CN118067987A - 一种点阵式免疫层析检测卡、制备方法及其应用 - Google Patents
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
本公开涉及体外诊断技术领域,公开一种点阵式免疫诊断检测卡及其制备方法,所述点阵式免疫层析检测卡包括底板和设于所述底板上的样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫,其中,结合垫上含有标记抗体或抗原,反应膜上设有检测点阵,且检测点阵之间物理隔离,所述点阵式检测卡采用侧向层析的方式检测待测样本。如此,通过现场打印可在有限尺寸的试纸条上实现超多重检测,这对多种疾病早期的全面筛查具有重大意义,不仅可定性筛选出潜在的疾病,还可通过检测该疾病标志物的浓度判断疾病所处的程度。
Description
技术领域
本公开属于体外诊断技术领域,具体涉及一种用于免疫诊断的点阵式免疫层析检测卡、制备方法及其应用。
背景技术
体外诊断是指在体外通过特定的试剂和仪器对采集的样本进行检测而获取疾病的诊断信息,由于其可以对疾病进行早期快速筛查,指导患者进行合理的治疗,因而广泛应用于医学领域,如临床检验、病理学、生物制药等。根据检测原理的不同,体外诊断方法可以分为生化诊断、分子生物学诊断、微生物学诊断和免疫学诊断等多种类型。其中,免疫学诊断由于受到化学发光市场的推动,是近年来体外诊断领域规模最大、新增品种最多的细分领域。
免疫学诊断是利用抗原和抗体的特异性结合反应对微量抗原或抗体进行测定的方法。根据目标分析物的类型,诊断分析通过夹心法或竞争法的形式进行。竞争法分析主要是用于检测小分子物质,如药物和毒素,目标分析物分子与抗原竞争性结合抗体,目标物的浓度越高,信号越低,试纸条上的检测线的颜色越浅。而夹心法主要用于检测中大型分子分析物,如蛋白质、抗体、细菌、病毒等,其原理是当含有目标抗原的液体样本被滴加至免疫层析试纸条上时,溶液中的靶抗原与结合垫上标记的抗体相互作用,并被固定在检测线上的抗体捕获,导致测试线中的颜色改变,多余标记的抗体被固定在质控线上的二抗捕获,如果存在目标分析物,试纸条上会出现两条线,没有目标分析物时,只在质控线处出现一条线。
现有技术中的免疫层析检测卡一般是单通道或者少量的多通道,这就意味着一次只能针对一个或者几个项目进行分析,并且仅有的少量多通道技术并不能进行定量测量或者定量标准存在问题。此外,患者在选择使用之前必须潜在了解所使用的检测卡的检测项目,现在越来越多的人更加注重体检过程中的早期筛查或者居家自我监测,这就意味着如果患者需要排除一些潜在的病症,就需要同时购买多套检测卡或者在医院进行多个项目的体检才能完全筛查。这样不仅检测效率低下,样本消耗量大,且患者的筛查成本显著提高。即便存在一些多通道的层析检测卡,也存在各种不足,例如,一方面通道数量受限于检测卡的大小,另一方面只能对潜在的病症进行定性检测或者在一定的程度上进行半定量检测。此外,尽管已经存在极少量的点阵免疫发光分析仪的技术,但这些技术都是流式的,在一个反应管中检测,其点阵主要是孔板点阵,因此在检测前后需要复杂的纯化过程。
如何能够使得免疫层析检测卡的检测项目更加广泛,检测结果更加精确,检测成本更加低廉成为本领域亟待解决的技术问题。
发明内容
本公开的目的是提供一种点阵式免疫层析检测卡、检测方法及应用,本公开提供的点阵式免疫层析检测卡可以在一张检测卡上同时实现不同种类疾病标志物的检测、同种疾病不同标志物的检测和检测浓度的定量测量,这对早期潜在患者身体状况的自我筛查具有重大意义。
在下文中给出了关于本公开的简要概述,以便提供关于本公开的一些方面的基本理解。但是,应当理解,这个概述并不是关于本公开的穷举性概述。它并不是意图用来确定本公开的关键性部分或重要部分,也不是意图用来限定本公开的范围。其目的仅仅是以简化的形式给出关于本公开的某些概念,以此作为稍后给出的更详细描述的前序。
本公开提供的点阵式免疫层析检测卡包括底板和设于所述底板上的样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫,其中,结合垫上含有标记抗体或抗原,反应膜上设有检测点阵,且检测点阵之间物理隔离。所述点阵式检测卡采用侧向层析的方式检测待测样本。
在上述技术方案中,样品垫、结合垫、反应膜及吸水垫之间依次塔接,所述结合垫上含有标记抗体,所述反应膜的检测点阵上固定有捕获抗体。在检测的过程中,当待测样品滴加至检测卡一端的样品垫上后,通过毛细作用向检测卡另一端方向移动,溶解结合垫上的标记抗体发生特异性结合反应,再移动至固定有抗体的反应膜区域时发生特异性结合而被捕获,形成双抗体夹心抗原的免疫复合物,其中包被了荧光微球的抗体会在特定波段的激发光下发射荧光,并固定在反应膜特定点阵位置,形成点阵,通过发光信号检测实现免疫诊断分析。
本公开通过在反应膜上将检测区域设计成点阵,这样,在同样尺寸的反应膜或者也可以理解为同样尺寸的检测卡上即可实现多重检测甚至超多重检测,或者多重检测、超多重检测的同时实现定量测量。此外,本公开的点阵式免疫分析检测卡相比于点阵式芯片的微流控或者流式的点阵分析,该检测卡的结合垫处含有大量的抗体或抗原,因此在结合垫处可直接使用混合液,不需要额外的洗涤和纯化过程,在检测卡上设置含有可分离式接触的吸水垫,可以将游离的抗体或抗原直接分离,从而减小游离的抗体或抗原对检测的不利影响,因此操作简单。
如此,通过检测点阵的合理设计,实现点阵式免疫层析检测,例如,可以实现同类型疾病的不同标志物的检测,如对于肿瘤类筛查而言,可以同时实现癌胚抗原、甲胎蛋白、糖类抗原CA125、糖类抗原CA153、糖类抗原CA19-9、糖类抗原CA724、神经元烯醇化酶、细胞角蛋白片段19、附睾蛋白4、胃泌素释放肽前体、总前列腺特异性抗原、游离前列腺特异性抗原、前列腺特异性抗原同源异构体、异常凝血酶原、鳞状细胞癌相关抗原、肺癌自身抗体检测,从而定性筛查肿瘤的潜在可能性;又或者在肿瘤标志物的检测中,通过点阵式设计,如点阵中的行从上到下设计成浓度梯次检测,点阵中的列从左到右设计成标志物类型的筛查检测,这样即可实现定性检测和定量检测,助于患者预估潜在疾病的程度,以采取预防和治疗措施。又或者,对于不同类型疾病标志物的筛查,如在采集标本均为血液时,同时对肿瘤标志物、感染性疾病、内分泌及代谢性疾病、心血管疾病、免疫功能及自身免疫性疾病相关抗体检测,如此,患者只需采集一次样本,即可实现不同类型疾病标志物的筛查,甚至在条件允许的情况下,可以设计成不同类型疾病、同类型疾病的不同标志物、同种标志物的不同浓度的同时检测。这对于提高检测效率和检测精度,降低患者的检测成本具有重大意义。
其中,样品垫是待测样本滴加位置,对待测样本具有一定的过滤和缓冲作用,降低待测样本中的离子强度或者酸碱度对检测结果的影响。上文中所述的吸水垫是通过吸水作用使待测样本向靠近吸水垫一侧流动,带动结合垫上的抗体或抗原也向吸水垫一侧流动,从而与反应膜上的抗原或者抗体发生反应。
一般而言,检测点阵的密度越大,能进行检测的通道越多,分析结果也更加精细,因此检测点阵的直径、尺寸、环境等参数的控制显得至关重要。
在一些实施例中,检测点阵是由喷墨机构打印而成。喷墨机构可以将待打印的溶液经由喷头将液滴喷射到反应膜上,从而形成m×n的检测点阵。在该实施方式中,m、n均为整数,且1≤m≤100,1≤n≤100。
在一些实施例中,检测点阵的大小、尺寸、形状、液滴体积可控。这样可以根据检测需求现场打印满足要求的检测点阵。
在一些实施例中,检测点阵的打印过程可由喷墨机构的运动控制单元所控制,通过预先输入的液滴运动参数来控制检测点阵的排布、液滴运动的速度及加速度、液滴运动的方向等。
在一些实施例中,检测点阵的打印过程可由喷墨机构的视觉监测单元全程监测,所述视觉监测单元包括相机和频闪灯,相机配置为水平方向和竖直方向,其中,水平方向的相机和频闪灯可对打印的液滴进行观测,而竖直方向的相机可对位识别、打印观测。
在一些实施例中,检测点阵打印完毕后可对点阵进行分析处理,上述视觉监测单元可将监测到的图像反馈给喷墨机构的分析处理单元,可对实际打印的点阵的参数进行反馈,便于分析理论设计的点阵和实际打印的点阵之间的偏差,且同时可以分析检测点阵的检测结果。
在一些实施例中,检测点阵的形状可以为圆形、正方形,优选为圆形。在同样尺寸大小的反应膜上,圆形相比于其他形状,所占的面积更小,因而可排布的点阵数量更多。
在一些实施例中,上述点阵式免疫诊断检测卡适用于化学发光分析、胶体金法分析、时间分辨免疫分析。
一种点阵式免疫层析检测卡的制备方法,包括如下步骤:
S1、抗体的包被:称取荧光微球置于离心管中,通过MSE和纯水的混合溶液离心洗涤后去上清液,向超声后的溶液中加入EDC和NHS活化微球,取活化后的溶液离心去上清液后加入MSE溶液冰浴超声,加入抗体进行标记,取标记后的上述溶液离心去上清液后加入BBS溶液冰浴超声,最后加入10%的BSA溶液进行封闭;
S2、标记物的固化:将S1中抗体包被的荧光微球通过喷金仪和固化液固化在裁剪好的玻璃纤维素膜上;
S3、点阵的打印:将预先配置好的抗体溶液加入至喷墨机构,调整打印参数,确保打印的液滴在相机频闪过程中保持在中间位置,液滴下落过程稳定,选择打印模式并设置点阵参数进行打印;
S4、检测卡的组装:将玻璃纤维素膜、吸水垫粘贴在底板上形成试纸条,将试纸条组装在检测卡的卡壳内,后进行压壳。
本公开提供的点阵式免疫层析检测卡及制备方法,具有以下有益效果:一方面相比于传统的只有一条检测线和质控线的免疫层析检测卡,该公开中的点阵式免疫层析检测卡具有多重检测位点或超多重检测位点,因此可以实现多重或超多重疾病或标志物的检测。另一方面,相比于现有技术中的具有多条检测线和质控线的免疫层析检测卡,尽管能在很有限的程度上实现有限种类疾病或标志物的检测,同时检测样本在检测卡上最先接触的样本检测结果更为准确,而在毛细作用下向吸水垫方向移动时,后面的样本量显然减少,因此发光强度减弱,因此检测结果可信度低,而本公开中的点阵式免疫层析检测卡采用侧向层析,检测样本到达每条检测阵列的浓度相同,因此灵敏度更高,检测结果更加准确。此外,相比于流式点阵设计例如孔板点阵或者芯片点阵,本公开的点阵式免疫层析卡不需要对待测样本进行洗涤或者纯化,因此在检测流程上更加简化,可以缩短检测耗时,检测效率更高。
通过以下参照附图对本公开的示例性实施例的详细描述,本公开的其它特征及其优点将会变得更为清楚。
附图说明
构成说明书的一部分的附图描述了本公开的实施例,并且连同说明书一起用于解释本公开的原理。在附图中阐述的实施例本质上是说明性和示例性的,并不旨在限制本公开。当结合以下附图阅读时,可以清楚地理解以下对示例性实施例的详细描述,其中相似的结构用相似的附图标记指示,并且其中:
图1示意性示出本公开实施例免疫层析检测卡部分结构示意图;
图2示意性示出本公开实施例免疫层析检测卡下卡壳的结构示意图;
图3示意性示出本公开实施例免疫层析检测卡上卡壳的结构示意图;
图4示意性示出本公开实施例免疫层析检测卡的分布示意图;
图5示意性示出本公开实施例免疫层析检测卡检测时的动态过程图;
图6示意性示出本公开实施例样品中含有两种抗原时的检测状态图;
图7示意性示出图6中样品中含有两种抗原时的补充检测状态图;
图8示意性示出本公开实施例4多重肿瘤疾病筛选中的检测卡设计图;
图9示意性示出本公开实施例5多重感染性疾病筛选中的检测卡设计图;
图10示意性示出本公开实施例6多重内分泌及代谢性疾病的检测卡设计图;
图11示意性示出本公开实施例7多重心血管疾病筛选中的检测卡设计图;
图12示意性示出本公开实施例8多重自身免疫性疾病检测筛选中的检测卡设计图;
图13示意性示出本公开实施例9多重其他疾病检测筛选中的检测卡设计图;
图14示意性示出本公开实施例13以CRP、α1-1MG和β2-MG三种待测样本进行打印的点阵布局图;
图15示意性示出本公开实施例13的液滴打印后10min的拍摄画面图;
图16示意性示出本公开实施例13打印的液滴干涸后的拍摄画面图;
图17示意性示出本公开实施例13打印的液滴干涸后的另一拍摄画面图;
图18示意性示出本公开实施例14以CRP、NGAL、α1-1MG和β2-MG四种待测样本进行打印的点阵布局图;
图19示意性示出本公开实施例14的液滴打印后10min的拍摄画面图;
图20示意性示出本公开实施例14打印的液滴干涸后的拍摄画面图。
附图标号说明:1-样品垫;10-待测样本;2-结合垫;20-标记抗体;21-标记抗体结合物;3-反应膜;30-点阵;31-T点;32-C点;33-捕获抗体;34-双夹心抗体免疫复合物;4-吸水垫;5-塔接位;6-底板;7-上卡壳;70-上卡槽;71-卡合柱;72-固定槽;73-加样口;74-检测视窗;8-下卡壳;80-下卡槽;81-卡合柱;82-固定槽;a-待测样本流动方向;b-激发光。
具体实施方式
下面将参照附图来详细描述本公开的各种示例性实施例。应注意到:除非另外具体说明,否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本公开的范围。
以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的,决不作为对本公开及其应用或使用的任何限制。也就是说,本文中的结构、检测方法及点阵的排布是以示例性的方式示出,来说明本公开中的结构、检测方法及点阵的排布的不同实施例。然而,本领域技术人员将会理解,它们仅仅说明可以用来实施的本公开的示例性方式,而不是穷尽的方式。此外,附图不必按比例绘制,一些特征可能被放大以示出具体组件的细节,也或者一些特征在本公开的附图中未被示出,但通过说明书加以说明。
另外,对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作详细讨论,但在适当情况下,所述技术、方法和设备应当被视为授权说明书的一部分。
在这里示出和讨论的所有示例中,任何具体值应被解释为仅仅是示例性的,而不是作为限制。因此,示例性实施例的其它示例可以具有不同的值。
【术语解释】
标记是指通过化学反应将一种分子共价偶联到另一种分子上,参与偶联反应的两种物质分别称为标记物和被标记物,化学标记要求被标记物保持自身的性质(如免疫原性质),又具有标记物的某些性质(如发光性质)。
术语“标记抗体”将标记物(酶,荧光素,生物素等)共价连接到抗体上,与待检测物(如某些特定抗原)特异性反应形成多元复合物,并借助于仪器对试验结果直接镜检观察或进行自动化测定,以用于对抗原、抗体反应进行定性和定位研究或进行定性和定量测定。本公开中具体而言是指另一种能够特异性识别待测抗原的抗体,其与捕获抗体分别特异性识别同一待测抗原分子上的不同抗原表位,且检测抗体标记了吖啶酯,从而实现待测抗原的定量或定性的检测。
术语“捕获抗体”是指能够从待测物中特异性识别并结合待测抗原的抗体。术语“质控点阵”是指用于确认检测卡是否失效的点阵,而术语“测试点阵”是指用于对待测样本进行定性检测或者定量检测的点阵。
免疫层析技术是即时检测的(point of care testing,POCT)一种,将已知的抗原或抗体预先偶联到载体上作为捕获线,待检测样本在载体的毛细作用带动下流经捕获线,若样本中存在相应的抗体或抗原,就能和载体上的抗原或抗体发生特异性反应而吸附到载体上,并通过标记物显色或者发光以确定是否含有待测物或者待测物的含量。其中,本发明实施例的点阵式免疫层析是以纳米微球为载体,结合荧光标记物探针,发光稳定性高,并且可以直接检测发光信号,其检测信号具有较高的信噪比,较高的信号检测量和检测灵敏度。
目前市场上的免疫层析检测卡多为单卡检测,即一张检测卡一般只能检测一种标志物,例如用于人绒毛膜促性激素HCG的检测,以此作为早期怀孕的诊断依据,又例如作为新型冠状病毒抗原检测,以此作为是否感染新冠的诊断依据。随着医疗临床的需求,更多疾病需要早期筛查,进而可对症治疗,这就对免疫层析的检测提出了更高的需求。现有技术中有针对免疫层析试纸条的多重检测,主要集中于结构的改进,例如,具有多个检测线的试纸条或具有多条试纸条的多通道结构,可以理解的是,具有多个检测线的试纸条,在检测过程中,样本在毛细作用下向着吸水垫的方向流动时,结合垫上靠近样品垫的检测线由于接触的样本量相对充足,因此发光信号强,检测结果相对更加准确,而靠近吸水垫的检测线由于样本流动至该部分检测线时,样本量会不可避免地减少,这样对检测结果的准确度影响较大;而具有多条试纸条的多通道结构,也仅能在有限的几个通道中对样本进行检测,且在同样尺寸的试纸条上多通道结构的数量极其有限,如需不断地扩大通道数量,则只能增大试纸条的尺寸,因此很难满足目前临床上多重及超多重疾病及标志物早期筛选的需求。
为此,本公开提供了一种基于打印技术的免疫层析检测卡、制备方法及其应用,其可以基于打印技术来制备检测卡的反应膜上的液滴点阵,即若干列T点和C点,从而构建多重检测位点,实现不同检测物之间的物理隔离,完成多重检测物甚至超多重检测物在同一试纸条进行检测。硝酸纤维素膜本身的结构类似孔状,可以固定液滴,因此可实现不同检测物之间的物理隔离。而且,本公开的点阵采取侧向设计,这样待测样本在流经阵列时,在与待测样本流向方向垂直的方向上的每列点阵所接收的样本的浓度是相同的,因此检测结果更加精确。此外,本公开的检测卡由于可以在有限的试纸条上可以设置超多检测位点,可以实现待测样本浓度的定量检测,可以根据发光图像沿着样品流动方向的亮度变化判断待检测物的浓度。可以理解,实际的检测卡可能还存在其他部件,而为了避免模糊本公开的要点,附图没有示出且本公开也不赘述其它部件。
参见图1,本公开实施例提供的基于打印技术的免疫层析检测卡包括底板6和设于所述底板6上的样品垫1、结合垫2、反应膜3和吸水垫4。可以理解的是,在某些特定的场合下,底板6、样品垫1、结合垫2、反应膜3和吸水垫4可以理解成免疫层析检测卡的试纸条,主要用于承载各类液体,例如待测样本、固定探针、捕获抗体等。
在一些其他实施例中,参见图2和图3,检测卡还包括卡壳,在一些情景中,卡壳包括上卡壳7和下卡壳8,主要用于试纸条的装配,可以固定、保护试纸条。其中图2示出的是下卡壳8,图3示出的是上卡壳7。可以理解的是,此处的“上”和“下”对应于通常来讲检测卡在检测样本时的状态,在检测样本时,通常与承载检测卡的平面直接接触的为下卡壳8,反之,另外一侧则为上卡壳7。下卡壳8通常而言设置有下卡槽80,这样试纸条插入下卡槽80中,再经由上卡壳7和下卡壳8的卡合扣即可组装在一起,卡合扣包括卡合柱和固定槽,在组装时,上卡壳7的上卡合柱71和下卡壳8的下固定槽82对应,上卡壳7上的上固定槽72和下卡壳8上的下卡合柱81对应。因此,在组装过程中简单易于操作。此外,上卡壳7上还设有加样口73和检测视窗74,加样口73用于滴加待测样本,检测视窗74用于观察或收集发光信号。
继续地,参见图4,图4示意性示出本公开实施例免疫层析检测卡的分布示意图,图中可以看到本公开的结合垫2设于样品垫1中,二者在一些实施例中均为玻璃纤维,样品垫1用于接收待测样本,结合垫2上含有标记抗体,在某些情景中也可以称为荧光探针,用于检测待测样本的探针。反应膜3上检测点阵,这些点阵包括T点31和C点32,T点31可以理解为测试点,C点32可以理解为质控点,质控点可以理解为是判断检测步骤是否正确或者检测点阵是否正常的标准,也可以理解为是测试点的内部质控。
以上附图从结构上简要说明本公开免疫层析检测卡的主要结构,下面将从检测原理上继续对本公开的检测卡进行说明。参见图5,图5用系列动态图展示了检测的全过程,当向样品垫上滴加待测样本时,待测样本在毛细力的作用下迁移流动到结合垫区,结合垫区的标记抗体可以和待测样本结合,形成标记抗体和待测样本的复合物,在一些情景中也可以理解为标记抗体复合物,复合物继续在毛细力的作用下迁移流动至反应膜区,也可以理解为检测区,如果待测样本中存在某种标志物,则会被反应膜区的捕获抗体捕获,形成双夹心抗体免疫复合物,双夹心抗体免疫复合物在激发光的照射下会化学发光,通过观察各个位点是否存在发光可以判断待测样本中是否存在标志物,进而可以判断该待测样本的患者是否潜在患有某种疾病,未被捕获的待测样本继续在毛细力的作用下留至吸水垫,被吸收,以免待测样本溢出造成环境的污染。此外,未被捕获的复合物在流经C点时,会和C点处与结合垫处的标记抗体对应的抗原结合,观察是否显示出颜色或者发光,这样可以判断检测卡是否有效。
下面参见图6和图7,图6和图7是以样品中有两种抗原为例,进一步详细地阐述本公开检测卡的检测原理,待测样本10滴加至样品垫1上,在结合垫2处被标记抗体20标记形成标记抗体复合物21,经由塔接位5到达反应膜区3,在反应膜3上的捕获抗体33的作用下,形成双夹心抗体免疫复合物34,在激发光b的作用下发光,如果待测样本10中没有对应的捕获抗体33对应的抗原,则标记抗体20会继续到达C点32,与C点32处的抗原结合发光,多余的未被捕获的待测样本10继续经由塔接位5到达吸水垫4被吸收。图6中以不同颜色代表不同的捕获抗体为例,待测样本1侧向层析,在第一次接触不同的捕获抗体33时待测样本10的浓度相同,且在随着流动方向a逐渐向吸水垫方向流动时,点阵30每行设置的捕获抗体33相同,每列设置的是不同种类的捕获抗体33,这样只要每行有发光信号,则证明待测样本10中含有该标志物,而不像现有技术中的每行设置的捕获抗体33不同,这样待测样本10在沿着流动方向a流向靠近吸水垫4的检测位点或者检测线时,可能待测样本10因为被靠近样品垫1的捕获抗体33捕获,而导致即便现有的检测通道能够检测多种,但是检测不准确的问题。
以下以具体实施例阐述本公开实施例的免疫层析检测卡的制备方法及应用。
在下述实施例中,荧光微球通过以下方式来制备:(1)分别取30mg菁类荧光染料DiD分散于10mL四氢呋喃溶液中,形成有机相;
(2)取1g空心聚苯乙烯微球复溶到50mL去离子水中,充分超声,形成空心聚苯乙烯球水溶液;
(3)向羧基聚苯乙烯球水溶液中加入20%的十二烷基苯磺酸钠和10%乙二胺聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段聚醚各1mL,并放入2mL磁力搅拌子,搅拌得到溶液A;
(4)将有机相迅速加入溶液A中,然后逐渐升温到50℃,持续搅拌10h;
(5)步骤(4)反应完成得到荧光微球,离心除去多余的荧光染料,再分别用去离子水和乙醇清洗两次,并保存于去离子水中,避光放于常温下备用。
空心聚苯乙烯微球通过以下方法来制备:将3mL的苯乙烯和1.8mL的甲基丙烯酸缩水甘油酯加入到250mL的三口烧瓶中,加入110mg的过硫酸钾、100mg氯化钠和100mL去离子水,启动机械搅拌并设置转速为350rpm,开启冷凝水,通入惰性气体15min后,于室温下加热到70℃,反应8h后,反应溶液呈现乳白色,将乳液和四氢呋喃按照体积比1:5混合5min后,离心弃上层液体,随后分别用乙醇和水交替离心洗涤一次,即得空心的聚苯乙烯微球。
实施例1点阵免疫层析检测卡的制备(化学发光法检测)
(1)抗体的包被
抗体的包被过程包括活化、标记、封闭等步骤,在本实施例中,首先,配置荧光微球、2-(N-吗啉代)乙磺酸(2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate,MES)、纯水的混合溶液,并向其中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide,NHS)活化微球,室温下混合。然后,取活化后溶液离心弃上清液后加入500μL MSE溶液,冰浴超声,加入抗体200μg标记,室温颠倒12h。最后,取标记后溶液离心弃上清液后加入450μL 0.05mol BBS(Balanced salt solution)溶液,冰浴超声,加入500μL 10% BSA溶液封闭,室温下混合。
(2)固化
首先配置含量为2% NaCl、2%BSA、7%海藻糖、2‰色素、1‰PC300的混合固化液。然后裁剪适当宽度的玻璃纤维素膜,按照荧光探针溶液稀释倍数、玻璃纤维素膜的喷涂长度、仪器喷金量,配置装载到XYZ三维划膜喷金仪内的溶液,将抗体包被的荧光微球固化在玻璃纤维素膜上。最后操作XY划膜喷金仪将配制溶液均匀喷涂在玻璃纤维素膜上,37.5℃下干燥过夜。
例如,稀释倍数为10倍,荧光探针体积为10μL,固化液体积为90μL,配制总体积为100μL,喷金速度为2.0μL/cm,喷涂长度为300mm。
(3)打印
首先,配置含量为1% PBS(pH=7.4)、2%蔗糖、0.5% NaCl的划膜液,选择合适的底板和满足条件的PALL NC膜,抗体溶液取自高浓度抗体标准溶液,按照划膜抗体浓度、点阵设计、仪器参数稀释配置的溶液,将配置好的抗体溶液加样至喷墨打印设备喷头。在选择打印模式时,将基底安置在机器底板气孔上方,开启负压吸附固定,先粗调位置,再打开垂直相机继续细调位置,直至相机或喷头移动至指定位点,保存当前相机位置并修改z轴方向上的数值距离。将喷头移至废液槽,打开水平相机,正压观察是否可以正常出液,控制气压调参,直至有且只有一滴液滴可以在相机频闪过程保持在中间位置稳定、圆滑,开关喷头前后依旧保持原位,频闪延迟加大可以观察到下落现象且过程中液滴依旧保持稳定。
例如参数可以调节如下:
上述操作完成后,将喷头移动至保存点位置处,选择打印模式为点阵模式,设置点阵间隔等参数,例如可以调整如下:
保存现有位置到喷头机构,选择喷墨模式,测试打印,将配置溶液喷涂打印在NC膜上,37.5℃干燥过夜。
(4)组卡
配置含量为0.05M BBS7.42+0.5%TW20+2%NaCl+0.5%BSA+H2O的样本稀释液;将玻璃纤维素膜、吸水纸用用裁切器裁剪至合适宽度,并粘贴在底板上,注意边缘与底板对齐,且玻璃纤维素膜、吸水纸与NC膜有1mm覆盖;将装配好玻璃纤维素膜、吸水纸、NC膜的底板用斩切机切至4mm/条;组卡;压壳;设置标准品浓度梯度,样本稀释倍数100倍,上样体积100μL。
(5)检测读图
样品滴加10min后、30min后分别放入荧光显微镜读图;打开荧光调节黑平衡,关闭荧光调节聚焦;加装滤光片至荧光显微镜,从右至左依次拍摄图像;增加标尺、保存图像;数据分析。
实施例2点阵免疫层析检测卡的制备(胶体金法检测)
将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上,胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上,当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后,通过毛细作用向前移动,溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应,再移动至固定的抗原或抗体的区域时,待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留,聚集在检测带上,可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条,使用十分方便。
(1)抗体-胶体金标记物的制备
取胶体金于离心管中,向离心管中加入抗体,振荡后静置,再向离心管中加入10%的BSA溶液,振荡静置,制备得到抗体-胶体金标记物,将制备的抗体-胶体金标记物溶液低温下离心,去上清液,稀释备用;
(2)固化:用含有5%的蔗糖、5% BSA和终体积浓度为0.1%的pH为7.9的0.01mol/L的PBS溶液进行浸泡,浸泡后将溶液沥干,在37℃条件下烘干12h备用;
(3)打印
打印方法参见实施例1;
(4)组卡
组卡方法参见实施例1;
(5)检测读图
方法参见实施例1。
实施例3点阵免疫层析检测卡的制备(时间免疫分辨检测)
时间分辨荧光免疫层析法(time-resolved fluorescent microspheresimmunochromatographic assay,TRFMIA)是将三价稀土镧系离子铕等通过络合物标记到抗原或抗体分子上,并通过检测其荧光实现免疫分析。由于稀土离子荧光的激发光波长范围较宽,而发射光波长范围较窄,而且激发光和发射光之间的波长差距较大,特别是荧光寿命大大长于常规荧光。因此它采用了与常规荧光免疫不同的检测方式,即通过脉冲激光器间歇激发样品,同时检测器在其激发的间隙测定特定波长的荧光强度。这样不仅消除了杂散光的干扰,而且也大大减弱了样品及反应杯中杂质所产生的背景荧光干扰。所以其检测灵敏度和线性范围大大高于常规荧光。
(1)抗体的包被:时间分辨荧光微球为功能化的聚苯乙烯微球,其内部填充有铕的螯合物,将Eu-时间分辨荧光微球用pH=6的MES缓冲液清洗后重悬,加入活化剂EDC和NHS,振荡活化微球,加入乙醇混匀后离心洗涤去上清,再加入硼酸缓冲液重悬微球,混匀后再加入抗体,振荡标记,再用复溶缓冲液(包含0.08%BSA、0.08%-20.4%海藻糖和0.05%NaN3,百分比为质量百分比)重悬,加入10% BSA封闭,得到时间分辨荧光微球标记的抗体。
(2)固化
玻璃纤维素膜用含有表面活性剂的缓冲液(配方:100mM PB(pH7.4),其中含有2%NaCl,2%BSA、0.5%酪蛋白、0.1%-20.5%蔗糖,其中百分比为质量百分比)浸泡进行预封闭后,37℃干燥3h;通过喷头将标记有时间分辨荧光微球的抗体喷至玻璃纤维素膜上,37℃干燥3h。
(3)打印
打印方法参见实施例1;
(4)组卡
组卡方法参见实施例1;
(5)检测读图
方法参见实施例1。
实施例4在多重肿瘤疾病筛选中点阵免疫层析检测卡的设计
由于本公开实施例中的检测卡具有超多点阵,因此检测通道具有超多位点,本实施例以肿瘤标志物为例进行说明。
常见的肿瘤标志物有22种,参见下表:
/>
例如要实现对上述各种肿瘤标志物的筛选,则可以设置的点阵排布图参见图8,其中,从左往右代表不同的颜色代表不同的肿瘤标志物,即22列,相同的颜色代表相同浓度,例如1mg/mL,每个点阵的液滴体积为20pL,排布方式如下表:
例如,在第2列(CEA)、第6列(SCC)、第17列(NSE)的检测点阵有发光现象发生时,则可以根据肿瘤标志物联合异常初步判断患者可能患有潜在的肺癌;又例如,在第2列(CEA)、第3列(CA199)、第9列(CA242)、第10列(CA724)的检测点阵有发光现象时,则可以根据肿瘤标志物联合异常初步判断患者可能患有潜在的胃癌;还例如,在第4列(CA125)、第3列(CA199)、第2列(CEA)的检测点阵有发光现象时,则可以根据肿瘤标志物联合异常初步判断患者可能患有潜在的胰腺癌。如此,可以根据标志物的检测对患者潜在的疾病进行定性筛选。
实施例5在多重感染性疾病筛选中点阵免疫层析检测卡的设计本实施例筛选的多重感染性疾病如下:
如需排查上述19种感染性疾病标志物,只需定性筛选的情况下,其点阵排布方式可参见图9,其中不同颜色的阵列代表不同的感染性疾病标志物,相同颜色的点阵代表相同的浓度,可参见下表:
实施例6在多重内分泌及代谢性疾病筛选中点阵免疫层析检测卡的设计分泌及代谢性疾病的标志物如下:
/>
如需排查上述33种内分泌及代谢性疾病标志物,点阵排布方式参见图10,其中不同颜色的阵列代表不同的感染性疾病标志物,相同颜色的点阵代表相同的浓度,可参见下表:
/>
实施例7在多重心血管疾病筛选中点阵免疫层析检测卡的设计心血管疾病标志物如下:
如需排查上述9种心血管疾病标志物,检测点阵的打印排布方式参见,或者必要时可附图说明排布方式。
实施例8在多重自身免疫性疾病检测筛选中点阵免疫层析检测卡的设计自身免疫性疾病标志物如下表所示:
如需排查上述25种自身免疫性疾病标志物,检测卡的点阵排布方式及打印方式参见图12,排布方式参见下表:
/>
实施例9在多重其他疾病检测筛选中点阵免疫层析检测卡的设计其他疾病的标志物种类如下:
/>
如需排查上述19种其他免疫范畴的疾病标志物,检测卡的点阵排布方式及打印方式参见图13,排布方式参见下表:
实施例11在多重肿瘤疾病定量检测中点阵免疫层析检测卡的设计
例如,在排查完其中可能的几项肿瘤标志物后需进一步定量检测,检测卡的点阵分布方式、打印方式、打印参数及浓度间隔设置等,可参见下表:
/>
实施例12在多重毒品及药物筛选中点阵免疫层析检测卡的设计(胶体金法)
胶体金法检测卡的制备可参见实施例2,具体可筛选的毒品及药物如下:
例如,在排查上述毒品及药物标志物时,检测卡的点阵排布方式、打印方式、打印参数及浓度间隔设置等可参见实施例7,附图可参见图11,附图排布方式参见下表:
实施例13
本实施例以CRP、α1-1MG和β2-MG三种待测样本进行打印,其中,沿着侧向流动方向,每列代表同一种抗体,每列点阵的点位之间的间隔为500μm,在与侧向流动方向垂直的水平方向上,每行代表不同的抗体,不同抗体之间的间隔为800μm,打印的液滴大小为10nL,布局方式参见图14,其中,橙色代表CRP,红色代表β2-MG,灰色代表α1-1MG,加样后10min检测液滴,参见图15,其中,图15a代表没有抗体的拍摄画面图,图15b代表CRP、α1-1MG和β2-MG三种抗体均存在的画面图,图15c代表α1-1MG和β2-MG两种抗体存在时的画面图,图15d代表CRP和β2-MG两种抗体存在时的画面图,图15e代表CRP和α1-1MG两种抗体存在时的画面图,图15f代表只有CRP抗体存在时的画面图,图15g代表只有β2-MG抗体存在时的画面图,图15h代表只有α1-1MG抗体存在时的画面图。在放置数小时后观察,即打印液滴干涸后拍摄画面图参见图16,其中,图16a、图16b、图16c分别代表只有α1-1MG、只有β2-MG和只有CRP时的画面,而每张图从左往右有许多帧画面是随着侧向流动方向拍摄。此外,同理,图17a、图17b、图17c、图17d则分别代表α1-1MG+β2-MG、CRP+α1-1MG、CRP+β2-MG、CRP+α1-1MG+β2-MG在放置数小时干涸后沿着侧向流动方向上的拍摄画面图。
实施例14
本实施例以CRP、NGAL、α1-1MG和β2-MG四种待测样本进行打印,其中,沿着侧向流动方向,每列代表同一种抗体,每列点阵的点位之间的间隔为300μm,在与侧向流动方向垂直的水平方向上,每行代表不同的抗体,不同抗体之间的间隔为500μm,打印的液滴大小为10pL,液滴直径为60μm,布局方式参见图18,打印液滴的画面参见图19,放置数小时干涸后的画面图参见图20。
应当说明的是,上述实施例均可根据需要自由组合。以上仅是本公开的部分实施方式,应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,例如根据实际检测需求调控液滴的大小、液滴的形状、点阵之间的距离、点阵的大小、点阵的排布方式、检测卡的尺寸等,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (15)
1.一种点阵式免疫层析检测卡,其特征在于,所述点阵式免疫层析检测卡包括:底板和设于所述底板上的样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫,
其中,结合垫上含有标记抗体或抗原,反应膜上设有检测点阵,且检测点阵之间物理隔离;
其中,所述点阵式检测卡采用侧向层析的方式检测待测样本。
2.根据权利要求1所述的点阵式免疫层析检测卡,其特征在于,所述检测点阵由喷墨机构打印而成,所述喷墨机构将待打印溶液喷射到所述反应膜上,形成m×n的检测点阵,其中m、n均为整数,且1≤m≤100,1≤n≤100。
3.根据权利要求2所述的点阵式免疫层析检测卡,其特征在于,所述检测点阵在与液体流动平行的方向上设置相同的捕获抗体,在与液体流动垂直的方向上设置不同的捕获抗体。
4.根据权利要求1所述的点阵式免疫层析检测卡,其特征在于,所述检测点阵的形状为圆形或正方形,优选为圆形。
5.根据权利要求1所述的点阵式免疫层析检测卡,其特征在于,所述检测点阵包括质控点阵和测试点阵,沿着待测样本流动的方向,所述质控点阵设置在所述测试点阵下游,且所述质控点阵包括抗体或抗原,并与结合垫上的标记抗体或抗原对应。
6.根据权利要求1所述的点阵式免疫层析检测卡,其特征在于,所述样品垫、反应膜和吸水垫之间塔接,所述结合垫配置在样品垫上,且,
所述结合垫上配置有标记抗体,所述反应膜上配置有捕获抗体。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的点阵式免疫层析检测卡,其特征在于,所述检测卡被配置适用于化学发光法、胶体金法、时间分辨免疫法进行检测。
8.一种如权利要求1-7中任一项所述的点阵式免疫层析检测卡的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1、抗体的包被:称取荧光微球置于离心管中通过MSE和纯水的混合溶液离心洗涤后去上清液,向超声后的溶液中加入EDC和NHS活化微球,取活化后的溶液离心去上清液后加入MSE溶液冰浴超声,加入抗体进行标记,取标记后的上述溶液离心去上清液后加入BBS溶液冰浴超声,最后加入10%的BSA溶液进行封闭;
S2、标记物的固化:将S1中抗体包被的荧光微球通过喷金仪和固化液固化在裁剪好的玻璃纤维素膜上;
S3、点阵的打印:将预先配置好的抗体溶液加入至喷墨机构,调整打印参数,确保打印的液滴在相机频闪过程中保持在中间位置,液滴下落过程稳定,选择打印模式并设置点阵参数进行打印;
S4、检测卡的组装:将玻璃纤维素膜、吸水垫粘贴在底板上形成试纸条,将试纸条组装在检测卡的卡壳内,后进行压壳。
9.一种如权利要求1-7中任一项所述的点阵式免疫层析检测卡的应用,其特征在于,所述检测卡用于肿瘤疾病、感染性疾病、内分泌及代谢性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病、毒品及药物的定性筛选和/或定量测量。
10.根据权利要求9所述的免疫层析检测卡的应用,其特征在于,所述肿瘤疾病的标志物包括AFP、CEA、CA199、CA125、CA153、SCC、HE4、HER-2、CA242、CA724、CA50、Ferr、PGI、PGⅡ、G-17、HP、NSE、CYFRA211、ProGRP、PSA、FPSA、PAP。
11.根据权利要求9所述的免疫层析检测卡的应用,其特征在于,所述感染性疾病的标志物包括乙型肝炎病毒相关抗原抗体、丙肝抗体、梅毒特异性抗体、甲肝抗体、戊肝抗体、人类免疫缺陷病毒抗体、TORCH抗体、EB病毒抗体系列、肺炎支原体抗体、肺炎衣原体抗体、嗜肺军团菌抗体、呼吸道合胞病毒抗体、腺病毒抗体、柯萨奇病毒抗体、新型冠状病毒抗体、降钙素原、白介素-6、C-反应蛋白、淀粉样蛋白A。
12.根据权利要求9所述的免疫层析检测卡的应用,其特征在于,所述内分泌及代谢性疾病的标志物包括三碘甲状腺原氨酸、甲状腺素、游离三碘甲状腺原氨酸、游离甲状腺素、促甲状腺激素、甲状腺结合球蛋白、促甲状腺素受体抗体、甲状腺球蛋白、抗甲状腺球蛋白抗体、抗甲状腺微粒体抗体、反T3、雌二醇、雌三醇、睾酮、游离睾酮、促黄体生成素、促卵泡刺激素、泌乳素、孕酮、雄烯二酮、脱氢表雄酮及硫酸酯、血清促红细胞生成素、抗缪勒氏管激素、绒毛膜促性腺激素、促肾上腺皮质激素、皮质醇、生长激素、胰岛素样生长因子-1、性激素结合球蛋白、尿液香草扁桃酸、皮质醇、17-酮类固醇、17-羟类固醇。
13.根据权利要求9所述的免疫层析检测卡的应用,其特征在于,所述心血管疾病的标志物包括超敏肌钙蛋白T/I、氨基末端脑钠肽前体、脑钠肽、肌酸激酶同工酶MB质量、肌红蛋白、同型半胱氨酸、超敏C-反应蛋白、可溶性生长刺激基因表达蛋白2-脂蛋白相关磷脂酶A2。
14.根据权利要求9所述的免疫层析检测卡的应用,其特征在于,所述自身免疫性疾病的标志物包括抗U1-nRNP抗体、抗Sm抗体、抗SSA/Ro抗体、抗SSB/La抗体、抗Scl-70抗体、抗PM-Scl抗体、抗Jo-1抗体、抗着丝粒抗体、抗PCNA抗体、抗dsDNA抗体、抗Rib-P抗体、抗核小体抗体、抗组蛋白抗体、抗线粒体抗体及抗AMA-M2、抗平滑肌抗体、抗SLA/LP抗体、抗LC-1抗体、抗LKM抗体、抗Sp-100抗体、抗LMA抗体、抗gp210抗体、抗PR3抗体、抗MPO抗体、抗GBM抗体、抗中性粒细胞胞浆抗体、抗核抗体。
15.根据权利要求9所述的免疫层析检测卡的应用,其特征在于,所述毒品及药物包括吗啡、氯胺酮、甲基安非他明、四氢大麻酚酸、亚甲基二氧基甲基安非他明、可卡因、安非他明、苯二氮类。
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