CN118006810A - 一种基于RPA-CRISPR/Cas13a-LFD技术的副溶血性弧菌核酸检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用于现场及床边诊断副溶血性弧菌核酸检测试剂盒及检测方法，本发明首先利用RPA实现toxR DNA片段的大量扩增，然后将扩增片段通过T7 RNA聚合酶体外转录为单链ssRNA，CrRNA与靶标ssRNA互补结合后激活Cas13a蛋白的附带切割活性对RNA报告基团切割，结合LFD实现结果可视化，完成检测。该试剂盒检测过程中整个反应在39℃恒温条件下进行，50分钟内即可通过试纸条肉眼判读结果。该诊断试剂盒具有灵敏，特异，便携，检测简便易上手等优点，适用于副溶血性弧菌患者的临床诊断及疫区的食品和环境评估。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，公开了一种基于RPA-CRISPR/Cas13a-LFD技术的副溶血性弧菌核酸检测试剂盒及检测方法。
背景技术
副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus，V.parahaemolyticus)是一种常见的革兰氏阴性弧菌，具有嗜盐性，不但在于鱼、虾、贝类等多种海产品中均有检出，而且在即食食品中也有副溶血性弧菌检出的案例。副溶血性弧菌感染不但会造成以水样腹泻、恶心、呕吐、腹部痉挛等为特征的胃肠道疾病，还会引起伤口感染，严重者可导致败血症、休克甚至死亡。世界范围内多个国家都有副溶血性弧菌胃肠炎暴发的报道，表明其已成为常见且重要的公共卫生问题之一。在我国，副溶血性弧菌是导致感染性腹泻的第二大病原菌。因此，建立灵敏、快速的检测方法对于为临床提供有效诊断、控制副溶血性弧菌感染、保护公众健康有重要意义。副溶血性弧菌携带多种毒力因子，其中toxR基因可编码跨膜蛋白，参与细菌细胞膜的形成和某些毒力基因的转运和表达，且在副溶血性弧菌的种内相对保守，具有较高的特异性，常被选做核酸检测的靶点。
目前，常用的副溶血性弧菌的检测方法有：病原学诊断、免疫学诊断以及分子生物学诊断等，其中分离培养鉴定被认为是副溶血性弧菌检测的“金标准”，但其耗时、费力不能满足快速检测的需要；免疫学诊断常用技术有酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)、胶体金检测等，需要制备高品质抗原、特异性抗体所需费用高、耗时长，受干扰因素较多容易发生交叉反应造成假阳性结果或在窗口期因检测灵敏度不够造成假阴性结果。随着分子生物学的快速发展，包括定量PCR及多重PCR等在核酸检测技术被广泛应用于副溶血性弧菌的快速检测，PCR方法通常需要专业且昂贵的仪器、复杂的检测流程和专业的操作人员，因此不便于在无专业仪器的基层实验室和非实验室场景下实现快速检测。恒温扩增技术如RPA和环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)技术等因不需要专业仪器和专业技术人员被越来越多的应用于非实验室场景下的病原菌核酸快速检测。不同恒温扩增技术各有优缺点，RPA与LAMP相比具有引物设计相对简单、在37-42℃恒温下30min内即可实现核酸体外大量扩增的优点；但其样品的前处理过程以及核酸的提取如采用商品化试剂盒仍然需要离心机等小型设备且耗时较长，在某种程度上限制了RPA应用于核酸检测方法发展，因此改良现有核酸提取方式也将更有利于将RPA应用于现场检测。
CRISPR-Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associatedprotein)是原核生物内的适应性免疫系统，当特异性crRNA识别DNA或RNA靶标时不同CRISPR-Cas核酸酶即表现出特异性切割活性。目前，已鉴定出的CRISPR-Cas系统有三个型，其中II型系统在靶向切割时仅需一种核酸内切酶、一条导引RNA和一个原间隔区相邻基序(protospacer adjacent motif,PAM)。Cas13a(亦称为C2c2)是II型CRISPR-Cas系统中一种单效应RNA引导的RNA酶，在特异性识别其ssRNA靶标后被激活并发挥非特异性核酸内切酶活性，通过对非靶标ssRNA的附带切割(ssRNA连接荧光猝灭基团对或生物素报告基团)实现检测信号放大，来提高检测体系的灵敏度与特异性。Cas13a可在非温度循环的情况下对特定的核酸序列进行切割，提示CRISPR/Cas13a系统与等温扩增方法相结合可较大程度的增强恒温扩增检测方法的灵敏度。Zhang等将RPA技术和CRISPR-Cas13a系统结合建立了SHERLOCK(specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking)核酸检测体系并成功应用于寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)、登革热病毒(Dengue virus，DENV)及其它病原体的快速检测，该技术具有较高灵敏度和较优的特异性，在病原体核酸快速检测方面具有重要的应用价值。RPA与CRISPR-Cas13a系统相结合的检测可在同一容器中进行，简化了检测流程，降低了污染风险。此外，Cas13a蛋白可附带切割ssRNA核酸探针，进而通过检测荧光或在侧流层析(lateral flow dipstick，LFD)试纸条上显示结果；LFD试纸条便携、结果肉眼即可判读，不需要荧光检测仪从而更适于现场和资源匮乏地区检测。
本研究旨在以副溶血性弧菌toxR基因为检测靶点，基于RPA-CRISPR/Cas13a反应体系建立一种简单、高效、便携的副溶血性弧菌核酸快速检测方法，可在40℃等温条件下，50min内完成样本检测，为副溶血性弧菌致病菌的非实验室场景下的快速检测提供便捷手段。
发明内容
本发明的目的是针对目前副溶血性弧菌所致食源性疾病诊断技术及副溶血性弧菌环境评估存在的缺陷，提供一种新型的基于RPA-CRISPR/Cas13a-LFD技术的，具有特异，灵敏，快速，简便，高效的副溶血性弧菌核酸检测试剂盒及检测方法。
为了实现上述目的本发明采取的技术方案是：提供一种副溶血性弧菌的核酸检测试剂盒，该试剂盒含有：
(1)RPA冻干颗粒：噬菌体重组酶UvsX及其辅助因子UvsY、DNA聚合酶、单链
DNA结合蛋白(gp32)、dNTPS；
(2)缓冲液1：Rehydration Buffer；
(3)T7 RNA聚合酶；
(4)醋酸镁；
(5)RPA反应引物：
F1：AACTCATTTGTACTGTTGAACGCCTAAGCCC；
R1：AGGTACTACTGGCGCTTCTGGTTCAACGATT；
(6)缓冲液2：HEPES缓冲剂；
(7)氯化镁(MgCl2)；
(8)cas13a蛋白；
(9)RNase抑制剂；
(10)crRNA：gaaattaatacgactcactatagggAAGGCGUCGCUAAAGGCGGCUCUACGAU；
(11)ssRNA报告基团：/FAM/mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA/Bio/；ssRNA5’端
用FAM标记，3’端用BHQ1标记；
(12)阴性对照为双蒸水；
(13)阳性对照为副溶血性弧菌基因组DNA。
本发明还提供一种利用上述试剂盒检测副溶血性弧菌核酸的检测方法，包括以下步骤：
(1)基因组DNA提取：利用相应的核酸提取方法或者基因组提取试剂盒对患者血液完成基因组DNA的提取。
(2)引物设计：从Genebank获取副溶血性弧菌和多个常见弧菌的toxR基因序列进行比对，选取在不同弧菌间有良好的序列多样性的区段作为检测靶区，利用Oligo7.0软件设计合成RPA引物。
F1：CATTGAITGGGTICCCACTGGCCGCACGAC；
R1：CAGCATITCATGGGAITTGGGGAGATACGG。
crRNA和ssRNA设计：在设计完成的引物对区间设计相应的crRNA和ssRNA.
crRNA：gaaattaatacgactcactatagggAAGGCGUCGCUAAAGGCGGCUCUACGAU ssRNA报告基团：/FAM/mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA/Bio/ssRNA 5’端用FAM标记，3’端用BHQ1标记。
引物、crRNA和ssRNA由上海生工生物工程有限公司合成。
(3)反应体系：在RPA冻干颗粒中【噬菌体重组酶UvsX及其辅助因子UvsY、DNA
聚合酶、单链DNA结合蛋白(gp32)、dNTPS】加入29.5μL Rehydration Buffer，2.1μL 10μMPrimer A，2.1μL 10μM Primer B，1.2μL DEPC水，3μL T7 RNA聚合酶，4μL三磷酸核糖核苷混合物，上下颠倒反应管使之充分混匀后再次离心。随后在RPA反应管中加入0.5μL乙酸镁，启动RPA扩增。RPA反应完成后，将CRISPR/Cas13a反应体系(置于管盖)：0.4μLHEPES、1μL MgCl2、1μL LwaCas13a、1μL RNase抑制剂、1μL crRNA和1μL LFD报告基团通过短暂离心与RPA反应产物混合。然后将混合物在37℃孵育25分钟。反应结束后，向每个反应管中加入80μL HybriDetect检测缓冲液。随后，将试纸放入每个反应管中，让反应混合物流到试纸上，然后读取结果。
(4)结果判定：含有副溶血性弧菌基因组DNA的反应管LFD试纸条检测线和质控线均出现明显条带，阴性对照仅质控线出现条带。
本发明的有益效果在于：
本发明利用RPA-CRISPR/Cas13a-LFD技术建立副溶血性弧菌的检测方法。这一方法同现有检测技术相比，其灵敏度与特异性与RT-PCR法相当，远远高于病原学方法、免疫学方法。然而RT-PCR需要昂贵的热循环仪器，对环境及人员要求较高，整个反应需要90min以上，相比之下，本专利建立的RPA-CRISPR/Cas13a-LFD试剂盒所需仪器轻巧便携，整个反应时间在50min内完成，结果判定仅需通过肉眼观测试纸条条带变化来判定。总而言之，该检测试剂盒具有灵敏，特异，结果判定简便，快捷等优点。不仅适用于床边诊断而且可以用于现场研究，环境评估。
附图说明：
图1为副溶血性弧菌特异性分析；
图2为副溶血性弧菌灵敏度分析。
具体实施方式
实施例1
(1)模板：利用相应的核酸提取方法或者基因组提取试剂盒对7株菌株(分别是：副溶血性弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌、梅氏弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌)
基因组进行DNA的提取。
(2)引物设计：从Genebank获取副溶血性弧菌和多个常见弧菌的toxR基因序列进行比对，选取在不同弧菌间有良好的序列多样性的区段作为检测靶区，利用Oligo7.0软件设计合成RPA引物。
F1：CATTGAITGGGTICCCACTGGCCGCACGAC；
R1：CAGCATITCATGGGAITTGGGGAGATACGG。
crRNA和ssRNA设计：在设计完成的引物对区间设计相应的crRNA和ssRNA。
crRNA：gaaattaatacgactcactatagggAAGGCGUCGCUAAAGGCGGCUCUACGAU
ssRNA报告基团：/FAM/mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA/Bio/；ssRNA 5’端用FAM标记，3’端用BHQ1标记。
引物、crRNA和ssRNA由上海生工生物工程有限公司合成。
(3)反应体系：在RPA冻干颗粒中【噬菌体重组酶UvsX及其辅助因子UvsY、DNA
聚合酶、单链DNA结合蛋白(gp32)、dNTPS】加入29.5μL Rehydration Buffer，2.1μL 10μMPrimer A，2.1μL 10μM Primer B，1.2μL DEPC水，3μL T7 RNA聚合酶，4μL三磷酸核糖核苷混合物，上下颠倒反应管使之充分混匀后再次离心。随后在RPA反应管中加入0.5μL乙酸镁，启动RPA扩增。RPA反应完成后，将CRISPR/Cas13a反应体系(置于管盖)：0.4μLHEPES、1μL MgCl2、1μL LwaCas13a、1μL RNase抑制剂、1μL crRNA和1μL LFD报告基团通过短暂离心与RPA反应产物混合。然后将混合物在37℃孵育25min。反应结束后，向每个反应管中加入80μL HybriDetect检测缓冲液。随后，将试纸放入每个反应管中，让反应混合物流到试纸上，然后读取结果。
(4)实验结果：如图1所示，含有副溶血性弧菌基因组DNA的反应管LFD试纸条检测线和质控线均出现明显条带，溶藻弧菌、河流弧菌、梅氏弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、阴性对照仅质控线出现条带。
实施例2
(1)基因组DNA准备：将合成的含有副溶血性弧菌toxR质粒依次稀释为1×106copies/μL、1×105copies/μL、1×104copies/μL、1×103copies/μL、1×102copies/μL、1×101copies/μL、1copies/μL备用
(2)引物设计：从Genebank获取副溶血性弧菌和多个常见弧菌的toxR基因序列进行比对，选取在不同弧菌间有良好的序列多样性的区段作为检测靶区，利用Oligo7.0软件设计合成RPA引物。
F1：CATTGAITGGGTICCCACTGGCCGCACGAC；
R1：CAGCATITCATGGGAITTGGGGAGATACGG。
crRNA和ssRNA设计：在设计完成的引物对区间设计相应的crRNA和ssRNA.
crRNA：gaaattaatacgactcactatagggAAGGCGUCGCUAAAGGCGGCUCUACGAU
ssRNA报告基团：/FAM/mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA/Bio/ssRNA 5’端用FAM标记，3’端用BHQ1标记。
副溶血性弧菌质粒、引物、crRNA和ssRNA由上海生工生物工程有限公司合成。
(3)反应体系：在RPA冻干颗粒中【噬菌体重组酶UvsX及其辅助因子UvsY、DNA
聚合酶、单链DNA结合蛋白(gp32)、dNTPS】加入29.5μL Rehydration Buffer，2.1μL 10μMPrimer A，2.1μL 10μM Primer B，1.2μL DEPC水，3μL T7 RNA聚合酶，4μL三磷酸核糖核苷混合物，上下颠倒反应管使之充分混匀后再次离心。随后在RPA反应管中加入0.5μL乙酸镁，启动RPA扩增。RPA反应完成后，将CRISPR/Cas13a反应体系(置于管盖)：0.4μLHEPES、1μL MgCl2、1μL LwaCas13a、1μL RNase抑制剂、1μL crRNA和1μL LFD报告基团通过短暂离心与RPA反应产物混合。然后将混合物在37℃孵育25min。反应结束后，向每个反应管中加入80μL HybriDetect检测缓冲液。随后，将试纸放入每个反应管中，让反应混合物流到试纸上，然后读取结果。
(4)实验结果：如图2所示，当副溶血性弧菌toxR质粒浓度为1×106copies/μL、1×105copies/μL、1×104copies/μL、1×103copies/μL、1×102copies/μL、1×101copies/μL、1copies/μL时LFD试纸条检测线和质控线均出现明显条带，灵敏度高，阴性对照仅质控线出现条带。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修
饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (2)
1.一种副溶血性弧菌核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
RPA冻干颗粒：噬菌体重组酶UvsX及其辅助因子UvsY、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白gp32、dNTPS；
缓冲液1：Rehydration Buffer；
T7 RNA聚合酶；
醋酸镁；
RPA反应引物：
Primer A：AACTCATTTGTACTGTTGAACGCCTAAGCCC；
Primer B：AGGTACTACTGGCGCTTCTGGTTCAACGATT；
缓冲液2：HEPES缓冲剂；
氯化镁；
cas13a蛋白；
RNase抑制剂；
crRNA：gaaattaatacgactcactatagggAAGGCGUCGCUAAAGGCGGCUCUACGAU；
ssRNA报告基团：/FAM/mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA/Bio/；所述ssRNA的 5’端用FAM标记，3’端用BHQ1标记；
阴性对照为双蒸水；
阳性对照为副溶血性弧菌基因组DNA。
2.一种利用权利要求1所述的试剂盒检测副溶血性弧菌核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）引物设计：从Genebank获取副溶血性弧菌和多个常见弧菌的toxR基因序列进行比对，选取在不同弧菌间有良好的序列多样性的区段作为检测靶区，利用Oligo7.0软件设计合成RPA引物；
（2）crRNA和ssRNA设计：在设计完成的引物对区间设计相应的crRNA和ssRNA；
（3）反应体系：取反应管，加入RPA冻干颗粒中，加入29.5μL Rehydration Buffer，2.1μL 10μM Primer A，2.1μL 10μM Primer B，1.2μL DEPC水，3μL T7 RNA聚合酶，4μL 三磷酸核糖核苷混合物，1μL模板，上下颠倒反应管使之充分混匀后再次离心；随后在 RPA 反应管中加入 0.5 μL 醋酸镁，启动 RPA 扩增；
RPA 反应完成后，将 CRISPR/Cas13a 反应体系： 0.4μL HEPES、1μL MgCl2、1 μLLwaCas13a、1μL RNase 抑制剂、1 μL crRNA和1μL LFD 报告基团通过短暂离心与 RPA 反应产物混合；然后将混合物在 37°C 孵育 25 分钟；反应结束后，向每个反应管中加入 80μL HybriDetect 检测缓冲液；随后，将试纸放入每个反应管中，让反应混合物流到试纸上，然后读取结果；
（4）结果判定：含有副溶血性弧菌基因组DNA的反应管LFD试纸条检测线和质控线均出现明显条带，阴性对照仅质控线出现条带。
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