CN118064384A - 一种裂解梨火疫病菌的噬菌体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种裂解梨火疫病菌的噬菌体及其应用，属于生物技术领域。本发明以新疆梨火疫病发生区分离获得的梨火疫病菌为宿主菌，从发病果园土壤中分离获得1株梨火疫病菌的裂解噬菌体RH‑42‑1，属于Tectiviridae科Alphatectivirus属，其保藏编号为CCTCCNO:M 2024106。该噬菌体具有特异性强，裂解谱较宽，潜伏期短、爆发时间长、爆发量大，对高温、酸碱、紫外线和有机药剂氯仿、异丙醇和过氧化氢均有一定的耐受力的优点。对梨火疫病菌具有强裂解、清除作用和较为广谱的种内裂解杀菌效果，具有防治梨火疫病的良好应用潜力。本发明为梨火疫病噬菌体杀菌剂的研发奠定了基础，为病害防治提供了新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种裂解梨火疫病菌的噬菌体及其应用。
背景技术
梨火疫病是由解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)侵染引起的对梨、苹果、山楂等蔷薇科仁果类果树具有毁灭性危害的重大国际检疫性细菌病害。病原菌通过伤口或自然孔口侵入，侵染寄主植物地上部分所有组织，包括花、嫩枝、树干、主干、果实以及砧木，流行严重时短短几周内就可以从发病的幼嫩器官扩展到主枝和主干上直至根部，可以在一到几个生长季内造成整株死亡，果园被毁，带来严重的经济损失。
梨火疫病害传播途径多，流行速度快，抗病品种缺乏，防治难度大，安全高效的防控依然是世界性的难题。目前化学防治依然是控制梨火疫病的发生和蔓延的主要措施。当前生产中针对梨火疫病防效显著的专用登记药剂品种和类型都十分有限，以抗生素和化学药剂为主，单一用药不仅防效有限，还会造成病原菌抗药性增加，果品农药残留超标和环境污染等一系列问题。
近年来国内外在关于梨火疫病生物防治的相关研究和应用中取得了一定进展。国外开发的荧光假单胞菌“Blight Ban A506”、泛菌Pantoea sp制剂“Blight BanC9-1”、枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis QST713制剂“Serenade”及BD170等生防商品制剂等均得到了一定规模的应用，部分产品的防治效果和抗生素效果相当。近些年，国内筛选获得了一批对梨火疫病菌具有较好活性的拮抗菌株，尚处于研究或中试阶段，尚未登记应用，用于生产的生防产品匮乏。针对梨火疫病菌发掘、筛选出更多的新型的生防资源，研发出安全高效的生物制剂是病害防治的重要研究方向。
烈性噬菌体是专性寄生于目标细菌并进行自我复制，可导致细菌快速裂解死亡的一类病毒，具有特异性强、增殖迅速、效价高，不易产生抗性等优点。作为植物细菌病害生物防治的一类重要资源，其所特有的杀菌特性能有效地解决对抗生素有耐药性细菌引起的侵染，利用噬菌体防治番茄青枯病(Ralstonia solanacearum)、番茄细菌性叶斑病(Pseudomonas syringaepv.tomato)、柑橘溃疡病(Xanthomonas citri subsp.citri)和马铃薯软腐病(Pectobacteriumcarotovora subsp.carotovora)都取得了良好的效果，有望成为替代抗生素的抗菌制剂的开发潜质。国外在利用噬菌体防治梨火疫病害已开展了一些研究。Akremi等发现了4株E.amylovora噬菌体PEar1、PEar2、PEar4和PEar6，将其单独或组合使用可显著减少E.amylovora的存在量，降低梨火疫病害的发生
发明内容
本发明的目的是提供一种裂解梨火疫病菌的噬菌体及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该噬菌体能高效裂解梨火疫病菌，为梨火疫病害的有效防控提供生防资源。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种裂解梨火疫病菌的噬菌体(Erwinia amylovory)RH-42-1，所述噬菌体的保藏编号为CCTCC NO:M 2024106，保藏时间为2024年1月15日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
本发明还提供一种所述的噬菌体在制备抗梨火疫病菌的生物制剂中的应用。
本发明还提供一种所述的噬菌体在制备防治梨火疫病的生物制剂中的应用。
本发明还提供一种裂解梨火疫病菌的噬菌体制剂，包含所述的噬菌体。
本发明公开了以下技术效果：
本发明在中国新疆梨火疫病发病地区分离出梨火疫病菌裂解噬菌体RH-42-1毒株，鉴定为Tectiviridae科、Alphatectivirus属，是Tectiviridae科新宿主的首次报道。该噬菌体具有特异性强，裂解谱较宽，潜伏期短、爆发时间长、爆发量大，对高温、酸碱、紫外线和有机药剂均有一定的耐受力，及稳定性好的优点。杀菌试验表明RH-42-1毒株对单个E.amylovora菌株及不同来源的E.amylovora混合菌株均具有强烈的抑制增殖和裂解杀菌作用，显著降低活菌数。该毒株的基因组中不含有毒力因子和抗生素抗性基因，具有防治梨火疫病的良好应用潜力。本发明为梨火疫病噬菌体杀菌剂的研发奠定了基础，为病害防治提供了新的思路。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为噬菌体RH-42-1在培养基上培养的噬菌斑；
图2为噬菌体RH-42-1一步生长曲线；
图3为噬菌体RH-42-1对不同温度的耐受性测定结果；
图4为噬菌体RH-42-1的酸碱稳定性测定结果；
图5为噬菌体RH-42-1对紫外线的耐受性测定结果；
图6为噬菌体RH-42-1对有机溶剂的耐受性测定结果；
图7为噬菌体RH-42-1对梨火疫病菌KER-1的杀菌效果图；
图8为噬菌体RH-42-1对梨火疫病菌混合菌株的杀菌效果图；
图9为噬菌体RH-42-1与RH-42-1联合对梨火疫病菌混合菌株的杀菌效果图；
图10为噬菌体RH-42-1在透射电镜下的形态图；
图11为噬菌体RH-42-1基因组图谱；
图12为基于噬菌体RH-42-1全基因组序列构建的系统发育树；
图13为基于噬菌体RH-42-1末端酶大亚基氨基酸序列与衣壳蛋白氨基酸的信息数据库比较构建的系统发育树；
图14为基于噬菌体RH-42-1末端酶大亚基氨基酸序列与GenBank数据库比较构建的系统发育树。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
1、实验材料
(1)供试菌株与培养基
梨火疫病菌Erwinia amylovora菌株：本实验室2016-2023年从新疆各地州果园采集具有梨火疫病典型症状的病样，通过组织分离法分离菌株，经致病性测定、鉴定及保存的14个E.amylovora菌株(表1)。
丁香假单胞菌丁香致病变种D1(Pseudomonas syringaepv.Syringae)、梨火疫病菌拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌FN12、F34、F44(Bacillus velezensis)、解淀粉芽孢杆菌FX74(Bacillus amyloliquefaciens)均由本实验室分离和保存。大肠杆菌B13(Escherichiacoli)由新疆农业大学农业微生物实验室提供。
表1供试E.amylovora菌株及来源信息
(2)培养基
营养肉汤琼脂NA固体(半)培养基(g·L-1)：牛肉膏3g·L-1、蔗糖5g·L-1、NaCl5g·L-1、蛋白胨10g·L-1、琼脂15g·L-1(6g·L-1)。营养肉汤培养基NB不添加琼脂。
(3)土壤样品
在新疆巴州库尔勒市、尉犁县等梨火疫病发生较严重的果园，于发病植株周围，清除地表枯枝落叶，采集5-15cm处的土壤样品共134份。
2、噬菌体的富集与分离
宿主菌的活化与菌液制备：将5个梨火疫病菌Ea 001、FK-1、KRL-1、TC-1、TC-2菌株在NA固体培养基上四区划线活化，分别挑取单菌落接入NB培养液中，在28℃摇床180r·min-1振荡培养24h至菌液OD600为0.8～1.0，用无菌水稀释至浓度为108CFU·mL-1，等体积混合制备混合菌液。
富集培养滤液制备：称取采集的土样20g加入50mLE.amylovora混合菌液中，充分混匀后，摇床28℃180r/min，过夜培养。将培养液10000r/min离心10min，取上清经微孔滤膜(孔径0.22um)过滤2次，获得富集液过滤液备用。
噬菌体筛选：采用双层平板法。取E.amylovora混合菌液100μL与富集液滤液按照1：1(体积分数比)混匀，静置15min后将混合液与7.5mL45℃的NA半固体培养基混合均匀，迅速倒入制备好的NA平板上。将凝固后的双层平板倒置于28℃培养箱中培养，12h观察有无噬菌斑。
3、噬菌体的纯化、浓缩及效价测定
在24h内挑取单个噬菌斑于1mL SM缓冲液(100mM NaCl，8mM MgSO4和100mM Tris-HCl)中，捣碎斑块后用漩涡仪震荡。用微孔滤膜(孔径0.22μm)过滤两次后，用SM缓冲液依次进行10倍稀释，取100μL稀释噬菌体液与100μL宿主菌液混合，摇床振荡培养15min，倾倒双层平板，28℃于恒温箱中倒置培养。重复此操作3-5次，直至噬菌斑形态大小均匀一致。挑取纯化后的噬菌斑置于含有1mL宿主菌菌液的100mLNB培养液中，于28℃下180r/min振荡培养12h，8000r/min离心10min。取上清液过滤，获得噬菌体纯化液。在噬菌体纯化液中加入固体PEG8000至终浓度100g/L，充分振荡溶解后冰浴3h以上，使噬菌体颗粒充分沉淀，4℃下10000r/min离心10min，弃上清液。向沉淀中加入2mL SM缓冲液重悬沉淀，微孔滤膜(孔径0.22μm)过滤重悬液，即获得噬菌体浓缩液。
噬菌体效价：用NB培养液倍比稀释扩增后的噬菌体液，各取100μL噬菌体稀释液和宿主菌液充分混匀后，室温下孵育15min，制作双层平板，过夜培养后观察计数双层平板法上的噬菌斑。
噬菌体效价(PFU/mL)＝噬菌斑个数×稀释倍数×10
4、噬菌体的生物学特性测定
4.1噬菌体最佳感染复数(MOI值)测定
将活化后的宿主菌培养至对数初期(OD600＝0.2～0.3)，将不同稀释浓度的噬菌体按照不同的感染复数(MOI＝噬菌体数量/细菌数量，MOI分别为100、10、1、0.1、0.01和0.001)与等体积的宿主菌液混合，室温孵育15min，28℃、180r/min摇床培养9h，用双层平板法检测噬菌斑数量，重复3次，计算不同感染复数条件下的噬菌体效价。
4.2一步生长曲线测定
将培养至生长对数初期(OD600≈0.2～0.3，浓度2.05×107CFU/mL)的宿主菌菌液，10000r/min离心2min，弃上清，重复2次。以最佳感染复数的比例添加噬菌体稀释液，充分混匀于室温下孵育10min，离心弃上清除去游离的噬菌体。用10mLNB培养液重悬沉淀，28℃180r·min-1摇床震荡，每10min取400μL，从0时刻起，每10min取样1次，连续120min，利用双层平板法检测噬菌体的效价，计算噬菌体裂解量，将所得结果绘制曲线图。
噬菌体裂解量＝爆发末期噬菌体的效价/感染初期宿主菌浓度
4.3噬菌体的裂解谱测定
采用斑点法测定噬菌体的裂解谱。将14个梨火疫病菌株、1个大肠杆菌菌株、1个丁香假单胞菌菌株，以及4个梨火疫病菌拮抗芽孢细菌菌株，活化后分别挑取单菌落接入NB培养液中，在28℃摇床180r·min-1振荡培养24h至菌液OD600为0.8～1.0，用无菌水稀释至浓度为108CFU·mL-1。分别取待测细菌宿主菌液100μL与7.5mLNA半固体培养基混合均匀倾倒于NA固体培养基平板上制作双层平板，待上层培养基凝固后划分8个区，分别将10μL的8个不同稀释浓度的噬菌体液(100-10-7)点接在双层平板的不同分区上，28℃培养过夜，观察是否有噬菌斑的形成。
4.4噬菌体对温度、PH、紫外线和有机溶剂的敏感性测定
噬菌体对温度的敏感性测定：将1mL噬菌体液(109PFU/mL)分别置于4℃、28℃、37℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃和70℃的水浴锅内处理，分别于0、15、30、45和60min时取样，将处理后的噬菌体液与等体积梨火疫菌液混合均匀，测定噬菌体效价。
噬菌体对pH的敏感性测定：将噬菌体液(109PFU/mL)按体积分数比1:9分别加入pH值分别为3、4、5、6、7、8、9、10、11的NB培养液中，充分混匀后置于28℃、180r/min培养2h，将处理后的噬菌体液与等体积梨火疫菌液混合均匀，测定噬菌体效价。
噬菌体对紫外线的敏感性测定：取15mL噬菌体液(109PFU/mL)于90mm无菌平皿中，置于紫外灯(功率30W)下30cm处照射30、60、90、120、150、180min，将处理后的噬菌体液与等体积梨火疫菌液混合均匀，测定噬菌体效价。
噬菌体对有机溶剂的敏感性测定：在噬菌体液(109PFU/mL)加入99％氯仿(CHCl3)、99.7％异丙醇(C3H8O)、20％双氧水(H2O2)和99.5％乙醇(CH3CH2OH)至终浓度分别为5％、5％、3％和75％于28℃培养12h，将处理后的噬菌体液与等体积梨火疫菌液混合均匀，测定噬菌体效价。
上述每个处理重复3次。
5、噬菌体对E.amylovora的杀菌效果测定
参照1.2的方法分别制备梨火疫病菌单菌株(E.a KER-1)和混合菌株(Ea 001、FK-1、KRL-1、TC-1、TC-2)菌悬液，将浓度调整至107CFU/mL。按照感染复数(MOI)100、10、1、0.1、0.01、0.001分别加入RH-42-1噬菌体悬液和RH-42-1+RH-42-2(本实验室分离的另一株梨火疫病菌噬菌体，2个毒株按照1:1体积比混合)混合噬菌体悬液，以加入等量的NB培养液为对照，每个处理重复3次。
在28℃、80r/min振荡培养180～300min。每15～30min取样一次，测定E.amylovoraKER-1与噬菌体共培养液中的残余活菌数，计算杀菌率。
杀菌率％＝(不加噬菌体的梨火疫病菌对照组培养液中的活菌数-加入噬菌体与梨火疫病菌共培养处理组的活菌数)/不加噬菌体的梨火疫病菌对照组培养液中的活菌数×100。
6、噬菌体的电镜观察
将噬菌体增殖液用0.22μm细菌滤器除菌，采用磷钨酸负染色后在透射电镜(HITACHI,HT7800)下观察并拍照，采用Image-pro plus 6.0(Media Cybernetics,Inc.,Rockville,MD,USA)软件分析其大小。
7、噬菌体RH-42-1的全基因组测序分析
对噬菌体RH-42-1进行扩增和浓缩，按照Magen生物噬菌体DNA小量提取试剂盒(HiPure Lambda Mini Kit，广州，美基生物)提取噬菌体DNA，经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，送至上海派森诺公司采用全基因组鸟枪法(Whole Genome Shotgun,WGS)策略，构建不同插入片段的文库，利用第二代测序技术(Next-Generation Sequencing,NGS)，基于ILLuminaNovaSeq测序平台进行全基因组测序。
采用A5-MiSeq(v20160825)和SPAdes(v3.12.0)进行基因组序列拼接，使用Pilon(v1.18)软件进行校正得到最终的病毒基因组序列，采用GeneMarkS(v4.2)软件对基因组的蛋白质编码基因进行预测，diamond(v0.8.36)软件对蛋白质编码基因进行序列比对、功能注释等。采用cgview绘制基因组圈图。
将全基因组序列和噬菌体末端酶大亚基、衣壳蛋白氨基酸序列与GenBank数据库比对，选取同源性较高的序列用MEGA11.0软件以邻接(Neighbor-Joining)构建系统发育树。
8、结果与分析
8.1梨火疫病菌噬菌体的分离与纯化
从新疆巴州库尔勒市、尉犁县等梨火疫病发生较严重的果园采集的134份土壤样品中，22个样品通过富集培养，在双层平板10-12h培养后可在E.amylovora的菌苔上观察到有大小不同的噬菌斑逐渐出现。2个样品的噬菌斑较大而清晰，12个样品的噬菌斑为小针点状，8个样品的噬菌斑为围绕菌落周围的小晕圈状。对噬菌斑经过反复纯化，最终从2个较大而清晰的噬菌斑中得到2株噬菌体，其产生的噬菌斑圆形透明、边缘光滑、无晕环、大小均匀。其中噬菌斑较大的1个直径为3.29±0.02mm(见图1)，效价为9.6×109PFU/mL，扩增培养后稳定性良好，将其命名为RH-42-1。
噬菌体RH-42-1已于2024年1月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M 2024106，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
8.2噬菌体RH-42-1的最佳感染复数(MOI值)
通过将不同比例的噬菌体与宿主菌共培养，测定其感染复数，结果如表2所示。当MOI值为1时，噬菌体RH42-1感染宿主后产生子代噬菌体的效价最高为9.6×109PFU/mL，因此确定该噬菌体的最佳感染复数为1。
表2噬菌体RH-42-1的最佳感染复数测定结果
8.3噬菌体RH-42-1的一步生长曲线
噬菌体RH-42-1一步生长曲线的测定结果如图2所示。在其侵染宿主菌10min内，数量保持不变处于潜伏状态。在侵染20-100min内，噬菌体RH-42-1数量急剧增长，进入爆发裂解期，爆发时间为80min，爆发量为2.07×102PFU/cell；侵染100min后，噬菌体数量趋于稳定，效价稳定在109PFU/mL左右。
8.4噬菌体RH-42-1的裂解谱
检测噬菌体RH-42-1的裂解宿主菌的范围，结果如表3所示。噬菌体RH42-1可裂解5个不同来源、不同寄主的菌株FK-1、KEL-1、KEL-2、TC-1、TC-2。对大肠杆菌、丁香假单胞菌及4个梨火疫病菌拮抗芽孢细菌菌株均不能裂解。
表3噬菌体RH-42-1的裂解范围测定
注：“+”表示可被噬菌体裂解，“-”表示不可被裂解。
8.5噬菌体RH-42-1的耐受性
8.5.1对温度的耐受性
在不同温度作用下噬菌体RH-42-1的裂解能力如图3所示。温度≦45℃时，RH-42-1均可保持较高的活性，处理0-60min内效价基本维持不变。温度≧55℃时，RH-42-1活性开始降低，效价随着处理时间的增加而减少；60℃处理60min，效价维持在7.29×104PFU/mL；温度≧65℃时，效价急剧下降，处理60min时效价减少了7个数量级；温度为70℃时，处理15min时彻底失去活性。
8.5.2对pH的耐受性
噬菌体RH-42-1在不同pH值下的效价如图4所示。在pH值5-9的范围内，RH-42-1可以保持较高活性，效价较稳定，其中pH为7时，噬菌体效价最高(9.6×109PFU/mL)。在此范围以外，效价开始降低。pH 3-4时，噬菌体效价下降4-6个数量级；pH10-11时，噬菌体效价下降2-3个数量级，仍能维持较高活性，表现出较强的耐碱特性。
8.5.3对紫外线的耐受性
噬菌体RH-42-1随着紫外线照射时间的延长，其效价逐渐下降。连续照射60min后，下降约2个数量级；150min后下降约7个数量级；180min后彻底失活(见图5)。结果表明，噬菌体RH-42-1对60min的紫外线照射有一定的耐受性。
8.5.4对有机溶剂的耐受性
如图6所示，测定结果表明：5％CHCl3、5％C3H8O、3％H2O2处理对噬菌体的裂解能力影响不大，在12小时内噬菌体效价降低约1个数量级，表明其耐受性较强，处理后仍能保持较高的活性。而75％CH3CH2OH对噬菌体的影响较大，可使其裂解效价降低约4个数量级。
8.6噬菌体RH-42-1对梨火疫病菌的体外杀菌效果
分别在梨火疫病菌单个菌株E.a KER-1及5个混合菌株(E.a 001、FK-1、KRL-1、TC-1、TC-2)的菌悬液中加入RH-42-1噬菌体悬液，测定在不同感染复数共培养下噬菌体的杀菌效果。结果可知，不加RH-42-1噬菌体的梨火疫病菌培养液在15min(单菌株)vs 60min(混合菌株)即进入快速增殖的对数期，且一直持续到210min(单菌株)vs 360min(混合菌株)以后。而加入RH-42-1噬菌体能显著降低活菌数，具有强烈抑梨火疫病菌增殖和裂解杀菌作用。MOI不同，噬菌体的杀菌作用有一定差异。RH-42-1噬菌体对梨火疫病菌单个菌株E.aKER-1的杀菌试验中(见图7)，在MOI分别为100、10、1、0.1、0.01和0.001时，均表现为共培养90～105min开始宿主活菌数开始降低，对数生长被抑制进入迟滞生长，宿主菌活菌数迅速下降，至180min时，杀菌率均达到99.99％以上，且随着时间的推移活菌数不再增长。
RH-42-1噬菌体对梨火疫病菌混合菌株的杀菌试验中(见图8)，MOI为100、10、1时杀菌效果最佳，共培养120min后宿主活菌数开始降低，至300min时杀菌率均在99.9％以上；MOI为0.1、0.01时，杀菌率均为99.7％。
8.7本发明中梨火疫病菌噬菌体RH-42-1可以单独或与其他梨火疫病菌噬菌体混合使用，对梨火疫病菌混合菌株具有更好的杀菌效果。将噬菌体RH-42-1与RH-42-1混合液加入到梨火疫病菌混合菌株的菌液中共培养，MOI＝100、10时，在90min'时即迅速裂解梨火疫病菌，活菌数快速下降；MOI＝1、0.1、0.01、0.001，150min时梨火疫病菌活菌数开始明显下降。至300min时，杀菌率均可达到99.99％以上。见图9。
8.8噬菌体RH-42-1的电镜观察
如图10所示，其为透射电镜观察形态，噬菌体RH-42-1为短尾蝌蚪形，具有清晰的二十面体头部直径为69.44±1.96nm，尾部长为21.13±3.30nm，不收缩。
8.9噬菌体RH-42-1基因组测序及分析
对噬菌体RH-42-1的全基因组进行测序和比较基因组分析。结果表明，噬菌体RH-42-1的基因组是一条线性双链DNA分子，基因组大小为14942bp，GC含量为48.19％(登录号：PP099880)，基因组图谱见图11。预测噬菌体RH-42-1基因组含有28个开放阅读框(openreading frame,ORF)，其中25个ORF的功能已被注释，编码噬菌体结构蛋白、DNA复制和调控蛋白、穿孔素和内溶素等存在。具有与裂解细菌相关的holin-lysin系统(包括内溶素Endolysin，登录号YP_338008.1)和穿孔素(holin，登录号AAX45661.1)；有3个ORF的功能被注释为假定蛋白(hypothetical protein)(见表4)。其基因组中不含抗生素抗性基因和毒力因子相关基因，不会造成跨物种的基因转移，具有适合安全应用的价值。
表4噬菌体RH-42-1的ORF功能预测
噬菌体RH-42-1的全基因组序列与GenBank数据库比较，基于全基因组序列构建系统发育树(见图12)显示，该噬菌体与复层病毒科(Tectiviridae)的噬菌体聚在一起，同时与Tectiviridae、Alphatectivirus属的肠杆菌科噬菌体5个噬菌体PR3(AY848685.1)、L17(AY848684.1)、PRD1(NC001421.2)、伯克霍尔德氏噬菌体Burkholderia phage vB_Bco-CSP1(OQ674210.1)和噬菌体PR4(NC 007451.1)的基因组有较高的同源性(95.34％～97.55％)处于同一个进化分支上，具有共同的进化起源。
进一步将噬菌体RH-42-1保守蛋白功能基因噬菌体末端酶大亚基(terminaselarge subunit)和衣壳蛋白氨基酸的信息(major capsid protein)与GenBank数据库比较。噬菌体RH-42-1的末端酶大亚基氨基酸序列与数据库中5株噬菌体的同源性较高(98.24％-99.56％)，衣壳蛋白氨基酸序列与数据库中4株噬菌体的同源性较高(99.49％-99.56％)。选取相似性高的噬菌体构建系统发育树(见图13，图14)，结果均表明噬菌体RH-42-1与Tectiviridae噬菌体聚在一个大的分支上，又与Alphatectivirus分布在同一个小的分支上，其中与Enterobacteria phage PRD1(NC 001421.2)的亲缘关系最近。
综上结果，将噬菌体RH-42-1鉴定为Tectiviridae科Alphatectivirus属。目前已报道的梨火疫病菌噬菌体有短尾病毒科(Podoviridae)、肌尾病毒科(Myoviridae)、丝状噬菌体科(Inoviridae)等。而已报道的Tectiviridae科噬菌体宿主有假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、芽孢杆菌(Bacillus)、链霉菌(Streptomyces)及葡萄糖杆菌(Gluconobacter)等，未有侵染梨火疫病菌(E.amylovora)的相关报道，本发明分离获得的噬菌体RH-42-1是梨火疫病菌作为Tectiviridae科噬菌体宿主菌的首次发现。
从上述实施例可以看出：以新疆梨火疫病发生区分离获得的梨火疫病菌为宿主菌，从发病果园采集土壤样品，采用双层平板法分离噬菌体，获得1株梨火疫病菌的裂解噬菌体RH-42-1，在E.amylovora的菌苔上可形成直径3.29±0.02mm透亮均匀的噬菌斑。对噬菌体RH-42-1的裂解谱、最佳感染复数、一步生长曲线，对热、酸碱稳定性及对紫外线和化学药剂的敏感性等生物学特性进行测定。结果表明，该噬菌体能裂解不同来源、不同寄主的5个E.amylovora菌株，而对大肠杆菌、丁香假单胞菌及梨火疫病菌拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌菌株均不能裂解，具有极强的宿主专一性；最佳感染复数(MOI)为1，噬菌体效价可达9.6×109PFU/mL；潜伏期为10min，爆发期为80min，裂解量为207PFU/cell，属于潜伏期短，爆发时间长、裂解量大的噬菌体，表明该噬菌体复制活性强，能在短时间内入侵并裂解杀死宿主菌。RH-42-1对60℃以下的温度具有一定的耐受性，超过60℃开始急剧失活。在pH 5～9的环境中效价稳定，对碱性环境(pH 10～11)表现出较强的耐性，在酸性环境下(pH 3～4)活性下降。对紫外线有一定的耐受性，在0-60min紫外线持续照射下可保持较高活性，连续照射180min后失活；对氯仿、异丙醇和3％H2O2不敏感，但对75％乙醇敏感。噬菌体RH-42-1对E.amylovora KEL-1菌株具有强烈的抑制增殖和裂解杀菌作用，能显著降低活菌数，且能同时裂解不同来源的E.amylovora混合菌株；噬菌体与梨火疫病菌单菌株MOI为100、10、1、0.1、0.01和0.001共培养状态下作用180min，杀菌率均在99.99％以上；噬菌体与梨火疫病菌混合菌株在MOI为100、10、1、0.1、0.01共培养下，杀菌率均在99.7％以上，且随着时间的推移活菌数不再增长。通过透射电镜观察RH-42-1形态特征，为短尾不可收缩蝌蚪形，二十面体头部直径为69.44±1.96nm，尾部长21.13±3.30nm(n＝15)。对RH-42-1噬菌体进行全基因组测序分析，其基因组核酸为dsDNA，基因组大小为14942bp，GC含量为48.19％，预测有28个开放阅读框，含有holin-lysin裂解系统，不含抗生素抗性基因和毒力因子相关基因。通过形态观察、全基因组和末端酶大亚基和衣壳蛋白氨基酸序列分析，将该噬菌体鉴定为Tectiviridae科Alphatectivirus属，与前人报道的梨火疫病菌噬菌体的种类不同，也是梨火疫病菌作为Tectiviridae科Alphatectivirus属噬菌体宿主菌的首次发现。
本发明RH-42-1噬菌体对梨火疫病菌具有高效、较为广谱的种内裂解杀菌作用，对梨火疫病菌单个菌株及不同来源的混合菌株的杀菌率都在99.7％以上，且稳定性较好，对梨火疫病具有良好的生防潜力。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (4)
1.一种裂解梨火疫病菌的噬菌体(Erwinia amylovory)，其特征在于，所述噬菌体的保藏编号为CCTCC NO:M 2024106。
2.一种如权利要求1所述的噬菌体在制备抗梨火疫病菌的生物制剂中的应用。
3.一种如权利要求1所述的噬菌体在制备防治梨火疫病的生物制剂中的应用。
4.一种裂解梨火疫病菌的噬菌体制剂，其特征在于，包含权利要求1所述的噬菌体。
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