合试验中使用表达约3.5X 104ROR1分子/细胞的细胞测量的。在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质对于ROR1结合的EC50为1nM至10nM(例如，1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM、9nM或10nM)，如在基于流式细胞术的ROR1结合试验中使用表达约3.5X 104ROR1分子/细胞的细胞测量的。在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质对于ROR1结合的EC50为2nM至5nM(例如，2nM、3nM、4nM或5nM)，如在基于流式细胞术的ROR1结合试验中使用表达约3.5X 104ROR1分子/细胞的细胞测量的。在一些实施方式中，本发明的双特异性蛋白质对于CD3结合的EC50为10nM至100nM、10nM至90nM、10nM至80nM、10nM至70nM、10nM至60nM、10nM至50nM、10nM至40nM、10nM至30nM、10nM至20nM、20nM至100nM、20nM至90nM、20nM至80nM、20nM至70nM、20nM至60nM、20nM至50nM、25nM至75nM、25nM至65nM、25nM至55nM、25nM至45nM或25nM至35nM，如在基于流式细胞术的CD3结合试验中使用活化的T细胞测量的。
通过CD3/TCR复合物与其在靶细胞的主要组织相容性复合物(MHC)分子上呈递的同源肽配体的结合活化T细胞，例如细胞毒性CD8+T细胞，诱导预先形成的裂解颗粒的脱颗粒并释放细胞毒性酶进入T细胞和靶细胞之间形成的免疫突触。在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质促进T细胞裂解性颗粒脱颗粒。
在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质诱导对表达TAA的肿瘤细胞的T细胞介导的细胞毒性。在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质诱导对表达ROR1的肿瘤细胞的T细胞介导的细胞毒性。例如，在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质对表达ROR1的肿瘤细胞的T细胞介导的细胞毒性的EC50为150pM至250pM、155pM至250pM、160pM至250pM、165pM至250pM、170pM至250pM、175pM至250pM、150pM至225pM、155pM至225pM、160pM至225pM、165pM至225pM、170pM至225pM、175pM至225pM、150pM至200pM、155pM至200pM、160pM至200pM、165pM至200pM、170pM至200pM、175pM至200pM、150pM至190pM、155pM至190pM、160pM至190pM、165pM至190pM、170pM至190pM或175pM至190pM，如实施例3中所述的T细胞/肿瘤细胞共培养杀伤试验中所测量的。
在其他实施方式中，本公开的双特异性蛋白质对表达ROR1的肿瘤细胞的T细胞介导的细胞毒性的EC50为10pM至100pM、15pM至100pM、20pM至100pM、25pM至100pM、30pM至100pM、35pM至100pM、40pM至100pM、50pM至100pM、10pM至75pM、15pM至75pM、20pM至75pM、25pM至75pM、30pM至75pM、35pM至75pM、40pM至75pM、50pM至75pM、10pM至50pM、15pM至50pM、20pM至50pM、25pM至50pM、30pM至50pM、35pM至50pM、40pM至50pM、10pM至40pM、15pM至40pM、20pM至40pM、25pM至40pM、30pM至40pM或35pM至40pM，如实施例3中所述的T细胞/肿瘤细胞共培养杀伤试验中所测量的。
通过CD3/TCR复合物与其在靶细胞的主要组织相容性复合物(MHC)分子上呈递的同源肽配体的结合活化T细胞，能够诱导促炎细胞因子的释放，例如但不限于，IFNγ、TNFα和IL2。在一些实施方式中，与参考对照分子相比，本公开的双特异性蛋白质不诱导活化的T细胞释放显著水平的促炎细胞因子。例如，在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质对于IFNγ释放的EC50为1000pM至2000pM、1200pM至2000pM、1400pM至2000pM、1600pM至2000pM、1800pM至2000pM、1000pM至1800pM、1200pM至1800pM、1400pM至1800pM或1600pM至1800pM，如实施例3中所述的T细胞/肿瘤细胞共培养IFNγ产生试验中所测量的。
在一些实施方式中，与参考对照分子相比，本公开的双特异性蛋白质不诱导活化的T细胞释放显著水平的促炎细胞因子。例如，在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质对于IFNγ释放的EC50为1000pM至2000pM、1200pM至2000pM、1400pM至2000pM、1600pM至2000pM、1800pM至2000pM、1000pM至1800pM、1200pM至1800pM、1400pM至1800pM或1600pM至1800pM，如实施例3中所述的T细胞/肿瘤细胞共培养IFNγ产生试验中所测量的。
在其他实施方式中，本公开的双特异性蛋白质对于IFNγ释放的EC50为100pM至1000pM、200pM至1000pM、300pM至1000pM、400pM至1000pM、500pM至1000pM、600pM至1000pM、700pM至1000pM、800pM至1000pM、900pM至1000pM、100pM至800pM、200pM至100pM、300pM至800pM、400pM至800pM、500pM至800pM、600pM至800pM、700pM至800pM、100pM至600pM、200pM至100pM、300pM至600pM、400pM至600pM、500pM至600pM、100pM至500pM、200pM至500pM、300pM至500pM或400pM至500pM，如实施例3中所述的T细胞/肿瘤细胞共培养IFNγ产生试验中所测量的。
如本文所用，“最大浓度”或“C最大”是指可以从细胞释放的细胞因子的最大浓度。在一些实施方式中，与参考T细胞结合物相比，本公开的双特异性蛋白质可诱导10％至80％、20％至60％、35％至45％、45％至55％或35％至75％的C最大，如在T细胞/肿瘤细胞共培养IFNγ产生试验中所测量的。例如，参考T细胞结合物可包括但不限于包括四种多肽的双特异性蛋白质，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:302、SEQ ID NO:303、SEQ ID NO:304和SEQ ID NO:305。
参考T细胞结合物多肽1：
MGWSCIILFLVATATGVHSELVLTQSPSVSAALGSPAKITCTLSSAHKTDTIDWYQQLQGEAPRYLMQVQSDGSYTKRPGVPDRFSGSSSGADRYLIIPSVQADDEADYYCGADYIGGYVFGGGTQLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(SEQ ID NO:302)
参考T细胞结合物多肽2：
QEQLVESGGRLVTPGGSLTLSCKASGFDFSAYYMSWVRQAPGKGLEWIATIYPSSGKTYYATWVNGRFTISSDNAQNTVDLQMNSLTAADRATYFCARDSYADDGALFNIWGPGTLVTISSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:303)
参考T细胞结合物多肽3：
QEQLVESGGRLVTPGGSLTLSCKASGFDFSAYYMSWVRQAPGKGLEWIATIYPSSGKTYYATWVNGRFTISSDNAQNTVDLQMNSLTAADRATYFCARDSYADDGALFNIWGPGTLVTISSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO:304)
参考T细胞结合物多肽4：
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC(SEQ IDNO:305)
在一些实施方式中，与抗CD3参考抗体相比，当施用于新鲜分离的PBMC培养物时，本公开的双特异性蛋白质不诱导显著水平的TNFα释放。在一些实施方式中，与抗CD3参考抗体相比，当施用于以高密度(例如，1.0x107个细胞/mL)培养48小时的PBMC时，本公开的双特异性蛋白质不诱导显著水平的TNFα释放。
在一些实施方式中，与抗CD3参考抗体相比，当施用于新鲜分离的PBMC培养物时，本公开的双特异性蛋白质不诱导显著水平的IL2释放。在一些实施方式中，与抗CD3参考抗体相比，当施用于以高密度(例如，1.0x107个细胞/mL)培养48小时的PBMC时，本公开的双特异性蛋白质不诱导显著水平的IL2释放。
如本文所用，给定双特异性蛋白质的“细胞因子释放与杀伤解偶联比率”是指诱导IFNγ释放(如实施例3中所述的T细胞/肿瘤细胞共培养IFNγ产生试验中测量的)的曲线下面积(AUC)和细胞毒性杀伤的AUC(如实施例3中所述的在T细胞/肿瘤细胞共培养杀伤试验测量的)之间的比率。在一些实施方式中，如在T细胞/肿瘤细胞共培养杀伤试验和IFNγ产生试验中测量的，由参考T细胞结合物标准化，本公开的双特异性蛋白质的细胞因子释放与杀伤解偶联比率为1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6.1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9、1:4、1:4.1、1:4.2、1:4.3、1:4.4、1:4.5、1:4.6、1:4.7、1:4.8、1:4.9或1:5。例如，在一些实施方式中，如在T细胞/肿瘤细胞共培养杀伤试验和IFNγ产生试验中所测量的，用参考T细胞结合物标准化，本公开的双特异性蛋白质的细胞因子释放与杀伤解偶联比率为1:2至1:4。在某些实施方式中，如在T细胞/肿瘤细胞共培养杀伤试验和IFNγ产生试验中所测量的，用参考T细胞结合物标准化，本公开的双特异性蛋白质的细胞因子释放与杀伤解偶联比率为1:2.2。在某些实施方式中，如在T细胞/肿瘤细胞共培养杀伤试验和IFNγ产生试验中所测量的，用参考T细胞结合物标准化，本公开的双特异性蛋白质的细胞因子释放与杀伤解偶联比率为1:2.9。
如本文所用，术语“连续杀伤指数”或“肿瘤连续杀伤指数”是指被单个CD8+T细胞杀伤的肿瘤细胞的平均数量。在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质诱导2至6的肿瘤连续杀伤指数。例如，用本公开的双特异性蛋白质处理的T细胞的连续杀伤指数为2.2至5.5、2.4至5.5、2.6至5.5、2.8至5.5、3.0至5.5、3.2至5.5、3.4至5.5、3.6至5.5、3.8至5.5、4.0至5.5、2.2至5.0、2.4至5.0、2.6至5.0、2.8至5.0、3.0至5.0、3.2至5.0、3.4至5.0、3.6至5.0、3.8至5.0、4.0至5.0、2.2至4.8、2.4至4.8、2.6至4.8、2.8至4.8、3.0至4.8、3.2至4.8、3.4至4.8、3.6至4.8、3.8至4.8、4.0至4.8、2.2至4.6、2.4至4.6、2.6至4.6、2.8至4.6、3.0至4.6、3.2至4.6、3.4至4.6、3.6至4.6、3.8至4.6、4.0至4.6、2.2至4.4、2.4至4.4、2.6至4.4、2.8至4.4、3.0至4.4、3.2至4.4、3.4至4.4、3.6至4.4、3.8至4.4、4.0至4.4、2.2至4.2、2.4至4.2、2.6至4.2、2.8至4.2、3.0至4.2、3.2至4.2、3.4至4.2、3.6至4.2、3.8至4.2、4.0至4.2、2.2至4.0、2.4至4.0、2.6至4.0、2.8至4.0、3.0至4.0、3.2至4.0、3.4至4.0、3.6至4.0、3.8至4.0、2.2至3.8、2.4至3.8、2.6至3.8、2.8至3.8、3.0至3.8、3.2至3.8、3.4至3.8、3.6至3.8、2.2至3.6、2.4至3.6、2.6至3.6、2.8至3.6、3.0至3.6、3.2至3.6、3.4至3.6、2.2至3.4、2.4至3.4、2.6至3.4、2.8至3.4、3.0至3.4或3.2至3.4，如在T细胞/肿瘤细胞共培养杀伤试验中所测量的。在某些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质诱导3.4至3.6的肿瘤连续杀伤指数。在某些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质诱导3.8至4.2的肿瘤连续杀伤指数。
在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质与食蟹猴CD3交叉反应，但不与小鼠CD3交叉反应。在一些实施方式中，本公开的双特异性蛋白质与食蟹猴ROR1和小鼠ROR1交叉反应。
II抗体
本文还提供了特异性结合ROR1的抗体。在一些实施方式中，特异性结合ROR1的抗体包含选自表2中列出序列的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。
在一些实施方式中，本文所述抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域包含选自表1中列出的VHCDR和VLCDR序列的VH和VL CDR序列。
除非另有说明，表1中提供的CDR序列是根据IMGT独特编号方案确定的。
在一些实施方式中，本发明的抗体可以是IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。在某些实施方式中，本文所述抗体是IgG1、IgG1、IgG3或IgG4。在某些实施方式中，本发明的抗体是人IgG1抗体。
在某些实施方式中，特异性结合ROR1的抗体包含选自序列SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:25的VHCDR3序列。在某些实施方式中，特异性结合ROR1的抗体包含选自共有序列SEQ IDNO:13或序列SEQ ID NO:28的VLCDR3序列。
在一些实施方式中，特异性结合ROR1的抗体包含：包含氨基酸序列SEQID NO:8或SEQ ID NO:23的重链可变互补决定区1(VHCDR1)；包含氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ IDNO:24的重链可变互补决定区2(VHCDR2)；以及包含氨基酸序列：SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:25的重链可变互补决定区3(VHCDR3)。
在一些实施方式中，特异性结合ROR1的抗体包含：包含氨基酸序列SEQID NO:11或SEQ ID NO:26的轻链可变互补决定区1(VLCDR1)；包含氨基酸序列DAS或GAS的轻链可变互补决定区2(VLCDR2)；以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或的SEQ ID NO:28的轻链可变互补决定区3(VLCDR3)。
在一些实施方式中，特异性结合ROR1的抗体包含：包含氨基酸序列SEQID NO:8的VHCDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的VHCDR2；包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的VHCDR3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的VLCDR1；包含氨基酸序列DAS的VLCDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的VLCDR3。
在一些实施方式中，特异性结合ROR1的抗体包含：包含氨基酸序列SEQID NO:8的VHCDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的VHCDR2；包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的VHCDR3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的VLCDR1；包含氨基酸序列DAS的VLCDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:15的VLCDR3。
在一些实施方式中，特异性结合ROR1的抗体包含：包含氨基酸序列SEQID NO:23的VHCDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:24的VHCDR2；包含氨基酸序列SEQ ID NO:25的VHCDR3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:26的VLCDR1；包含氨基酸序列GAS的VLCDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的VLCDR3。
在一些实施方式中，根据IMGT独特编号方案，特异性结合ROR1的抗体包含VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，各自包含分别对应于表1的VHCDR和VLCDR共有序列的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3序列的氨基酸序列。
在某些实施方式中，特异性结合ROR1的抗体包含抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)，所述抗体重链可变结构域(VH)包含与表2中公开的抗体的VH至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，所述抗体轻链可变结构域(VL)包含与表2中公开的同一抗体的VL至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，抗体包含表1中公开的VH和VL序列的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，前述是根据IMGT独特编号方案、Kabat(参见Kabat等,(1991)具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences ofProteins of Immunological Interest),NIH公开号91-3242,Bethesda)、Chothia(参见，例如，Chothia C&Lesk A M,(1987),J.Mol.Biol.196:901-917)、MacCallum(参见MacCallum R M等,(1996)J.Mol.Biol.262:732-745)或本领域已知的任何其他CDR确定方法确定的。
在某些实施方式中，特异性结合ROR1的抗体包含VH和VL，所述VH包含与SEQ IDNO:29至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，所述VL包含与SEQ ID NO:30至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。
在某些实施方式中，特异性结合ROR1的抗体包含VH和VL，所述VH包含与SEQ IDNO:29至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，所述VL包含与SEQ ID NO:31至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。
在某些实施方式中，特异性结合ROR1的抗体包含VH和VL，所述VH包含与SEQ IDNO:39至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，所述VL包含与SEQ ID NO:40至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。
III治疗性应用
本公开还提供了包含治疗有效量的本文所述的蛋白质的药物制剂。药物制剂包含一种或多种赋形剂，并维持在某个pH。本文所用的术语“赋形剂”是指添加到制剂中以提供所需物理或化学性质的任何非治疗剂，所述物理或化学性质例如pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放的速率、吸附性能或渗透性。
本申请提供了使用本文描述的蛋白质和/或本文描述的药物制剂治疗癌症的方法。该方法可用于治疗多种癌症，包括但不限于慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、肺癌、支气管癌、结肠癌、直肠癌、黑素瘤、肾癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、乳腺癌、口腔癌、咽癌、毛细胞白血病、肝癌、肝内胆管癌和甲状腺癌
实施例
以上是对本公开的一般性说明，参考以下实施例将更容易理解，所述实施例仅用于说明本公开的某些方面和实施方式，无意于以任何方式限制本公开的范围。
实施例1：试剂制备
该实施例描述了用于产生本公开的数据的试剂和筛选试验。
1.1荧光素酶报告靶细胞
靶细胞被工程改造以通过慢病毒转导稳定表达萤火虫荧光素酶和eGFP。向样品中添加D-荧光素后荧光素酶活性的丧失被用作细胞杀伤的指示。
1.2结合ROR1的克隆的筛选和鉴定
使用本领域普通技术人员熟知的标准技术，从对重组RORl蛋白进行淘选的初始人scFv噬菌体文库中获得克隆69A02。对加His标签的人ROR2胞外域(ECD)和不相关的加His标签的阴性靶标进行反选择。对加His标签的人ROR1 ECD ROR1结合物进行正选择。针对人ROR1比人ROR2进行初步筛选，然后针对特异性细胞结合重组过表达人ROR1进行二次筛选。随后的ELISA结构域分箱(binning)应用包被的人Fc-Ig(huFc-Ig)(SEQ ID NO:134)、人Fc-Ig-卷曲的(huFc-Ig-frz)(SEQ ID NO:137)或人Fc-卷曲的-Kringle(huFc-frz-KNG)(SEQID NO:138)融合蛋白显示了69A02对人ROR1的Ig样结构域的特异性。另一个基于夹心ELISA的Ig结合物分箱(结合物A包被、预孵育结合物B+人ROR1 ECD-His、通过抗His辣根过氧化物酶(HRP)检测非重叠结合)表明了不与进一步的内部命中候选物重叠的独特表位。
通过应用来源于用人ROR1 ECD-His蛋白免疫的用于产生人可变抗体结构域的转基因大鼠的随机配对的Fab酵母表面展示文库来鉴定克隆82H02。通过对小鼠和人ROR1门选来选择82H02，并在随后的分选轮中进一步分选huFc-Ig(SEQ ID NO:134)但不分选huFc-frz-KNG(SEQ ID NO:138)结合。使用重组细胞系的流式细胞术证实了对人ROR1的特异性，而不结合人ROR2。使用标准ELISA试验进一步证实了这一点。
huFc-Ig：
MKLPVRLLVLMFWIPASLSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKQETELSVSAELVPTSSWNISSELNKDSYLTLDEPMNNITTSLGQTAELHCKVSGNPPPTIRWFKNDAPVVQEPRRLSFRSTIYGSRLRIRNLDTTDTGYFQCVATNGKEVVSSTGVLFVKFGPPPTASPGYSDEY(SEQ ID NO:134)
huFc-frz：
MKLPVRLLVLMFWIPASLSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKQETELSVSAELVPTSSWNISSELNKDSYLTLDEPMNNITTSLGQTAELHCKVSGNPPPTIRWFKNDAPVVQEPRRLSFRSTIYGSRLRIRNLDTTDTGYFQCVATNGKEVVSSTGVLFVKFGPPPTASPGYSDEYEEDGFCQPYRGIACARFIGNRTVYMESLHMQGEIENQITAAFTMIGTSSHLSDKCSQFAIPSLCHYAFPYCDETSSVPKPRDLCRDECEILENVLCQTEYIFARSNPMILMRLKLPNCEDLPQPESPEAANCIRIGIPMADPINKNH(SEQ ID NO:137)
huFc-frz-KNG：
MKLPVRLLVLMFWIPASLSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKVKFGPPPTASPGYSDEYEEDGFCQPYRGIACARFIGNRTVYMESLHMQGEIENQITAAFTMIGTSSHLSDKCSQFAIPSLCHYAFPYCDETSSVPKPRDLCRDECEILENVLCQTEYIFARSNPMILMRLKLPNCEDLPQPESPEAANCIRIGIPMADPINKNHKCYNSTGVDYRGTVSVTKSGRQCQPWNSQYPHTHTFTALRFPELNGGHSYCRNPGNQKEAPWCFTLDENFKSDLCDIPACDSKDSKEKNKMEILY(SEQ ID NO:138)
实施例2：细胞结合试验
该实施例描述了用于确定本公开的双特异性TCE的结合亲和力的细胞结合试验。
靶细胞(例如，人Jurkat-T细胞(图2A)；食蟹猴泛T细胞(图2B)；敲入人CD3ε的C57BL/6小鼠T细胞(图2C)；敲除CD3ε的人Jurkat-T细胞(图2D)；MDA-MB-231细胞(图3A)；T-47D细胞(图3B)；表达人ROR1的小鼠4T1细胞(图3C)；表达小鼠ROR1的小鼠4T1细胞(图3D)；人CD8+T细胞(图12A)；食蟹猴泛T细胞(图12B)；MDA-MB-231细胞(图13A和图13B)；表达小鼠ROR1的小鼠4T1细胞(图13C和图13D)以每孔300,000个细胞添加到V底96孔板中。用200μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次后，在室温下以500×g离心5分钟，将细胞重悬于100μL活/死可固定绿工作缓冲液中(赛默飞世尔科技(ThermoFisher Scientific)，目录号：L23101；一小瓶活/死可固定绿粉末溶解在50μL的DMSO中，1μL溶解的活/死可固定绿加入1mL的PBS中，以制备工作缓冲液)。室温孵育15分钟后，用200μLPBS洗涤细胞两次，在室温下以500×g离心5分钟，然后重悬于50mL 10％山羊血清的BD染色缓冲溶液(BD生物科学公司(BDBiosciences)，目录号：554657)中。接下来，将细胞在室温下孵育20分钟，并加入50μL双特异性参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)(其包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:302、SEQ IDNO:303、SEQ ID NO:304、SEQ ID NO:305的多肽)、参考结合卷曲的TCE((Ref结合Frz的TCE1A或Ref结合Frz的TCE 1B)、69A02TCE(69A02 TCE 1A或69A02 TCE 1B)或82H02 TCE(82H02TCE 1A或82H021B)(在BD染色缓冲液中系列稀释，从250nM到10pM，如各图所示)添加到细胞中，无需清洗。然后用箔覆盖板以避免直射光，并在4℃下孵育60分钟。然后，在室温下以500×g离心5分钟，用200μL PBS洗涤细胞两次，并重悬于100μL 3μg/mL山羊抗人IgG-AlexaFluor 647抗体(杰克逊免疫研究实验室(Jackson ImmunoResearch Lab)，目录号：109-606-003)的BD染色缓冲溶液中。4℃孵育30分钟后，在室温下以500×g离心5分钟，用200μLPBS洗涤细胞两次，然后重悬于100μL固定缓冲液(白乐津(BioLegend)，目录号：420801)中。然后在流式细胞仪上分析样品，使用FlowJo软件分析结合信号。使用GraphPad Prism中的4参数非线性回归曲线拟合获得参考分子和测试双特异性TCE的ROR1和CD3结合EC50(浓度对比平均荧光强度(MFI))。
2.1CD3结合亲和力
在Jurkat T细胞、食蟹猴泛T细胞、从表达嵌合CD3ε(该嵌合CD3ε由人CD3的胞外域和小鼠CD3的跨膜和胞质结构域组成)的C57BL/6小鼠中分离的T细胞，或敲除人CD3的Jurkat T细胞上，人或食蟹猴CD3与下述关联的表观结合亲和力：参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)、结合ROR1卷曲结构域的1A形式参考TCE(Ref.结合Frz的TCE 1A)、结合ROR1的卷曲结构域的1B形式参考TCE(Ref.结合Frz的TCE 1B)、双特异性1A形式TCE 69A02(69A02TCE 1A)、双特异性1B形式TCE 69A02(69A02 TCE 1B)、双特异性1A形式TCE 82H02(82H02TCE 1A)和双特异性1B形式TCE 82H02(82H02 TCE 1B)，分别地示出于图2A(并总结在表12中)，图2B(并总结在表12中)，图2C(并总结在表12中)和图2D(并总结在表12中)。
表12：表观CD3结合亲和力
如表12所示，EC50表明69A02 TCE 1A、69A02 TCE 1B、82H02 TCE 1A和82H02 TCE1B对人、食蟹猴和人/小鼠嵌合CD3的表观结合亲和力彼此之间差异小于3倍。1B形式的69A02和82H02 TCE对CD3的表观结合亲和力比1A形式的大约低4倍。参考T细胞结合物与1A形式的双特异性TCE 69A02和82H02相比，对CD3的表观结合亲和力大约低15倍，与1B形式的双特异性TCE 69A02和82H02相比，对CD3的表观结合亲和力大约低4倍。为了解决CD3的特异性问题，评估了1A形式和1B形式的双特异性TCE 69A02和82H02与缺乏CD3的Jurkat T细胞的结合(图2D)。没有观察到非特异性结合。
通过流式细胞术，使用人CD8+T细胞(图12A，并总结于表13中)和来自食蟹猕猴(cynomolgus macaque)的泛T细胞(图12B，并总结于表13中)，确定了人和食蟹猴CD3与下述关联的表观结合亲和力：纳入了序列优化变体的双特异性TCE 82H02(具有高ROR1结合亲和力和高CD3亲和力的82H02TCE#1)、82H02 TCE#2(具有高ROR1结合亲和力和低CD3结合亲和力)、82H02 TCE#3(具有低ROR1结合亲和力和高CD3结合亲和力)和82H02 TCE#4(具有低ROR1结合亲和力和低CD3结合亲和力)以及参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)。
表13：序列优化变体的表观CD3结合亲和力
| 人CD8+T细胞 | 食蟹猴泛T细胞 | |
| EC50(nM) | EC50(nM) | |
| 抗-HEL对照 | 无结合 | 无结合 |
| Ref.T细胞结合物 | 266.3 | 358.2 |
| 82H02 TCE#1 | 2.8 | 4.1 |
| 82H02 TCE#2 | 19.8 | 26.2 |
| 82H02 TCE#3 | 3.0 | 4.4 |
| 82H02 TCE#4 | 20.4 | 27.7 |
如表13所示，参考T细胞结合物对人和食蟹猴CD3具有最弱的亲和力，分别为约250和350nM。这些值比序列优化变体82H02 TCE#1和82H02 TCE#3的亲和力低约100倍，比序列优化变体82H02 TCE#2和82H02 TCE#4的亲和力低约10至15倍。各个序列优化的82H02 TCE变体的人和食蟹猴CD3的表观CD3结合亲和力之间的差异小于2倍。有趣的是，82H02 TCE#1结合的CD3分子的最大数量(C最大)比82H02 TCE#3观察到的C最大高出30％(人)至40％(食蟹猴)。这一观察结果的作用机制尚不清楚，但可能是由两个双特异性TCE之间的构象差异引起的，导致82H02 TCE#1比82H02 TCE#3更容易接近CD3。
2.2ROR1结合亲和力
在MDA-MB-231细胞、T47D细胞、经工程改造以过表达人ROR1的4T1细胞或经工程改造以过表达鼠ROR1的4T1细胞上，人ROR1与下述关联的表观结合亲和力：参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)、结合ROR1卷曲结构域的1A形式参考TCE(Ref.结合Frz的TCE 1A)、结合ROR1的卷曲结构域的1B形式参考TCE(Ref.结合Frz的TCE 1B)、双特异性1A形式TCE69A02(69A02 TCE 1A)、双特异性1B形式TCE 69A02(69A02 TCE 1B)、双特异性1A形式TCE 82H02(82H02 TCE 1A)、双特异性1B形式TCE 82H02
(82H02 TCE 1B)，分别地示出于图3A(并总结在表14中)，图3B(并总结在表14中)，图3C(并总结在表14中)和图3D(并总结在表14中)。
表14：表观ROR1结合亲和力
如表14所示，使用野生型MDA-MB-231细胞，其表达低水平的ROR1，参考T细胞结合物、69A02 TCE和82H02 TCE的表观结合亲和力比结合ROR1卷曲结构域的参考TCE高30倍以上。高浓度的结合ROR1卷曲结构域的参考TCE和参考T细胞结合物中观察到与ROR1-T47D细胞的最小非特异性结合。未观察到69A02或82H02 TCE的非特异性结合。
为了确定1A形式和1B形式的双特异性82H02对小鼠ROR1的表观结合亲和力，使用PiggyBAC转座子工程改造4T1细胞以过表达小鼠ROR-1(图3D)，并与工程改造以表达人ROR1的细胞进行比较(图3C)。1A形式的双特异性TCE82H02、1B形式的双特异性TCE 82H02和结合ROR1卷曲结构域的参考TCE对人和小鼠ROR1的表观亲和力彼此之间差异小于3倍。使用纯化的人IgG作为阴性对照。参考T细胞结合物不结合小鼠ROR1。
与MDA-MB-231细胞(图3A)相比，在工程改造以表达人ROR1的4T1细胞中(图3C)，结合ROR1卷曲结构域的参考TCE的表观ROR1结合亲和力高出超过30倍。这种结合亲和力增加可能是因为4T1-hROR1+细胞上的ROR1表达密度比MDA-MB-231细胞上的表达密度高出超过10倍。此外，1A和1B形式的结合ROR1卷曲结构域的参考TCE结合的hROR1分子的最大数量比1A和1B形式的双特异性TCE 82H02少大约2.5倍。相反，对于小鼠ROR1，由1A和1B形式的双特异性TCE 82H02和结合ROR1卷曲结构域的参考TCE结合的muROR1分子的最大数量大约相同。对人与小鼠ROR1的结合存在这种差异的原因可能是由于(1)对人与小鼠ROR1卷曲结构域的接近，其中结合ROR1卷曲结构域的参考TCE具有特异性和/或(2)人和小鼠ROR1在4T1细胞上的表达密度差异。
通过流式细胞术，使用ROR1+MDA-MB-231细胞(图13A，并总结于表15中)和经工程改造以过表达鼠ROR1的4T1细胞(图13B，并总结于表15中)，确定了人和小鼠ROR1与纳入了82H02序列优化变体的双特异性TCE(82H02 TCE#1、82H02 TCE#2、82H02 TCE#3、82H02 TCE#4)和参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)关联的表观结合亲和力。
表15：序列优化变体的表观ROR1结合亲和力
| ROR1+MDA-MB-231 | 4T1 muROR1 | |
| EC50(nM) | EC50(nM) | |
| 抗-HEL对照 | 无结合 | 无结合 |
| Ref.T细胞结合物 | 0.14 | 无结合 |
| 82H02 TCE#1 | 0.81 | 2.19 |
| 82H02 TCE#2 | 0.72 | 2.24 |
| 82H02 TCE#3 | 211.18 | 1037 |
| 82H02 TCE#4 | 76.48 | 496 |
如表15所示，序列优化的变体82H02 TCE#1和82H02 TCE#2在人和小鼠ROR1之间的表观ROR1结合亲和力方面都具有大约3倍的差异。对于序列优化的变体82H02 TCE#3和82H02 TCE#4，人和小鼠之间的表观ROR1结合亲和力差异分别约为5倍和6.5倍。具有高ROR1结合亲和力的双特异性TCE(82H02 TCE#1和82H02 TCE#2)与具有低ROR1结合亲和力的双特异性TCE(82H02 TCE#3和82H02 TCE#4)表观ROR1结合亲和力的差异，对于人ROR1在100至250倍之间，对于小鼠ROR1在250至500倍之间。有趣的是，尽管具有高ROR1结合亲和力的双特异性TCE的表观ROR1结合亲和力并未明显受到高或低CD3结合亲和力的影响，但82H02TCE#3(具有低82H02结合亲和力和高CD3结合亲和力)与82H02 TCE#4(具有低82H02结合亲和力和低CD3结合亲和力)相比的ROR1结合亲和力的差异，对于人ROR1和小鼠ROR1分别高约3倍和2倍。该结果可能是由于相对于82H02 TCE#1和82H02 TCE#2而言，82H02 TCE#3和82H02 TCE#4结合ROR1分子最大数量，这使得计算82H02 TCE#3和82H02 TCE#4的精确EC50结合值变得困难。
实施例3：靶标依赖性细胞毒性(TDCC)和细胞因子释放试验(TDCR)
该实施例描述了在存在或不存在本公开的双特异性TCE的情况下CD8+T细胞诱导靶肿瘤细胞杀伤和细胞因子释放。
3.1使用人CD8+T细胞进行TDCC和TDCR试验
TDCC和TDCR实验前24小时，在不含抗生素的培养基中培养靶细胞(MDA-MB-231细胞(图5A和图5B)；MCF-7细胞(图5C)；T-47D细胞(图5D)；MDA-MB-231细胞(图8A和图8C))。将100μL靶细胞悬浮液分配到黑壁透明平底板(每孔5000个细胞)的每个孔中，并孵育4小时。通过台盼蓝排除法试验确定在250IU/mL IL2中培养48小时的人CD8+T细胞(HemaCareBioresearch(目录号：PB08NC))的活力，并将补充有250U/mLIL2的AIM-V培养基(Gibco，目录号：12055-091)中的活细胞密度调整至500,000个细胞/mL。测试双特异性TCE、参考T细胞结合物和结合卷曲的参考TCE在AIM-V培养基中系列稀释。靶细胞孵育4小时结束时，弃去培养基，并将50μL培养基对照添加到指定孔中，或将50μL CD8+T细胞悬浮液添加到每个指定孔中，以使得效应CD8+T细胞:靶细胞细胞(E:T)比率为5:1。将50μL培养基对照、测试双特异性TCE、参考T细胞结合物或结合卷曲的参考TCE稀释液添加到指定孔中，并将板在37℃、5％CO2下孵育24小时。
孵育24小时后，将板以1000RPM离心30秒，并将50μL上清液转移至黑壁、透明平底板，并将50μL ONE-Glo荧光素酶测定溶液(普洛米格(Promega)，目录号：E6120)添加到每个孔中，并在室温下孵育2分钟。使用Envision读板器(或等同设备)测量板中样品的生物发光。通过将包含与CD8+T细胞和培养基对照共培养的靶细胞的样品的生物发光视为靶细胞的100％杀伤，同时将包含靶细胞的样品的生物发光和包含靶细胞但不存在CD8+T细胞的样品视为对靶细胞的杀伤为0％，计算样品中靶细胞的杀伤百分比。使用GraphPad Prism中的4参数非线性回归曲线拟合获得杀伤EC50(浓度比杀伤百分比)。
孵育24小时后，将50μL上清液也转移至V底储存板的孔中用于IFNγ释放检测。使用人IFNγAlphaLISA检测试剂盒(铂金埃尔默(PerkinElmer)，目录号：AL217F)测量IFNγ释放。简言之，将5μL样品或标准品添加到不透明的384孔平底试验板中。将AlphaLISA抗IFNγ受体珠(1体积)与生物素化的抗IFNγ抗体(1体积)在198体积制备的1×试验缓冲液中混合。将20μL混合受体珠/抗体添加到样品和标准品中，并在室温下黑暗中孵育60分钟。接下来，将1体积的链霉亲和素供体珠稀释在61.5体积的1×试验缓冲液中，并将25μL稀释的链霉亲和素供体珠添加到含有样品和标准品的孔中，并在室温下避光孵育30分钟。孵育30分钟后，使用Envision读板器读板。根据制造商的说明计算IFNγ浓度的转换。使用GraphPadPrism中的4参数非线性回归曲线拟合获得IFNγ释放的EC50(浓度比IFNγ)。
如图5A所示(并总结在表16中)，参考T细胞结合物和结合ROR1卷曲结构域的1A形式参考TCE是在与MDA-MB-231细胞共培养时诱导CD8+T细胞细胞毒性能力测试中效力最强的分子，彼此之间的差异小于2倍。效力定义为靶细胞杀伤的EC50。双特异性1A形式TCE69A02和双特异性1A形式TCE 82H02的EC50均约为20pM，并且分别与双特异性1B形式TCE69A02和双特异性1B形式TCE 82H02的EC50相差在2至3倍之内。
参考T细胞结合物、结合ROR1卷曲结构域的1A形式参考TCE、双特异性1A形式TCE69A02和双特异性1A形式TCE 82H02的杀伤程度没有明显差异，而双特异性1B形式TCE69A02和双特异性1B形式TCE 82H02的效力略有降低，EC50范围为约35至60pm。
表16：人CD8+T细胞的靶标依赖性细胞毒性
如图5B所示(并总结在表17中)，参考T细胞结合物和结合ROR1卷曲结构域的参考TCE是在与MDA-MB-231细胞共培养时诱导CD8+T细胞IFNγ释放能力测试中效力最强的分子，彼此之间的差异约2倍。效力定义为IFNγ释放的EC50。
双特异性1A形式TCE 69A02和双特异性1A形式TCE 82H02比参考T细胞结合物的效力低约2至3倍，并且诱导的最大IFNγ释放减少约30％，表明与T细胞细胞毒活性诱导解偶联。双特异性1B形式TCE 69A02和双特异性1B形式TCE 82H02比参考T细胞结合物的效力低约3至9倍，并且诱导的最大IFNγ释放减少约40％。
如图5C和5D所示(并总结在表17中)，1A形式或1B形式的结合ROR1卷曲结构域的参考TCE，或1A形式或1B形式的双特异性TCE 69A02均不诱导可检测水平的IFNγ释放，表明IFNγ释放是ROR1依赖性的。
表17：人CD8+T细胞的靶标依赖性细胞因子释放
3.2使用食蟹猴CD8+T细胞进行TDCC和TDCR试验
为了评估食蟹猴是否是研究本公开的双特异性TCE的相关物种，我们在体外靶标依赖性细胞毒性和IFNγ释放试验中比较了人和食蟹猴CD8+T细胞的功能活性。
使用食蟹猴CD8+T细胞(IQ生物科学(IQ Biosciences)，目录号：IQB-Mn1-CD8T2)的TDCC试验使用与如上文实施例3.1中所述的使用人CD8+T细胞的TDCC试验类似的方法进行。
使用食蟹猴CD8+T细胞的TDCR试验是使用食蟹猴IFNγAlphaLISA检测试剂盒(铂金埃尔默(PerkinElmer)，目录号：AL561C)进行的，该试剂盒具有类似于上文实施例3.1中所述的人IFNγAlphaLISA检测试剂盒的制造商方案。
如图8A及图8B所示(并总结在表18中)，当与MDA-MB-231肿瘤细胞共培养时，所测试的分子诱导CD8+T细胞细胞毒性的能力的排序对于人和食蟹猴CD8+T细胞是相同的；即，结合ROR1卷曲结构域的1A形式参考TCE>参考T细胞结合物>结合ROR1卷曲结构域的1B形式参考TCE>双特异性1A形式TCE 82H02>双特异性1B形式TCE 82H02。对于每种测试分子，经处理的人CD8+T细胞和经处理的食蟹猴CD8+T细胞之间诱导细胞毒性活性的效力大约有2倍的差异。
表18：人和食蟹猴CD8+T细胞的靶标依赖性细胞毒性
如图8C及图8D所示(并总结在表19中)，当与MDA-MB-231肿瘤细胞共培养时，所测试的分子诱导CD8+T细胞的IFNγ释放能力的排序对于人和食蟹猴CD8+T细胞是相同的；即，结合ROR1卷曲结构域的1A形式参考TCE>参考T细胞结合物>结合ROR1卷曲结构域的1B形式参考TCE>双特异性1A形式TCE 82H02>双特异性1B形式TCE 82H02。对于每种测试分子，经处理的人CD8+T细胞和经处理的食蟹猴CD8+T细胞之间诱导IFNγ释放的效力大约有2倍的差异。
人和食蟹猴CD8+T细胞之间RORl依赖性肿瘤细胞毒性和IFNγ释放的程度相似。这支持了使用食蟹猴来进行本公开的双特异性TCE的非临床研究。
表19：人和食蟹猴CD8+T细胞的靶标依赖性细胞因子释放
3.3使用人PBMC进行TDCC和TDCR试验
使用分离自人全血的PBMC和靶细胞(MDA-MB-231细胞(图4A、图4C和图14)；T-47D细胞(图4B和图4D)；Du-145细胞、A549细胞、NCI-H1975细胞、MDA-MB-231细胞、NCCIT细胞和MCF-7细胞(图7)；以及具有不同ROR1表达水平的MDA-MB-231细胞(图16和图17))的TDCC试验使用类似于上面实施例3.1中所述的使用人CD8+T细胞的TDCC试验的方法进行。
具体地，根据制造商的说明，使用Ficoll-Paque Plus培养基(GE Healthcare，目录号：17144002)从全血中分离PBMC，并以300万个细胞/mL的细胞密度重悬于补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中。
使用PBMC的TDCR试验是使用人IFNγAlphaLISA检测试剂盒(PerkinElmer，货号：AL217F)进行的，如上文实施例3.1中所述。
为了鉴定诱导靶肿瘤细胞的强力TDCC和来自PBMC的低水平TDCR的双特异性TCE，计算解偶联比率并将其定义为TDCC试验杀伤百分比对比浓度的图的曲线下面积(AUC)与TDCR试验IFNγ释放对比浓度的图的AUC的商。
如图4A所示(并总结在表20中)，参考T细胞结合物和结合ROR1卷曲结构域的1A形式参考TCE是在与MDA-MB-231细胞共培养时诱导CD8+T细胞细胞毒性能力测试中效力最强的分子，彼此之间的差异小于2倍。效力定义为靶细胞杀伤的EC50。
双特异性1A形式TCE 69A02和双特异性1A形式TCE 82H02的EC50比参考T细胞结合物效力低约5倍(约19-25pM)。双特异性1B形式TCE 69A02和双特异性1B形式TCE 82H02的EC50分别比双特异性1A形式TCE 69A02和双特异性1A形式TCE 82H02效力低4倍(约48-77pM)。
参考T细胞结合物、结合ROR1卷曲结构域的1A形式参考TCE、双特异性1A形式TCE69A02和双特异性1A形式TCE 82H02的杀伤程度没有明显差异。如图4B所示(并总结在表20中)，在PBMC与ROR1-T47D靶肿瘤细胞的共培养物中没有检测到可测量的细胞毒性，表明观察到的细胞毒性是ROR1依赖性的。
表20：人PBMC的靶标依赖性细胞毒性
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如图4C所示(并总结在表21中)，参考T细胞结合物和结合ROR1卷曲结构域的1A形式参考TCE是在与MDA-MB-231细胞共培养时诱导PBMCIFNγ释放能力测试中效力最强的分子，彼此之间的差异小于2倍。效力定义为IFNγ释放的EC50。
双特异性1A形式TCE 69A02和双特异性1A形式TCE 82H02比参考T细胞结合物效力低约10倍。双特异性1B形式TCE 69A02和双特异性1B形式TCE 82H02比参考T细胞结合物的效力低约300至1000倍，并且诱导的最大IFNγ释放减少约60-70％。
如图4D所示(并总结在表21中)，参考T细胞结合物、结合ROR1卷曲结构域的1A形式参考TCE、1A形式或1B形式的双特异性TCE 69A02或1A形式或1B形式的双特异性TCE 82H02均不诱导可检测水平的IFNγ释放，表明IFNγ释放是ROR1依赖性的。
虽然参考T细胞结合物和结合ROR1卷曲结构域的1A形式参考TCE在诱导PBMC细胞毒性杀伤肿瘤细胞和IFNγ释放方面非常高效，但1A和1B形式的双特异性TCE 69A02和82H02在细胞毒性杀伤诱导剂方面比IFNγ释放更强力。
表21：人PBMC的靶标依赖性细胞因子释放
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为了量化每个测试双特异性TCE将细胞毒性与促炎细胞因子释放解偶联的程度，将“解偶联比率”计算为给定的测试或参考分子的靶标杀伤的曲线下面积(AUC)与IFNγ释放的AUC之间的商。
将AUC值相对于参考T细胞结合物的计算值标准化，其中靶细胞杀伤和IFNγ释放的EC50(效力)均为约6pM(即解偶联比率为1，意味着细胞毒性未与IFNγ释放解偶联)。如图4E所示，1A和1B形式的双特异性TCE 69A02以及1A和1B形式的双特异性TCE 82H02具有显著大于参考T细胞结合物的解偶联比率(即大于1)。
1A和1B形式的双特异性TCE 69A02和1A形式的双特异性TCE 82H02具有约1.8至2范围的相当的解偶联比率。1B形式的双特异性TCE 82H02具有最高的解偶联比率。
在PBMC中观察到的细胞毒性与促炎细胞因子释放的解偶联比在纯CD8+T细胞群中观察到的解偶联更显著(实施例3.1，上文)，特别是1B形式的双特异性TCE 82H02。这些结果表明，CD4+辅助T细胞的存在可能在本公开的双特异性TCE维持细胞毒性同时减少IFNγ释放的作用机制中发挥作用。
为了确定由本公开的双特异性TCE介导的细胞毒性与促炎细胞因子释放的解偶联是否是跨ROR1+肿瘤细胞系阵列的普遍特征，跨多个具有各种ROR1表面表达水平的肿瘤细胞系评估ROR1依赖性靶细胞杀伤和ROR1依赖性IFNγ释放。本实施例中使用的细胞系上ROR1的平均细胞表面密度示于表22中。
表22：各种细胞系的ROR1细胞表面密度
| 细胞系 | ROR1密度(分子/细胞) |
| MCF-7 | 0 |
| Du-145 | 13336 |
| A549 | 36334 |
| NCI-H1975 | 38486 |
| MDA-MB-231 | 46660 |
| NCCIT | 94426 |
如图7A至7D所示，并且如先前用MDA-MB-231靶标所观察到的，当在1A形式(图7A和图7B)和1B形式(图7C和图7D)双特异性TCE 82H02存在的情况下与PBMC共培养时，在所有ROR-1+肿瘤细胞系中观察到细胞毒性与促炎细胞因子释放的解偶联。参考T细胞结合物或结合ROR1卷曲结构域的1A形式参考TCE中均未观察到解偶联(图7E和图7F)。在PBMC与ROR1-MCF-7细胞共培养物中未观察到靶细胞杀伤或IFNγ释放。
总体而言，观察到靶细胞杀伤和促炎细胞因子释放都是ROR1依赖性的。此外，鉴于在所有测试的ROR1+细胞系中观察到1A和1B形式的双特异性TCE82H02的细胞毒性与细胞因子释放的解偶联，可见这种现象不仅限于MDA-MB-231，而且更普遍适用于所有ROR1+细胞系。
如图14A所示(并总结在表23中)，当PBMC与MDA-MB-231细胞共培养时，与序列优化的双特异性TCE 82H02 TC E#1和82H02 TCE#2；和双特异性TCE 82H02 TCE#3和82H02 TCE#4相比，参考T细胞结合物在诱导细胞毒性肿瘤细胞杀伤方面分别更强力2至4倍和15倍。与双特异性TCE 82H02TCE#3和82H02 TCE#4(低亲和力ROR1结合)相比，双特异性TCE82H02TCE#1和82H02 TCE#2(高亲和力ROR1结合)的效力降低了4至6倍。与双特异性TCE82H02 TCE#2和82H02 TCE#4(低亲和力CD3结合)相比，双特异性TCE 82H02 TCE#1和82H02TCE#3(高亲和力CD3结合)的效力降低了小于2倍。这些结果表明，本公开的双特异性TCE之间诱导细胞毒性杀伤活性的效力的主要差异主要是由对ROR1而不是CD3的表观亲和力驱动的。
如图14B所示(并总结在表24中)，当PBMC与MDA-MB-231细胞共培养时，与序列优化的双特异性TCE 82H02 TC E#1和82H02 TCE#2；和双特异性TCE 82H02 TCE#3和82H02 TCE#4相比，参考T细胞结合物在诱导IFNγ释放方面分别更强力约20至25倍和40至50倍。与双特异性TCE 82H02 TCE#3和82H02 TCE#4(低亲和力ROR1结合)相比，双特异性TCE 82H02 TCE#1和82H02 TCE#2(高亲和力ROR1结合)的效力降低了约2倍。与双特异性TCE 82H02 TCE#2和82H02 TCE#4(低亲和力CD3结合)相比，双特异性TCE 82H02 TCE#1和82H02 TCE#3(高亲和力CD3结合)的效力降低了小于2倍。这些结果表明，本公开的双特异性TCE之间诱导IFNγ释放的效力的主要差异主要是由对ROR1而不是CD3的表观亲和力驱动的。此外，由测序优化的双特异性TCE 82H02 TCE#1和82H02 TCE#2；和双特异性TCE82H02 TCE#3和82H02 TCE#4的IFNγ的最大释放量分别减少了约50％和60至65％。
如图14C所示，所有双特异性TCE 82H02 TCE#1、82H02 TCE#2、82H02TCE#3和82H02TCE#4都与彼此没有显著差异的解偶联比率相关(相对于参考T细胞结合物标准化，大约2)。
表23：人PBMC的靶标依赖性细胞毒性
表24：人PBMC的靶标依赖性细胞因子释放
| PBMC:MDA-MB-231 | PBMC:MDA-MB-231 | |
| EC50(nM) | 最大IFNγ(pg/mL) | |
| Ref.T细胞结合物 | 10.7 | 2136.1 |
| 82H02 TCE#1 | 204.7 | 1124.8 |
| 82H02 TCE#2 | 264.9 | 1001.1 |
| 82H02 TCE#3 | 424.9 | 880.7 |
| 82H02 TCE#4 | 509.4 | 764.3 |
通过将PBMC与经工程改造以表达不同细胞表面密度的ROR1的靶MDA-MB-231肿瘤细胞共培养来评估与本公开的序列优化的双特异性TCE相关的ROR1密度区分能力。MDA-MB-231细胞每个细胞表达约40,000个ROR1分子。为了减少ROR1的表面表达，用编码ROR1特异性shRNA的慢病毒转导MDA-MB-231细胞。为了增加ROR1的表面表达，用编码全长ROR1的慢病毒转导MDA-MB-231细胞。敲除ROR1的MDA-MB-231细胞是使用Cas9/CRISPR技术制备的。总共产生了6个具有不同ROR1表面表达水平的细胞系：0.2x105个分子/细胞(MDA-MB-231-0.2)；0.4x105个分子/细胞(MDA-MB-231-0.4)；6x105个分子/细胞(MDA-MB-231-0.6)；1.3x106个分子/细胞(MDA-MB-231-1.3)；7x106个分子/细胞(MDA-MB-231-7)。
如图16F(并总结在表25中)和图17F所示(并在表26中总结)，PBMC与敲除ROR1的MDA-MB-231靶细胞共培养没有导致高于背景的明显水平的杀伤或IFNγ释放。如图16A至16E所示，由序列优化的双特异性82H02 TCE或参考T细胞结合物诱导的最大PBMC介导的细胞毒性随着ROR1的细胞表面密度的降低而降低。类似地，如图17A至17E所示，由序列优化的双特异性82H02 TCE或参考T细胞结合物诱导的最大IFNγ释放随着ROR1的细胞表面密度的降低而降低。
诱导细胞毒性活性和IFNγ释放的效力的排序是：参考T细胞结合物>82H02 TCE#1>82H02 TCE#2>82H02 TCE#3>82H02 TCE#4。
对于靶肿瘤细胞的细胞毒性杀伤，测试分子的效力差异随着RORl密度降低而增加。在最低ROR1细胞密度(MDA-MB-231-0.2)下，参考T细胞结合物、82H02 TCE#1、82H02TCE#2、82H02 TCE#3和82H02 TCE#4的细胞毒性活性效力为小于3倍。
对于IFNγ释放，相对于细胞毒性杀伤而言较低的EC50和E最大值与细胞毒性和细胞因子释放的解偶联一致，并且在82H02 TCE#1、82H02 TCE#2、82H02TCE#3和82H02 TCE#4中观察到，但参考T细胞结合物并非如此。解偶联的程度与ROR1的细胞表面密度呈负相关，并且在ROR1的超生理密度(即>1.3x106个分子/细胞)下，并不明显优于参考T细胞结合物的诱导。
如图18所示，(由参考T细胞结合物标准化的)解偶联比率随着细胞表面ROR1表达密度的降低而增加。82H02 TCE#2、82H02 TCE#3和82H02 TCE#4观察到最高的解偶联比率，并且彼此之间没有明显差异。在ROR1密度介于0.2x105和0.6x105个分子/细胞之间时，与82H02 TCE#2、82H02 TCE#3和82H02 TCE#4相比，82H02 TCE#1相关的解偶联比率大约低20％。
表25：针对具有各种ROR1细胞表面密度的靶细胞的人PBMC的靶标依赖性细胞毒性
表26：针对具有各种ROR1细胞表面密度的靶细胞的人PBMC的靶标依赖性细胞因子释放
3.4使用敲入CD3ε的C57BL/6小鼠脾细胞进行TDCC和TDCR试验
生成C57BL/6小鼠，其中小鼠CD3ε被敲除并被嵌合CD3ε取代，所述嵌合CD3ε由人CD3的胞外域和小鼠CD3ε的跨膜和胞质结构域组成(敲入人CD3或hCD3-KI)，以观察这种动物是否可以用作评估本公开的双特异性TCE的临床前体内活性的相关模型。使用基于PiggyBAC转座子的系统，4T1细胞稳定表达细胞表面人ROR1(hROR1+4T1)或小鼠ROR1(mROR1+4T1)。
使用敲入CD3ε的C57BL/6小鼠脾细胞和靶细胞(4T1-hROR1细胞(图9A和图9B)；或4T1-mROR1细胞(图9C和图9D))的TDCC试验，使用类似于上文实施例3.1中所述的使用人CD8+T细胞的TDCC试验的方法进行。
具体地，通过将脾脏压过100-μm细胞过滤器进入50mL锥形管，从敲入人CD3ε的C57BL/6小鼠的脾脏中分离小鼠脾细胞。用5mL PBS清洗细胞过滤器两次，并将流出液收集至50mL锥形管中。沉淀脾细胞，重悬于5mL ACK裂解缓冲液(赛默飞世尔(ThermoFisher)，目录号：A1049201)中，并在室温下孵育5分钟。用PBS洗涤脾细胞，并以3x106个细胞/mL的密度重悬于培养基(含10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI1640)中。
使用小鼠CD8+T细胞的TDCR试验是使用小鼠IFNγAlphaLISA检测试剂盒(铂金埃尔默(PerkinElmer)，目录号：AL501C)进行的，该试剂盒具有类似于上文实施例3.1中所述的人IFNγAlphaLISA检测试剂盒的制造商方案。
为了鉴定诱导靶肿瘤细胞的强力TDCC和来自PBMC的低水平TDCR的双特异性TCE，计算解偶联比率并将其定义为TDCC试验杀伤百分比对比浓度的图的AUC与TDCR试验IFNγ释放对比浓度的图的AUC的商。
如图9A所示(并总结在表27中)，针对hROR1+4T1细胞的细胞毒性靶细胞杀伤诱导的效力的排序为参考T细胞结合物>结合ROR1卷曲结构域的1A形式参考TCE>结合ROR1卷曲结构域的1B形式参考TCE>双特异性1A形式TCE 82H02>双特异性1B形式TCE 82H02。如图9C所示(并总结在表27中)，针对mROR1+4T1细胞的细胞毒性靶细胞杀伤诱导的效力的排序为双特异性1A形式TCE 82H02>结合ROR1卷曲结构域的1A形式参考TCE>结合ROR1卷曲结构域的1B形式参考TCE>双特异性1B形式TCE 82H02。正如预期的那样，参考T细胞结合物对mROR1+4T1细胞没有细胞毒性活性，因为它不结合鼠ROR1。对于双特异性TCE 82H02，对于1A和1B形式，针对hROR1+4T1和mROR1+4T1的效力差异分别约为3倍和9倍。
如图9B所示(并总结在表28中)，针对hROR1+4T1细胞的IFNγ释放诱导的效力的排序为参考T细胞结合物>结合ROR1卷曲结构域的1A形式参考TCE>结合ROR1卷曲结构域的1B形式参考TCE>双特异性1A形式TCE82H02>双特异性1B形式TCE 82H02。如图9D所示(并总结在表28中)，针对hROR1+4T1细胞的IFNγ释放诱导的效力的排序为结合ROR1卷曲结构域的1A形式参考TCE>结合ROR1卷曲结构域的1B形式参考TCE>双特异性1A形式TCE 82H02>双特异性1B形式TCE 82H02。正如预期的那样，参考T细胞结合物对mROR1+4T1细胞没有可测量的IFNγ释放，因为它不结合鼠ROR1。对于双特异性TCE 82H02，对于1A和1B形式，针对hROR1+4T1和mROR1+4T1的IFNγ释放效力差异分别为约3倍和大于3倍。
表27：敲入人CD3的小鼠脾细胞针对人或小鼠ROR1+4T1细胞的靶标依赖性细胞毒性
表28：敲入人CD3的小鼠脾细胞针对人或小鼠ROR1+4T1细胞的靶标依赖性细胞因子释放
在脾细胞敲入hCD3的小鼠脾细胞和hROR1+4T1细胞的共培养物中，对于1A和1B形式的双特异性TCE 82H02观察到细胞毒性与促炎细胞因子释放的解偶联，但对于参考T细胞结合物或结合ROR1卷曲结构域的1A形式或1B形式参考TCE未观察到解偶联。使用1A和1B形式的双特异性TCE 82H02观察到解偶联比率≥1.5，其由参考T细胞结合物标准化的Δ(delta)分别达到约1.7和2倍(图9E)。
因为参考T细胞结合物不结合mROR1，所以在敲入hCD3的小鼠脾细胞和mROR1+4T1细胞的共培养实验中，解偶联比率被计算由结合ROR卷曲结构域的1A形式参考TCE标准化。如图9F所示，在脾细胞敲入hCD3的小鼠脾细胞和mROR1+4T1细胞的共培养物中观察到细胞毒性与促炎细胞因子释放几乎没有解偶联。
总体而言，当表达人或小鼠ROR1的小鼠肿瘤靶标与来自敲入hCD3的小鼠的脾细胞共培养时，ROR1依赖性肿瘤细胞细胞毒性的程度相似。在与hROR1+4T1细胞共培养中观察到细胞毒性与促炎细胞因子释放的解偶联，但在与mROR1+4T1细胞共培养中似乎减弱。这些观察结果支持使用携带人ROR1工程改造的同系基因肿瘤的敲入hCD3的小鼠进行非临床体内药代动力学/药效学和功效研究。
实施例4：肿瘤浸润T细胞(TIL)的连续杀伤试验
该实施例描述了在存在或不存在本公开的双特异性TCE的情况下肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)诱导靶肿瘤细胞连续杀伤。
从新鲜的三阴性乳腺癌活检中分离TIL并在培养物中扩增。简言之，将1mm/1克活检组织碎片与5mL胶原酶IA(Sigma目录号：C9891，以100U/ml重悬于RPMI1640中)一起孵育，并在37℃下孵育30分钟，然后在室温下再孵育30分钟。样品通过40μm细胞过滤器并收集到50ml管中。根据制造商的说明，用RPMI1640培养基洗涤细胞，并使用Ficoll-Paque plus培养基(Cytiva，目录号：GE17-1440-02)分离单核细胞。将1x106个分离的单核细胞与6000U/mL人IL2在补充有10％热灭活人AB血清、1％青霉素/链霉素、10mM谷氨酰胺和10mM HEPES的RPMI1640培养基中以1x106个细胞/mL的细胞密度培养24小时。孵育24小时后，将1.3x105TIL重悬于10mL RPMI1640培养基中，其补充有10％热灭活人AB血清、1％青霉素/链霉素、10mM谷氨酰胺、10mM HEPES、3000U/mL人IL-2和0.03μg/mL CD3抗体克隆OKT3。
从六个不同的健康供者收集的外周血单核细胞(PBMC)以5000rad进行γ辐射，并将2.7x106个经辐射的PBMC重悬于AIM-V培养基中并添加至T-25烧瓶中的1.3x105TIL中。将PBMC-TIL共培养物孵育96小时，然后从每个烧瓶中取出10mL培养基，并更换为5ml AIM-V培养基和5mL补充有10％热灭活人AB血清、1％青霉素/链霉素、10mM谷氨酰胺、10mM HEPES和6000U/mL人IL2的RPMI1640。通过添加补充有3,000U/mL IL2的AIM-V培养基，将细胞维持在低于1x106个细胞/mL的培养密度。孵育14天后，通过流式细胞仪对TIL细胞进行计数并通过CD3、CD4和CD8表达染色进行分析(>99％的细胞是CD3+T细胞，>80％的CD3+T细胞是CD8+T细胞)。TIL在冷冻培养基(赛默飞世尔，货号：12648010)中冷冻，直至用于连续杀伤试验。
为了进行连续杀伤试验，将冷冻的TIL解冻、洗涤，在补充有10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素/链霉素和500U/mL人IL2的RPMI1640培养基中于37℃、5％CO2下培养48小时，然后在相同培养基中系列稀释，制成细胞密度为1x106、5x105、2.5x105、1.25x105、6.25x104、3.125x104、1.562x104、7.81x103的TIL细胞悬液或单独的培养基(即0TIL)。
将靶细胞(NCI-H1975细胞(图6A和图15)；和T-47D细胞(图6B))在不存在抗生素的情况下培养24小时，然后以50,000个细胞/mL培养基的细胞密度重悬。将100μL靶细胞悬浮液小心地分配到黑壁透明平底板的每个孔中，并孵育4小时。将100μL培养基中含有20000、10000、5000、2500、1250、625、313、156、78和0个靶细胞的孔也接种到指定孔中，用作标准参考。
将100μL的每种测试双特异性TCE(100pM)、参考T细胞结合物(100pM)、结合卷曲的参考TCE稀释液(100pM)或培养基对照与100μL每种TIL细胞悬浮液稀释液或培养基对照混合，然后添加到含有靶细胞稀释液的黑壁透明平底板的孔中，且共培养物在30℃、5％CO2下孵育24小时。
孵育24小时后，将细胞以1000RPM离心30秒，并从每个孔中取出100μL上清并转移至第二个板用于储存。将100μL One-Glo溶液添加到含有共培养物的每个孔中，并添加剩余的100μL共培养物上清液，并在室温下孵育2分钟。使用Envision读板器(或等同设备)测量板中样品的生物发光。使用靶细胞标准参考的生物发光强度绘制标准曲线。使用标准曲线计算每个共培养样品中活靶细胞的数量，并进一步计算杀伤的靶细胞的数量，作为接种到每个孔中的5000个靶细胞与计算的活靶细胞数量之间的差异。通过将每种条件下被杀伤的靶细胞数量除以TIL数量来计算杀伤频率，并求平均值以提供E:T比率为1:8和1:16时的杀伤频率。使用GraphPad Prism绘制平均杀伤频率。
如图6A所示，当TIL与NCI-H1975细胞在参考T细胞结合物存在下共培养时，几乎没有观察到连续杀伤。1A形式的双特异性TCE 82H02比1A形式的双特异性TCE 82H02诱导的连续杀伤高出30％至40％。结合ROR1卷曲结构域的1A形式TCE比1A形式的双特异性TCE 69A02和1A形式的双特异性TCE 82H02分别多诱导约25％和30％的连续杀伤。结合ROR1卷曲结构域的1B形式TCE比1B形式的双特异性TCE 69A02和1B形式的双特异性TCE82H02分别多诱导约20％和30％的连续杀伤。
总体而言，结合ROR1卷曲结构域的1A形式参考TCE、1A形式的双特异性TCE 69A02和1A形式的双特异性TCE 82H02均诱导每个T细胞至少3个肿瘤细胞的连续杀伤频率。与1B形式的分子相比，使用1A形式的分子观察到的更强的连续杀伤归因于对CD3的更高的表观亲和力，这可能是由于与1B形式的C端相比，当工程改造至1A形式的桥接部分的N端时，空间位阻减少。如图6B所示，当TIL与ROR1-T47D细胞共培养时，没有观察到连续杀伤，表明观察到的连续杀伤是ROR1依赖性的。
如图15所示，参考T细胞结合物几乎没有诱导TIL对NCI-H1975肿瘤细胞的连续杀伤。序列优化的双特异性TCE 82H02#1、82H02#2、82H02#3和82H02#4具有相似的连续杀伤水平(大约3至4个肿瘤细胞/T细胞)
实施例5：生物安全试验
该实施例描述了实施实验以测量由在存在或不存在本公开的双特异性TCE的情况下培养的以高密度预培养的PBMC或新鲜分离的PBMC释放的细胞因子和趋化因子。从健康供者中新鲜分离的PBMC旨在模拟循环中的PBMC，其中细胞与细胞的接触稀疏。高密度预培养的PBMC(例如，1x107个细胞/mL，持续48小时)旨在模拟细胞间接触较高的次级淋巴结构(例如，脾和淋巴结)中的PBMC。这种细胞间接触被认为通过与所有细胞上的MHC的极低亲和力相互作用，导致T细胞上TCR/CD3复合物的弱强直信号传导，从而温和地引发T细胞。这种“高密度”预培养被证明对于复现由CD28超级激动剂抗体TGN1412诱导的非特异性T细胞介导的促炎细胞因子释放是必要的(Romer等(2011)Blood.118(26):6772-82.)。
根据制造商的说明，使用Ficoll-Paque Plus培养基(GE Healthcare，目录号：17144002)从全血中分离人PBMC。然后将PBMC以2x106个细胞/mL的细胞密度重悬于培养基(补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI1640)中。将50μL PBMC添加到平底96孔板的每个孔中(即100,000个细胞/孔)。测试双特异性TCE(82H02 TCE 1A或82H02 TCE 1B)、参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)、参考结合卷曲的TCE(Ref.结合Frz的TCE 1A或Ref.结合Frz的TCE 1A)、同种型对照抗体(hIgG)或小鼠抗人CD3克隆OKT3(OKT3，阳性对照)均在补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中制备至24pM的浓度。将50μl制备的测试双特异性TCE、参考T细胞结合物、结合卷曲的参考TCE、hIgG或OKT3添加到含有PBMC的96孔板的孔中，直至最终体积为100μL，并在37℃，5％CO2下孵育24小时。24小时孵育后，收集上清液用于细胞因子和趋化因子释放的定量。
对于高密度共培养实验，将新鲜分离的PBMC沉淀并重悬于补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中至细胞密度为1.0x107个细胞/mL，并在37℃，5％CO2孵育48小时。孵育48小时后，将PBMC以2.0x106个细胞/mL的细胞密度重悬于补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中。将50μL PBMC添加到平底96孔板的每个孔中(即100,000个细胞/孔)。测试双特异性TCE(82H02 TCE 1A或82H02 TCE 1B)、参考T细胞结合物(Ref.T细胞结合物)、参考结合卷曲的TCE(Ref.结合Frz的TCE 1A或Ref.结合Frz的TCE1A)、同种型对照抗体(hIgG)或小鼠抗人CD3克隆OKT3(OKT3，阳性对照)均在补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中制备至24pM的浓度。将50μl制备的测试双特异性TCE、参考T细胞结合物、结合卷曲的参考TCE、hIgG或OKT3添加到含有高密度预培养PBMC的96孔板的孔中，直至最终体积为100μL，并在37℃，5％CO2下孵育24小时。24小时孵育后，收集上清液用于细胞因子和趋化因子释放的定量。
根据制造商的说明，使用人CD8+T细胞磁珠组预混合17Plex-免疫学多重试验试剂盒(Immunology Multiplex Assay kit)(Sigma，目录号：HCD8MAG15K17PMX)测量培养的PBMC样品中的细胞因子和趋化因子水平。简言之，将200μL试验缓冲液添加到试剂盒中提供的96孔试验板中。然后将板密封并在室温下置于板摇床上10分钟并弃去缓冲液。将25μL PBMC培养物上清液、标准品或对照添加到指定孔中，并将25μLRPMI1640培养基添加到每个孔中，使每个孔中的体积达到50μL。将25μL预混珠添加到每个孔中，将板密封并置于板摇床上，在4℃下孵育过夜。洗板两次，每孔加入25μL制备的检测抗体。将板密封并在板摇床上于室温下孵育1小时。将25μl链霉亲和素-藻红蛋白(PE)添加到每个孔中，将板密封并在板摇床上在室温下再孵育30分钟。孵育后，洗板两次，每孔加入150μL鞘液。将板在板摇床上进一步孵育5分钟，并使用/>软件在/>仪器上分析样品。使用各个标准品的读数生成标准曲线。使用每种细胞因子或趋化因子的各个标准曲线计算细胞因子或趋化因子的水平。结果在GraphPad Prism中绘制(细胞因子/趋化因子释放与测试物浓度)。
如图10A至10D以及图11A至11D所示，抗人CD3克隆OKT3在新鲜分离的PBMC培养物和高密度预培养的PBMC中以剂量依赖性方式诱导显著的细胞因子释放(IFNγ、TNFα和IL10)。
参考T细胞结合物和结合卷曲的1B形式参考TCE诱导新鲜分离的PBMC中小程度的非特异性IL2释放和高密度预培养的PBMC中的TNFα释放。与背景或hIgG1同种型对照相比，1A和1B形式的双特异性TCE 82H02不诱导显著水平的细胞因子释放。
实施例6：竞争试验
该实施例描述了实施实验以确定本公开的RORl结合克隆(82H02和69A02)、双特异性参考T细胞结合物或结合卷曲的参考克隆是否竞争结合NCCIT细胞上的RORl。
测试NCCIT细胞培养物的活力并以1x106个细胞/ml的细胞密度重悬于培养基中。将200μl NCCIT细胞悬浮液添加到U形底96孔板的每个孔中(即每孔200,000个细胞)。用PBS洗涤细胞两次，并向每个孔中添加100μl活/死可固定染色溶液(赛默飞世尔，目录号：L34961)。将细胞在黑暗中室温孵育15分钟，用PBS洗涤两次，然后重悬于100μL系列稀释的未标记82H02scFv-Fc、69A02 scFv-Fc、Ref.T细胞结合物scFv-Fc或Ref.结合Frz的scFv-Fc(从1000nM至0.017nM三倍稀释)的染色缓冲液中(eBiosciences，目录号：00-4222-26)。然后将细胞在黑暗中冰上孵育30分钟，用冰冷的PBS清洗，然后重悬于100μL 146nM 82H02scFv-Fc中，该ScFv-Fc用Alexa Fluor 647-偶联的Zenon片段(赛默飞世尔，目录号Z25408)标记。将细胞在冰上避光孵育30分钟，用冰冷的PBS洗涤3次，然后在50μl/孔的固定缓冲液(白乐津(Biolegend)，目录号：42080)中室温固定10分钟。然后将细胞重悬于200μlPBS中，并使用FlowJo软件在Fortessa X-20仪器上通过流式细胞术对细胞进行分析。
如图19所示，Alexa Fluor 647-偶联的Zenon片段标记的82H02 scFv-Fc不会结合被其竞争抗体(即未标记的82H02 scFv-Fc)占用的NCCIT细胞上的ROR-1，并且产生微弱的Alexa Fluor 647信号，如流式细胞术所测得。相比之下，在用69A02 scFv-Fc、Ref.T细胞结合物scFv-Fc或Ref.结合Frz的scFv-Fc预处理的NCCIT细胞样品中测量到显著的AlexaFluor 647信号表明AlexaFluor 647-偶联的Zenon片段标记的82H02 scFv-Fc不会与这些分子竞争ROR1的结合，并且这些分子与ROR1的不同表位/区域结合。
实施例7：结合亲和力试验
该实施例描述了用于确定本公开的双特异性TCE和序列优化变体的结合亲和力的生物层干涉实验。
表29显示了通过生物层干涉测量的固定化双特异性TCE对重组人RORl胞外结构域蛋白的KD值。
表29：结合ROR1的双特异性TCE的结合亲和力
表30显示通过生物层干涉测量的固定化双特异性TCE对重组人CD3ε/δ异二聚体SEED Fc融合蛋白的KD值。
表30：结合CD3的双特异性TCE的结合亲和力
通过引用纳入
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等同形式
在不脱离本公开的精神或基本特征的情况下，本发明可以其他特定形式实施。因此，前述实施方式在所有方面都被认为是说明性的而不是限制本文所述的公开内容。不同实施方式中的各种结构元件和所述各种方法步骤可以任意组合排列而所有这些变型都应视为本公开的方式。因此由附加的权利要求而不是前面描述指示发明的范围，并且因此意味着包含与权利要求等同含义和范围之内的所有改变。
Claims (194)
1.一种蛋白质，其包含：
特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其连接至桥接部分的端部；和
特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其连接至所述桥接部分的相反端。
2.如权利要求1所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物连接至所述桥接部分的C端，并且所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物连接至所述桥接部分的N端。
3.如权利要求2所述的蛋白质，其还包含连接至所述桥接部分的N端的特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物。
4.如权利要求3所述的蛋白质，其中所述桥接部分包含两个多肽臂，且其中所述特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物以及特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物分别连接至同一多肽臂的C端和N端，并且所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物连接至第二多肽臂的N端。
5.如权利要求1所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物连接至所述桥接部分的N端，并且所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物连接至所述桥接部分的C端。
6.如权利要求5所述的蛋白质，其还包含连接至所述桥接部分的N端的特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物。
7.如权利要求6所述的蛋白质，其中所述桥接部分包含两个多肽臂，且其中所述特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物以及特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物分别连接至样品多肽臂的N端和C端，并且所述特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物连接至第二多肽臂的N端。
8.如权利要求1-7中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物选自下组：单链可变片段(scFv)、Fab、Fab’、F(ab’)2、微型抗体和纳米抗体(VHH)。
9.如权利要求8所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物是scFv。
10.如权利要求3、4、6或7中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物选自下组：scFv、Fab、Fab’、F(ab’)2、微型抗体和VHH。
11.如权利要求10所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物是scFv。
12.如权利要求1-11中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含：
重链互补决定区1(VHCDR1)，其包含氨基酸序列GFTFTSYA(SEQ ID NO:8)或氨基酸序列GFSITTSGVS(SEQ ID NO:23)；
重链互补决定区2(VHCDR2)，其包含氨基酸序列ISGSGGGT(SEQ ID NO:9)或氨基酸序列IYWDDDK(SEQ ID NO:24)；
重链互补决定区3(VHCDR3)，其包含氨基酸序列AQGSSIFDY(SEQ ID NO:10)或氨基酸序列AHAPRYTPGGYFDY(SEQ ID NO:25)；
轻链互补决定区1(VLCDR1)，其包含氨基酸序列QSVSSY(SEQ ID NO:11)或氨基酸序列QSVSSN(SEQ ID NO:26)；
轻链互补决定区2(VLCDR2)，其包含氨基酸序列DAS或GAS；和
轻链互补决定区3(VLCDR3)，其包含氨基酸序列QQRSNWPPXT(SEQ ID NO:13)，其中X是F、S、C、R、Q、I、L、Y或V，或氨基酸序列QQYKNWPPA(SEQ ID NO:28)。
13.如权利要求3、4、6、7或10-12中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含：
重链互补决定区1(VHCDR1)，其包含氨基酸序列GFTFTSYA(SEQ ID NO:8)或氨基酸序列GFSITTSGVS(SEQ ID NO:23)；
重链互补决定区2(VHCDR2)，其包含氨基酸序列ISGSGGGT(SEQ ID NO:9)或氨基酸序列IYWDDDK(SEQ ID NO:24)；
重链互补决定区3(VHCDR3)，其包含氨基酸序列AQGSSIFDY(SEQ ID NO:10)或氨基酸序列AHAPRYTPGGYFDY(SEQ ID NO:25)；
轻链互补决定区1(VLCDR1)，其包含氨基酸序列QSVSSY(SEQ ID NO:11)或氨基酸序列QSVSSN(SEQ ID NO:26)；
轻链互补决定区2(VLCDR2)，其包含氨基酸序列DAS或GAS；和
轻链互补决定区3(VLCDR3)，其包含氨基酸序列QQRSNWPPXT(SEQ ID NO:13)，其中X是F、S、C、R、Q、I、L、Y或V，或氨基酸序列QQYKNWPPA(SEQ ID NO:28)。
14.如权利要求1-13中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含：包含氨基酸序列GFTFTSYA(SEQ ID NO:8)的VHCDR1；包含氨基酸序列ISGSGGGT(SEQ ID NO:9)的VHCDR2；包含氨基酸序列AQGSSIFDY(SEQ ID NO:10)的VHCDR3；包含氨基酸序列QSVSSY(SEQ ID NO:11)的VLCDR1；包含氨基酸序列DAS的VLCDR2；和包含氨基酸序列QQRSNWPPFT(SEQ ID NO:14)的VLCDR3。
15.如权利要求3、4、6、7或10-14中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含：包含氨基酸序列GFTFTSYA(SEQ ID NO:8)的VHCDR1；包含氨基酸序列ISGSGGGT(SEQ ID NO:9)的VHCDR2；包含氨基酸序列AQGSSIFDY(SEQ ID NO:10)的VHCDR3；包含氨基酸序列QSVSSY(SEQ ID NO:11)的VLCDR1；包含氨基酸序列DAS的VLCDR2；和包含氨基酸序列QQRSNWPPFT(SEQ ID NO:14)的VLCDR3。
16.如权利要求1-13中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含：包含氨基酸序列GFTFTSYA(SEQ ID NO:8)的VHCDR1；包含氨基酸序列ISGSGGGT(SEQ ID NO:9)的VHCDR2；包含氨基酸序列AQGSSIFDY(SEQ ID NO:10)的VHCDR3；包含氨基酸序列QSVSSY(SEQ ID NO:11)的VLCDR1；包含氨基酸序列DAS的VLCDR2；和包含氨基酸序列QQRSNWPPST(SEQ ID NO:15)的VLCDR3。
17.如权利要求3、4、6、7、10-13或16中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含：包含氨基酸序列GFTFTSYA(SEQ IDNO:8)的VHCDR1；包含氨基酸序列ISGSGGGT(SEQ ID NO:9)的VHCDR2；包含氨基酸序列AQGSSIFDY(SEQ ID NO:10)的VHCDR3；包含氨基酸序列QSVSSY(SEQ ID NO:11)的VLCDR1；包含氨基酸序列DAS的VLCDR2；和包含氨基酸序列QQRSNWPPST(SEQ ID NO:15)的VLCDR3。
18.如权利要求1-13中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含：包含氨基酸序列GFSITTSGVS(SEQ ID NO:23)的VHCDR1；包含氨基酸序列IYWDDDK(SEQ ID NO:24)的VHCDR2；包含氨基酸序列AHAPRYTPGGYFDY(SEQ IDNO:25)的VHCDR3；包含氨基酸序列QSVSSN(SEQ ID NO:26)的VLCDR1；包含氨基酸序列GAS的VLCDR2；和包含氨基酸序列QQYKNWPPA(SEQ ID NO:28)的VLCDR3。
19.如权利要求3、4、6、7、10-13或18中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含：包含氨基酸序列GFSITTSGVS(SEQ IDNO:23)的VHCDR1；包含氨基酸序列IYWDDDK(SEQ ID NO:24)的VHCDR2；包含氨基酸序列AHAPRYTPGGYFDY(SEQ ID NO:25)的VHCDR3；包含氨基酸序列QSVSSN(SEQ ID NO:26)的VLCDR1；包含氨基酸序列GAS的VLCDR2；和包含氨基酸序列QQYKNWPPA(SEQ ID NO:28)的VLCDR3。
20.如权利要求1-11中任一项所述的蛋白质，根据IMGT独特编号方案，其中所述特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含：VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，其各自分别包含对应于表1中所列的重链可变结构域和轻链可变结构域的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3序列的氨基酸序列。
21.如权利要求3、4、6、7、10、11或20中任一项所述的蛋白质，根据IMGT独特编号方案，其中所述特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含：VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，其各自分别包含对应于表1中所列的重链可变结构域和轻链可变结构域的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3序列的氨基酸序列。
22.如权利要求1-13中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含与SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:39具有至少90％序列相同性的序列和与SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:40具有至少90％序列相同性的序列。
23.如权利要求3、4、6、7、10-13或22中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含与SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:39具有至少90％序列相同性的序列和与SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38或SEQ IDNO:40具有至少90％序列相同性的序列。
24.如权利要求1-15、22或23中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含与SEQ ID NO:29具有至少90％序列相同性的序列和与SEQ ID NO:30具有至少90％序列相同性的序列。
25.如权利要求3、4、6、7、10-15或22-24中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含与SEQ ID NO:29具有至少90％序列相同性的序列和与SEQ ID NO:30具有至少90％序列相同性的序列。
26.如权利要求1-13、16、17、22或23中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含与SEQ ID NO:29具有至少90％序列相同性的序列和与SEQ ID NO:31具有至少90％序列相同性的序列。
27.如权利要求3、4、6、7、10-13、16、17、22、23或26中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含与SEQ ID NO:29具有至少90％序列相同性的序列和与SEQ ID NO:31具有至少90％序列相同性的序列。
28.如权利要求1-13、18、19、22或23中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含与SEQ ID NO:39具有至少90％序列相同性的序列和与SEQ ID NO:40具有至少90％序列相同性的序列。
29.如权利要求3、4、6、7、10-13、18、19、22、23或28中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含与SEQ ID NO:39具有至少90％序列相同性的序列和与SEQ ID NO:40具有至少90％序列相同性的序列。
30.如权利要求1-11、20或21中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其各自包含分别对应于表2中列出的重链可变结构域和轻链可变结构域的重链可变结构域和轻链可变结构域序列的氨基酸序列。
31.如权利要求3、4、6、7、10、11、20、21或30中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其各自包含分别对应于表2中列出的重链可变结构域和轻链可变结构域的重链可变结构域和轻链可变结构域序列的氨基酸序列。
32.如权利要求1-31中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含接头多肽，所述接头多肽包含(GGGGS)n(SEQ ID NO:1)序列，其中n是1-12。
33.如权利要求3、4、6、7或10-32中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含接头多肽，所述接头多肽包含(GGGGS)n(SEQ ID NO:1)序列，其中n是1-12。
34.如权利要求1-13、22、23、32或33中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含与SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:59具有至少90％序列相同性的序列。
35.如权利要求3、4、6、7、10-13、22、23或32-34中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含与SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:49或SEQ ID NO:59具有至少90％序列相同性的序列。
36.如权利要求1-15、22-25或32-35中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含与SEQ ID NO:41具有至少90％序列相同性的序列。
37.如权利要求3、4、6、7、10-15、22-25或32-36中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含与SEQ ID NO:41具有至少90％序列相同性的序列。
38.如权利要求1-13、16、17、22、23、26、27或32-35中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含与SEQ ID NO:42具有至少90％序列相同性的序列。
39.如权利要求3、4、6、7、10-13、16、17、22、23、26、27、32-35或38中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含与SEQ IDNO:42具有至少90％序列相同性的序列。
40.如权利要求1-13、18、19、22、23、28、29或32-35中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含与SEQ ID NO:59具有至少90％序列相同性的序列。
41.如权利要求3、4、6、7、10-13、18、19、22、23、28、29、32-35或40中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含与SEQ IDNO:59具有至少90％序列相同性的序列。
42.如权利要求1-11、20、21、30或31中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含scFv，所述scFv包含与表3中所列出的scFv对应的氨基酸序列。
43.如权利要求3、4、6、7、10、11、20、21、30、31或42中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含scFv，所述scFv包含与表3中所列出的scFv对应的氨基酸序列。
44.如权利要求1-43中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物选自下组：Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、微型抗体和VHH。
45.如权利要求44所述的蛋白质，其中所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物是Fab。
46.如权利要求1-45中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含：
重链互补决定区1(VHCDR1)，其包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:61)；
重链互补决定区2(VHCDR2)，其包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:62)；
重链可变互补决定区3(VHCDR3)，其包含氨基酸序列VRHGNFGX1X2YVSWFAY(SEQ ID NO:67)，其中X1是N、A或E，且X2是S或A；
轻链互补决定区1(VLCDR1)，其包含氨基酸序列TGAVTTSN(SEQ ID NO:64)；
轻链互补决定区2(VLCDR2)，其包含氨基酸序列GT；和
轻链互补决定区3(VLCDR3)，其包含氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:66)。
47.如权利要求1-46中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含：包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:61)的VHCDR1；包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:62)的VHCDR2；包含氨基酸序列VRHGNFGNSYVSWFAY(SEQ IDNO:63)的VHCDR3；包含氨基酸序列TGAVTTSN(SEQ ID NO:64)的VLCDR1；包含氨基酸序列GT的VLCDR2；和包含氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:66)的VLCDR3。
48.如权利要求1-46中任一项所述的蛋白质，其中特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含：包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:61)的VHCDR1；包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:62)的VHCDR2；包含氨基酸序列VRHGNFGASYVSWFAY(SEQ ID NO:68)的VHCDR3；包含氨基酸序列TGAVTTSN(SEQ ID NO:64)的VLCDR1；包含氨基酸序列GT的VLCDR2；和包含氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:66)的VLCDR3。
49.如权利要求1-45中任一项所述的蛋白质，根据IMGT独特编号方案，其中所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含：VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，其各自分别包含对应于表4中所列的重链可变结构域和轻链可变结构域的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3序列的氨基酸序列。
50.如权利要求1-48中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含与SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:80具有至少90％序列相同性的序列和与SEQ ID NO:76、SEQ IDNO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:81具有至少90％序列相同性的序列。
51.如权利要求1-48或50中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含与SEQ ID NO:72具有至少90％序列相同性的序列和与SEQID NO:81具有至少90％序列相同性的序列。
52.如权利要求1-48或50中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含与SEQ ID NO:71具有至少90％序列相同性的序列和与SEQID NO:76具有至少90％序列相同性的序列。
53.如权利要求1-45或49中任一项所述的蛋白质，根据IMGT独特编号方案，其中所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其各自包含分别对应于表5中列出的重链可变结构域和轻链可变结构域的重链可变结构域和轻链可变结构域序列的氨基酸序列。
54.如权利要求1-48或50中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含与SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:83具有至少90％序列相同性的序列和与SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:85具有至少90％序列相同性的序列。
55.如权利要求1-48、50或54中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含与SEQ ID NO:82具有至少90％序列相同性的序列和与SEQ ID NO:84具有至少90％序列相同性的序列。
56.如权利要求1-48、50或54中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含与SEQ ID NO:83具有至少90％序列相同性的序列和与SEQ ID NO:85具有至少90％序列相同性的序列。
57.如权利要求1-45、49或53中任一项所述的蛋白质，根据IMGT独特编号方案，其中所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物包含重链和轻链，其各自包含分别对应于表6中列出的重链和轻链的重链和轻链序列的氨基酸序列。
58.如权利要求1-57中任一项所述的蛋白质，其中所述桥接部分是功能性的或非功能性的。
59.如权利要求1-58中任一项所述的蛋白质，其中桥接部分包括链交换工程改造的结构域(SEED)形式Fc结构域或其功能性片段、免疫球蛋白Fc结构域或其功能性片段、多肽接头或多肽铰链。
60.如权利要求59所述的蛋白质，其中所述桥接部分包含SEED形式Fc结构域。
61.如权利要求59或60所述的蛋白质，其中所述SEED形式Fc结构域包含一种或多于一种效应子功能沉默突变。
62.如权利要求59-61中任一项所述的蛋白质，其中所述SEED形式Fc结构域包含包含与SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:117或SEQ ID NO:88具有至少90％序列相同性的序列的多肽，和包含与SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:118或SEQ ID NO:89具有至少90％序列相同性的序列的多肽。
63.如权利要求59-62中任一项所述的蛋白质，其中所述SEED形式Fc结构域包含包含SEQ ID NO:86或由SEQ ID NO:86组成的多肽，和包含SEQ ID NO:87或由SEQ ID NO:87组成的多肽。
64.如权利要求59所述的蛋白质，其中所述桥接部分包含免疫球蛋白Fc结构域。
65.如权利要求59或64所述的蛋白质，其中免疫球蛋白Fc结构域包含两个多肽臂，每个多肽臂包含一个或多于一个促进异二聚化的突变。
66.如权利要求59、64或65所述的蛋白质，其中所述免疫球蛋白Fc结构域包含第一多肽臂和第二多肽臂，其各自包含分别对应于表8中列出的第一多肽臂和第二多肽臂的第一多肽臂和第二多肽臂序列的氨基酸序列。
67.如权利要求60-66中任一项所述的蛋白质，其中所述桥接部分还包含位于其N端的铰链。
68.如权利要求67所述的蛋白质，其中所述铰链包含多肽臂，所述多肽臂包含含有SEQID NO:92的氨基酸序列。
69.如权利要求68所述的蛋白质，其中所述铰链还包含第二多肽臂，所述第二多肽臂包含含有SEQ ID NO:90或SEQ ID NO:92的氨基酸序列。
70.如权利要求67所述的蛋白质，其中所述铰链包含多肽臂，所述多肽臂包含表9所列出的氨基酸序列。
71.如权利要求68所述的蛋白质，其中所述铰链还包含第二多肽臂，所述第二多肽臂包含表9所列出的氨基酸序列。
72.如权利要求1-4或8-71中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物通过接头多肽连接至所述桥接部分的C端。
73.如权利要求1或5-71中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物通过接头多肽连接至所述桥接部分的C端。
74.如权利要求72或73所述的蛋白质，其中所述接头多肽包含(GGGGS)n(SEQ ID NO:1)序列，其中n是1-12。
75.一种蛋白质，其包含：
(i)特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含：重链互补决定区1(VHCDR1)，其包含氨基酸序列GFTFTSYA(SEQ ID NO:8)或氨基酸序列GFSITTSGVS(SEQ IDNO:23)，重链互补决定区2(VHCDR2)，其包含氨基酸序列ISGSGGGT(SEQ ID NO:9)或氨基酸序列IYWDDDK(SEQ ID NO:24)，重链互补决定区3(VHCDR3)，其包含氨基酸序列AQGSSIFDY(SEQ ID NO:10)或氨基酸序列AHAPRYTPGGYFDY(SEQ ID NO:25)，轻链互补决定区1(VLCDR1)，其包含氨基酸序列QSVSSY(SEQ ID NO:11)或氨基酸序列QSVSSN(SEQ ID NO:26)，轻链互补决定区2(VLCDR2)，其包含氨基酸序列DAS或GAS，和轻链互补决定区3(VLCDR3)，其包含氨基酸序列QQRSNWPPXT(SEQ ID NO:13)，其中X是F、S、C、R、Q、I、L、Y或V，或氨基酸序列QQYKNWPPA(SEQ ID NO:28)；
(ii)特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含：包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:61)的VHCDR1，包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:62)的VHCDR2，包含氨基酸序列VRHGNFGX1X2YVSWFAY(SEQ ID NO:67)的VHCDR3，其中X1是N、A或E，且X2是S或A，包含氨基酸序列TGAVTTSN(SEQ ID NO:64)的VLCDR1，包含氨基酸序列GT的VLCDR2，和包含氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:66)的VLCDR3；以及
(iii)桥接部分，其将所述特异性结合RORl的多肽或两种或更多种多肽的复合物与所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物连接，其中所述桥接部分包含：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:86或SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:86的多肽臂，和(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:87，或SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:87的第二多肽臂。
76.如权利要求75所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物连接至所述桥接部分的C端，并且所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物连接至所述桥接部分的N端。
77.如权利要求76所述的蛋白质，其还包含连接至所述桥接部分的N端的特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物。
78.如权利要求77所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含：VHCDR1，其包含氨基酸序列GFTFTSYA(SEQ ID NO:8)或氨基酸序列GFSITTSGVS(SEQ ID NO:23)，VHCDR2，其包含氨基酸序列ISGSGGGT(SEQ ID NO:9)或氨基酸序列IYWDDDK(SEQ ID NO:24)，VHCDR3，其包含氨基酸序列AQGSSIFDY(SEQ ID NO:10)或氨基酸序列AHAPRYTPGGYFDY(SEQ ID NO:25)，VLCDR1，其包含氨基酸序列QSVSSY(SEQ IDNO:11)或氨基酸序列QSVSSN(SEQ ID NO:26)，VLCDR2，其包含氨基酸序列DAS或GAS，和VLCDR3，其包含氨基酸序列QQRSNWPPXT(SEQ ID NO:13)，其中X是F、S、C、R、Q、I、L、Y或V，或氨基酸序列QQYKNWPPA(SEQ ID NO:28)。
79.如权利要求76-78中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物通过接头多肽连接至所述桥接部分的C端。
80.如权利要求79所述的蛋白质，其中所述接头多肽包含(GGGGS)n(SEQ ID NO:1)序列，其中n是1-12。
81.如权利要求75所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物连接至所述桥接部分的N端，并且所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物连接至所述桥接部分的C端。
82.如权利要求81所述的蛋白质，其还包含连接至所述桥接部分的N端的特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物。
83.如权利要求82所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含：VHCDR1，其包含氨基酸序列GFTFTSYA(SEQ ID NO:8)或氨基酸序列GFSITTSGVS(SEQ ID NO:23)，VHCDR2，其包含氨基酸序列ISGSGGGT(SEQ ID NO:9)或氨基酸序列IYWDDDK(SEQ ID NO:24)，VHCDR3，其包含氨基酸序列AQGSSIFDY(SEQ ID NO:10)或氨基酸序列AHAPRYTPGGYFDY(SEQ ID NO:25)，VLCDR1，其包含氨基酸序列QSVSSY(SEQ IDNO:11)或氨基酸序列QSVSSN(SEQ ID NO:26)，VLCDR2，其包含氨基酸序列DAS或GAS，和VLCDR3，其包含氨基酸序列QQRSNWPPXT(SEQ ID NO:13)，其中X是F、S、C、R、Q、I、L、Y或V，或氨基酸序列QQYKNWPPA(SEQ ID NO:28)。
84.如权利要求81-83中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物通过接头多肽连接至所述桥接部分的C端。
85.如权利要求84所述的蛋白质，其中所述接头多肽包含(GGGGS)n(SEQ ID NO:1)序列，其中n是1-12。
86.如权利要求75-80中任一项所述的蛋白质，其包含：
(i)特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含：包含氨基酸序列GFTFTSYA(SEQ ID NO:8)的VHCDR1，包含氨基酸序列ISGSGGGT(SEQ ID NO:9)的VHCDR2，包含氨基酸序列AQGSSIFDY(SEQ ID NO:10)的VHCDR3，包含氨基酸序列QSVSSY(SEQ ID NO:11)的VLCDR1，包含氨基酸序列DAS的VLCDR2和包含氨基酸序列QQRSNWPPST(SEQ ID NO:15)的VLCDR3；
(ii)特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含：包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:61)的VHCDR1，包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:62)的VHCDR2，包含氨基酸序列VRHGNFGASYVSWFAY(SEQ ID NO:68)的VHCDR3，包含氨基酸序列TGAVTTSN(SEQ ID NO:64)的VLCDR1，包含氨基酸序列GT的VLCDR2，和包含氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:66)的VLCDR3；
(iii)桥接部分，其将所述特异性结合RORl的多肽或两种或更多种多肽的复合物的N端与所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物的C端连接，其中所述桥接部分包含：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:86的多肽臂，和(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:87的第二多肽臂；和
(iv)连接至所述桥接部分N端的特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物，其包含：包含氨基酸序列GFTFTSYA(SEQ ID NO:8)的VHCDR1，包含氨基酸序列ISGSGGGT(SEQ ID NO:9)的VHCDR2，包含氨基酸序列AQGSSIFDY(SEQ ID NO:10)的VHCDR3，包含氨基酸序列QSVSSY(SEQ ID NO:11)的VLCDR1，包含氨基酸序列DAS的VLCDR2和包含氨基酸序列QQRSNWPPST(SEQ ID NO:15)的VLCDR3。
87.如权利要求75-80中任一项所述的蛋白质，其包含：
(i)特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含：包含氨基酸序列GFTFTSYA(SEQ ID NO:8)的VHCDR1，包含氨基酸序列ISGSGGGT(SEQ ID NO:9)的VHCDR2，包含氨基酸序列AQGSSIFDY(SEQ ID NO:10)的VHCDR3，包含氨基酸序列QSVSSY(SEQ ID NO:11)的VLCDR1，包含氨基酸序列DAS的VLCDR2和包含氨基酸序列QQRSNWPPST(SEQ ID NO:15)的VLCDR3；
(ii)特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含：包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:61)的VHCDR1，包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:62)的VHCDR2，包含氨基酸序列VRHGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:63)的VHCDR3，包含氨基酸序列TGAVTTSN(SEQ ID NO:64)的VLCDR1，包含氨基酸序列GT的VLCDR2，和包含氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:66)的VLCDR3；
(iii)桥接部分，其将所述特异性结合RORl的多肽或两种或更多种多肽的复合物的N端与所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物的C端连接，其中所述桥接部分包含：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:86的多肽臂，和(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:87的第二多肽臂；和
(iv)连接至所述桥接部分N端的特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物，其包含：包含氨基酸序列GFTFTSYA(SEQ ID NO:8)的VHCDR1，包含氨基酸序列ISGSGGGT(SEQ ID NO:9)的VHCDR2，包含氨基酸序列AQGSSIFDY(SEQ ID NO:10)的VHCDR3，包含氨基酸序列QSVSSY(SEQ ID NO:11)的VLCDR1，包含氨基酸序列DAS的VLCDR2和包含氨基酸序列QQRSNWPPST(SEQ ID NO:15)的VLCDR3。
88.如权利要求75-80中任一项所述的蛋白质，其包含：
(i)特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含：包含氨基酸序列GFTFTSYA(SEQ ID NO:8)的VHCDR1，包含氨基酸序列ISGSGGGT(SEQ ID NO:9)的VHCDR2，包含氨基酸序列AQGSSIFDY(SEQ ID NO:10)的VHCDR3，包含氨基酸序列QSVSSY(SEQ ID NO:11)的VLCDR1，包含氨基酸序列DAS的VLCDR2和包含氨基酸序列QQRSNWPPFT(SEQ ID NO:14)的VLCDR3；
(ii)特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含：包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:61)的VHCDR1，包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:62)的VHCDR2，包含氨基酸序列VRHGNFGASYVSWFAY(SEQ ID NO:68)的VHCDR3，包含氨基酸序列TGAVTTSN(SEQ ID NO:64)的VLCDR1，包含氨基酸序列GT的VLCDR2，和包含氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:66)的VLCDR3；
(iii)桥接部分，其将所述特异性结合RORl的多肽或两种或更多种多肽的复合物的N端与所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物的C端连接，其中所述桥接部分包含：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:86的多肽臂，和(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:87的第二多肽臂；和
(iv)连接至所述桥接部分N端的特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物，其包含：包含氨基酸序列GFTFTSYA(SEQ ID NO:8)的VHCDR1，包含氨基酸序列ISGSGGGT(SEQ ID NO:9)的VHCDR2，包含氨基酸序列AQGSSIFDY(SEQ ID NO:10)的VHCDR3，包含氨基酸序列QSVSSY(SEQ ID NO:11)的VLCDR1，包含氨基酸序列DAS的VLCDR2和包含氨基酸序列QQRSNWPPFT(SEQ ID NO:14)的VLCDR3。
89.如权利要求75-80中任一项所述的蛋白质，其包含：
(i)特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含：包含氨基酸序列GFTFTSYA(SEQ ID NO:8)的VHCDR1，包含氨基酸序列ISGSGGGT(SEQ ID NO:9)的VHCDR2，包含氨基酸序列AQGSSIFDY(SEQ ID NO:10)的VHCDR3，包含氨基酸序列QSVSSY(SEQ ID NO:11)的VLCDR1，包含氨基酸序列DAS的VLCDR2和包含氨基酸序列QQRSNWPPFT(SEQ ID NO:14)的VLCDR3；
(ii)特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含：包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:61)的VHCDR1，包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:62)的VHCDR2，包含氨基酸序列VRHGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:63)的VHCDR3，包含氨基酸序列TGAVTTSN(SEQ ID NO:64)的VLCDR1，包含氨基酸序列GT的VLCDR2，和包含氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:66)的VLCDR3；
(iii)桥接部分，其将所述特异性结合RORl的多肽或两种或更多种多肽的复合物的N端与所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物的C端连接，其中所述桥接部分包含：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:86的多肽臂，和(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:87的第二多肽臂；和
(iv)连接至所述桥接部分N端的特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物，其包含：包含氨基酸序列GFTFTSYA(SEQ ID NO:8)的VHCDR1，包含氨基酸序列ISGSGGGT(SEQ ID NO:9)的VHCDR2，包含氨基酸序列AQGSSIFDY(SEQ ID NO:10)的VHCDR3，包含氨基酸序列QSVSSY(SEQ ID NO:11)的VLCDR1，包含氨基酸序列DAS的VLCDR2和包含氨基酸序列QQRSNWPPFT(SEQ ID NO:14)的VLCDR3。
90.如权利要求75-80中任一项所述的蛋白质，其包含：
(i)特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含：包含氨基酸序列GFSITTSGVS(SEQ ID NO:23)的VHCDR1，包含氨基酸序列IYWDDDK(SEQ ID NO:24)的VHCDR2，包含氨基酸序列AHAPRYTPGGYFDY(SEQ ID NO:25)的VHCDR3，包含氨基酸序列QSVSSN(SEQID NO:26)的VLCDR1，包含氨基酸序列GAS的VLCDR2和包含氨基酸序列QQYKNWPPA(SEQ IDNO:28)的VLCDR3；
(ii)特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含：包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:61)的VHCDR1，包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:62)的VHCDR2，包含氨基酸序列VRHGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:63)的VHCDR3，包含氨基酸序列TGAVTTSN(SEQ ID NO:64)的VLCDR1，包含氨基酸序列GT的VLCDR2，和包含氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:66)的VLCDR3；
(iii)桥接部分，其将所述特异性结合RORl的多肽或两种或更多种多肽的复合物的C端与所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物的N端连接，其中所述桥接部分包含：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:86的多肽臂，和(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:87的第二多肽臂；和
(iv)特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物，其包含：包含氨基酸序列GFSITTSGVS(SEQ ID NO:23)的VHCDR1，包含氨基酸序列IYWDDDK(SEQ ID NO:24)的VHCDR2，包含氨基酸序列AHAPRYTPGGYFDY(SEQ ID NO:25)的VHCDR3，包含氨基酸序列QSVSSN(SEQ ID NO:26)的VLCDR1，包含氨基酸序列GAS的VLCDR2和包含氨基酸序列QQYKNWPPA(SEQ ID NO:28)的VLCDR3。
91.如权利要求81-85中任一项所述的蛋白质，其包含：
(i)特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含：包含氨基酸序列GFTFTSYA(SEQ ID NO:8)的VHCDR1，包含氨基酸序列ISGSGGGT(SEQ ID NO:9)的VHCDR2，包含氨基酸序列AQGSSIFDY(SEQ ID NO:10)的VHCDR3，包含氨基酸序列QSVSSY(SEQ ID NO:11)的VLCDR1，包含氨基酸序列DAS的VLCDR2和包含氨基酸序列QQRSNWPPST(SEQ ID NO:15)的VLCDR3；
(ii)特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含：包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:61)的VHCDR1，包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:62)的VHCDR2，包含氨基酸序列VRHGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:63)的VHCDR3，包含氨基酸序列TGAVTTSN(SEQ ID NO:64)的VLCDR1，包含氨基酸序列GT的VLCDR2，和包含氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:66)的VLCDR3；
(iii)桥接部分，其将所述特异性结合RORl的多肽或两种或更多种多肽的复合物的C端与所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物的N端连接，其中所述桥接部分包含：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:86的多肽臂，和(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:87的第二多肽臂；和
(iv)连接至所述桥接部分N端的特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物，其包含：包含氨基酸序列GFTFTSYA(SEQ ID NO:8)的VHCDR1，包含氨基酸序列ISGSGGGT(SEQ ID NO:9)的VHCDR2，包含氨基酸序列AQGSSIFDY(SEQ ID NO:10)的VHCDR3，包含氨基酸序列QSVSSY(SEQ ID NO:11)的VLCDR1，包含氨基酸序列DAS的VLCDR2和包含氨基酸序列QQRSNWPPST(SEQ ID NO:15)的VLCDR3。
92.如权利要求81-85中任一项所述的蛋白质，其包含：
(i)特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含：包含氨基酸序列GFSITTSGVS(SEQ ID NO:23)的VHCDR1，包含氨基酸序列IYWDDDK(SEQ ID NO:24)的VHCDR2，包含氨基酸序列AHAPRYTPGGYFDY(SEQ ID NO:25)的VHCDR3，包含氨基酸序列QSVSSN(SEQID NO:26)的VLCDR1，包含氨基酸序列GAS的VLCDR2和包含氨基酸序列QQYKNWPPA(SEQ IDNO:28)的VLCDR3；
(ii)特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含：包含氨基酸序列GFTFNTYA(SEQ ID NO:61)的VHCDR1，包含氨基酸序列IRSKYNNYAT(SEQ ID NO:62)的VHCDR2，包含氨基酸序列VRHGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:63)的VHCDR3，包含氨基酸序列TGAVTTSN(SEQ ID NO:64)的VLCDR1，包含氨基酸序列GT的VLCDR2，和包含氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:66)的VLCDR3；
(iii)桥接部分，其将所述特异性结合RORl的多肽或两种或更多种多肽的复合物的C端与所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物的N端连接，其中所述桥接部分包含：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:86的多肽臂，和(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:87的第二多肽臂；和
(iv)连接至所述桥接部分N端的特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物，其包含：包含氨基酸序列GFSITTSGVS(SEQ ID NO:23)的VHCDR1，包含氨基酸序列IYWDDDK(SEQ ID NO:24)的VHCDR2，包含氨基酸序列AHAPRYTPGGYFDY(SEQ ID NO:25)的VHCDR3，包含氨基酸序列QSVSSN(SEQ ID NO:26)的VLCDR1，包含氨基酸序列GAS的VLCDR2和包含氨基酸序列QQYKNWPPA(SEQ ID NO:28)的VLCDR3。
93.一种蛋白质，其包含：
(i)特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，所述重链可变结构域(VH)包含氨基酸序列SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:39，所述轻链可变结构域(VL)包含氨基酸序列SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:40；
(ii)特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含VH和VL，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:80，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQID NO:79或SEQ ID NO:81；和
(iii)桥接部分，其将所述特异性结合RORl的多肽或两种或更多种多肽的复合物与所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物连接，其中所述桥接部分包含：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:86，或SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:86的多肽臂，和(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:87，或SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:87的第二多肽臂。
94.如权利要求93所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物连接至所述桥接部分的C端，并且特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物连接至所述桥接部分的N端。
95.如权利要求94所述的蛋白质，其还包含连接至所述桥接部分的N端的特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物。
96.如权利要求95所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，所述重链可变结构域(VH)包含氨基酸序列SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:39，所述轻链可变结构域(VL)包含氨基酸序列SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:40。
97.如权利要求94-96中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物通过接头多肽连接至所述桥接部分的C端。
98.如权利要求97所述的蛋白质，其中所述接头多肽包含(GGGGS)n(SEQ ID NO:1)序列，其中n是1-12。
99.如权利要求93所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物连接至所述桥接部分的N端，并且特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物连接至所述桥接部分的C端。
100.如权利要求99所述的蛋白质，其还包含连接至所述桥接部分的N端的特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物。
101.如权利要求100所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，所述重链可变结构域(VH)包含氨基酸序列SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:39，所述轻链可变结构域(VL)包含氨基酸序列SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:34、SEQID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:40。
102.如权利要求99-101中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物通过接头多肽连接至所述桥接部分的C端。
103.如权利要求102所述的蛋白质，其中所述接头多肽包含(GGGGS)n(SEQ ID NO:1)序列，其中n是1-12。
104.如权利要求93-98中任一项所述的蛋白质，其包含：
(i)特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含含有氨基酸序列SEQID NO:29的VH和含有氨基酸序列SEQ ID NO:31的VL；
(ii)特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含含有氨基酸序列SEQID NO:72的VH和含有氨基酸序列SEQ ID NO:81的VL；
(iii)桥接部分，其将所述特异性结合RORl的多肽或两种或更多种多肽的复合物的N端与所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物的C端连接，其中所述桥接部分包含：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:86的多肽臂，和(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:87的第二多肽臂；和
(iv)连接至所述桥接部分N端的特异性结合RORl的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:29的VH和含有氨基酸序列SEQ ID NO:31的VL。
105.如权利要求93-98中任一项所述的蛋白质，其包含：
(i)特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含含有氨基酸序列SEQID NO:29的VH和含有氨基酸序列SEQ ID NO:31的VL；
(ii)特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含含有氨基酸序列SEQID NO:71的VH和含有氨基酸序列SEQ ID NO:76的VL；
(iii)桥接部分，其将所述特异性结合RORl的多肽或两种或更多种多肽的复合物的N端与所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物的C端连接，其中所述桥接部分包含：(a)在其N端包含氨基酸序列SEQ ID NO:92的两个多肽，和(b)包含氨基酸序列SEQ IDNO:86的多肽和包含氨基酸序列SEQ ID NO:87的多肽，其中所述桥接部分包含：(1)包含氨基酸序列SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:86的多肽臂，和(2)包含氨基酸序列SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:87的第二多肽臂；和
(iv)连接至所述桥接部分N端的特异性结合RORl的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:29的VH和含有氨基酸序列SEQ ID NO:31的VL。
106.如权利要求93-98中任一项所述的蛋白质，其包含：
(i)特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含含有氨基酸序列SEQID NO:29的VH和含有氨基酸序列SEQ ID NO:30的VL；
特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含含有氨基酸序列SEQ IDNO:72的VH和含有氨基酸序列SEQ ID NO:81的VL；
(ii)桥接部分，其将所述特异性结合RORl的多肽或两种或更多种多肽的复合物的N端与所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物的C端连接，其中所述桥接部分包含：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:86的多肽臂，和(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:87的第二多肽臂；和
(iii)连接至所述桥接部分N端的特异性结合RORl的第二多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:29的VH和含有氨基酸序列SEQ ID NO:30的VL。
107.如权利要求93-98中任一项所述的蛋白质，其包含：
(i)特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含含有氨基酸序列SEQID NO:29的VH和含有氨基酸序列SEQ ID NO:30的VL；
(ii)特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含含有氨基酸序列SEQID NO:71的VH和含有氨基酸序列SEQ ID NO:76的VL；
(iii)桥接部分，其将所述特异性结合RORl的多肽或两种或更多种多肽的复合物的N端与所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物的C端连接，其中所述桥接部分包含：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:86的多肽臂，和(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:87的第二多肽臂；和
(iv)连接至所述桥接部分N端的特异性结合RORl的第二多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:29的VH和含有氨基酸序列SEQ ID NO:30的VL。
108.如权利要求93-98中任一项所述的蛋白质，其包含：
(i)特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含含有氨基酸序列SEQID NO:39的VH和含有氨基酸序列SEQ ID NO:40的VL；
(ii)特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含含有氨基酸序列SEQID NO:80的VH和含有氨基酸序列SEQ ID NO:81的VL；
(iii)桥接部分，其将所述特异性结合RORl的多肽或两种或更多种多肽的复合物的C端与所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物的N端连接，其中所述桥接部分包含：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:86的多肽臂，和(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:87的第二多肽臂；和
(iv)连接至所述桥接部分N端的特异性结合RORl的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:39的VH和含有氨基酸序列SEQ ID NO:40的VL。
109.如权利要求99-103中任一项所述的蛋白质，其包含：
(i)特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含含有氨基酸序列SEQID NO:29的VH和含有氨基酸序列SEQ ID NO:31的VL；
(ii)特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含含有氨基酸序列SEQID NO:72的VH和含有氨基酸序列SEQ ID NO:81的VL；
(iii)桥接部分，其将所述特异性结合RORl的多肽或两种或更多种多肽的复合物的C端与所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物的N端连接，其中所述桥接部分包含：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:86的多肽臂，和(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:87的第二多肽臂；和
(iv)连接至所述桥接部分N端的特异性结合RORl的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:29的VH和含有氨基酸序列SEQ ID NO:31的VL。
110.如权利要求99-103中任一项所述的蛋白质，其包含：
(i)特异性结合ROR1的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含含有氨基酸序列SEQID NO:39的VH和含有氨基酸序列SEQ ID NO:40的VL；
(ii)特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物，其包含含有氨基酸序列SEQID NO:72的VH和含有氨基酸序列SEQ ID NO:81的VL；
(iii)桥接部分，其将所述特异性结合RORl的多肽或两种或更多种多肽的复合物的C端与所述特异性结合CD3的多肽或两种或更多种多肽的复合物的N端连接，其中所述桥接部分包含：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:86的多肽臂，和(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:87的第二多肽臂；和
(iv)连接至所述桥接部分N端的特异性结合RORl的第二多肽或两种或更多种多肽的第二复合物，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:39的VH和含有氨基酸序列SEQ ID NO:40的VL。
111.一种蛋白质，其包含：
(i)特异性结合ROR1的单链可变片段(scFv)，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59或SEQID NO:60；
(ii)特异性结合CD3的Fab，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:83的重链，和含有氨基酸序列SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:85的轻链；和
(iii)桥接部分，其将所述特异性结合RORl的scFv与所述特异性结合CD3的Fab连接，其中所述桥接部分包含：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:86，或SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:86的多肽臂，和(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:87，或SEQ IDNO:92和SEQ ID NO:87的第二多肽臂。
112.如权利要求111所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的scFv被连接至所述桥接部分的C端，并且特异性结合CD3的Fab连接至所述桥接部分的N端。
113.如权利要求112所述的蛋白质，其还包含连接至所述桥接部分的N端的特异性结合ROR1的第二scFv。
114.如权利要求113所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的第二scFv包含氨基酸序列SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ IDNO:58、SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:60。
115.如权利要求112-114中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的scFv通过接头多肽连接至所述桥接部分的C端。
116.如权利要求115所述的蛋白质，其中所述接头多肽包含(GGGGS)n(SEQ ID NO:1)序列，其中n是1-12。
117.如权利要求111所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的scFv被连接至所述桥接部分的N端，并且特异性结合CD3的Fab连接至所述桥接部分的C端。
118.如权利要求117所述的蛋白质，其还包含连接至所述桥接部分的N端的特异性结合ROR1的第二scFv。
119.如权利要求118所述的蛋白质，其中所述特异性结合ROR1的第二scFv包含氨基酸序列SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ IDNO:58、SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:60。
120.如权利要求117-119中任一项所述的蛋白质，其中所述特异性结合CD3的Fab通过接头多肽连接至所述桥接部分的C端。
121.如权利要求120所述的蛋白质，其中所述接头多肽包含(GGGGS)n(SEQ ID NO:1)序列，其中n是1-12。
122.如权利要求112-116中任一项所述的蛋白质，其包含：
(i)特异性结合ROR1的scFv，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:42；
(ii)特异性结合CD3的Fab，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:82的重链，和含有氨基酸序列SEQ ID NO:84的轻链；
(iii)桥接部分，其将所述特异性结合RORl的scFv的N端与所述特异性结合CD3的Fab的C端连接，其中所述桥接部分包含：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:86的多肽臂，和(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:87的第二多肽臂；和
(iv)连接至所述桥接部分N端的特异性结合ROR1的第二scFv，其包含氨基酸序列SEQID NO:42。
123.如权利要求112-116中任一项所述的蛋白质，其包含：
(i)特异性结合ROR1的scFv，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:42；
(ii)特异性结合CD3的Fab，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:83的重链，和含有氨基酸序列SEQ ID NO:85的轻链；
(iii)桥接部分，其将所述特异性结合RORl的scFv的N端与所述特异性结合CD3的Fab的C端连接，其中所述桥接部分包含：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:86的多肽臂，和(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:87的第二多肽臂；和
连接至所述桥接部分N端的特异性结合ROR1的第二scFv，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:42。
124.如权利要求112-116中任一项所述的蛋白质，其包含：
(i)特异性结合ROR1的scFv，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:41；
(ii)特异性结合CD3的Fab，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:82的重链，和含有氨基酸序列SEQ ID NO:84的轻链；
(iii)桥接部分，其将所述特异性结合RORl的scFv的N端与所述特异性结合CD3的Fab的C端连接，其中所述桥接部分包含：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:86的多肽臂，和(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:87的第二多肽臂；和
(iv)连接至所述桥接部分N端的特异性结合ROR1的第二scFv，其包含氨基酸序列SEQID NO:41。
125.如权利要求112-116中任一项所述的蛋白质，其包含：
(i)特异性结合ROR1的scFv，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:41；
(ii)特异性结合CD3的Fab，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:83的重链，和含有氨基酸序列SEQ ID NO:85的轻链；
(iii)桥接部分，其将所述特异性结合RORl的scFv的N端与所述特异性结合CD3的Fab的C端连接，其中所述桥接部分包含：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:86的多肽臂，和(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:87的第二多肽臂；和
(iv)连接至所述桥接部分N端的特异性结合ROR1的第二scFv，其包含氨基酸序列SEQID NO:41。
126.如权利要求112-116中任一项所述的蛋白质，其包含：
(i)特异性结合ROR1的scFv，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:59；
(ii)特异性结合CD3的Fab，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:93的重链，和含有氨基酸序列SEQ ID NO:84的轻链；
(iii)桥接部分，其将所述特异性结合RORl的scFv的C端与所述特异性结合CD3的Fab的N端连接，其中所述桥接部分包含：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:86的多肽臂，和(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:87的第二多肽臂；和
(iv)连接至所述桥接部分N端的特异性结合ROR1的第二scFv，其包含氨基酸序列SEQID NO:59。
127.如权利要求117-121中任一项所述的蛋白质，其包含：
(i)特异性结合ROR1的scFv，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:42；
(ii)特异性结合CD3的Fab，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:93的重链，和含有氨基酸序列SEQ ID NO:84的轻链；
(iii)桥接部分，其将所述特异性结合RORl的scFv的C端与所述特异性结合CD3的Fab的N端连接，其中所述桥接部分包含：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:86的多肽臂，和(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:87的第二多肽臂；和
(iv)连接至所述桥接部分N端的特异性结合ROR1的第二scFv，其包含氨基酸序列SEQID NO:42。
128.如权利要求117-121中任一项所述的蛋白质，其包含：
(i)特异性结合ROR1的scFv，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:59；
(ii)特异性结合CD3的Fab，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:93的重链，和含有氨基酸序列SEQ ID NO:84的轻链；
(iii)桥接部分，其将所述特异性结合RORl的scFv的C端与所述特异性结合CD3的Fab的N端连接，其中所述桥接部分包含：(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:86的多肽臂，和(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:87的第二多肽臂；和
(iv)连接至所述桥接部分N端的特异性结合ROR1的第二scFv，其包含氨基酸序列SEQID NO:59。
129.一种蛋白质，其包含与选自下组的氨基酸序列具有至少90％序列相同性的多肽：SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:219、SEQ IDNO:109和SEQ ID NO:220。
130.一种蛋白质，其包含与选自下组的氨基酸序列具有至少90％序列相同性的多肽：
(a)SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:84；
(b)SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:85；
(c)SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:84；
(d)SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:85；
(e)SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:219和SEQ ID NO:85；
(f)SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:84；和
(g)SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:221和SEQ ID NO:84。
131.一种蛋白质，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:94的多肽、含有氨基酸序列SEQID NO:95的多肽和含有氨基酸序列SEQ ID NO:84的多肽。
132.一种蛋白质，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:97的多肽、含有氨基酸序列SEQID NO:98的多肽和含有氨基酸序列SEQ ID NO:85的多肽。
133.一种蛋白质，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:100的多肽、含有氨基酸序列SEQID NO:101的多肽和含有氨基酸序列SEQ ID NO:84的多肽。
134.一种蛋白质，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:103的多肽、含有氨基酸序列SEQID NO:104的多肽和含有氨基酸序列SEQ ID NO:85的多肽。
135.一种蛋白质，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:218的多肽、含有氨基酸序列SEQID NO:219的多肽和含有氨基酸序列SEQ ID NO:85的多肽。
136.一种蛋白质，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:109的多肽、含有氨基酸序列SEQID NO:110的多肽和含有氨基酸序列SEQ ID NO:84的多肽。
137.一种蛋白质，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:220的多肽、含有氨基酸序列SEQID NO:221的多肽和含有氨基酸序列SEQ ID NO:84的多肽。
138.一种蛋白质，其包含第一重链、第二重链和轻链，其各自包含分别对应于表11列出的第一重链的序列、第二重链的序列和轻链的序列的氨基酸序列。
139.如权利要求1-138中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质结合CD3的KD为10nM至50nM，如在生物层干涉试验中测得的。
140.如权利要求1-139中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质结合CD3的KD为15nM至20nM，如在生物层干涉试验中测得的。
141.如权利要求1-140中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质在使用活化的T细胞的CD3结合试验中具有20nM至50nM的EC50。
142.如权利要求1-141中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质在使用活化的T细胞的CD3结合试验中具有25nM至35nM的EC50。
143.如权利要求1-142中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质结合ROR1的Ig样结构域。
144.如权利要求1-143中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质不结合ROR1的卷曲和/或Kringle结构域。
145.如权利要求1-144中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质结合ROR1的KD为80nM至120nM，如在生物层干涉试验中测得的。
146.如权利要求1-145中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质结合ROR1的KD为95nM至105nM，如在生物层干涉试验中测得的。
147.如权利要求1-144中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质结合ROR1的KD为1nM至10nM，如在生物层干涉试验中测得的。
148.如权利要求1-144中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质结合ROR1的KD为3nM至5nM，如在生物层干涉试验中测得的。
149.如权利要求1-148中任一项所述的蛋白质，其中在使用表达约3.5X104ROR1分子/细胞的细胞的ROR1结合试验中，所述蛋白质具有80nM至120nM的EC50。
150.如权利要求149所述的蛋白质，其中在使用表达约3.5X104ROR1分子/细胞的细胞的ROR1结合试验中，所述蛋白质具有90nM至110nM的EC50。
151.如权利要求1-148中任一项所述的蛋白质，其中在使用表达约3.5X104ROR1分子/细胞的细胞的ROR1结合试验中，所述蛋白质具有1nM至10nM的EC50。
152.如权利要求1-148中任一项所述的蛋白质，其中在使用表达约3.5X104ROR1分子/细胞的细胞的ROR1结合试验中，所述蛋白质具有2nM至5nM的EC50。
153.如权利要求145、146、149或150中任一项所述的蛋白质用于治疗实体瘤的用途。
154.如权利要求147、148、151或152中任一项所述的蛋白质用于治疗血液肿瘤的用途。
155.如权利要求1-154中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质诱导T细胞裂解性颗粒脱颗粒。
156.如权利要求1-155中任一项所述的蛋白质，其中在T细胞/肿瘤细胞共培养杀伤试验中所测量的T细胞介导的对表达ROR1的肿瘤细胞的细胞毒性，所述蛋白质具有160pM至200pM的EC50。
157.如权利要求156所述的蛋白质，其中在T细胞/肿瘤细胞共培养杀伤试验中所测量的T细胞介导的对表达ROR1的肿瘤细胞的细胞毒性，所述蛋白质具有165pM至190pM的EC50。
158.如权利要求1-155中任一项所述的蛋白质，其中在T细胞/肿瘤细胞共培养杀伤试验中所测量的T细胞介导的对表达ROR1的肿瘤细胞的细胞毒性，所述蛋白质具有25pM至50pM的EC50。
159.如权利要求158所述的蛋白质，其中在T细胞/肿瘤细胞共培养杀伤试验中所测量的T细胞介导的对表达ROR1的肿瘤细胞的细胞毒性，所述蛋白质具有30pM至40pM的EC50。
160.如权利要求1-159中任一项所述的蛋白质，其中当以足以诱导T细胞介导的细胞毒性的浓度给予培养物时，所述蛋白质不诱导T细胞促炎细胞因子的产生和/或释放的显著增加。
161.如权利要求1-159中任一项所述的蛋白质，其中在T细胞/肿瘤细胞共培养IFNγ产生试验中所测量的所述蛋白质具有1000pM至2000pM的EC50。
162.如权利要求161中任一项所述的蛋白质，其中在T细胞/肿瘤细胞共培养IFNγ产生试验中所测量的所述蛋白质具有1400pM至1800pM的EC50。
163.如权利要求1-159中任一项所述的蛋白质，其中在T细胞/肿瘤细胞共培养IFNγ产生试验中所测量的所述蛋白质具有200pM至600pM的EC50。
164.如权利要求163中任一项所述的蛋白质，其中在T细胞/肿瘤细胞共培养IFNγ产生试验中所测量的所述蛋白质具有300pM至500pM的EC50。
165.如权利要求1-159中任一项所述的蛋白质，其中在T细胞/肿瘤细胞共培养IFNγ产生试验中所测量的所述蛋白质相较于参考T细胞结合物具有20％至60％的C最大。
166.如权利要求165所述的蛋白质，其中在T细胞/肿瘤细胞共培养IFNγ产生试验中所测量的所述蛋白质相较于参考T细胞结合物具有35％至45％的C最大。
167.如权利要求165所述的蛋白质，其中在T细胞/肿瘤细胞共培养IFNγ产生试验中所测量的所述蛋白质相较于参考T细胞结合物具有45％至55％的C最大。
168.如权利要求1-167中任一项所述的蛋白质，其中当给予新鲜分离的外周单核细胞(PBMC)培养物时，所述蛋白质不诱导显著水平的TNFα释放。
169.如权利要求1-168中任一项所述的蛋白质，其中当给予以高密度预培养48小时的PBMC时，所述蛋白质不诱导显著水平的TNFα释放。
170.如利要求1-169中任一项所述的蛋白质，其中当给予新鲜分离的PBMC培养物时，所述蛋白质不诱导显著水平的IL2释放。
171.如权利要求1-169中任一项所述的蛋白质，其中当给予以高密度预培养48小时的PBMC时，所述蛋白质不诱导显著水平的IL2释放。
172.如权利要求1-171中任一项所述的蛋白质，其中在T细胞/肿瘤细胞共培养杀伤试验中所测量的，用参考T细胞结合物标准化，所述蛋白质具有1:2至1:4的细胞因子释放与杀伤解偶联比率。
173.如权利要求1-172中任一项所述的蛋白质，其中在T细胞/肿瘤细胞共培养杀伤试验中所测量的，用参考T细胞结合物标准化，所述蛋白质具有1:2.2的细胞因子释放与杀伤解偶联比率。
174.如权利要求1-172中任一项所述的蛋白质，其中在T细胞/肿瘤细胞共培养杀伤试验中所测量的，用参考T细胞结合物标准化，所述蛋白质具有1:2.9的细胞因子释放与杀伤解偶联比率。
175.如权利要求1-174中任一项所述的蛋白质，其中在T细胞/肿瘤细胞共培养杀伤试验中所测量的，所述蛋白质诱导3至5的肿瘤连续杀伤指数。
176.如权利要求175所述的蛋白质，其中在T细胞/肿瘤细胞共培养杀伤试验中所测量的，所述蛋白质诱导3.4至3.6的肿瘤连续杀伤指数。
177.如权利要求175所述的蛋白质，其中在T细胞/肿瘤细胞共培养杀伤试验中所测量的，所述蛋白质诱导3.8至4.2的肿瘤连续杀伤指数。
178.如权利要求1-177中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质与食蟹猴CD3交叉反应而不与小鼠CD3交叉反应。
179.如权利要求1-178中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质与食蟹猴ROR1和小鼠ROR1交叉反应。
180.一种制剂，其包含权利要求1-179中任一项所述的蛋白质和药学上可接受的运载体。
181.一种编码权利要求1至179中任一项所述蛋白质的核酸。
182.一种细胞，其包含一种或多种编码权利要求1-179中任一项所述蛋白质的核酸。
183.一种治疗患者的癌症的方法，所述方法包括给予所述患者如权利要求1-179中任一项所述的蛋白质或如权利要求180所述制剂。
184.如权利要求183所述的方法，其中所述癌症是血液癌症或实体瘤癌症。
185.如权利要求184所述的方法，其中所述癌症选自下组：慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、肺癌、支气管癌、结肠癌、直肠癌、黑素瘤、肾癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、乳腺癌、口腔癌、咽癌、毛细胞白血病、肝癌、肝内胆管癌和甲状腺癌。
186.如权利要求129所述蛋白质或其功能性片段在制备权利要求130所述的蛋白质中的用途。
187.编码权利要求129所述蛋白质或其功能性片段的核酸在制备权利要求130所述蛋白质中的用途。
188.一种抗体或其功能性片段，按照IMGT独特编号方案，其包含：重链可变互补决定区1(VHCDR1)，其包含氨基酸序列GFTFTSYA(SEQ ID NO:8)，重链可变互补决定区2(VHCDR2)，其包含氨基酸序列ISGSGGGT(SEQ ID NO:9)，重链可变互补决定区3(VHCDR3)，其包含氨基酸序列AQGSSIFDY(SEQ ID NO:10)，轻链可变互补决定区1(VLCDR1)，其包含氨基酸序列QSVSSY(SEQ ID NO:11)，轻链可变互补决定区2(VLCDR2)，其包含氨基酸序列DAS，以及轻链可变互补决定区3(VLCDR3)，其包含氨基酸序列QQRSNWPPFT(SEQ ID NO:14)。
189.如权利要求188所述的抗体，其中所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO:29至少90％相同的氨基酸序列，和所述轻链包含与SEQ ID NO:30至少90％相同的氨基酸序列。
190.一种抗体或其功能性片段，按照IMGT独特编号方案，其包含：重链可变互补决定区1(VHCDR1)，其包含氨基酸序列GFTFTSYA(SEQ ID NO:8)，重链可变互补决定区2(VHCDR2)，其包含氨基酸序列ISGSGGGT(SEQ ID NO:9)，重链可变互补决定区3(VHCDR3)，其包含氨基酸序列AQGSSIFDY(SEQ ID NO:10)，轻链可变互补决定区1(VLCDR1)，其包含氨基酸序列QSVSSY(SEQ ID NO:11)，轻链可变互补决定区2(VLCDR2)，其包含氨基酸序列DAS，以及轻链可变互补决定区3(VLCDR3)，其包含氨基酸序列QQRSNWPPST(SEQ ID NO:15)。
191.如权利要求190所述的抗体，其中所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO:29至少90％相同的氨基酸序列，和所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:31至少90％相同的氨基酸序列。
192.一种抗体或其功能性片段，按照IMGT独特编号方案，其包含：重链可变互补决定区1(VHCDR1)，其包含氨基酸序列GFSITTSGVS(SEQ ID NO:23)，重链可变互补决定区2(VHCDR2)，其包含氨基酸序列IYWDDDK(SEQ ID NO:24)，重链可变互补决定区3(VHCDR3)，其包含氨基酸序列AHAPRYTPGGYFDY(SEQ ID NO:25)，轻链可变互补决定区1(VLCDR1)，其包含氨基酸序列QSVSSN(SEQ ID NO:26)，轻链可变互补决定区2(VLCDR2)，其包含氨基酸序列GAS，以及轻链可变互补决定区3(VLCDR3)，其包含氨基酸序列QQYKNWPPA(SEQ ID NO:28)。
193.如权利要求192所述的抗体，其中所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO:39至少90％相同的氨基酸序列，和所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:40至少90％相同的氨基酸序列。
194.如权利要求188至193中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体是人IgG1抗体。
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