CN118086550A - 检测痰液中真菌的荧光探针组合、检测试剂盒和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及检测痰液中真菌的荧光探针组合、检测试剂盒和应用，所述真菌为白色念珠菌、热带念珠菌和光滑念珠菌；所述白色念珠菌的引物探针序列包括SEQ ID NO 1‑7；所述热带念珠菌的引物探针序列包括SEQ ID NO 8‑14；所述光滑念珠菌的引物探针序列包括SEQ ID NO 15‑21；所述荧光探针组合还包括人内参基因，引物探针序列包括SEQ ID NO 22‑30。

Description

检测痰液中真菌的荧光探针组合、检测试剂盒和应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及检测痰液中真菌的荧光探针组合、检测试剂盒和应用。

背景技术

侵袭性真菌病(invasive fungal disease,IFD)是指真菌侵犯人体皮下黏膜组织、血液和内脏器官等所引起的真菌感染性疾病。近年来，侵袭性真菌病已逐步成为严重的感染性疾病，是威胁人类健康与生命的顽凶之一。

随着侵入性检查、广谱抗生素、免疫抑制剂、糖皮质激素和肿瘤化疗药物的广泛应用，真菌感染的风险也不断增加，因此及早发现和鉴定病原体类型对于临床诊断和治疗尤为重要。此外，近年来主要致病真菌的病原谱也在不断发生变化，除已被人类认知多年的常见真菌感染之外，许多以往不致病的环境真菌发生进化、突变，逐渐成为致病菌，甚至成为多重耐药的强致病菌(例如，近年来发现的耳念珠菌被认为超级真菌)。由于侵袭性真菌病临床表现及症状不典型，且常被基础疾病掩盖，其早期诊断主要依赖于直接镜检法、培养法和影像学等传统诊断手段。

组织病理学检查为侵袭性真菌感染诊断的金标准，通过组织病理学检查可确定真菌的种、属，如隐球菌、念珠菌、曲霉、着色真菌等。真菌检验基本上可分为培养技术和非培养技术两大类。非培养技术又分为显微镜检查技术、生化免疫检查技术和分子生物学技术。前者是直接观察真菌形态；后者是检测真菌的抗原、抗体和核酸。这些技术的综合使用可大大地提高侵袭性真菌感染诊断的准确性。

其中，将标本直接涂片染色镜检和接种在培养基上进行分离培养是对真菌感染性疾病进行病原微生物诊断的常用方法。但其具有以下缺点：

1)培养时间较长，延误诊断导致死亡率上升。例如，念珠菌可在48小时培养鉴定，而隐球菌培养时间最长可达2-4周。侵袭性念珠菌延迟4天治疗，死亡率由15.4％上升到41.4％；

2)难以区分定植与感染。由于常见真菌念珠菌、曲霉都是条件致病菌在正常人体呼吸道、泌尿道等均有定植，因此如果标本取材来自非无菌部位，则培养和镜检无法区分定植和感染；

3)由于检查有创性造成患者依从性差。如果进行侵入性检查从无菌部位获取待测样本，尤其对有肺曲霉病等基础疾病的患者难以实施；

4)根据形态难以鉴定菌种。缺乏灵敏性和精确性，比如同一菌种的菌丝，在镜下会表现出不同的形态。

传统的病原微生物诊断方法操作繁琐，检测周期长，结果特异性低，对操作人员技术水平要求比较高，限制了传统病原微生物诊断方法在侵袭性真菌病诊断中的临床应用。

近年来，血清学诊断方法已被逐步应用于侵袭性真菌病的早期诊断，成为传统诊断方法的重要补充与提升。侵袭性真菌病血清学诊断技术可大致分为抗原检测和抗体检测两类。抗原检测主要包括G试验、GM试验、GXM试验和Mn试验等，抗体检测主要指各菌属特异性IgM、IgG抗体的检测。对于免疫功能正常的患者，抗体检测结果则更能反映整体的病程发展阶段，更具检测价值。血清学诊断便于开展、易于操作，各实验室间结果有较强可比性，较好地弥补了传统诊断技术的缺陷。

随着分子生物学技术的不断进步，分子诊断给临床真菌病诊断带来了新的契机。与传统方法、血清学检测法相比，以PCR、恒温扩增为代表的分子诊断方法因其高灵敏度、高敏感性、特异性和不容易受限等特点被广泛推广应用。

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)核酸检测技术无需培养，且已被证明有助于扩大可检测病原体的范围和提高检出率，适用于检测临床标本中低丰度的真菌DNA，对曲霉、肺孢子菌和念珠菌检测有良好应用前景。目前以实时荧光定量PCR及相关技术为代表的分子诊断，已逐步成为感染性疾病诊断的重要方法，不仅对提早开始抗真菌治疗、改善患者预后及降低病死率具有重要意义，还对辅助诊断侵袭性真菌病具有很高的潜力。

痰液是呼吸系统疾病最常见、无创、容易重复收集并可用于检测肺部真菌感染的样本来源。有相关报道痰液中分离出的曲霉和肺泡灌洗液中分离出的曲霉是同源的，即提示了从痰液和肺泡灌洗液中获取的微生物学证据对肺曲霉病的诊断能力相近。尽管痰液的批次易受患者自身因素导致差异变化，例如是否每次采样都能够按照标准流程进行，且其本身属于复杂样本，各类杂质都可对检测结果产生影响，但因痰液样本的获取容易无创，如检测技术足够灵敏、稳定和可靠，痰液样本可作为用于分子生物学方法检测真菌感染并辅助临床诊断的样本来源。

发明内容

本发明针对痰液样本中的白色念珠菌、热带念珠菌和光滑念珠菌设计引物探针序列，进行荧光定量PCR检测。

本发明的第一个方面提供了一种检测痰液中真菌的荧光探针组合，所述真菌为白色念珠菌(Candida albicans)、热带念珠菌(Candida tropicalis)和光滑念珠菌(Candidaglabrata)；

所述白色念珠菌的引物探针序列包括SEQ ID NO 1-7；

所述热带念珠菌的引物探针序列包括SEQ ID NO 8-14；

所述光滑念珠菌的引物探针序列包括SEQ ID NO 15-21；

所述荧光探针组合还包括人内参基因GAPDH、ACTB和RPP30，引物探针序列包括SEQID NO 22-30。

具体见下表。

在一些实施方式中，所述荧光探针组合的检测靶标为临床样本中的真菌游离DNA片段。

在一些实施方式中，所述荧光探针的序列可以包含如下化学修饰：5'端：采用FAM、HEX、VIC、JOE、TAMRA、Cy3、NED、ROX、TEXAS-Red、Cy5荧光染料基团中任意三种染料的组合的化学修饰；和，3'端：采用BHQ1或BHQ2或3IABkFQ或3IAbRQSp淬灭基团的化学修饰。

在一些实施方式中，所述白色念珠菌的引物探针序列为F2R2P2组合，所述热带念珠菌的引物探针序列为F1-2R1P1组合，所述光滑念珠菌的引物探针序列为F2R2P2组合，所述人内参基因的引物探针序列为RnaseP组合。

在一些实施方式中，所述白色念珠菌的引物探针序列为F2R2P2组合，F2、R2、P2的体积比为1：1：1；所述热带念珠菌的引物探针序列为F1-2R1P1组合，F1-2、R1、P1的体积比为1：1：1；所述光滑念珠菌的引物探针序列为F2R2P2组合，F2、R2、P2的体积比为1：1：1；所述人内参基因的引物探针序列为RnaseP组合。

本发明的第二个方面提供了一种用于检测痰液中真菌感染的试剂盒，所述试剂盒包括荧光探针组合、Buffer、核酸、水、酶、dNTP。

在一些实施方式中，所述酶包括诺唯赞QN211、诺唯赞P132-d1、诺唯赞QN114、takara、启衡星FS-Q3001-S、天根ET108-1、环球酶中的至少一种。

在一些实施方式中，所述试剂盒包括荧光探针组合2μL、Buffer4μL、核酸2μL、水10μL、酶1μL、dNTP1μL。

在一些实施方式中，所述酶为环球酶。

本发明的第三个方面提供了一种上述试剂盒在对痰液中侵袭性真菌进行区分和鉴定中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明的试剂盒相对于现有技术，能够一次性检测白色念珠菌、光滑念珠菌和热带念珠菌三种真菌，并将其更好地区分开来，检测准确度高。

2.本发明的试剂盒能解决培养过程中时间长，容易漏检的缺点，具有很高的灵敏度和时效性。

3.本发明特异性强，只针对真菌基因组特异性DNA进行PCR扩增，对无真菌DNA无法进行扩增。

附图说明

图1-4为实施例1的实验结果，其中图1为热带念珠菌引物探针筛选，图2为白色念珠菌引物探针筛选，图3为光滑念珠菌引物探针筛选，图4为人内参引物探针筛选。

图5-6为实施例2的实验结果，其中图5为白色念珠菌引物探针不同比例的筛选，图6为光滑念珠菌和热带念珠菌引物探针不同比例的筛选。

图7-9为实施例3的实验结果，其中图7为启衡星FS-Q3001-S酶筛选三种真菌的结果，图8为天根ET108-1酶筛选三种真菌的结果，图9为环球酶筛选三种真菌的结果，蓝色为白色念珠菌，红色为光滑念珠菌，橙色为热带念珠菌。

图10-36为实施例4的实验结果，其中图10为环球酶加入量0.5μL，图11为环球酶加入量1μL，图12为环球酶加入量1.5μL，图13为环球酶加入量0.5μL，1μL，1.5μL时的阴性对照。图14为dNTP加入量0.5μL，图15为dNTP加入量1μL，图16为dNTP加入量1.5μL，图17为dNTP加入量0.5μL，1μL，1.5μL时的阴性对照。图18为白色念珠菌核酸加入量2μL，图19为白色念珠菌核酸加入量5μL，图20为白色念珠菌核酸加入量8μL，图21为白色念珠菌核酸加入量2μL、5μL、8μL的阴性对照。图22为热带念珠菌核酸加入量2μL，图23为热带念珠菌核酸加入量5μL，图24为热带念珠菌核酸加入量8μL，图25为热带念珠菌核酸加入量2μL、5μL、8μL的阴性对照。图26为光滑念珠菌核酸加入量2μL，图27为光滑念珠菌核酸加入量5μL，图28为光滑念珠菌核酸加入量8μL，图29为光滑念珠菌核酸加入量2μL、5μL、8μL的阴性对照。图30为人内参核酸加入量2μL，图31为人内参核酸加入量5μL，图32为人内参核酸加入量8μL，图33为人内参核酸加入量2μL、5μL、8μL的阴性对照。图34为退火温度58℃，图35为退火温度60℃，图36为退火温度62℃。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例探究白色念珠菌、热带念珠菌和光滑念珠菌三种真菌和人内参基因GAPDH、ACTB和RPP30的最佳引物探针组合。

热带念珠菌-ROX	Ct	Rn
			F1R1P1	14.04	4716.286
F1R1-2P1	13.10	4228.201
			F2R2P2	13.61	8404.648
光滑念珠菌-Cy5	Ct	Rn
			F1R1P1	12.09	3085.329
F1-2R1P1	11.85	1531.806
			F2R2P2	11.93	3391.910
白色念珠菌-FAM	Ct	Rn
			F1R1P1	12.38	5939.997
F1-2R1P1	12.20	7239.484
			F2R2P2	11.67	5328.184
靶标-IC-HEX	Ct	Rn
			GAPDH	36.08	275.681
Actin	33.18	531.066
			RnaseP	34.75	800.324
Rpp30	NoCt	34.391

实验结果：如图1-4所示，根据Ct值和荧光值，热带念珠菌选择F2R2P2组合、白色念珠菌选择F1-2R1P1组合、光滑念珠菌选择选择F2R2P2组合、人内参选择RnaseP组合。

F2R2P2组合具体序列为：

F1-2R1P1组合具体序列为：

F1-2	AACAAACTTGCTTTGGCGGTGGG
		R1	ATCGATGCGAGAACCAAGAGATC
P1	AGGTCTAAACTTACAACCAAT

F2R2P2组合具体序列为：

F2	TCAACAATGGATCTCTTGGTTCTC
		R2	ATGTGCGTTCAAAGATTCGAT
P2	TGAAGAACGCAGCGAAATGCGATA

RnaseP组合具体序列为：

F3	AGTCATGGGTTCTGTATTCCGT
		R3	TCTCTGAGGAGCAGATGTT
P3	TGTAAAGTGTTGGAATAGAGAGAT

实施例2

本实施例探究引物探针组合在试剂盒中的最佳比例，试剂盒构成和PCR所用程序如下表。

序号	名称	体积/μL
			1	Buffer	4
2	探针	2
			3	核酸	2
4	水	10
			5	酶	1
6	dNTP	1
			7	合计	20

白色念珠菌：将白色念珠菌的引物探针设置3组不同比例(F：R：P＝1:1:0.5、F：R：P＝1:1:0.75、F：R：P＝1:1:1)，混合好后，引物稀释到10μm，与其他三个组等比例混合(其他三组比例为F：R：P＝1:1:1)，用来判断白色念珠菌最适合的探针浓度，结果见下表(阈值100)。

实验结论：如图5所示，C组(F：R：P＝1:1:1)时，白色念珠菌的荧光值最高，Ct值最小。

热带念珠菌：将热带念珠菌的引物探针设置3组不同比例(F：R：P＝1:1:0.5、F：R：P＝1:1:0.75、F：R：P＝1:1:1)，混合好后，引物稀释到10μm，与其他三个组等比例混合(其他三组比例为F：R：P＝1:1:1)，用来判断热带念珠菌最适合的探针浓度，结果见下表(阈值100)。

实验结论：C组(F：R：P＝1:1:1)时，热带的荧光值最高，Ct值最小。

光滑念珠菌：将光滑念珠菌的引物探针设置3组不同比例(F：R：P＝1:1:0.5、F：R：P＝1:1:0.75、F：R：P＝1:1:1)，混合好后，引物稀释到10μm，与其他三个组等比例混合(其他三组比例为F：R：P＝1:1:1)，用来判断光滑念珠菌最适合的探针浓度，结果见下表(阈值100)。

结论：如图6所示，H(F：R：P＝1:1:0.75)和I组(F：R：P＝1:1:1)时，荧光值最高，Ct值最小，选择I组(F：R：P＝1:1:1)。

实施例3

本实施例探究引物探针试剂盒中的酶的最佳选择，测试对象包括诺唯赞QN211、诺唯赞P132-d1、诺唯赞QN114、takara、启衡星FS-Q3001-S、天根ET108-1、环球酶，均来自市售。各个酶的反应条件见下表。

上述7种酶的实验结果见下表。

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如图7-9所示：

诺唯赞QN211的阴性白色念珠菌和光滑起跳，阳性热带没有起跳，整体荧光值高于其他酶；

诺唯赞P132-d1的阴性一组白色念珠菌和光滑起跳，Ct值整体滞后，整体荧光值低于其他酶；

诺唯赞QN114的阴性正常，但是Ct值整体滞后，荧光值中等；

takara的阴性一组白色念珠菌和光滑起跳，阳性热带没有起跳，荧光值中等；

启衡星FS-Q3001-S的阴性一组白色念珠菌和光滑起跳，Ct值较小，荧光值较高；

天根ET108-1的阴性一组白色念珠菌和光滑起跳，，Ct值较小，荧光值较高；

环球酶的阴性正常，Ct值较小，荧光值较高；

实验结论：从Ct值和荧光值而言，启衡星FS-Q3001-S、天根ET108-1和环球酶表现较好，从Ct值和Rn值来看，环球酶在三者中的表现最好，故而最终选择环球酶。

实施例4

本实施例探究引物探针试剂盒的最佳程序和体系。

(1)筛选环球酶加入量，分别为0.5μL、1μL、1.5μL，结果见下表。

实验结果：如图10-13所示，根据Ct值和荧光值判断，选择加酶量为1μL，此时效果较好。

(2)筛选dNTP加入量，分别为0.5μL、1μL、1.5μL。

实验结果：如图14-17所示，dNTP加入量0.5μL和1μL组数据好于dNTP加入量1.5μL，ct相差不大，加入量0.5μL组FAM荧光值好于1μL组，但1μL组CY5荧光值较高，考虑光滑检出问题，故选用dNTP加入量1μL。

(3)筛选核酸加入量，分别为2μL、5μL、8μL。

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实验结果：如图18-33所示，根据Ct值和荧光值判断，考虑到样本可能存在抑制物，本试剂选择核酸量为5μL。

(4)筛选退火温度，此项指标关系到特异性问题，分别为58℃、60℃、62℃，结果见下表。

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实验结果：如图34-36所示，根据Ct值和荧光值判断，第一组数据较好，即退火温度为58℃。

实施例5

本实施例探究本发明的试剂盒检测确诊侵袭性真菌病患者的痰液样本情况，结果如下表。

所述带证试剂盒为杭州缔蓝生物技术有限公司的白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌核酸检测试剂盒(荧光PCR法)。

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上述结果表明：本发明的与市面上的带证试剂盒相比，总符合率高达96.4％-100％，这也说明本发明实际应用性强，性能优越。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种检测痰液中真菌的荧光探针组合，其特征在于，所述真菌为白色念珠菌、热带念珠菌和光滑念珠菌；

所述白色念珠菌的引物探针序列包括SEQ ID NO 1-7；

所述热带念珠菌的引物探针序列包括SEQ ID NO 8-14；

所述光滑念珠菌的引物探针序列包括SEQ ID NO 15-21；

所述荧光探针组合还包括人内参基因，引物探针序列包括SEQ ID NO 22-30。

2.根据权利要求1所述的荧光探针组合，其特征在于，所述荧光探针组合的检测靶标为临床样本中的真菌游离DNA片段。

3.根据权利要求1所述的荧光探针组合，其特征在于，所述荧光探针的序列可以包含如下化学修饰：5'端：采用FAM、HEX、VIC、JOE、TAMRA、Cy3、NED、ROX、TEXAS-Red、Cy5荧光染料基团中任意三种染料的组合的化学修饰；和，3'端：采用BHQ1或BHQ2或3IABkFQ或3IAbRQSp淬灭基团的化学修饰。

4.根据权利要求1所述的荧光探针组合，其特征在于，所述白色念珠菌的引物探针序列为F2R2P2组合，所述热带念珠菌的引物探针序列为F1-2R1P1组合，所述光滑念珠菌的引物探针序列为F2R2P2组合，所述人内参基因的引物探针序列为RnaseP组合。

5.根据权利要求4所述的荧光探针组合，其特征在于，所述白色念珠菌的引物探针序列为F2R2P2组合，F2、R2、P2的体积比为1：1：1；所述热带念珠菌的引物探针序列为F1-2R1P1组合，F1-2、R1、P1的体积比为1：1：1；所述光滑念珠菌的引物探针序列为F2R2P2组合，F2、R2、P2的体积比为1：1：1；所述人内参基因的引物探针序列为RnaseP组合。

6.一种用于检测痰液中真菌感染的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-5任一项所述的荧光探针组合、Buffer、核酸、水、酶、dNTP。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述酶包括诺唯赞QN211、诺唯赞P132-d1、诺唯赞QN114、takara、启衡星FS-Q3001-S、天根ET108-1、环球酶中的至少一种。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括荧光探针组合2μL、Buffer4μL、核酸2μL、水10μL、酶1μL、dNTP1μL。

9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述酶为环球酶。

10.一种如权利要求6所述的试剂盒在对痰液中侵袭性真菌进行区分和鉴定中的应用。