CN118086395A - 一种盖塔病毒质粒载体、弱毒株及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种盖塔病毒质粒载体、弱毒株及其制备方法和应用。本发明制备的盖塔病毒重组弱毒株对乳鼠和仔猪的毒力显著减弱，不引起任何临床症状，并且引入的突变设计具有良好的遗传稳定性，10代以内未恢复到野生型基因组表型，可以用于盖塔病毒减毒活疫苗的制备中，具有广阔的应用前景。

Description

一种盖塔病毒质粒载体、弱毒株及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种盖塔病毒质粒载体、弱毒株及其制备方法和应用。

背景技术

盖塔病毒（Getah Virus，GETV）一直在动物中流行，近几年的流行病学研究显示，GETV的流行趋势逐渐上升，危害越来越严重。GETV严重影响马和猪的健康，感染马后主要表现一过性发热和后肢肿胀。而感染妊娠母猪则可能引起流产和垂直传播，新生仔猪感染后常引起严重的腹泻、后肢瘫痪甚至死亡。

虽然在养殖动物中危害严重，且具有潜在的公共卫生风险。但我国目前仍没有商品化的疫苗来防控这一疾病。灭活疫苗通常需要2次甚至更多次的加强免疫才能达到理想的免疫效果。这加大了猪群的应激反应，并提升了养殖的人力成本。随着反向遗传学技术的快速发展，通过直接修饰病毒基因组而产生的弱毒株具有更高的安全性，因为其通常依赖于大片段的基因修饰亦或协同突变，而不仅仅依赖于少量的点突变所造成的毒力衰减。此外，基于cDNA克隆衍生的弱毒株可以通过在基因组中插入外源病毒基因序列，有望进一步开发重组二价疫苗。因此，对于GETV防控而言，单剂量的减毒活疫苗更具应用前景，急需研制一种安全性高、免疫效果好的GETV减毒活疫苗。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中尚无盖塔病毒减毒活疫苗，提供一种盖塔病毒质粒载体、弱毒株及其制备方法和应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

第一方面，本发明保护一种质粒载体，所述质粒载体含有nsP3突变蛋白的编码基因和Cap突变蛋白的编码基因，其中，所述nsP3突变蛋白是将nsP3蛋白的第418-453位氨基酸被Linker序列取代后得到的，突变后的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述Cap突变蛋白是将Cap蛋白的69-72位氨基酸由RRRR突变为AAAA得到，突变后氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在具体的实施方案中，所述nsP3蛋白和Cap蛋白皆为GETV-HN的蛋白，所述GETV-HN在NCBI的Genbank上登录号为：MZ736801。

在具体的实施方案中，所述质粒载体以pSM-GETV-HN^FL为骨架质粒，所述pSM-GETV-HN^FL的序列如SEQ ID NO.3所示。

在具体的实施方案中，所述质粒载体的序列如SEQ ID NO.4所示。

在更具体的实施方案中，所述质粒载体的构建方法如下：

（1）首先构建质粒载体pSM-GETV-3ΔS2，所述质粒载体包含nsP3蛋白编码基因的突变，并引入了Linker序列；

（2）在步骤（1）构建的质粒载体pSM-GETV-3ΔS2的基础上，引入Cap蛋白编码基因的突变，获得本发明要求保护的质粒载体，命名为pSM-GETV-3ΔS2-CM1。

第二方面，本发明保护一种盖塔病毒重组弱毒株的制备方法，将前文任一所述的质粒载体转染至BHK-21或Vero细胞，获得盖塔病毒重组弱毒株。

第三方面，本发明还保护前文所述的制备方法制备得到的盖塔病毒重组弱毒株。

第四方面，本发明还保护前文任一所述的质粒载体、或前文所述的盖塔病毒重组弱毒株在制备疫苗中的应用。

在具体的实施方案中，所述疫苗为盖塔病毒减毒活疫苗。

第五方面，本发明还保护前文任一所述的质粒载体、或前文所述的盖塔病毒重组弱毒株在制备抗盖塔病毒的抗体产品中的应用。

第六方面，本发明还保护一种疫苗，含有前文所述的盖塔病毒重组弱毒株。

将上述方法制备得到的盖塔病毒减毒活疫苗候选株制备成盖塔病毒减毒活疫苗免疫妊娠母猪或仔猪，可以为猪只带来安全且高效的免疫保护。

本发明所具有的有益效果：

1）本发明将盖塔病毒HN株感染性cDNA克隆的nsP3基因进行了部分缺失，并引入了Linker序列；在该nsP3突变cDNA克隆的基础上进一步在Cap蛋白中引入了全新的突变。协同突变显著降低了病毒的复制效率；获得了GETV重组弱毒株（GETV-3ΔS2-CM1）。

2）本发明制备的GETV重组弱毒株在Vero和BHK-21细胞上的空斑显著减小，致病性实验显示该弱毒株对乳鼠和仔猪致病性显著降低，不引起任何临床症状，但保持了良好的免疫原性。

3）本发明引入的协同突变对于病毒遗传稳定性有益，需要多轮突变或重组才有可能恢复至原始序列，因此本发明所述的GETV重组弱毒株不具备毒力返强的条件。最后，单剂量GETV-3ΔS2-CM1免疫妊娠母猪可以为其新生仔猪提供良好的被动免疫保护效果，是制备盖塔病毒减毒活疫苗的非常优秀的候选病毒株。

附图说明

图1为pSM-GETV-3ΔS2和pSM-GETV-3ΔS2-CM1的构建示意图。

图2为IFA鉴定GETV-3ΔS2和GETV-3ΔS2-CM1的荧光信号图。

图3为GETV-3ΔS2和GETV-3ΔS2-CM1在BHK-21细胞上的多步生长曲线。

图4为Vero和BHK-21细胞空斑鉴定GETV-3ΔS2和GETV-3ΔS2-CM1的结果。

图5为GETV-3ΔS2-CM1在新生ICR乳鼠中的致病性实验。

图6为GETV-3ΔS2-CM1在妊娠母猪中的IgG抗体检测。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。

实施例1、构建质粒载体pSM-GETV-3ΔS2-CM1

基于已建立的亲本GETV-HN株（NCBI的Genbank上登录号为：MZ736801）全长cDNA克隆pSM-GETV-HN^FL（如SEQ ID NO.3所示），使用BglII和SgrAI酶切位点之间的片段进行nsP3区域突变，引物如表1所示。具体而言，以pSM-GETV-HN^FL为模版，使用引物F1+R2；F2+R1进行PCR获得片段C1和C2，使用F1+R1引物进行融合PCR获得突变的nsP3片段（即C片段，如SEQ IDNO.1所示），该片段缺失了nsP3蛋白第418-453位氨基酸，并引入了Linker序列。进一步，将pSM-GETV-HN^FL和回收的C片段分别通过BglII和SgrAI酶切，条件为：SgrAI内切酶（Buffer为Cutsmart）37℃酶切1 h，然后回收片段，使用BglII内切酶（Buffer为3.1）37℃酶切15 min，最后通过T4连接酶过夜连接获得重组质粒，转化至DH10B感受态细胞后，挑菌至1.5 mL EP管中过夜培养，所述LB液体培养基为卡纳抗性。使用F1+R1引物进行菌液PCR鉴定。对于阳性菌液通过测序验证引入的突变是否正确，将该中间质粒命名为pSM-GETV-3ΔS2（图1）。

在已生成的nsP3突变质粒的基础上，使用SgrAI和MluI酶切位点之间的片段进行Cap区域突变，引物如表1所示。具体而言，以pSM-GETV-3ΔS2为模版，使用引物F3+R4；F4+R3进行PCR获得片段D1和D2，使用F1+R1引物进行融合PCR获得突变的Cap片段（D片段，如SEQID NO.2所示），该片段将Cap蛋白的第69-72位氨基酸，将RRRR突变为AAAA。进一步，将pSM-GETV-3ΔS2和回收的D片段分别通过SgrAI和MluI酶切，条件为：SgrAI内切酶和MluI内切酶（Buffer为Cutsmart）37℃酶切1 h，最后通过T4连接酶过夜连接获得重组质粒，转化至DH10B感受态细胞后，挑菌使用F3+R3引物进行菌液PCR鉴定。对于阳性菌液通过测序验证引入的突变是否正确，所获得的质粒命名为pSM-GETV-3ΔS2-CM1（图1，如SEQ ID NO.4所示）。

表1：实施例1中所使用的引物序列

实施例2、转染拯救盖塔病毒重组弱毒株pSM-GETV-3ΔS2和GETV-3ΔS2-CM1

使用去内毒素质粒提取试剂盒提取实施例1得到的pSM-GETV-3ΔS2和pSM-GETV-3ΔS2-CM1质粒，然后将2 ug的pSM-GETV-3ΔS2或pSM-GETV-3ΔS2-CM1加入100 uL OPTI-MEM中，再加入4 uL Lip2000转染试剂，充分混匀，室温避光孵育15 min后，将转染复合物添加至35 mm皿的BHK-21或Vero细胞中，于转染后4 h换液。继续培养3-5天，每天观察病变情况。当观察到80%细胞病变时，立即置于- 80℃冰箱冻融细胞，并离心后收集上清液作为P0代次种毒。将10-20 uL的P0代次GETV-3ΔS2或GETV-3ΔS2-CM1重新接种至BHK-21细胞扩繁病毒，36-48 h后收样，所收集的上清液作为P1代次病毒。使用P1代次病毒进行后续实验。

实施例3、重组弱毒株GETV-3ΔS2和GETV-3ΔS2-CM1的IFA鉴定

将GETV-3ΔS2或GETV-3ΔS2-CM1接种至96孔板中的BHK-21细胞进行IFA鉴定。具体而言：将MOI=0.01的GETV-3ΔS2或GETV-3ΔS2-CM1接种至96孔板的BHK-21细胞中，在感染12 h后，使用GETV E2-3H2小鼠单克隆抗体进行IFA鉴定。具体的，使用4%多聚甲醛固定感染的细胞15 min，然后使用0.1% Triton X-100进行透化10 min，使用PBST清洗3次；然后加入5%脱脂奶粉进行室温封闭1 h，使用PBST清洗3次；然后加入GETV E2-3H2单抗（1:1000）室温孵育2 h，使用PBST清洗3次；然后加入FITC-goat anti-mouse抗体（1:1000）室温避光孵育1 h，使用PBST清洗3次后，加入DAPI（1:1000）室温避光孵育10 min，于倒置荧光显微镜观察绿色荧光。结果显示，GETV-3ΔS2或GETV-3ΔS2-CM1可以被GETV E2-3H2单抗识别而显示出绿色荧光（图2）。表明GETV-3ΔS2或GETV-3ΔS2-CM1的抗原性没有被改变。

实施例4、GETV-3ΔS2和GETV-3ΔS2-CM1在BHK-21细胞的多步生长曲线

将GETV-3ΔS2或GETV-3ΔS2-CM1以MOI=0.01接种至24孔板的单层BHK-21细胞，在37℃孵育1h后，弃去病毒液，并使用预冷的PBS洗涤3次，其后更换含2%血清的DMEM培养液放至培养箱继续培养。分别于接种后12、24、36和48h收集培养上清，并通过TCID₅₀法测定培养上清中的病毒滴度。结果显示，在BHK-21细胞上，GETV-3ΔS2或GETV-3ΔS2-CM1较亲本GETV-HN的增殖能力显著降低（图3）。

实施例5、GETV-3ΔS2和GETV-3ΔS2-CM1的空斑鉴定

将GETV-3ΔS2或GETV-3ΔS2-CM1接种至12孔板的单层Vero或BHK-21细胞，在37℃孵育1h后，弃去病毒液，并使用预冷的PBS洗涤3次，其后更换含1%甲基纤维素的DMEM培养液放至培养箱继续培养，待感染48h（BHK-21）或72h（Vero）出现明显的空斑时，弃去上层培养液，使用结晶紫染色，并观察记录空斑形态。空斑结果显示（图4），GETV-3ΔS2和GETV-3ΔS2-CM1在细胞上的空斑形态减小，表明其体外复制能力减弱。

实施例6、GETV-3ΔS2-CM1对ICR新生乳鼠的毒力验证

2日龄ICR新生乳鼠30只，由其各自的母亲饲养在单独的笼子中，每组10只。将GETV-HN和GETV-3ΔS2-CM1稀释至10⁷TCID₅₀/mL，皮下接种30 uL稀释的病毒液。空白对照小鼠皮下接种30 uL无菌PBS。接种后每天观察并记录小鼠的死亡情况和体重变化。结果如图5所示。结果表明高剂量GETV-3ΔS2-CM1接种新生ICR乳鼠不会引起死亡和明显的体重下降，体重增长与对照组结果类似。而亲本GETV-HN毒株则引起乳鼠快速死亡（图5）。以上结果说明，GETV-3ΔS2-CM1在易感的ICR乳鼠中具有高度的安全性。

实施例7、GETV-3ΔS2-CM1对新生仔猪的毒力验证

检测无GETV抗体的13头新生仔猪用于评估GETV-3ΔS2-CM1的安全性，其中亲本毒株GETV-HN组5头（A组）；GETV-3ΔS2-CM1组5头（B组）；模拟感染组3头（C组）。A组每头组合接种注射1头份（每头份病毒含量为5*10⁷TCID₅₀）的GETV-HN；B组每头组合接种注射1头份（每头份病毒含量为5*10⁷TCID₅₀）的GETV-3ΔS2-CM1，C组作为空白接种对照，接种等量无菌生理盐水。攻毒后第1-3天监测血清病毒血症，至接种后14天，每天观察临床症状、体温变化，结果如表2所示。GETV-HN感染组所有猪均出现腹泻、喜卧、消瘦等症状，所有仔猪在观察期内均死亡，并检测到高滴度的病毒血症。而GETV-3ΔS2-CM1感染组所有猪均未出现明显的临床症状（如腹泻、喜卧、后肢麻痹、消瘦等），体温无升高，且在第3天没有检测到病毒血症。空白对照组仔猪在观察期间无任何异常。攻毒后2周收集存活动物的血清，利用基于盖塔病毒p62-E1的ELISA法检测GETV抗体。结果表明攻毒后2周B组仔猪抗体水平增高，而C组仔猪仍无可检测的抗体。以上结果说明，GETV-3ΔS2-CM1在新生仔猪中没有可检测的致病性，但具备良好的免疫原性。

表2：仔猪致病性比较

实施例8、GETV-3ΔS2-CM1在对新生仔猪的被动免疫保护效力试验

检测无GETV抗体的5头妊娠母猪用于评估GETV-3ΔS2-CM1的被动保护效力。A组3头母猪颈部肌肉注射2 mL（病毒含量为10⁵TCID₅₀）的GETV-3ΔS2-CM1，B组2头母猪作为空白接种对照，接种无菌生理盐水2 mL。待母猪生产仔猪后对其仔猪进行攻毒，每组6头。每头仔猪组合接种注射1头份（每头份病毒含量为5*10⁷TCID₅₀）的GETV-HN株P1代，攻毒后14天内每天观察临床症状、体温变化，并于攻毒后第1-3天监测血清病毒血症，结果如表3所示。

这些结果表明免疫母猪组的新生仔猪可以通过吸食母乳而获得了抗GETV抗体，而对照母猪组的新生仔猪攻毒前无可检测的抗体。具体而言，GETV-3ΔS2-CM1免疫母猪组的仔猪攻毒后所有仔猪均未出现明显的临床症状，体温无升高，且没有可检测的病毒血症；而对照母猪组的仔猪出现腹泻，喜卧、消瘦等临床症状，其中3头仔猪死亡，但监测期间体温同样无升高。此外，攻毒后1-3天可以检测到高水平的血清病毒血症。说明GETV-3ΔS2-CM1免疫妊娠母猪对其所生仔猪具有良好的被动免疫保护效果，可以保护其子代免受高剂量的GETV感染。此外，在攻毒14天后，GETV-3ΔS2-CM1免疫母猪组仔猪的抗体逐渐降低，表明通过初乳转移的抗体足以达到灭菌免疫效果，而没有引起由病毒增殖所导致的加强免疫反应；而对照母猪组仔猪的GETV抗体升高，表明GETV感染并在随后诱导GETV抗体。因此，我们的结果表明GETV-3ΔS2-CM1不仅对妊娠母猪是安全的，并且在母猪中诱导了高滴度的抗体（图6）。此外，通过初乳被动转移的GETV抗体可以完全保护其子代免受高剂量GETV的感染，具有良好的免疫保护效果。

表3：GETV-3ΔS2-CM1的被动保护效力评估

实施例9、GETV-3ΔS2-CM1的遗传稳定性实验

将GETV-3ΔS2-CM1的P0代病毒以MOI=0.01在BHK-21细胞上连续传代。具体而言：以MOI=0.01的GETV-3ΔS2-CM1接种至单层BHK-21细胞，在37℃培养箱孵育1 h，然后更换为含有2%血清的DMEM。继续培养36-48 h，观察到90%细胞出现病变时，放置-80℃冰箱冻融一次。以此类推，在BHK-21细胞上进行连续10代次的传代，并分别将P5和P10代次病毒提取RNA用于扩增nsP3、Cap和E2基因，观察缺失、突变区域和病毒糖蛋白基因的稳定性。结果表明，在BHK-21细胞连续传代10次没有改变突变区域及E2基因的序列，表明GETV-3ΔS2-CM1在BHK-21细胞上遗传稳定，BHK-21细胞可以作为疫苗生产用细胞。

综上所述，本发明制备的重组病毒弱毒株GETV-3ΔS2-CM1在BHK-21和Vero细胞上空斑显著减小，对新生乳鼠和新生仔猪的毒力显著减弱，不引起任何临床症状。引入的突变设计都具有良好的遗传稳定性，10代以内未恢复到野生型基因组。并且保持了良好的免疫原性，可以在猪中产生良好的血清转换，并通过免疫母猪的被动保护方式为其新生仔猪提供完全的攻毒保护，是制备盖塔病毒减毒活疫苗的非常优秀的候选病毒株。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。

Claims (9)

1.一种质粒载体，其特征在于，所述质粒载体含有nsP3突变蛋白的编码基因和Cap突变蛋白的编码基因，其中，所述nsP3突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述Cap突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的质粒载体，其特征在于，所述质粒载体以pSM-GETV-HN^FL为骨架质粒，所述pSM-GETV-HN^FL的序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求2所述的质粒载体，其特征在于，所述质粒载体的序列如SEQ ID NO.4所示。

4.一种盖塔病毒弱毒株的制备方法，其特征在于，将权利要求1-3任一所述的质粒载体转染至BHK-21或Vero细胞，获得盖塔病毒弱毒株。

5.权利要求4所述的制备方法制备得到的盖塔病毒重组弱毒株。

6.权利要求1-3任一所述的质粒载体、或权利要求5所述的盖塔病毒重组弱毒株在制备疫苗中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述疫苗为盖塔病毒减毒活疫苗。

8.权利要求1-3任一所述的质粒载体、或权利要求5所述的盖塔病毒重组弱毒株在制备抗盖塔病毒的抗体产品中的应用。

9.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗含有权利要求5所述的盖塔病毒重组弱毒株。