CN118064342A

CN118064342A - 一种以葡萄糖为碳源合成2′-岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其应用

Info

Publication number: CN118064342A
Application number: CN202410264731.0A
Authority: CN
Inventors: 李珮铷; 张少伦; 李超
Original assignee: Tianyi Health Science Research Institute Zhenjiang Co ltd
Current assignee: Tianyi Health Science Research Institute Zhenjiang Co ltd
Priority date: 2024-03-08
Filing date: 2024-03-08
Publication date: 2024-05-24

Abstract

本发明公开了一种以葡萄糖为碳源合成2′‑岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其应用。所述基因工程菌是以大肠杆菌为出发菌株，敲除lacZ和wcaJ基因，并且过表达manA、manB‑manC、gmd‑fcl、futC、zwf、putAB、rcsA和lacY基因。与现有技术相比，本发明提供了一种生物合成2'‑FL的新方法，经济，科学，成本较低，工艺简单和具有大规模生成意义。此外，本发明优化了发酵条件，使用葡萄糖作为碳源，设置特定乳糖浓度和IPTG浓度，优化的M9培养基使产量显著提高。与传统化学合成法、酶合成法、全细胞合成法相比，显著节约时间，产量显著提高。

Description

一种以葡萄糖为碳源合成2′-岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其应用

技术领域

本发明属于2′-岩藻糖基乳糖合成技术领域，尤其涉及一种以葡萄糖为碳源合成2′-岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其应用。

背景技术

母乳通常被认为是婴儿最重要的营养来源，具有唯一的活性功能，对婴儿健康十分重要。研究发现，母乳喂养的新生儿比母乳喂养的婴儿患胃酸、急性耳鸣和其他免疫系统疾病的比率要低得多。而且未来在智商发育上也会占据很大的优势，母乳喂养患上肥胖症和糖尿病的可能性比非母乳喂养的可能性小得多。作为母乳中第三种最丰富的固体成分(5-15g/L)，母乳寡糖(HMOs)在母乳喂养的肠道菌群的发育中起着关键作用，并预防病原体粘附于上皮细胞。岩藻糖基化的HMO，包括2'-岩藻糖基乳糖(2'-FL)，3'-岩藻糖基乳糖(3'-FL)，乳酸-N-岩藻五糖和乳糖-N-二岩藻糖，可以选择性地刺激双歧杆菌的生长并形成致病菌受体的类似物，从而保护婴儿免受肠道病原体的感染。在岩藻糖基化的HMO中，2'-FL和3'-FL最丰富，可作为细菌或病毒粘附于上皮细胞的有效抑制剂。此外，含有2'-FL或3'-FL的婴儿营养物可能会减少腹泻的频率。大多数HMOs包含3-6个糖基，以乳糖或唾液酸结尾，这可以分3类，包括集中化修饰的中性HMos(35％-50％)，酸性HMos包含唾液酸及其硫酸盐(12％-14％)，和非集中化中性HMos(42％-55％)。2'-focusyllactose(2'-FL)含量最高，接近总HMO的30％，在母乳中的浓度为0.5-2.0g/L。因此，这些功能性糖由于其在营养保健和药物用途中的潜在应用而受到了极大的关注。2'-FL的研究合成对HMO的工业化应用相当重要，特别是寻找到高效率、低生产成本、绿色环保的合成路线。2'-FL可以通过人乳分离或化学合成来生产。然而，人乳的来源有限以及化学合成过程中对侧基保护和脱保护的严格要求限制了生产并增加了成本。

几年前，丹麦公司宣布了一种2'-FL的化学合成方法。首先，以乳糖为原料，经过两阶段化学反应后，反应时间约为8小时，形成乳糖受体，收率为52％。其次，以L-岩藻糖为原始基质，三阶段化学反应后，反应时间约24小时，生成岩藻糖基供体，收率为67％-72％。乳酸受体和岩藻糖给药在三阶段化学反应后重新排列，响应时间约为192小时，以施用反射性2'-FL混合物。最后，分离混合物，经过脱盐、变色和清洗后，2'-FL的纯度较高，收率为19.8％-27.3％。化学合成方法具有对产品生产有用的优点和高纯度，但存在成本和安全问题，例如工艺步骤庞大，反应高，产品产量低，以及在制造过程中使用许多有机基质，这限制了该方法的大规模应用。而酶合成仍处于探索阶段。目前在实验中常用的酶有两种:a-1,2-聚焦转移酶和a-l-岩藻糖苷酶。与传统工艺相比，2'-FL酶合成工艺响应条件可控，响应时间短，产品组成简单，易于清洗。优势大，具有良好的发展前景。但是在生产2'-FL的过程中，由于原料的成本较高，因此很难实现2'-FL的批量生产。为了降低生产成本，以相对便宜的gdp-d-甘露糖为起始原料，形成2'-FL产率为65％。2'-FL全细胞的形成通过微生物代谢在细胞内和外部发生在碳供体成为GDP-岩藻糖后，它通过FUT2进入乳糖细胞2'-FL成形法，合成时间通常要达到80小时左右。

综上，化学合成方法虽然具有便于生产测量和产品纯度高等优点，但是存在工艺步骤繁琐，反应要达到的要求高，合成产品时收率低，以及在制造过程中使用多种有机底物等成本和安全问题，这限制了研究人乳糖的方法的大规模应用。酶合成法在生产2'-FL的过程中，由于原料的成本较高，并且该工艺还会产生无法在食品领域应用应的产物pNP,,同时生产成本较高因此很难实现2'-FL的批量生产。全细胞合成法岩藻糖作为初始底物对细菌体的代谢作用较小，使得2'-FL产量提高难度更高，而且原料价格较高，生产成本较高，缺乏实用价值。同时FUT2在细胞中的活性和GDP-细胞中岩藻糖的浓度，细胞中乳糖的浓度和副产品对酶抑制都是影响2'-FL全细胞生产中的关键因素。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种以葡萄糖为碳源合成2′-岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其应用。利用所述基因工程菌合成2′-岩藻糖基乳糖，该方法经济，科学，成本较低，工艺简单和具有大规模生成意义，为直接从微生物中合成2'-FL提供了最合理的方法。

技术方案：为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种以葡萄糖为碳源合成2′-岩藻糖基乳糖的基因工程菌，所述基因工程菌是以大肠杆菌为出发菌株，敲除lacZ和wcaJ基因，并且过表达manA、manB-manC、gmd-fcl、futC、zwf、putAB、rcsA和lacY基因。

作为具体实施方案，所述manB-manC和gmd-fcl基因通过克隆至pETDuet-1载体上构建过表达载体，然后转入敲除lacZ和wcaJ基因后的大肠杆菌中进行表达。

作为具体实施方案，所述manA和rcsA基因通过克隆至pACYCDuet-1载体上构建过表达载体，然后转入敲除lacZ和wcaJ基因后的大肠杆菌中进行表达。

作为具体实施方案，所述futC和lacY基因通过克隆至pCDFDuet-1载体上构建过表达载体，然后转入敲除lacZ和wcaJ基因后的大肠杆菌中进行表达。

作为具体实施方案，所述zwf和pntAB基因通过克隆至pCOLADuet-1载体上建过表达载体，然后转入敲除lacZ和wcaJ基因后的大肠杆菌中进行表达。

作为具体实施方案，所述manA、manB-manC、gmd-fcl、futC、zwf、putAB、rcsA和lacY基因的核苷酸序列依序如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；所述lacZ和wcaJ基因核苷酸序列依序如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

作为具体实施方案，所述大肠杆菌选自大肠杆菌BL21。

本发明还提供了上述基因工程菌在以葡萄糖为碳源合成2′-岩藻糖基乳糖中的应用。

本发明最后提供了一种以葡萄糖为碳源合成2′-岩藻糖基乳糖的方法，包括对上述基因工程菌进行培养，然后将培养物接种到含有葡萄糖的培养基中进行培养，诱导，最后加入乳糖合成2′-岩藻糖基乳糖。

作为具体实施方案，所述将培养物接种到含有葡萄糖的培养基中进行培养，所述培养物的接种量为0.5-5％(体积比)，所述葡萄糖的浓度为30-40g/L；所述培养基为添加了90-110μg/mL氨苄青霉素Amp、30-40μg/mL氯霉素CMR、40-60μg/mL卡那霉素Kana和40-60μg/mL链霉素SMR的LB培养基或改良M9培养基；所述诱导采用0.1-0.3mM IPTG进行诱导；所述乳糖的加入量为8-16g/L。

所述改良M9培养基包括：12-14g/L Na₂HPO₄·7H₂O，2-4g/L KH₂PO₄，1-3g/LNH₄Cl，0.1-1g/L NaCl，0.1-0.4g/L MgSO₄·7H₂O，13-16mg/L CaCl₂·2H₂O，9-11mg/L硫胺素，1-3g/L酵母提取物，0.05-0.2％(v/v)Triton-X100和0.5-1.5mL/L微量金属储备液。微量金属原液包含22-28g/L FeCl₃·6H₂O，1-3g/L CaCl₂·2H₂O，1-3g/L ZnCl₂、1-3g/L Na₂MoO₄·2H₂O，1.5-2.5g/L CuSO₄·5H₂O和0.2-0.8g/LH₃BO₃，pH7.0-7.5，灭菌后冷却后向溶液中补充90-110μg/mL氨苄青霉素，30-40μg/mL氯霉素，40-60μg/mL卡那霉素和40-60μg/mL链霉素。

作为优选方案，将所述基因工程菌菌株接种到LB培养基中。当菌株达到固定相时，将1mL培养物接种到100mL含有36g/L葡萄糖作为碳源的LB培养基或改良M9培养基中，以便在500mL摇瓶中生长。当OD600达到约0.6时，添加0.2mM IPTG以在25℃诱导。再培养2小时和10小时后，分别添加12g/L乳糖以生产2'-FL。

制备改良M9培养基：12.8g/L Na₂HPO₄·7H₂O，3g/L KH₂PO₄，2g/LNH₄Cl，0.5g/LNaCl，0.25g/L MgSO₄·7H₂O，14.7mg/L CaCl₂·2H₂O，10mg/L硫胺素，2g/L酵母提取物，0.1％(v/v)Triton-X100和1mL/L微量金属储备液。微量金属原液包含25g/L FeCl₃·6H₂O，2g/L CaCl₂·2H₂O，2g/L ZnCl₂、2g/L Na₂MoO₄·2H₂O，1.9g/L CuSO₄·5H₂O和0.5g/L H₃BO₃，pH7.2。灭菌后冷却到115℃后向溶液中补充100μg/mL氨苄青霉素，34μg/mL氯霉素，50μg/mL卡那霉素和50μg/mL链霉素。

有益效果：与现有技术相比，本发明提供了一种生物合成2'-FL的新方法，将manA，manB-manC，gmd-fcl，futC，zwf，putAB，rcsA，lacY八个基因克隆至四个不同的表达载体上，再将构建的过表达载体转入到BL21(DE3)感受态细胞中。本发明优化了发酵条件使用葡萄糖作为碳源，设置特定乳糖浓度和IPTG浓度，向以葡萄糖为碳源的LB培养基中添加0.2mMIPTG可获得最高的FL效价：9.24g/L 2'-FL。此外，补充了各种浓度的IPTG，当IPTG浓度从0.1mM增加到0.2mM时，使用含葡萄糖的改良M9培养基可获得最高滴度，为12.16g/L 2'-FL，优化的M9培养基使产量提高31.6％。

附图说明

图1为利用本发明所述基因工程菌合成2′-岩藻糖基乳糖的原理；

图2为本发明pETDuet-1载体图谱；

图3为本发明pCOLADuet-1载体图谱；

图4为本发明pCDFDuet-1载体图谱；

图5为本发明pACYCDuet-1载体图谱；

图6为本发明pCas载体图谱；

图7为本发明pTarget载体图谱；

图8为本发明胞内多糖LC-MS检测结果；

图9为本发明胞外多糖LC-MS检测结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

下述实验中所用引物信息如下：

manC-manB-F：CATACCATGGCGCAGTCGAAACTCTATCCAG

manC-manB-R：CCCAAGCTTTGGGGTAAGGGAAGATCCGAC

gmd-fcl-F：CGCGGCCGGCCTCAAAAGTCGCTCTCATCACC

gmd-fcl-R：CCGCTCGAGTTCCTGACGTAAAAACATCATT

manA-F：GAATTCATATGCAAAAACTCATT

manA-R：GGAAGATCTTACAGCTTGTTG

futC-F：CCGCCATGGCTTTTAAGGTGGTG

futC-R：ACAAGGATCCTTAAGCGTTATACTTTTGGG

rcsA-F：GGAAGATCTGAGGGTATGCCATGTC

rcsA-R：CATGGTACCTTAGCGCATGTTGACA

zwf-F：ATACCATGGCGGTAACGCAAACAGC

zwf-R：GCCTGGATCCTTACTCAAACTCATTCCAG

pntAB-F：ATAAGATCTGGAAGGGAATATCATGC

pntAB-R：ATAGGTACCTTACAGAGCTTTCAGGATTG

Cas9-F：ACGCGGATCCATGGATAAGAAATACTCAATAGGC

Cas9-R：ACCGCTCGAGGTCACCTCCTAGCTGACTCA

lacY-F：GAAAGATCTTATGTACTATTTAAAAAACACAAAC

lacY-R：ATTGGTACCTTAAGCGACTTCATTCAC

LacZ-target：

TCCTAGGTATAATACTAGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGTTTTAGAGCTA

GAAATAGC

ΔlacZ-F：TTGTGTGGAATTGTGAGCGGAT

ΔlacZ-R：AGGGGGATGTGCTGCAAGGCGA

LacZ-HR-F：

TTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGGATTCACTGGCAAAACC

LacZ-HR-R：

GGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTGCCAGTGAATCCG

wcaJ-F：TCATGTTTGCCGGACTATGG

wcaJ-R：AACACCGCGCCATGAGCGAT

wcaJ-target：

GGATCCTTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGTTCATGTTTGCCGGACTATGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGAATTCTCTAGAGTCGACCTGCAG

ΔwcaJ-F：CGCGAGCGAGCGAAAACCAA

ΔwcaJ-R：AATCAGCGCCACCAACAGGT

wcaJ-HR：

AAACCAATGCATCGTTAATCTCTATGGTGCAACGCTTTTCAGATACTG GTTTGCGAAGT

wcaJ-HR：

CCAACAGGTGCATGTAGAGGAATGACAGTCCGCTGACTTCGCAAACCAGTATCTGAAAAGC

实施例

Ⅰ、大肠杆菌MG1655的基因组DNA的提取

(1)收集过夜培养的大肠杆菌MG1655的菌液至1.5ml离心管内，12000rpm离心30s；

(2)去上清后将菌体充分悬浮于500μL裂解液中；

(3)加入15μLproteinaseK混匀后37℃恒温水浴1h；

(4)加入200ulNaCL颠倒混匀30s，冰浴10min后12000rpm离心30s；

(5)小心的吸出上清液后加入2倍体积无水乙醇颠倒混匀，12000rpm离心5min；

(6)弃上清后将沉淀充分悬浮于300μL无菌水中，加入15μLRNaseA混匀后37℃恒温水浴1h；

(7)加入200μL饱和酚和200μL四氯甲烷，震荡混匀后12000rpm离心1min；

(8)收集上清至1.5ml离心管中加入2倍体积无水乙醇颠倒混匀后12000rpm离心2min；

(9)弃上清后加入500μL，70％乙醇吹打洗涤后弃乙醇，沉淀于室温晾干；

(10)晾干后溶于200μL无菌水中，放置-20℃备用。

Ⅱ、2’-FL合成通路相关基因克隆

根据合成通路选择了manC-manB，gmd-fcl克隆至pETDuet-1载体上；manA，rcsA克隆至pACYCDuet-1载体上；futC，lacY克隆至pCDFDuet-1载体上；zwf，pntAB克隆至pCOLADuet-1载体上作为过表达载体。

PCR体系如下(20μl)：

PCR扩增采用提取的大肠杆菌MG1655基因组为模板。设定程序：94℃5min；94℃30s，TM值30s，72℃Xmin，35cycles，72℃5min。(X根据每队引物产物大小而定，一般500bp为30s，以此类推)，以2000/5000maker作参照进行琼脂糖凝胶电泳检测产物条带的正确性后回收PCR产物，将未纯化的PCR产物进行测序比对，测序结果无误进行后续步骤。

Ⅲ、基因片段及载体双酶切

将扩增出目的条带的PCR回收产物和pETDuet-1；pACYCDuet-1；pCDFDuet-1；pCOLADuet-1载体分别用限制性内切酶进行双酶切，设置PCR反应程序为：37℃30min；65℃5min。双酶切体系如下：

Ⅳ、基因的敲除

利用CRISPR/Cas9系统的敲除原理，将购买的pCas质粒转入制备好的大肠杆菌感受态细胞中，设计了两个敲除基因lacZ和wcaJ对应的序列插入pTarget载体中，最后通过融合将两个敲除基因的重组模板片段经过PCR回收后与构建好的pTarget载体共同转入至将pCas质粒转入后的大肠杆菌感受态细胞中。载体构建方法同上，融合体系如下：

PCR扩增设定程序：95℃2min；(95℃10s，50℃15s，72℃30s)30cycle，72℃10min。Ⅴ、基因片段及载体连接和转化

制备好BL21(DE3)的感受态细胞后，将双酶切片段与载体跑胶回收纯化后的胶回收产物进行过夜连接，16℃连接18h，连接体系如下：

感受态细胞制备步骤如下：

(1)从新鲜的LB平板上选取一个上述lacZ和wcaJ基因敲除后的BL21克隆，接种到6ml无抗LB中37℃，220rpm过夜扩大培养；

(2)取1ml扩大培养的菌液接种于100ml无抗LB中37℃，220rpm培养到OD600约为0.5-0.6之间；

(3)将摇瓶放在冰中冰浴30min后4℃，4000rpm离心20min；

(4)弃上清，加入预冷过后的15ml，10％甘油重悬菌体，4℃，4000rpm离心20min；

(5)重复一次步骤(4)；

(6)弃上清，加入预冷过后的15ml，10％甘油重悬菌体，4℃，3500rpm离心15min；

(7)小心的去掉上清，加入预冷过后的3ml，10％甘油重悬菌体；

(8)分装成100μl后立即置于-80℃冰箱保存。

连接产物转化至BL21(DE3)感受细胞内，步骤如下：

(1)将感受态细胞放置在冰上冰浴5min；

(2)将连接产物10μl全部加入感受态细胞内，冰浴30min；

(3)将冰浴后的感受态细胞42度金属浴热激90s；

(4)加入1ml无抗LB培养基至热失活后的感受态细胞中，37℃220rpm，培养1h后离心集菌涂板。

涂至氨苄青霉素Amp(pETDuet-1)/氯霉素CMR(pACYCDuet-1)/链霉素SMR(pCDFDuet-1)/卡那霉素Kana(pCOLADuet-1)抗性的固体培养皿上过夜培养，第二天挑选单克隆进行重组载体的鉴定，鉴定无误后提取质粒备用。

Ⅵ、重组质粒共转BL21(DE3)感受态细胞

将构建完成的四个重组质粒pET-manC-manB-gmd-fcl；pACYC-manA-rcsA；pCDF-futC-lacY；pCOLADuet-zwf-pntAB同时转入至制备好的BL21(DE3)感受态细胞中，转化步骤同步骤Ⅳ，涂至4抗(Amp，CMR，SMR，Kana)固体培养皿上过夜培养，第二天挑选单克隆进行发酵菌株的鉴定。

Ⅶ、发酵与纯化

对于分批发酵，将发酵菌株接种到5mL LB培养基中。当菌株达到固定相时，将1mL培养物接种到100mL含有36g/L葡萄糖作为碳源的LB培养基或改良M9培养基中，其中均含有100μg/mLAmp，34μg/mLCMR，50μg/mLKana和50μg/mLSMR。以便在500mL摇瓶中生长。当OD600达到约0.6时，添加0.2mMIPTG以在25℃诱导。再培养2小时和10小时后，分别添加12g/L乳糖以生产2'-FL。

制备改良的M9培养基：12.8g/L Na₂HPO ₄·7H₂ O，3g/L KH₂ PO ₄，2g/L NH₄Cl，0.5g/L NaCl，0.25g/L MgSO ₄·7H₂O，14.7mg/L CaCl₂·2H₂O，10mg/L硫胺素，2g/L酵母提取物，0.1％(v/v)Triton-X 100和1mL/L微量金属储备液。微量金属原液包含25g/L FeCl₃·6H ₂O，2g/L CaCl ₂·2H₂O，2g/L ZnCl₂、2g/L Na₂MoO₄·2H₂O，1.9g/L CuSO ₄·5H ₂O和0.5g/LH ₃BO ₃，pH 7.2。灭菌后冷却到115℃后向溶液中补充100μg/mL氨苄青霉素，34μg/mL氯霉素，50μg/mL卡那霉素和50μg/mL链霉素。

将发酵后的新鲜培养液以12,000g离心10分钟，并保留上清液定量细胞外寡糖，用于后续纯化。将细胞沉淀重悬于适量水中煮沸10分钟，然后以12,000g离心10分钟，并保留上清液以确定其细胞内寡糖含量，用于后续纯化。

将两种上清液依次用100kD，30kd，10kd，3kd的蛋白柱进行离心过滤去除大分子杂质，最后得到的过滤液利用HPLC进行纯化。

VIII、检测方法

为了确认2'-FL的生物合成，过滤液经0.22μm膜过滤处理通过HPLC纯化2'-FL并进行产量测定。HPLC流动相由0.005mol/L的H₂SO₄水溶液组成，比率为3.3：96.7，设定流速为0.6mL/min，进样量为10μL。收集并冻干后，将目标产物重新溶解在50％甲醇中，后进行MS检测分析。检测结果如图8和图9所示。

此外，相比于LB培养基，采用改良M9培养基，可以使2'-FL的产量提高31.6％。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种以葡萄糖为碳源合成2′-岩藻糖基乳糖的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以大肠杆菌为出发菌株，敲除lacZ和wcaJ基因，并且过表达manA、manB-manC、gmd-fcl、futC、zwf、putAB、rcsA和lacY基因。

2.根据权利要求1所述的以葡萄糖为碳源合成2′-岩藻糖基乳糖的基因工程菌，其特征在于，所述manB-manC和gmd-fcl基因通过克隆至pETDuet-1载体上构建过表达载体，然后转入敲除lacZ和wcaJ基因后的大肠杆菌中进行表达。

3.根据权利要求1所述的以葡萄糖为碳源合成2′-岩藻糖基乳糖的基因工程菌，其特征在于，所述manA和rcsA基因通过克隆至pACYCDuet-1载体上构建过表达载体，然后转入敲除lacZ和wcaJ基因后的大肠杆菌中进行表达。

4.根据权利要求1所述的以葡萄糖为碳源合成2′-岩藻糖基乳糖的基因工程菌，其特征在于，所述futC和lacY基因通过克隆至pCDFDuet-1载体上构建过表达载体，然后转入敲除lacZ和wcaJ基因后的大肠杆菌中进行表达。

5.根据权利要求1所述的以葡萄糖为碳源合成2′-岩藻糖基乳糖的基因工程菌，其特征在于，所述zwf和pntAB基因通过克隆至pCOLADuet-1载体上建过表达载体，然后转入敲除lacZ和wcaJ基因后的大肠杆菌中进行表达。

6.根据权利要求1所述的以葡萄糖为碳源合成2′-岩藻糖基乳糖的基因工程菌，其特征在于，所述manA、manB-manC、gmd-fcl、futC、zwf、putAB、rcsA和lacY基因的核苷酸序列依序如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQID NO.7和SEQ ID NO.8所示；所述lacZ和wcaJ基因核苷酸序列依序如SEQ ID NO.9和SEQID NO.10所示。

7.根据权利要求1所述的以葡萄糖为碳源合成2′-岩藻糖基乳糖的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌选自大肠杆菌BL21。

8.权利要求1-7任一项所述的基因工程菌在以葡萄糖为碳源合成2′-岩藻糖基乳糖中的应用。

9.一种以葡萄糖为碳源合成2′-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，包括对权利要求1-7任一项所述的基因工程菌进行培养，然后将培养物接种到含有葡萄糖的培养基中进行培养，诱导，最后加入乳糖合成2′-岩藻糖基乳糖。

10.根据权利要求9所述的以葡萄糖为碳源合成2′-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，所述将培养物接种到含有葡萄糖的培养基中进行培养，所述培养物的接种量为0.5-5％(体积比)，所述葡萄糖的浓度为30-40g/L；所述培养基为添加了90-110μg/mL氨苄青霉素、30-40μg/mL氯霉素、40-60μg/mL卡那霉素和40-60μg/mL链霉素的LB培养基或改良M培养基；所述诱导采用0.1-0.3mM IPTG进行诱导；所述乳糖的加入量为8-16g/L。