CN111979132B - 一种高产虾青素的发酵培养基及其应用 - Google Patents

一种高产虾青素的发酵培养基及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物发酵培养领域，具体涉及一种高产虾青素的发酵培养基及其应用。该技术通过优化发酵培养基配方，去除常规虾青素发酵培养基中所添加的锌离子，并添加铁离子和优化其浓度，大幅提高了虾青素的产量和纯度，使酿酒酵母工业化生产虾青素得以实现，同时该技术得到的虾青素与藻源的天然虾青素具有相同的构型，具备最强的生物活性，在保健食品和化妆品领域具有广阔的应用前景。本发明发酵周期短，培养方法简单，发酵过程无需流加有机氮源，且培养基组成简单更有利于下游提取，成本低、技术优势明显。

Description

一种高产虾青素的发酵培养基及其应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵培养领域，具体涉及一种高产虾青素的发酵培养基及其应用。
背景技术
虾青素是一种脂溶性类胡萝卜素，几乎不溶于水。具有极强的抗氧化能力，淬灭单线态 氧和捕捉自由基的能力比β-胡萝卜素高10余倍，比维生素E强100多倍。虾青素的抗氧化 性、着色性、增强机体免疫力的特性，已被广泛认可。另外，它也是唯一能通过血脑屏障的 一种类胡萝卜素，目前已逐步应用于保健品、医药、化妆品、食品添加剂以及水产养殖等方 面。虾青素有两个手性中心，有3种立体结构：(3S,3′S)、(3S,3′R)和(3R,3′R)，天然虾青素主要以(3S,3′S)或(3R,3′R)形式存在(马田,陈智莉,黄敏坚,等.合成微生物技术促进类胡萝卜素产品的高效合成)，其中(3S,3′S)结构具有最强的生物学活性，其应用范围也最广。
虾青素的生产方法大体上可以分为两大类，化学合成法和提取法。化学合成的虾青素为 3种立体结构的混合物，导致其抗氧化活性较低，而且目前美国FDA已禁止化学合成的虾青 素进入保健食品市场。提取法生产虾青素按照来源又可以分为3种：水产动物(如各种虾、 蟹)、酵母(法夫酵母、酿酒酵母等)、微藻(如雨生红球藻)。从水产动物中提取虾青素目前 存在过程复杂，废弃的虾、蟹数量有限，成本高等缺点，限制了该方法的推广；由于雨生红 球藻中虾青素含量高，且为(3S,3′S)立体结构，所以利用雨生红球藻制备虾青素被认为是 最具商业化前景的一种生产方法，但是也存在培养周期长、技术难度大的缺点；而利用酵母 发酵生产虾青素一直以来被制约的因素是产量较低，难以产业化，但是酵母细胞的优点是繁 殖速度快，成本低，生产过程较易控制(班磊,尤建伟.虾青素制备方法的研究进展)。例如 CN201910567660.0利用酿酒酵母发酵生产虾青素，该技术经过优化发酵条件后使5L发酵罐 中虾青素产量达到了404.78×10-3g/L，虽然已是业内较高水平，但仍难以产业化。
基于目前在工业化生产虾青素中存在的问题，诸如发酵产量低、成本高、纯度低、工艺 复杂、难以工业化生产，本发明通过优化发酵培养基组分，去除常规虾青素发酵培养基中所 添加的锌离子，并添加铁离子和优化其浓度，大幅提高了虾青素的产量和纯度，使酿酒酵母 工业化生产虾青素得以实现，同时酿酒酵母生产的虾青素与雨生红球藻来源的虾青素具有相 同的构型，具备最强的生物活性，在保健食品和化妆品领域具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明提供了一种高产虾青素的发酵培养基及其应用。该发明通过优化发酵培养基组分， 去除常规虾青素发酵培养基中所添加的锌离子，并添加铁离子和优化其浓度，大幅提高了虾 青素的产量和纯度，解决了现有技术中发酵产量低、成本高、工艺复杂、难以工业化生产等 缺点。本发明的上述技术目的是通过下述技术方案实现：
一种高产虾青素的发酵培养基，所述的发酵培养基中不含锌离子，含铁离子；常规培养 认为添加Zn2+有助于提高类胡萝卜素的产量和纯度，本申请在研究过程中发明人意外的发现 Zn2+的添加对本发明起到了相反的技术效果。
在本发明的一些实施方案中，所述的铁离子在发酵培养基中的浓度为0～0.56g/L；在本 发明的一些实施方案中，所述的铁离子在发酵培养基中的浓度为0～0.2g/L；在本发明的一些 实施方案中，所述的铁离子在发酵培养基中的浓度为0.65×10-3g/L；在本发明的一些实施方 案中，所述的铁离子在发酵培养基中的浓度为0.013g/L；在本发明的一些实施方案中，所述 的铁离子在发酵培养基中的浓度为0.035g/L；在本发明的一些实施方案中，所述的铁离子在 发酵培养基中的浓度为0.056g/L；在本发明的一些实施方案中，所述的铁离子在发酵培养基 中的浓度为0.2g/L；在本发明的一些实施方案中，所述的铁离子在发酵培养基中的浓度为0.56 g/L；在研究过程中发明人发现，虾青素的产量和纯度与培养基中铁离子的添加量并不是完全 成正比，在一定浓度范围内，虾青素的产量和纯度随着铁离子浓度的提高而增加，继续增加 铁离子的浓度，虾青素的产量和纯度保持不变，当达到一定浓度时，虾青素的产量和纯度有 下降趋势。
在本发明的一些实施方案中，所述的铁离子选自二价铁离子和/或三价铁离子；在本发明 的一些实施方案中，所述的铁离子是二价铁离子；在本发明的一些实施方案中，所述的铁离 子是三价铁离子；在本发明的一些实施方案中，所述的铁离子是二价铁离子和三价铁离子的 混合物；在研究过程中发明人意外发现，在培养基中分别添加二价铁离子和三价铁离子，相 比不添加铁离子时均可以提高虾青素的产量和纯度，而且单独添加三价铁离子的技术效果更 优于单独添加二价铁离子。
在本发明的一些实施方案中，所述的二价铁离子包括选自硫酸亚铁、氯化亚铁、草酸亚 铁、碘化亚铁的至少之一。
在本发明的一些实施方案中，所述的三价铁离子包括选自柠檬酸铁、柠檬酸铁铵、三氯 化铁、硝酸铁的至少之一。
进一步地，所述发酵培养基中还包含其他组分：葡萄糖10.0～40.0g/L，酵母粉2.5～20.0g/L， 蛋白胨2.5～20.0g/L，玉米浆5.0～20.0g/L，硫酸铵3.0～15.0g/L，磷酸二氢钾4.0～12.0g/L， 硫酸镁1.0～5.0g/L。
本发明还提供本发明所述的发酵培养基在酿酒酵母生产虾青素中的应用。本发明所述的 “酿酒酵母”为重组型酿酒酵母，是将虾青素合成相关基因整合至野生型酿酒酵母所得。
进一步地，本发明还公开了一种采用本发明所述的发酵培养基生产虾青素的方法，包括 如下步骤：
(1)种子培养：取酿酒酵母种子甘油管，按0.5％～10％的比例接种于一级YPD液体培 养基，在25～32℃、150～250rpm摇床过夜培养；之后再按0.5％～10％的比例接种于二级相同 培养基中，培养6～18h，使种子OD600达到6～15；
(2)发酵培养：将步骤(1)制备的二级种子液按0.5％-10％的比例接种于发酵培养基， 培养温度25～32℃，通气量0.5～2.0vvm，发酵过程用碱液控制pH≥5.5，维持溶氧≥20％；
(3)补料培养：当培养基中糖耗完时，开始流加葡萄糖5～15g/L/h；当细胞OD600达到 100～200时开始流加乙醇，维持发酵液中乙醇浓度1.0～15.0g/L；当虾青素含量不再增加时终 止发酵，利用HPLC法检测虾青素组分。
在本发明的一些实施方案中，所述的YPD液体培养基包含葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L， 蛋白胨20g/L。
与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：
1)本发明通过优化培养基配方，大大提升了虾青素的产量和纯度。虾青素产量由500×10-3 g/L提升至1540×10-3g/L，虾青素纯度(即占总类胡萝卜素的比例)由28％提升至70％；
2)本发明实现了采用酿酒酵母工业化生产虾青素，且放大生产后生产水平和纯度与小试 相当，工艺稳定性好；
3)本发明发酵周期短，培养方法简单，发酵过程无需流加有机氮源，培养基组成简单更 有利于下游提取，成本低、技术优势明显；
4)本发明生产得到的虾青素为(3S,3′S)构型，具有最强的抗氧化活性，在化妆品和保 健食品等领域最具应用潜力。
附图说明
图1为本发明20吨发酵过程菌体OD600、虾青素含量及纯度的变化曲线；
图2为本发明生产的虾青素HPLC检测结果，显示虾青素结构为(3S,3′S)构型；
图3为HPLC法检测虾青素纯度(占总类胡萝卜素的比例)。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描 述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1摇瓶考察不同浓度Zn2+和Fe3+对虾青素合成的影响
(1)酵母种子培养：首先，取出-80℃保存的酵母种子甘油管，按0.5％比例接种于一级 YPD液体培养基，30℃、200rpm摇床过夜培养；之后再按1％接种于二级相同培养基中，培 养10h，使种子OD600达6～10之间。
所述YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose)培养基组成：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L， 蛋白胨20g/L。配制好后118℃灭菌30min。
(2)接种发酵培养基：将上述制备的二级种子液按1％比例接种至装有50mL发酵培养 基的250mL三角瓶，30℃、250rpm培养3天。三角瓶添加七水硫酸锌的浓度分别0、0.3 ×10-3g/L、3.0×10-3g/L(柠檬酸铁铵添加0.1×10-3g/L)，添加柠檬酸铁铵的浓度分别为0、0.65 ×10-3g/L、1.3×10-3g/L、6.5×10-3g/L(七水硫酸锌添加为0)。每组实验均设置三个平行。发酵 结束后用HPLC检测虾青素(AST)含量和组分，检测结果取平均值见表1。
产虾青素的酿酒酵母种子工程菌YLK-AST的构建方法如下：
将三孢布拉霉菌(Blakeslea trispora)来源的类胡萝卜素合成基因BtcrtI、BtcrtE和BtcrtYB 以及细菌来源PacrtZ和BscrtW基因整合至酿酒酵母HEC-YLK(保藏单位：中国典型培养物 保藏中心，保藏地址：中国湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学，保藏编号：CCTCC NO： M2018062，保藏日期：2018-01-29，分类命名：酿酒酵母HEC-YLK)基因组上，并将外源 基因置于诱导型启动子pGAL1、pGAL10或组成型启动子pTEF1、pPGK1的控制下进行表达。
发酵培养基组成：葡萄糖20.0g/L，酵母粉2.5g/L，蛋白胨2.5g/L，玉米浆5.0g/L，硫 酸铵3.0g/L，磷酸二氢钾4.0g/L，硫酸镁1.0g/L，七水硫酸锌0～3.0×10-3g/L，柠檬酸铁铵 0～6.5×10-3g/L。配制好后121℃灭菌30min。
表1
Figure BDA0002642095620000041
结果：摇瓶发酵实验说明在发酵培养基中添加微量Zn2+，即可表现出对虾青素的产量有 明显的抑制作用，纯度也大幅下降，且虾青素的含量和纯度均随着Zn2+浓度的提高而下降； 而微量Fe3+的加入则对虾青素的合成有明显促进作用，且虾青素的产量和纯度随着Fe3+浓度 的提高呈现先增加后平稳的趋势。
实施例2 30L发酵罐发酵：发酵培养基中七水硫酸锌0.8g/L、七水硫酸亚铁(Fe2+)0.051g/L
(1)酵母种子培养：首先，取出-80℃保存的酵母种子甘油管，按0.5％比例接种于一级 YPD液体培养基，30℃、200rpm摇床过夜培养；之后再按1％接种于二级相同培养基中，培 养10h，种子OD600达6～10。
其中YPD培养基为：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L。配制好后118℃灭菌30min。
(2)接种发酵培养基：将上述制备的二级种子液按1％比例接种至装有30L发酵培养基 的发酵罐中，发酵温度30℃，通气量1vvm。发酵过程用氨水控制pH≥5.8，维持溶氧≥30％。
其中发酵培养基为：葡萄糖20.0g/L，酵母粉5.0g/L，蛋白胨2.5g/L，玉米浆10.0g/L， 硫酸铵7.5g/L，磷酸二氢钾8.0g/L，硫酸镁3.0g/L，七水硫酸锌0.8g/L，七水硫酸亚铁0.051 g/L。配制好后121℃灭菌30min。
(3)过程补料：当培养基中糖耗完时开始流加葡萄糖9.0g/L/h；当细胞OD600达到150 ±50开始流加乙醇，维持发酵液中乙醇浓度1.0～15.0g/L。当虾青素含量不再增加时终止发酵， 检测虾青素含量为500×10-3g/L，纯度28.7％。
实施例3 30L发酵罐发酵:发酵培养基中七水硫酸锌0、七水硫酸亚铁(Fe2+)0.051g/L
(1)酵母种子培养：首先，取出-80℃保存的酵母种子甘油管，按0.5％比例接种于一级 YPD液体培养基，30℃、200rpm摇床过夜培养；之后再按1％接种于二级相同培养基中，培 养10h，种子OD600达6～10。
其中YPD培养基为：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L。配制好后118℃灭菌30min。
(2)接种发酵培养基：将上述制备的二级种子液按1％比例接种至装有30L发酵培养基 的发酵罐中，发酵温度30℃，通气量1vvm。发酵过程用氨水控制pH≥5.8，维持溶氧≥30％。
其中发酵培养基为：葡萄糖20.0g/L，酵母粉5.0g/L，蛋白胨2.5g/L，玉米浆10.0g/L， 硫酸铵7.5g/L，磷酸二氢钾8.0g/L，硫酸镁3.0g/L，七水硫酸亚铁0.051g/L。配制好后121℃ 灭菌30min。
(3)过程补料：当培养基中糖耗完时开始流加葡萄糖9.0g/L/h；当细胞OD600达到150 ±50时开始流加乙醇，维持发酵液中乙醇浓度1.0～15.0g/L。当虾青素含量不再增加时终止发 酵，检测虾青素含量为970×10-3g/L，纯度55％。
实施例4 30L发酵罐发酵：发酵培养基中七水硫酸锌0、柠檬酸铁铵(Fe3+)0.056g/L
(1)酵母种子培养：首先，取出-80℃保存的酵母种子甘油管，按0.5％比例接种于一级 YPD液体培养基，30℃、200rpm摇床过夜培养；之后再按1％接种于二级相同培养基中，培 养10h，种子OD600达6～10。
其中YPD培养基为：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L。配制好后118℃灭菌30min。
(2)接种发酵培养基：将上述制备的二级种子液按1％比例接种至装有30L发酵培养基 的发酵罐中，发酵温度30℃，通气量1vvm。发酵过程用氨水控制pH≥5.8，维持溶氧≥30％。
其中发酵培养基为：葡萄糖20.0g/L，酵母粉5.0g/L，蛋白胨2.5g/L，玉米浆10.0g/L， 硫酸铵7.5g/L，磷酸二氢钾8.0g/L，硫酸镁3.0g/L，柠檬酸铁铵0.056g/L。配制好后121℃ 灭菌30min。
(3)过程补料：当培养基中糖耗完时开始流加葡萄糖9.0g/L/h；当细胞OD600达到150 ±50时开始流加乙醇，维持发酵液中乙醇浓度1.0～15.0g/L。当虾青素含量不再增加时终止发 酵，检测虾青素含量为1540×10-3g/L，纯度70％。
实施例5 30L发酵罐发酵：发酵培养基中七水硫酸锌0.0013g/L、柠檬酸铁铵(Fe3+)0.056g/L
(1)酵母种子培养：首先，取出-80℃保存的酵母种子甘油管，按0.5％比例接种于一级 YPD液体培养基，30℃、200rpm摇床过夜培养；之后再按1％接种于二级相同培养基中，培 养9h，种子OD600达6～10。
其中YPD培养基为：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L。配制好后118℃灭菌30min。
(2)接种发酵培养基：将上述制备的二级种子液按1％比例接种至装有30L发酵培养基 的发酵罐中，发酵温度30℃，通气量1vvm。发酵过程用氨水控制pH≥5.8，维持溶氧≥30％。
其中发酵培养基为：葡萄糖20.0g/L，酵母粉5.0g/L，蛋白胨2.5g/L，玉米浆10.0g/L， 硫酸铵7.5g/L，磷酸二氢钾8.0g/L，硫酸镁3.0g/L，七水硫酸锌0.0013g/L，柠檬酸铁铵0.056 g/L。配制好后121℃灭菌30min。
(3)过程补料：当培养基中糖耗完时开始流加葡萄糖9.0g/L/h；当细胞OD600达到150±50时开始流加乙醇，维持发酵液中乙醇浓度1.0～15.0g/L。当虾青素含量不再增加时终 止发酵，检测虾青素含量为1060×10-3g/L，纯度61％。
实施例6 30L发酵罐发酵：发酵培养基中七水硫酸锌0.1g/L、柠檬酸铁铵(Fe3+)0.056g/L
(1)酵母种子培养：首先，取出-80℃保存的酵母种子甘油管，按0.5％比例接种于一级 YPD液体培养基，30℃、200rpm摇床过夜培养；之后再按1％接种于二级相同培养基中，培 养10h，种子OD600达6～10。
其中YPD培养基为：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L。配制好后118℃灭菌30min。
(2)接种发酵培养基：将上述制备的二级种子液按1％比例接种至装有30L发酵培养基 的发酵罐中，发酵温度30℃，通气量1vvm。发酵过程用氨水控制pH≥5.8，维持溶氧≥30％。
其中发酵培养基为：葡萄糖20.0g/L，酵母粉5.0g/L，蛋白胨2.5g/L，玉米浆10.0g/L， 硫酸铵7.5g/L，磷酸二氢钾8.0g/L，硫酸镁3.0g/L，七水硫酸锌0.1g/L，柠檬酸铁铵0.056g/L。 配制好后121℃灭菌30min。
(3)过程补料：当培养基中糖耗完时开始流加葡萄糖9.0g/L/h；当细胞OD600达到150±50时开始流加乙醇，维持发酵液中乙醇浓度1.0～15.0g/L。当虾青素含量不再增加时终 止发酵，检测虾青素含量为700×10-3g/L，纯度30％。
实施例7 30L发酵罐发酵：发酵培养基中七水硫酸锌0、三氯化铁(Fe3+)0.035g/L
(1)酵母种子培养：首先，取出-80℃保存的酵母种子甘油管，按0.5％比例接种于一级 YPD液体培养基，30℃、200rpm摇床过夜培养；之后再按1％接种于二级相同培养基中，培 养9h，种子OD600达6～10。
其中YPD培养基为：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L。配制好后118℃灭菌30min。
(2)接种发酵培养基：将上述制备的二级种子液按1％比例接种至装有30L发酵培养基 的发酵罐中，发酵温度30℃，通气量1vvm。发酵过程用氨水控制pH≥5.8，维持溶氧≥30％。
其中发酵培养基为：葡萄糖20.0g/L，酵母粉5.0g/L，蛋白胨2.5g/L，玉米浆10.0g/L， 硫酸铵7.5g/L，磷酸二氢钾8.0g/L，硫酸镁3.0g/L，三氯化铁0.035g/L。配制好后121℃灭 菌30min。
(3)过程补料：当培养基中糖耗完时开始流加葡萄糖9.0g/L/h；当细胞OD600达到150±50时开始流加乙醇，维持发酵液中乙醇浓度1.0～15.0g/L。当虾青素含量不再增加时终 止发酵，检测虾青素含量为1420×10-3g/L，纯度59％。
实施例8 30L发酵罐发酵：发酵培养基中七水硫酸锌0、柠檬酸铁铵(Fe3+)0.56g/L
(1)酵母种子培养：首先，取出-80℃保存的酵母种子甘油管，按0.5％比例接种于一级 YPD液体培养基，30℃、200rpm摇床过夜培养；之后再按1％接种于二级相同培养基中，培 养9h，种子OD600达6～10。
其中YPD培养基为：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L。配制好后118℃灭菌30min。
(2)接种发酵培养基：将上述制备的二级种子液按1％比例接种至装有30L发酵培养基 的发酵罐中，发酵温度30℃，通气量1vvm。发酵过程用氨水控制pH≥5.8，维持溶氧≥30％。
其中发酵培养基为：葡萄糖20.0g/L，酵母粉5.0g/L，蛋白胨2.5g/L，玉米浆10.0g/L， 硫酸铵7.5g/L，磷酸二氢钾8.0g/L，硫酸镁3.0g/L，柠檬酸铁铵0.56g/L。配制好后121℃灭菌30min。
(3)过程补料：当培养基中糖耗完时开始流加葡萄糖9.0g/L/h；当细胞OD600达到150±50时开始流加乙醇，维持发酵液中乙醇浓度1.0～15.0g/L。当虾青素含量不再增加时终 止发酵，检测虾青素含量为460×10-3g/L，纯度54％。
实施例9 30L发酵罐发酵：发酵培养基中七水硫酸锌0、柠檬酸铁铵(Fe3+)0.2g/L
(1)酵母种子培养：首先，取出-80℃保存的酵母种子甘油管，按0.5％比例接种于一级 YPD液体培养基，30℃、200rpm摇床过夜培养；之后再按1％接种于二级相同培养基中，培 养9h，种子OD600达6～10。
其中YPD培养基为：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L。配制好后118℃灭菌30min。
(2)接种发酵培养基：将上述制备的二级种子液按1％比例接种至装有30L发酵培养基 的发酵罐中，发酵温度30℃，通气量1vvm。发酵过程用氨水控制pH≥5.8，维持溶氧≥30％。
其中发酵培养基为：葡萄糖20.0g/L，酵母粉5.0g/L，蛋白胨2.5g/L，玉米浆10.0g/L， 硫酸铵7.5g/L，磷酸二氢钾8.0g/L，硫酸镁3.0g/L，柠檬酸铁铵0.2g/L。配制好后121℃灭 菌30min。
(3)过程补料：当培养基中糖耗完时开始流加葡萄糖9.0g/L/h；当细胞OD600达到150 ±50时开始流加乙醇，维持发酵液中乙醇浓度1.0～15.0g/L。当虾青素含量不再增加时终止发 酵，检测虾青素含量为1175×10-3g/L，纯度66％。
实施例10 20吨发酵放大生产：七水硫酸锌0、柠檬酸铁铵(Fe3+)0.013g/L
(1)酵母种子培养：首先，取出-80℃保存的酵母种子甘油管，按0.5％比例接种于一级 YPD液体培养基，30℃、200rpm摇床过夜培养；之后再按1％接种于装有300L的YPD培养基的种子罐中，30℃培养11h，种子OD600达6～10。
其中YPD培养基为：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L。配制好后118℃灭菌30min。
(2)接种发酵培养基：将上述制备的二级种子液按2％比例接种至装有15000L发酵培 养基的发酵罐中，发酵温度30℃，通气量0.5vvm。发酵过程用氨水控制pH≥5.8，维持溶氧 ≥30％。
其中发酵培养基为：葡萄糖20.0g/L，酵母粉5.0g/L，蛋白胨2.5g/L，玉米浆20.0g/L， 硫酸铵7.5g/L，磷酸二氢钾8.0g/L，硫酸镁3.0g/L，柠檬酸铁铵0.013g/L。配制好后121℃ 灭菌30min。
(3)过程补料：培养基中糖耗完时开始流加葡萄糖9.0g/L/h；当细胞OD600达到150±50 时开始流加乙醇，维持发酵液中乙醇浓度1.0～15.0g/L。发酵56h，检测虾青素含量为1430×10-3 g/L，纯度68％。如图1所示。
结论：摇瓶实验和发酵罐放大实验均表明，在发酵培养基中加入Zn+，均可抑制虾青素 的产量，降低虾青素的纯度；反之，添加Fe离子(Fe2+、Fe3+)，在一定浓度范围内，均可以 促进虾青素的合成，提高虾青素的产量和纯度，而且添加Fe3+的效果会更优。本发明的发酵 方法真正实现了虾青素的高产和高纯度，且简单高效安全。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或 “一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于 本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的 是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个 实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以 将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的， 不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进 行变化、修改、替换和变型。

Claims (2)

1.采用发酵培养基生产虾青素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)种子培养：取酿酒酵母种子甘油管，按0.5％～10％的比例接种于一级YPD液体培养基，在25～32℃、150～250rpm摇床过夜培养；之后再按0.5％～10％的比例接种于二级相同培养基中，培养6～18h，使种子OD600达到6～15；
(2)发酵培养：将步骤(1)制备的二级种子液按0.5％～10％的比例接种于发酵培养基，培养温度25～32℃，通气量0.5～2.0vvm，发酵过程用碱液控制pH≥5.5，维持溶氧≥20％；
(3)补料培养：当培养基中糖耗完时，开始流加葡萄糖5～15g/L/h；当细胞OD600达到100～200时开始流加乙醇，维持发酵液中乙醇浓度1.0～15.0g/L；当虾青素含量不再增加时终止发酵，利用HPLC法检测虾青素组分；
所述的发酵培养基中不含锌离子，含三价铁离子，所述的铁离子在发酵培养基中的浓度为0.013～0.2g/L；
所述的三价铁离子包括选自柠檬酸铁、柠檬酸铁铵、三氯化铁、硝酸铁的至少之一；
所述的发酵培养基中还包含其他组分：葡萄糖10.0～40.0g/L，酵母粉2.5～20.0g/L，蛋白胨2.5～20.0g/L，玉米浆5.0～20.0g/L，硫酸铵3.0～15.0g/L，磷酸二氢钾4.0～12.0g/L，硫酸镁1.0～5.0g/L；
所述的酿酒酵母的构建方法如下：
将三孢布拉霉菌来源的类胡萝卜素合成基因BtcrtI、BtcrtE和BtcrtYB以及细菌来源PacrtZ和BscrtW基因整合至酿酒酵母HEC-YLK基因组上，并将外源基因置于诱导型启动子pGAL1、pGAL10或组成型启动子pTEF1、pPGK1的控制下进行表达；
所述的酿酒酵母HEC-YLK的保藏编号：CCTCC NO：M2018062，保藏单位是：中国典型培养物保藏中心。
2.根据权利要求1 所述的方法，其特征在于，所述的YPD液体培养基包含葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L。
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