CN118028413A - 一种天然乳化虾青素及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种天然乳化虾青素及其制备方法，属于虾青素制备技术领域，通过使用鲜茶叶、苹果酸、纤维素纳米晶等作为功能介质用于制备发酵基质，用于共培养藻类和酵母菌。利用产油藻类与产虾青素的酵母菌共同培养，随后共同提取油份和虾青素，在提取过程中，直接乳化，形成一步制备乳化虾青素的生产工艺，发酵过程中酵母菌活性好，产品稳定性好，也具有良好的储存稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及虾青素制备技术领域，具体为一种天然乳化虾青素及其制备方法。
背景技术
虾青素是一种类胡萝卜素，主要存在于虾、蟹、鱼类、甲壳类等水产动物的体内，具有强力的抗氧化效果和多种生物活性。在水产养殖业中，虾青素是赋予水产动物鲜艳色彩的主要成分，添加虾青素可以提高水产品的颜色，使其更加鲜艳诱人。并且虾青素具有抗氧化、抗炎和增强免疫力等作用，可以增强水产品的抗应激能力，提高养殖效率，改善水产品的品质，延长保鲜期，提高营养价值。
天然虾青素主要存在于海洋环境中，以游离态和酯化态等形式存在。游离态虾青素不稳定，易被氧化。虾青素由于末端环状结构中羟基的存在，易与脂肪酸结合形成虾青素酯而稳定存在。目前制备虾青素的主要方法是化学合成法和生物合成法。化学合成的虾青素为左旋：消旋：右旋等于1：2：1的混合物，主要用于工业染料，一般在食品、医药领域是不允许使用的。生物合成虾青素的方法主要是通过C40类胡萝卜素代谢得到的，经过中心碳代谢、胡萝卜素前体物质异戊烯焦磷酸酯(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸酯(DAMPP)的合成、类胡萝卜素合成三个阶段合成虾青素。在酵母菌、小球藻、金盏花、破囊壶属真核微生物中，都可以作为生物合成虾青素的来源，但都存在着产量小的缺陷。比如，藻类生产虾青素，培养周期长，提取率低，连续性差，很难规模培养。利用酵母菌生产虾青素，其稳定性不佳，对发酵条件控制要求高。
随着市场对虾青素关注与需求的提升，虾青素在食品营养强化剂、医疗保健、饲料等方面具有很大的应用价值和发展空间。为了解决市场对虾青素需求的日益增长的问题，需要一种可扩大生产、产品稳定性高、生物可及性好，产量大的虾青素制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种天然乳化虾青素及其制备方法，以解决背景技术中提出的问题。通过使用鲜茶叶、苹果酸、纤维素纳米晶等作为功能介质用于制备发酵基质，用于共培养藻类和酵母菌。利用产油藻类与产虾青素的酵母菌共同培养，随后共同提取油份和虾青素，在提取过程中，直接乳化，形成一步制备乳化虾青素的生产工艺，发酵过程中酵母菌活性好，产品稳定性好，也具有良好的储存稳定性。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种天然乳化虾青素的制备方法，包括以下步骤：
S1、将各组分经过无菌处理后，配置发酵基质，具体操作为：
以重量份计，按照功能介质5-10％、玉米粉末10-15％、酵母膏1％、蛋白胨2％、葡萄糖2％、磷酸二氢钾1％、甲醇含量为1.5％-2.5％和余量的无菌海水，搅拌均匀后得到发酵基质；
S2、将藻类和酵母菌使用S1步骤中制备的发酵基质进行共同培养，藻类与酵母菌的接种比例为1：(0.1-2)，酵母菌和藻类的总接种量为3％-7％；
S3、将S2步骤中共培养得到的培养物进行超声波破壁处理，随后向体系中加入纯丙酮，升高体系温度至50-60℃，浸提10-20分钟后过滤，即得到一种天然乳化虾青素。
进一步地，所述功能介质包括鲜茶叶、苹果酸、纤维素纳米晶、纤维素纳米纤维、维生素B12、维生素B2。
进一步地，功能介质中鲜茶叶、苹果酸、纤维素纳米晶、纤维素纳米纤维、维生素B12和维生素B2的质量比为(1-5)：(0.1-0.3)：5：(1-10)：(0.1-0.3)：(0.1-0.3)。
进一步地，藻类包括螺旋藻(Spirulina platensis)、佐芬根色绿球藻(Chromochloris zofingiensis)、杜氏盐藻(Dunaliella salina)、小球藻(Chlorellavulgaris)。
进一步地，所述酵母菌为红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)及其工程变种。
进一步地，S2步骤中，藻类和酵母菌进行共同培养的具体操作为：
A1、将藻类与酵母菌以1：(0.1-2)的比例混合，随后接种到S1步骤中的发酵基质中，在无菌环境下向发酵基质中通入无菌空气，控制发酵体系溶解氧高于30％，发酵60小时后过滤，得到滤得物和酵母菌菌液；在滤得物中添加只接种酵母菌的发酵基质进行新一轮发酵，并将过滤得到的酵母菌菌液转移至离心机中，离心处理分离上清液，得到酵母乳；
A2、将A1步骤中获得的酵母乳使用压滤机浓缩处理，控制固形物含量为20-30％；随后按照1g：12-18mL的质量体积比与二甲基亚砜溶液混合，得到预浸泡液；等到A1步骤中新一轮发酵时间到达60小时后，重复分离酵母菌菌液、添加只接种酵母菌的发酵基质、浓缩酵母乳并混合二甲基亚砜操作，重复次数为3-4次；
A3、发酵完成后将发酵体系与A2步骤中得到的预浸泡液混合。
进一步地，S2步骤中，共培养条件为：培养温度20-35℃，摇床速率为120-150rpm，发酵时间为7-10天，光照强度为2500-4000lux。
一种天然乳化虾青素，由上述所述制备方法制得。
进一步地，所述天然乳化虾青素的使用方法为：将天然乳化虾青素使用去离子水按照0.5-2％的质量比溶解稀释后，均匀泼洒，过塘和捕捞操作之前7-10天持续使用；在日常普通土池养殖过程中，每亩每米35-50mL，高位池45-60mL。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明技术方案中，通过使用鲜茶叶、苹果酸、纤维素纳米晶、纤维素纳米纤维、维生素B12、维生素B2等作为功能介质用于制备发酵基质，用于共培养藻类和酵母菌。其中，新鲜茶叶中含有β-D-葡萄糖苷酶，可以调节红法夫酵母菌中糖酵解有关下游通路，使得酵母菌细胞壁发生变化，可以减弱酵母细胞壁合成，并且促进虾青素的合成。在共培养过程中，苹果酸中含有的苹果酸和多种多酚类化合物，可以促进乙酰辅酶A转变成草酰乙酸参加红法夫酵母菌的三羧酸循环，促进腺嘌呤核苷三磷酸和还原型辅酶Ⅱ的形成，为酵母菌积累虾青素的甲基赤四醇4-磷酸途径提供能量，促进红法夫酵母菌中虾青素的含量。在藻类的培育过程中，苹果酸中的多酚类化合物可以促进藻类中贮存的脂肪酸通过乙酰辅酶A转化为葡萄糖，可以为藻类中虾青素的合成提供充足的物质基础，提高虾青素的产量，减少藻类中油脂的含量，提高虾青素产量，并且调节总产物中油脂和虾青素的比例，有利于后续形成稳定的虾青素乳液。
已知藻类在应激状态下，会改变颜色，并且体内虾青素的含量会提高。通过提高共培养过程中的光照强度、提高培养液的盐分胁迫、在基质中添加甲醇溶液，使得藻类处于应激状态，提高虾青素在藻类体内的积累，降低藻类的生长周期，使其更配合酵母菌的收获时间。此外，低浓度的甲醇溶液会改性藻类的通透性，使得其体内的脂肪酸进入基质的体系中，在摇床培养过程中，会被纤维素纳米晶和纤维素纳米纤维乳化，形成微乳液，保护体系中红法夫酵母菌的活性，并且降低其受到的强光影响。在纤维素纳米晶和纤维素纳米纤维的漫反射作用下，有光照但光照水平较低的情况下，红法夫酵母菌中赤霉素的含量较高，可以促进藻类中ctrZ基团的表达，抑制lcy基因的表达，促进虾青素在藻类体内的生物合成，得到的虾青素也具有更好的生物可及性。由于纤维素纳米晶和纤维素纳米纤维的添加，使得在制备浓缩酵母乳的过程中，利用其良好的保水性能，改善浓缩乳的结构，提高其稳定性。
在共培养结束后，对培养物进行超声破壁处理，随后使用纯丙酮处理破壁后的体系，纯丙酮同时作用于藻类和酵母菌，提取出酵母菌中的虾青素和藻类中的油份和虾青素。在50-60℃的提取温度下，提取出的脂肪酸易于虾青素发生酯化反应，形成稳定的虾青素酯。由于纤维素纳米晶和纤维素纳米纤维都是纳米级的材料，比酵母菌小很多，在分离酵母菌的时候，纤维素纳米晶和纤维素纳米纤维都能保留在体系中，并且纤维素纳米晶可以稳定的存在于虾青素酯表面，并且纤维素纳米纤维可以作为稳定剂覆盖相邻液滴的表面，形成密集的桥接网络，增加液滴的稠度，使得制备的产品具有良好的耗尽稳定性，不会导致产品开封后继续储存而发生油水分离或者厚乳液在下、上层很稀薄的分层现象，所制得天然乳化虾青素产品中，虾青素含量可达到500-700mg/L。
并且制得的虾青素产品，结合了酵母菌中(3R，3’R)结构和藻类中(3S，3’S)结构的虾青素，3S，3’S构型的虾青素对于脂质过氧化的抑制作用和免疫活性较强，3R，3’R构型的虾青素则表现出良好的清除自由基的能力，综合制备可以提高所制得的天然乳化虾青素的功能效果，既可以提高免疫力，在保险运输方面具有优势，又具有抗氧化抗应激的效果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例和对比例中所用试剂均为分析级，小球藻Chlorella vulgaris来源于国家水生生物种质资源库淡水藻种库，编号为FACHB-2723。佐芬根色绿球藻由美国典型培养物保藏中心提供，保藏编号为ATCC 30412。红法夫酵母菌由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供，保藏编号为CICC 33064。
实施例1
发酵基质由以下步骤制得：
将鲜茶叶、苹果酸剪碎，并使用紫外灯进行无菌处理，随后将鲜茶叶、苹果酸、纤维素纳米晶、纤维素纳米纤维、维生素B12和维生素B2按照1：0.1：5：1：0.1：0.1的质量比混合，得到功能介质；随后以重量百分比计，按照功能介质5％、玉米粉末10％、酵母膏1％、蛋白胨2％、葡萄糖2％、磷酸二氢钾1％、甲醇含量为1.5％和余量的无菌海水，搅拌均匀后得到发酵基质。
实施例2
将鲜茶叶、苹果酸剪碎，并使用紫外灯进行无菌处理，随后将鲜茶叶、苹果酸、纤维素纳米晶、纤维素纳米纤维、维生素B12和维生素B2按照3：0.2：5：5：0.2：0.2的质量比混合，得到功能介质；随后以重量百分比计，按照功能介质7％、玉米粉末13％、酵母膏1％、蛋白胨2％、葡萄糖2％、磷酸二氢钾1％、甲醇含量为2.0％和余量的无菌海水，搅拌均匀后得到发酵基质。
实施例3
将鲜茶叶、苹果酸剪碎，并使用紫外灯进行无菌处理，随后将鲜茶叶、苹果酸、纤维素纳米晶、纤维素纳米纤维、维生素B12和维生素B2按照5：0.3：5：10：0.3：0.3的质量比混合，得到功能介质；随后以重量百分比计，按照功能介质10％、玉米粉末15％、酵母膏1％、蛋白胨2％、葡萄糖2％、磷酸二氢钾1％、甲醇含量为2.5％和余量的无菌海水，搅拌均匀后得到发酵基质。
实施例4
天然乳化虾青素由以下步骤制得：
A1、将小球藻(Chlorella vulgaris)与红法夫酵母菌(Phaffia rhodozyma)以1：0.8的接种比例接种到实施例1中制备的发酵基质中，酵母菌和藻类的总接种量为3％，无菌环境下向发酵基质中通入无菌空气，控制发酵体系溶解氧高于30％，控制培养条件为：培养温度20℃，摇床速率为120rpm，光照强度为2500勒克斯；发酵60小时后过滤，得到滤得物和酵母菌菌液；在滤得物中添加只接种酵母菌(与酵母菌原接种量相同)的发酵基质进行新一轮发酵，并将过滤得到的酵母菌菌液转移至离心机中，离心处理分离上清液，得到酵母乳；
A2、将A1步骤中获得的酵母乳使用压滤机浓缩处理，控制固形物含量为25％；随后按照1g：12mL的质量体积比与二甲基亚砜溶液混合，得到预浸泡液；等到A1步骤中新一轮发酵时间到达60小时后，重复分离酵母菌菌液、添加只接种酵母菌的发酵基质、浓缩酵母乳并混合二甲基亚砜操作，重复次数为3次；
A3、发酵完成后将发酵体系与A2步骤中得到的预浸泡液混合，即得藻类和酵母菌进行共同培养体系，将体系中的培养物进行超声波破壁处理，随后向体系中加入等体积的纯丙酮，升高体系温度至55℃，浸提20分钟后过滤，即得到一种天然乳化虾青素。
实施例5
本实施例与实施例4的区别在于，A1步骤中，小球藻与红法夫酵母的接种比例为1：1.2，酵母菌和藻类的总接种量为5％，接入的发酵基质是由实施例2中制得的；培养温度为30℃，摇床速率为130rpm，光照强度为3500勒克斯；A2步骤中，混合二甲基亚砜的质量体积比为1g：16mL；操作重复次数为4次。
实施例6
本实施例与实施例4的区别在于，A1步骤中，所用的藻类为佐芬根色绿球藻。
实施例7
本实施例与实施例4的区别在于，A1步骤中，小球藻与红法夫酵母的接种比例为1：2，酵母菌和藻类的总接种量为7％，接入的发酵基质是由实施例3中制得的；培养温度为35℃，摇床速率为150rpm，光照强度为4000勒克斯；A2步骤中，混合二甲基亚砜的质量体积比为1g：18mL；操作重复次数为4次。
对比例1
本对比例与实施例5的区别在于，只接种红法夫酵母。
对比例2
本对比例与实施例5的区别在于，只接种藻类。
对比例3
本对比例与实施例5的区别在于，本对比例中发酵基质中不添加功能介质。
对比例4
本对比例与实施例5的区别在于，本对比例中发酵基质中不添加纤维素纳米纤维和纤维素纳米晶。
对比例5
本对比例与实施例5的区别在于，本对比例中发酵基质不添加甲醇。
现在对实施例4-7和对比例1-5中制备的虾青素进行稳定性测试。将7mM 2，2-叠氮双(3乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)水溶液与2.45mM K2S2O8水溶液置于室温下，并在黑暗条件下保持12小时，使用96％的乙醇溶液以1：10的比例将该溶液稀释，获得稀释液。将200μL样品与3.8mL 95％的乙醇溶液混合，加入1mL稀释液，搅拌均匀后在黑暗环境下保持6分钟。使用分光光度计在734nm处测量自由基。6个月后再次测量，判断其抗氧化效果稳定性。并对不同组别制备的样品进行高低温/光照/冷热循环测试，6个月后记录产品的颜色、外观变化，判断产品结构稳定性。每个样品获得五个读数并取平均值，测试结果如下表1所示。
表1实施例4-7和对比例1-5中制备的虾青素稳定性测试
由上表1可知，实施例4-7中制备的天然乳化虾青素具有良好的抗氧化稳定性和体系稳定性。由对比例1和2中的结果可知，单独培育红法夫酵母和藻类，使得体系中得到的油份和虾青素产量不匹配，虾青素产量变少，油含量偏多，长时间储存，会导致油份析出。由对比例3和4中的结果可知，功能介质可以帮助稳定乳化虾青素的抗氧化性，并且其中的纤维素纳米纤维和纤维素纳米晶可以提高体系的多方面稳定性。
现在对实施例4-7和对比例1-5中制备的天然乳化虾青素进行水产饲养效果检测。以南美白对虾为例，使用相同水质对15天的南美白对虾虾苗进行饲养，饲养时间为2个月，使用去离子水按照1％的质量比将不同组别制备的样品溶解稀释后，按照每亩每米50mL均匀泼洒，随后测量每10只虾的体重增长率，以及虾苗的存活率。测试结果如表2所示。
表2实施例4-7和对比例1-5中制备虾青素水产饲养效果检测
| 项目 | 虾苗存活率(％) | 产率(g/10只) |
| 实施例4 | 96 | 172 |
| 实施例5 | 99 | 182 |
| 实施例6 | 98 | 187 |
| 实施例7 | 96 | 176 |
| 对比例1 | 90 | 147 |
| 对比例2 | 91 | 152 |
| 对比例3 | 86 | 126 |
| 对比例4 | 90 | 153 |
| 对比例5 | 85 | 131 |
由表2的结果可知，实施例5和6中制备的天然乳化虾青素使得虾苗具有最好的成活率和产率。从虾苗的存活率来看，由于养殖条件较好，成活率没有产率的对比明显，但是由对比例3和5中的数据可以看出，功能介质的添加可以放大所制得的虾青素样品的功能效果，添加甲醇溶液，也可以增加制备过程中虾青素的活性。产率方面，由对比例1和2中的数据可知，共培养可以增加天然虾青素的构型种类，达到更好的增产效果。
在说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种天然乳化虾青素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将各组分经过无菌处理后，配置发酵基质，发酵基质包括以下重量百分比的成分：功能介质5-10％、玉米粉末10-15％、酵母膏1％、蛋白胨2％、葡萄糖2％、磷酸二氢钾1％、甲醇1.5％-2.5％和余量的无菌海水，搅拌均匀后得到发酵基质；
S2、将藻类和酵母菌使用S1步骤中制备的发酵基质进行共同培养，藻类与酵母菌的接种比例为1：(0.1-2)，酵母菌和藻类的总接种量为3％-7％；
S3、将S2步骤中共培养得到的培养物进行超声波破壁处理，随后向体系中加入纯丙酮，升高体系温度至50-60℃，浸提10-20分钟后过滤，即得到一种天然乳化虾青素。
2.根据权利要求1所述的一种天然乳化虾青素的制备方法，其特征在于，S1步骤中，所述功能介质包括鲜茶叶、苹果酸、纤维素纳米晶、纤维素纳米纤维、维生素B12、维生素B2。
3.根据权利要求2所述的一种天然乳化虾青素的制备方法，其特征在于，所述功能介质中鲜茶叶、苹果酸、纤维素纳米晶、纤维素纳米纤维、维生素B12、维生素B2的质量比为(1-5)：(0.1-0.3)：5：(1-10)：(0.1-0.3)：(0.1-0.3)。
4.根据权利要求1所述的一种天然乳化虾青素的制备方法，其特征在于，所述藻类包括螺旋藻、佐芬根色绿球藻、杜氏盐藻、小球藻中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的一种天然乳化虾青素的制备方法，其特征在于，所述酵母菌为红法夫酵母及其工程变种。
6.根据权利要求1所述的一种天然乳化虾青素的制备方法，其特征在于，S2步骤中，藻类和酵母菌进行共同培养的具体操作为：
A1、将藻类与酵母菌以1：(0.1-2)的比例混合，随后接种到S1步骤中的发酵基质中，在无菌环境下向发酵基质中通入无菌空气，控制发酵体系溶解氧高于30％，发酵60小时后过滤，得到滤得物和酵母菌菌液；在滤得物中添加只接种酵母菌的发酵基质进行新一轮发酵，并将过滤得到的酵母菌菌液转移至离心机中，离心处理分离上清液，得到酵母乳；
A2、将A1步骤中获得的酵母乳使用压滤机浓缩处理，控制固形物含量为20-30％；随后按照1g：12-18mL的质量体积比与二甲基亚砜溶液混合，得到预浸泡液；等到A1步骤中新一轮发酵时间到达60小时后，重复分离酵母菌菌液、添加只接种酵母菌的发酵基质、浓缩酵母乳并混合二甲基亚砜操作，重复次数为3-4次；
A3、发酵完成后将发酵体系与A2步骤中得到的预浸泡液混合。
7.根据权利要求1所述的一种天然乳化虾青素的制备方法，其特征在于，S2步骤中，共培养条件为：培养温度20-35℃，摇床速率为120-150rpm，发酵时间为7-10天，光照强度为2500-4000lux。
8.一种天然乳化虾青素，其特征在于，由权利要求1-7中任意一项所述的制备方法制得。
9.如权利要求8中所述的一种天然乳化虾青素，其特征在于，使用方法为：将天然乳化虾青素使用去离子水按照0.5-2％的质量比溶解稀释后，均匀泼洒，过塘和捕捞操作之前7-10天持续使用；在日常普通土池养殖过程中，每亩每米35-50mL，高位池45-60mL。
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