CN118006649A - 一种高响应范围的精氨酸生物传感器及其构建方法和应用 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明涉及一种高响应范围的精氨酸生物传感器及其构建方法和应用。具体地,本发明提供了一种精氨酸生物传感器,其包括argP基因突变体模块,抗性基因模块和tRNA模块;其中,所述argP基因突变体模块包括argP基因突变体,所述argP基因突变体是通过将亲本argP基因的一个或多个精氨酸密码子置换为终止密码子而获得的;所述抗性基因模块包括启动子PargO基因和抗性基因;所述tRNA模块包括tRNA和tRNA启动子,其中所述tRNA是能够识别并携带精氨酸至翻译位点并且能够通读终止密码子的tRNA。本发明通过将argP基因中引入一个或两个精氨酸密码子突变并引入tRNA模块,大大提高了灵敏度和响应范围,能有效地筛选出应用于工业化大规模生产的精氨酸高产菌株。
Description
技术领域
本发明涉及精氨酸的特异性生物传感器及其应用,属于基因工程技术领域。
背景技术
精氨酸是人体必需的一种氨基酸,亦是构成蛋白质的基本单位,存在于多种动物类食物中。精氨酸除了参与蛋白质合成以外,还在能量代谢、细胞凋亡和DNA修复等生物学过程中发挥重要作用。例如,有研究表明,精氨酸是生物体尿素循环的重要中间代谢产物,是肌体合成细胞浆蛋白和核蛋白的重要物质,还是天门冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、聚胺(腐胺、精胺)等转换为高能磷酸化合物磷酸肌酸的中间体,具有独特的生理和药理作用,因此,其在食品、医药和化妆品等领域有十分广泛的用途。根据市场研究报告,2020年精氨酸全球市场规模3.33亿美元,预计在2026年达到3.64亿美元,年复合增长率1.5%。亚太地区是精氨酸市场的主要消费区,占据了全球市场份额的40%以上,而北美和欧洲市场也在逐步增长,因此,精氨酸具有广阔的应用前景。
近年来,提高氨基酸菌株产量的方法有理性设计、半理性改造、非理性诱变筛选等策略,例如,基于代谢工程和基因工程等理性策略,可以显著提高氨基酸菌株的产量。然而,由于对细胞本身的认知有限,只基于理性改造的策略往往不能达到工业生产的要求,因此,基于生物传感器的半理性改造和非理性诱变的策略被广泛使用。目前,大多数精氨酸生物传感器是利用精氨酸调控蛋白等元件而建立的,这些生物传感器可以响应细胞内精氨酸的浓度。基于这些生物传感器,通过物理、化学诱变等策略,可以筛选出精氨酸高产菌株。但是目前现有的精氨酸生物传感器响应精氨酸的范围比较低,导致不能有效地筛选出应用于工业化大规模生产精氨酸菌株。因此,急需找到一种灵敏度更高并且响应范围更高的生物传感器用于筛选精氨酸高产菌株以克服现有筛选方法的缺陷。
JIANG等人(Jiang S,Wang R,Wang D,et al.Metabolic reprogramming andbiosensor-assisted mutagenesis screening for high-level production of L-arginine in Escherichia coli[J].Metabolic engineering,2023.)基于argP基因表达产生转录因子ArgP,与启动子PargO结合,抑制相关基因的表达,而L-精氨酸存在时与转录因子ArgP结合,激活启动子PargO控制的相关基因表达的原理,设计了一个质粒pABIO1作为生物传感器,以绿色荧光的强弱来反映L-精氨酸的浓度。并以此为基础,将GFP基因替换为抗卡那霉素的基因,由此得到一个筛选平台,利用诱变的方法挖掘有益的靶基因,成功构建了高效的L-精氨酸生产菌株。但是,该生物传感器的灵敏度低且响应范围小,本发明通过将argP基因中引入一个或多个精氨酸密码子突变并在传感器中引入tRNA模块,大大提高了灵敏度和响应范围。
发明内容
在本发明的第一方面,提供了一种灵敏度和响应范围更高的精氨酸生物传感器。具体地,本发明通过将argP基因中引入一个或多个精氨酸密码子突变并在传感器中引入能够通读上述突变基因的tRNA模块,大大提高了灵敏度和响应范围,能有效地筛选出应用于工业化大规模生产的精氨酸高产菌株,其设计原理可参见图1并解释如下:
在大肠杆菌中,精氨酸可以诱导argP基因的转录因子进行翻译表达,当argP基因表达时,可以激活PargO启动子(PargO)而导致其所连接的argO基因的表达。当将PargO启动子与抗性基因连接时,细胞内精氨酸浓度可以调控PargO启动子的激活从而可以调控其所连接的抗性基因的表达。因此,在该抗性基因所对应的抗性条件下,精氨酸高产菌株会被筛选出来。此外,本发明还使用了特殊tRNA(其为已报道的人工筛选改造的特殊tRNA,其具有一定概率的通读终止密码子例如UAG或TAG能力,其与普通携带精氨酸的tRNA区别之处包括反密码子改变,在本发明中该tRNA的序列如SEQ ID NO:5所示)。通过在argP基因中引入精氨酸密码子突变和tRNA模块双重限制,本发明的传感器提高了精氨酸的响应范围。当argP基因上的精氨酸密码子改变成TAG时,翻译终止导致蛋白无法正常表达;在精氨酸不存在或仅少量存在的情况下,PargO启动子无法被激活,导致PargO启动子下游的抗性基因的表达受到抑制,菌株在抗性条件下无法生长。在精氨酸存在条件下,tRNA模块与之形成精氨酰化tRNA,识别mRNA上的UAG,使得本该终止翻译的蛋白继续翻译表达,argP基因的顺利表达可以激活PargO启动子并导致其所连接的抗性基因的表达;提高精氨酸的浓度能提升精氨酸氨酰化tRNA的浓度,使得通读UAG密码子的概率提升,从而增加PargO启动子的激活水平并增加抗性基因的表达,因此,可以根据菌株生长情况选择精氨酸生产能力相对强的菌株。
在本发明中,通过三个独立的模块(argP基因突变体模块,抗性基因模块和tRNA模块),将argP基因,PargO及特殊tRNA联合响应构建精氨酸生物传感器元件。
本发明通过基因工程、蛋白质工程对精氨酸生物传感器进行改良,提高了其响应精氨酸的范围并提高了灵敏度。其中,由于具有argP基因中引入精氨酸密码子突变和tRNA模块双重限制,本发明的传感器提高了精氨酸的响应范围;其中,所述提高精氨酸的响应范围是指响应精氨酸浓度的范围较高(即,提高了精氨酸响应浓度的上限和下限),本发明的精氨酸生物传感器可用于从本身精氨酸浓度低的底盘菌株的一系列变体中筛选获得精氨酸产量相对较高的菌株变体,或者也可用于从本身精氨酸浓度高的底盘菌株的一系列变体中筛选获得精氨酸产量相对更高的菌株变体。在本发明中,所述传感器可用于筛选0-130g/L精氨酸产能的菌株,而现有技术传感器响应范围低,仅用于筛选约60-70g/L精氨酸产能的菌株。
在本发明的具体实施方案中,所述argP基因突变体为原始argP基因序列中对应第71位和/或120位精氨酸(即,argP基因所编码的氨基酸序列SEQ ID NO:2中第71位和/或120位精氨酸)的密码子替换为TAG,原始argP基因序列见SEQ ID NO:1,PargO启动子序列见SEQID NO:3,tRNA为已报导的能识别终止密码子UAG或TAG的精氨酸-tRNA,其序列见SEQ IDNO:5;tRNA启动子的序列见SEQ ID NO:6。
所述PargO启动子的序列:
ATAACAATCCCGCGATATAGTCTCTGCATCAGATACTTAATTCGG AATATCCAAC(SEQ ID NO:3)
所述tRNA的序列:
GCCCGGATAGCTCAGCTGGaTAGAGCGGGGATTCTAAATCCCCG TGtCCTTGGTTCGAATCCGAGTCCGGGCACCA(SEQ ID NO:5)
所述tRNA启动子的序列:
aagtgccttcccatcaaaaaaatattctcaacataaaaaactttgtgtaatacttgtaacgctacatggagatt aactcaa(SEQ ID NO:6)
所述tRNA模块的序列:
aagtgccttcccatcaaaaaaatattctcaacataaaaaactttgtgtaatacttgtaacgctacatggagattaactcaaGCCCGGATAGCTCAGCTGGaTAGAGCGGGGATTCTAAATCCCCGTGtCCTTGGTTCGAATCCGAGTCCGGGCACCAcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaatccgccgccctagacctaggggatatattccgcttcctcgc(SEQ ID NO:4)
在本发明的具体实施方案中,所述精氨酸传感元件为在SEQ ID NO:9所述重组质粒基础上将原始argP基因序列第71位精氨酸对应的密码子替换为TAG后所得的重组质粒,即SEQ ID NO:11所示(pSTV-ArgP(1TAG))。
在本发明的具体实施方案中,所述精氨酸传感元件为在SEQ ID NO:12所述重组质粒基础上将原始argP基因序列第71位精氨酸对应的密码子替换为TAG后所得的重组质粒,即SEQ ID NO:13所示(pTrc-ArgP(1TAG))。
在本发明中,tRNA序列可自行合成或委托公司合成,例如由通用生物(安徽)股份有限公司进行基因全合成。
本发明中,菌株产生精氨酸的能力是指当在培养基中培养利用本发明所述方法筛选出来的精氨酸生产菌株时,在培养基或细胞中积累精氨酸的能力,其可通过转化率进行评价。其中,所述转化率是指糖酸转化率(即每克葡萄糖生产精氨酸的量),是本领域用于判断氨基酸生产效果的常规参数。
在本发明的具体实施方案中,所使用的底盘菌株是能够生产精氨酸的任何野生型或重组型的细菌和真菌,例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、蓝细菌、丝状真菌、或酵母菌。
在本发明的具体实施方案中,所述tRNA是指携带精氨酸反密码子从而能够正常携带精氨酸至翻译位点并且同时具有通读终止密码子例如UAG能力的tRNA,其可使用现有技术中已知的此类tRNA。本发明示例性tRNA序列为SEQ ID NO:5,或者也可使用现有技术已知的能够正常携带精氨酸至翻译位点并且同时能够通读终止密码子的其他tRNA。
在本发明中,所述终止密码子是指在mRNA翻译过程中,起蛋白质合成终止信号作用的密码子,包括UAG,UAA,UGA(优选UAG),其相应的DNA上的终止密码子序列为TAG,TAA,TGA。
在本发明的具体实施方案中,所述tRNA启动子可使用本领域常规启动子,只要其能够启动下游tRNA的表达即可,例如可使用Ptrc,PM1-37,PM1-93启动子。
在本发明的具体实施方案中,可将argP基因中的任意一个或多个(例如2个、3个或4个)精氨酸密码子替换为终止密码子TAG,因为任何位点精氨酸密码子替换为终止密码子均会影响argP基因的翻译从而影响抗性基因的表达,突变位置并不影响翻译通读效率,在无法通读的情况下,不同突变位置所带来的结果仅仅是提前终止翻译的位置不同。本发明仅示例性选取了argP基因中较为靠近上游侧的71位和120位精氨酸密码子进行突变,但并不限于所述特定位点,argP基因编码区内的任何精氨酸密码子均可以实现本发明的效果,例如位点53位,58位,130位。
在本发明的第二方面,还提供了精氨酸生物传感器的构建方法,其包括:将所述argP基因突变体模块,所述抗性基因模块和所述tRNA模块分别引入相同或不同的质粒中。当所述三个模块位于相同质粒中时,本发明的生物传感器是单独的核苷酸链或单独的质粒的形式,当所述三个模块位于不同质粒中时,本发明的生物传感器是质粒混合物的形式。
本发明中,当上述所述argP基因突变体模块,所述抗性基因模块和所述tRNA模块引入不同的质粒中时,所述精氨酸生物传感器包含三个重组质粒。
在本发明的第三方面,还提供了所述精氨酸生物传感器在筛选精氨酸高产菌株中的应用。
在本发明的第四方面,还提供了筛选精氨酸高产菌株的方法,其包括将所述精氨酸生物传感器引入待筛选菌株中并在所述抗性基因所对应的抗生素条件下进行培养,选择菌株生长情况相对好的菌株,即为精氨酸生产能力相对强的菌株。
在本发明的具体实施方案中,通过检测培养液中的OD600值进行选择,OD600值相对高的培养液所对应的菌株即为精氨酸生产能力相对强的菌株;或者可直接通过菌株长势例如菌落大小进行选择,菌落相对较大的菌株即为精氨酸生产能力相对强的菌株。
具体地,本发明提供了以下技术方案:
1.一种精氨酸生物传感器,其包括argP基因突变体模块,抗性基因模块和tRNA模块;其中,
所述argP基因突变体模块包括argP基因突变体,所述argP基因突变体是通过将亲本argP基因的一个或多个精氨酸密码子置换为终止密码子而获得的;
所述抗性基因模块包括启动子PargO基因和抗性基因;
所述tRNA模块包括tRNA和tRNA启动子,其中所述tRNA是能够识别并携带精氨酸至翻译位点并且能够通读终止密码子的tRNA。
2.根据项目1所述的精氨酸生物传感器,其中,所述终止密码子为TAG;所述argP基因突变体的序列为将SEQ ID NO:1所示的亲本argP基因的第210-213位碱基突变为TAG后的核苷酸序列;或将SEQ ID NO:1所示的亲本argP基因的第358-360位碱基突变为TAG后的核苷酸序列;或将SEQ ID NO:1所示的亲本argP基因的第210-213位碱基和第358-360位碱基同时突变为TAG后的核苷酸序列。
3.根据项目1所述的精氨酸生物传感器,其中,所述启动子PargO基因的序列如SEQID NO:3所示。
4.根据项目1所述的精氨酸生物传感器,其中,所述抗性基因提供对抗生素的抗性或耐受性;任选地,所述抗生素选自潮霉素,卡那霉素,氯霉素,青霉素,利福平,氨苄青霉素,或头孢氨苄等。
5.根据项目1所述的精氨酸生物传感器,其中,所述tRNA的序列如SEQ ID NO:5所示,任选地,所述tRNA启动子的序列如SEQ ID NO:6所示。
6.根据项目1所述的精氨酸生物传感器,其中,所述argP基因突变体模块,所述抗性基因模块和所述tRNA模块位于相同或不同的质粒中,优选相同的质粒中。
7.根据项目6所述的精氨酸生物传感器,其中,所述质粒是能够在底盘菌株中正常复制的质粒,优选pSTV质粒或pTrc质粒。
8.项目1-7中任一项所述的精氨酸生物传感器的构建方法,其包括:将所述argP基因突变体模块,所述抗性基因模块和所述tRNA模块分别引入相同或不同的质粒中。
9.项目1-7中任一项所述的精氨酸生物传感器在筛选精氨酸高产菌株中的应用。
10.筛选精氨酸高产菌株的方法,其包括将项目1-7中任一项所述的精氨酸生物传感器引入待筛选菌株中并在所述抗性基因所对应的抗生素条件下进行培养,选择菌株生长情况相对好的菌株,即为精氨酸生产能力相对强的菌株。
11.根据项目10所述的方法,其中,所述待筛选菌株是能够生产精氨酸的野生型或重组型的细菌和真菌,例如大肠杆菌,枯草芽孢杆菌,谷氨酸棒杆菌,蓝细菌,丝状真菌或酵母菌。
本发明的有益效果
本发明的新型传感器通过将argP基因中引入一个或多个精氨酸密码子突变并在传感器中引入能够通读上述突变基因的tRNA模块,大大提高了灵敏度和响应范围,以弥补现有精氨酸生物传感器响应范围不足的缺点。结合其他检测方法:例如荧光强度等,可以更有效地筛选出应用于工业化大规模生产的精氨酸高产菌株。本发明的传感器可用于筛选0-130g/L精氨酸产能的菌株,而现有技术传感器仅能用于筛选60-70g/L精氨酸产能的菌株,传感器响应范围低。
附图说明
图1是生物传感元件工作原理图;其中,a显示了在精氨酸不存在的情况下的工作原理;b显示了在精氨酸存在的情况下的工作原理。
图2是不同菌株导入pSTV-ArgP(2TAG)在回补精氨酸情况下对菌株生长的图;
图3是不同菌株导入pSTV-ArgP(TAG)在回补精氨酸情况下对菌株生长的图;
图4是不同菌株导入pTrc-ArgP(TAG)在回补精氨酸情况下对菌株生长的图;
图5是精氨酸标样的液相色谱图;
图6是实施例6中菌株Arg13发酵液的液相色谱图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,并参照附图,对本发明作进一步的详细说明。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法,所用的试剂如无特别说明均为可商购的试剂。
实施例中涉及的生物材料/试剂盒来源
pSTV28质粒,购自于武汉淼灵生物科技有限公司(http://www.miaolingbio.com/),产品编号为P20194。
pTrc-99a质粒,实验室保存,序列见SEQ ID NO:7。
pKan质粒,以pSTV为骨架,克隆有PargO,kan,和tRNA基因序列,由安徽通用公司合成,序列见SEQ ID NO:8。
细菌质粒提取试剂盒,购自苏州优逸兰迪生物科技有限公司,产品货号UE-MN-P-250。
基因产物的纯化试剂盒和胶回收试剂盒为爱思进(Axygen)的产品,产品编号为分别AP-PCR-250和AP-GX-250G。
ClonExpress IIOne Step Cloning Kit,购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司,产品货号C112-01。
2×Phanta Max Master Mix,购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司,产品货号P515-01。
Arg13菌株,参考专利CN110964683B的制备方法制备,对应于菌株E.coli W3110ARG10。
DH5α商用感受态,购自擎科生物,货号TSC-C01-100。
实施例所用的引物信息如表1所示
表1本发明所用的引物
实施例中涉及的培养基成分
LB液体培养基:蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L,溶剂为去离子水,pH为7;溶剂为去离子水,pH为7。
LB平板:在LB液体培养基基础上加入琼脂粉20g/L。
氨苄青霉素工作浓度为50μg/ml,氯霉素工作浓度25μg/ml,卡那霉素工作浓度50μg/ml。
丰富培养基,用于验证元件灵敏度,其配方为:葡萄糖2-10g/L,酵母粉1-5g/L,蛋白胨1-5g/L,KH2PO4 1-5g/L,MgSO4 1-5g/L,FeSO40.01-0.05g/L,MnSO4 0.01-0.05g/L,加入去离子水溶解,用氨水调节pH至6.9-7.1;
优选地,丰富培养基为:葡萄糖10g/L,酵母粉4g/L,蛋白胨5g/L,KH2PO4 2g/L,MgSO4 2g/L,FeSO4 0.02g/L,MnSO4 0.02g/L,氨水调节pH至pH7.0。
种子培养基:蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,氯化钠5g/L。
发酵培养基配方为:葡萄糖5-20g/L,硫酸铵5-15g/L,酵母粉1-5g/L,磷酸二氢钾1-5g/L,柠檬酸1-3g/L,消泡剂PPE 0-0.5mL/L;微量元素母液1mL/L,维生素母液1mL/L,加入去离子水溶解,罐内灭菌后氨水调节pH至6.9-7.1;
具体可为:葡萄糖20g/L,硫酸铵10g/L,酵母粉3g/L,磷酸二氢钾5g/L,柠檬酸1g/L,消泡剂0.5mL/L,微量元素母液1mL/L,维生素母液1mL/L。
上述微量元素母液组成:FeCl3 5g/L,CoCl2·6H2O 2.5g/L,MnCl2·4H2O0.15g/L,CuCl2·2H2O 1.5g/L,H3BO3 3g/L,NaMnO4·2H2O 2.5g/L,Zn(CH3COO)2·2H2O 13g/L,溶剂为去离子水;
上述维生素母液组成:维生素B1 2g/L,微生物B3 2g/L,维生素B5 2g/L,维生素B12 2g/L,维生素H 2g/L;溶剂为去离子水,过膜除菌后使用。
实施例中涉及的操作方法
本发明中,基因克隆使用2×Phanta Max Master Mix,体系为:2×Phanta MaxMaster Mix 25μL,上下游引物各0.5μL,模板1μL,蒸馏水23μL,总体积为50μL。扩增条件为95℃预变性3min,95℃变性20s、55-65℃退火20s、72℃延伸若干秒(依克隆产物长度而定),以上变性退火延伸30个循环,72℃延伸5min(1个循环)。
本发明中,使用诺唯赞的ClonExpress IIOne Step Cloning Kit进行DNA连接,其体系为:线性化载体0.03pmol,目的片段0.06pmol,5×CE buffer 4μL,Exnase 2μL,补双蒸水至20μL,37℃连接30min。
本发明中,大肠杆菌质粒转化方法可以为本领域常规的化学转化法,例如,取待化转感受态置于冰上解冻;取待转化的质粒/连接产物加入解冻的感受态细胞中,冰上静止30min,42℃热激90s;再静置于冰上2min,加入600mL LB液体培养基,37℃孵育1h,涂布于筛选平板。
本发明中,感受态细胞的制备方法可以为本领域常规的化学转化感受态制备方法。例如,取待制备感受态的菌株,划线至LB平板,挑取平板上的单菌落,接种于LB液体培养基,过夜活化,然后转接至新鲜的LB液体培养基中,培养至OD600约0.4-0.6,冰上静置10min,4000rpm,4℃离心,弃上清培养基收集菌体,用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液重悬细胞,冰上静置15-30min,4000rpm,4℃离心;弃上清,加入含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液,-80℃保存。
本发明中,菌株筛选方法可以使用本领域的常规方法,例如:a、待含有抗生素的LB平板长出菌落后,随机挑取单菌落进行菌落PCR扩增;b、将扩增实验显阳性的单菌落进行液体扩大培养;c、并利用细菌质粒提取试剂盒提取质粒,然后以该提取的质粒为模板进行PCR扩增;d、将步骤c中PCR扩增产物序列送测序公司进行测定,若测序结果与上述待合成的序列相同,则证明质粒已构建成功。
本发明中,质粒抽提的方法为试本领域常规的抽提方法,例如:a、将带有质粒的菌株接种于含相应抗生素的LB液体培养基中,在适宜温度摇床中过夜培养;b、使用小量质粒抽提试剂盒按说明书步骤抽提质粒;c、测定质粒浓度与纯度,当A260/A280值在1.8-2.0之间,质量合格。
本发明中,将野生型菌株构建突变库菌株的方法为常规诱变方法,例如,紫外线处理、亚硝基胍、常温常压等离子诱变方法对精氨酸高产菌株进行诱变处理。
本发明中,所用的诱变筛选方法为常压室温等离子体(ARTP)诱变其步骤为:将已转入传感元件的待诱变的菌株划线至固体LB平板,过夜培养;挑取单菌落至LB液体试管中过夜活化;活化的菌株转接,30-37℃培养至OD600为0.4-0.6;取菌液,4000rpm,离心2min,弃上清;无菌水重悬菌体,离心洗涤两次;无菌水重悬菌体;取10-20uL重悬菌液均匀涂布于无菌载片上,置于仪器中;设置参数功率100W,气流量10SLM,处理时间60-120s;将处理后的带菌载片放置于带无菌水的EP管中洗涤,将带有菌的水涂布于筛选培养基平板进行筛选,其生长较快的菌落进行进一步验证。
本发明中,验证筛选菌落的方法为,将转化得到的单菌落逐个转接到筛选培养基中,使用96深孔板培养10-24h。通过测定各孔菌株的生长状态和精氨酸产量,挑选生长状态最好,精氨酸产量最高的菌株作为精氨酸高产菌株,进行发酵罐验证。
本发明中,发酵培养可以为本领域常规的补料发酵方法,如取待发酵的菌株,接种至LB液体培养基上,过夜培养;活化的菌液转接至新鲜的LB培养基中,培养OD600至0.6-0.8;10-15%的接种至发酵培养基中,控制发酵温度30-37℃,通气量0.2-0.5vvm,溶氧与搅拌联控,调控至25-40%,补加氨水调控pH至6.8-7.1,通过补加葡萄糖控制罐内残糖0-1g/L,另外以1-5mL/h恒速向罐内补加30-50%的硫酸铵溶液,发酵周期是24-48h。
具体的,上述发酵调控条件可以为:发酵温度37℃,通气量0.5vvm,溶氧30%,pH7.0,残糖控制0-1g/L。
实施例1精氨酸传感器1的构建
在本实施例中,以大肠杆菌W3110基因组为模板,用引物argP-F/R,扩增argP基因(见SEQ ID NO:1);以pSTV28为底盘质粒,用引物pSTV-C-F/R扩增获得线性化质粒,通过DNA连接,转化至DH5α商用感受态细胞中,涂布于氯霉素抗性板筛选,挑单菌落进行PCR验证、测序,获取第一次重组质粒。以第一次重组质粒为模板,用引物p1-C-F/R扩增获取线性化质粒片段,所述质粒含有argP基因;以pKan质粒(其上克隆有PargO,kan,和tRNA基因序列;其具体序列可参见SEQ ID NO:8,由安徽通用生物合成)为模板,用Kan-F/R引物扩增PargO-Kan-tRNA基因。将上述PargO-Kan-tRNA基因与线性化载体(即,以第一次重组质粒为模板并用引物p1-C-F/R扩增获取的含有argP基因的线性化质粒片段)连接,转化至DH5α商用感受态细胞中,涂布于氯霉素抗性的LB固体平板筛选,挑菌进行PCR验证、测序,获取完整质粒pSTV-ArgP(该质粒含有argP基因和PargO-Kan-tRNA基因,序列参见SEQ ID NO:9)。最后,通过定点突变的方法,以pSTV-ArgP为模板,利用突变引物71-F/R和120-F/R对质粒pSTV-ArgP进行定点突变,将argP基因中精氨酸所对应的2个密码子(分别为71位和120位精氨酸所对应的密码子)替换为TAG,通过PCR扩增,纯化,转化,涂布于氯霉素抗性板筛选,挑菌进行PCR验证、测序,构建获得71位和120位精氨酸所对应的密码子被替换为TAG的质粒pSTV-ArgP(2TAG),序列见SEQ ID NO:10。
其中,所述定点突变方法为现有技术常规方法,具体操作如下:PCR扩增使用2×Phanta Max Master Mix,扩增体系为:2×Phanta Max Master Mix 25μL,上下游引物各0.5μL,模板1μL,蒸馏水23μL,总体积为50μL。PCR扩增程序:①94℃预变性2min;②94℃变性15s;③55℃退火15s;④72℃延伸3min;⑤重复步骤②-④30次;⑥72℃延伸5min。
每轮进行一个位点的定点突变,第二次定点突变的模板为第一次成功定点突变后的重组质粒。可先进行第71位精氨酸所对应密码子的定点突变,也可先进行第120位精氨酸所对应密码子的定点突变。
本实施例中,先进行第71位精氨酸所对应的密码子的定点突变,所用模板为pSTV-ArgP(序列参见SEQ ID NO:9),引物为71-F/R;得到第71位精氨酸所对应密码子成功突变为TAG的质粒pSTV-ArgP(1TAG);
再进行第120位精氨酸所对应的密码子的定点突变,所用模板为pSTV-ArgP(1TAG),引物为120-F/R;从而得到第71、120位精氨酸所对应密码子均成功突变为TAG的质粒pSTV-ArgP(2TAG)。将测序正确的质粒pSTV-ArgP(2TAG)通过化学转化法导入W3110菌株(购自百欧博伟生物,货号BIO-82057)和本实验室已有的具有精氨酸生产能力的ARG13菌株(其制备方法和信息可参见CN110964683B中的菌株E.coli W3110 ARG10)中,将获得的重组菌株分别命名为W3110-pSTV-ArgP(2TAG)重组菌株和ARG13-pSTV-ArgP(2TAG)重组菌株,并将含有pSTV-ArgP质粒的ARG13菌株(命名为ARG13-pSTV-ArgP菌株)作为对照菌株。将两种重组菌株和一种对照菌株分别接种至丰富培养基(培养基组分参见上述“3.涉及的培养基成分”部分)中,通过kan抗性试管(含kan抗性的LB液体培养基),37℃,220rpm过夜培养,分别按照5g/L、10g/L用量回补精氨酸,验证质粒的灵敏度。
结果如图2,结果显示,相比于导入质粒pSTV-ArgP(argP基因不包含突变)的对照菌株ARG13-pSTV-ArgP,导入有传感器元件质粒pSTV-ArgP(2TAG)的W3110-pSTV-ArgP(2TAG)菌株和ARG13-pSTV-ArgP(2TAG)菌株的生长受到显著抑制,表明了感应元件pSTV-ArgP(2TAG)会严重抑制菌株生长;加入5g/L或10g/L精氨酸能够使所述两种重组菌株略恢复正常生长,表明传感器元件达到筛选效果的精氨酸浓度要求较高,由于两个位点同时突变对抗性基因的抑制作用过于强大而严重影响普通产能的菌株生长,因此其可适用于精氨酸高产能的菌株的筛选。
实施例2:精氨酸传感器2的构建
在本实施例中,以实施例1中的质粒pSTV-ArgP(其序列参见SEQ ID NO:9)为基础,通过定点突变的方法,利用突变引物71-F/R将argP基因中对应精氨酸的71位密码子替换为TAG,通过PCR扩增,纯化,转化至DH5α商用感受态中,涂布于氯霉素抗性平板筛选,挑菌进行PCR验证、测序,构建获得71位精氨酸所对应的密码子被替换为TGA的质粒pSTV-ArgP(1TAG),序列见SEQ ID NO:11。
将测序正确的质粒pSTV-ArgP(1TAG)导入W3110菌株和本实验室已有的具有精氨酸生产能力的ARG13菌株中,将获得的两种重组菌株分别命名为W3110-pSTV-ArgP(1TAG)重组菌株和ARG13-pSTV-ArgP(1TAG)重组菌株,将两种重组菌株分别接种至丰富培养基中,通过kan抗性试管,37℃,220rpm过夜培养,分别按照5g/L、10g/L用量回补精氨酸,验证质粒的灵敏度。
结果如图3显示,在抗性试管中,两种重组菌株的生长均受到明显抑制,但仍具有一定的生长能力。回补精氨酸后,两种重组菌株的生长均得到部分恢复,但ARG13-pSTV-ArgP(1TAG)重组菌株恢复情况更好。表明该感应元件pSTV-ArgP(1TAG)(即,71位精氨酸所对应的密码子被替换为TAG)在不同精氨酸浓度下存在生长差异,精氨酸浓度越高(0、5、10g/L),生长恢复越好,即菌株生长恢复是精氨酸浓度依赖性的,因此本发明的生物传感器具有筛选能力,从而可用于根据生长情况筛选高产精氨酸的菌株。
实施例3:精氨酸传感器3的构建
在本实施例中,以大肠杆菌W3110基因组为模板,用引物argP-F/R,扩增argP基因(SEQ ID NO:1);以pTrc-99a质粒为底盘质粒,用引物pTrc-C-F/R,扩增获得线性化质粒,通过DNA连接,转化至DH5α商用感受态中,涂布于氨苄抗性板,挑菌PCR验证、测序,获取第一次重组质粒。以第一次重组质粒为模板,用引物P2-C-F/R扩增获取线性化质粒片段;以pKan质粒为模板,用Kan-F/R引物扩增PargO-Kan-tRNA基因。将上述Kan-tRNA基因与线性化载体(即,以第一次重组质粒为模板并用引物P2-C-F/R扩增获取的线性化质粒片段)连接,转化至DH5α商用感受态细胞中,涂布于氨苄抗性板,挑菌进行PCR验证、测序,构建完整质粒pTrc-ArgP(该质粒的序列参见SEQ ID NO:12)。最后,通过定点突变的方法,利用突变引物71-F/R对质粒pTrc-ArgP进行定点突变,将argP基因中71位精氨酸所对应的密码子替换为TAG,通过PCR扩增、转化至DH5α商用感受态细胞中,涂布于氨苄抗性板,挑菌进行PCR验证、测序,构建获得71位精氨酸所对应的密码子被替换为TAG的质粒pTrc-ArgP(1TAG),其序列见序列SEQ ID NO:13。
将测序正确的质粒导入W3110菌株和本实验室已有的具有精氨酸生产能力的ARG13菌株中,将获得的重组菌株分别命名为W3110-pTrc-ArgP(1TAG)重组菌株和ARG13-pTrc-ArgP(1TAG)重组菌株,将两种重组菌株分别接种至丰富培养基中,通过kan抗性试管,37℃,220rpm过夜培养,分别按照5g/L、10g/L用量回补精氨酸,验证质粒的灵敏度。
结果如图4所示,可见argP基因突变体模块、抗性基因模块和tRNA模块引入高拷贝pTrc-99a质粒后,含有传感器元件的两种重组菌株在不存在精氨酸的情况下,生长受到抑制,但相较于实施例1和2的抑制较弱,且回补精氨酸后,含有传感器元件的两种重组菌株的生长抑制情况均得到缓解,灵敏度提高。并且,精氨酸浓度越高(0、5、10g/L),生长恢复越好,即菌株生长恢复是精氨酸浓度依赖性的,因此本发明生物传感器可用于根据生长情况筛选高产精氨酸的菌株,且导入高拷贝质粒后灵敏度提高。
实施例4:精氨酸传感器4的构建
本实施例中传感器的构建类似于实施例3,区别之处仅在于,将120位精氨酸所对应的密码子替换为终止密码子TAG,获得传感器元件质粒pTrc-ArgP(1TAG-120)。将所述质粒分别导入W3110菌株和ARG13菌株中,在kan条件下培养并回补精氨酸。结果与实施例3类似,回补精氨酸后,含有传感器元件的两种重组菌株的生长抑制情况均得到缓解,并且精氨酸浓度越高,生长恢复越好,从而该传感器可用于根据生长情况筛选高产精氨酸的菌株。
实施例5:W3110菌株诱变筛选
以W3110野生型菌株为底盘菌株,将底盘菌株利用CaCl2法制备感受态细胞,再利用化学转化法向感受态细胞中导入实施例3获得的传感元件pTrc-argP(1TAG),将已转入传感元件pTrc-argP(1TAG)的重组菌株W3110-pTrc-argP(1TAG)通过常压室温等离子体(ARTP)诱变法进行诱变筛选;
其中,ARTP诱变步骤为:将重组菌株W3110-pTrc-argP(1TAG)划线至LB平板,过夜培养;挑取单菌落至带氨苄抗性的LB液体培养基中过夜活化;活化的菌株转接至新鲜的带氨苄抗性的LB培养基,30-37℃培养至OD600为0.4-0.6;取菌液,4000rpm,离心2min,弃上清;无菌水重悬菌体,离心洗涤两次;无菌水重悬菌体,取10-20uL重悬菌液均匀涂布于无菌载片上,置于ARTP仪器中;设置参数功率100W,气流量10SLM,处理时间60-120s。
将处理后的带菌载片放置于带无菌水的EP管中洗涤,将带有菌的水稀释后涂布于带卡那抗性的丰富培养基平板进行筛选,从平板上挑取菌落较大的的单菌落至96孔深孔板,丰富培养基培养后测定OD600,对菌株进行复筛,最终挑选出长势较好的诱变菌株Arg-A3进行摇瓶产量验证。最终丰富培养基中摇瓶产量为0.1g/L,而野生型的W3110菌株无精氨酸积累。
在本发明的实际操作中,也可以通过首先进行ARTP诱变然后导入传感器元件的步骤进行筛选。具体地,可首先将W3110野生型菌株进行ARTP诱变,获得一系列W3110突变体菌株。
接下来,通过传感器元件pTrc-argP(1TAG)从所述一系列突变体中筛选高产精氨酸的菌株,具体如下:分别将所述传感器元件pTrc-argP(1TAG)导入所述一系列突变体中,并分别进行培养;由于传感器元件pTrc-argP(1TAG)的导入会导致重组突变菌株生长受到抑制,但是在精氨酸高浓度下,所述重组突变菌株的生长得到恢复,且精氨酸浓度越高菌株生长恢复能力越好。基于此原理,可以根据生长情况筛选获得精氨酸产量高的菌株。
实施例6:Arg13菌株诱变筛选
以本实验室保存的具有一定精氨酸生产能力的Arg13为底盘菌株,利用化学转化法将实施例3获得的传感元件pTrc-argP(1TAG)导入底盘菌株Arg13中;再将重组菌株Arg13-pTrc-argP(1TAG)通过常压室温等离子体(ARTP)诱变法对该菌株进行诱变筛选。从带卡那抗性的丰富培养基平板上挑取生长较快的单菌落至96孔深孔板,经过丰富培养基培养后测定OD600,对候选菌株进行复筛,最终挑选出长势较好的诱变菌株Arg13-1-B6和Arg13-1-E1,进行发酵罐产量验证;其中涉及的ARTP诱变法、感受态制备、质粒转化感受态及筛选方法均同实施例5。
发酵罐产量验证中,通过补料发酵培养,培养方式为:将底盘菌株Arg13、诱变菌株Arg13-1-B6、Arg13-1-E1分别接种至LB液体培养基上,37℃,过夜培养;活化的菌液转接至新鲜的LB培养基中,37℃,培养OD600至0.6-0.8;按照体积比10-15%接种至发酵培养基中,控制发酵温度37℃,通气量0.5vvm,设置溶氧与搅拌联控,控制溶氧30%,补加氨水调控pH至7.0,通过补加葡萄糖控制罐内残糖1g/L,另外以5mL/h恒速向罐内补加30-50%的硫酸铵溶液,发酵48h后,通过高效液相色谱检测精氨酸产量(菌株Arg13的液相色谱见图6)。
其中,发酵培养基为:葡萄糖20g/L,硫酸铵10g/L,酵母粉3g/L,磷酸二氢钾5g/L,柠檬酸1g/L,消泡剂0.5mL/L,微量元素母液1mL/L,维生素母液1mL/L;
微量元素母液组成:FeCl3 5g/L,CoCl2·6H2O 2.5g/L,MnCl2·4H2O0.15g/L,CuCl2·2H2O 1.5g/L,H3BO3 3g/L,NaMnO4·2H2O 2.5g/L,Zn(CH3COO)2·2H2O 13g/L,溶剂为去离子水;
维生素母液组成:维生素B1 2g/L,微生物B3 2g/L,维生素B5 2g/L,维生素B122g/L,维生素H 2g/L。
结果显示,Arg13发酵产量71g/L,转化率0.36g/g;Arg13-1-B6发酵产量79g/L,转化率0.39g/g;Arg13-1-E1发酵产量87g/L,转化率0.41g/g。表明精氨酸的产量与在筛选平板上生长态势成正相关。
本实施例中,发酵液中精氨酸产量检测方法采用高效液相色谱HPLC检测,色谱柱:离子层析色谱柱,型号HILIC Amphion II 4.6*150mm,5μm;流动相0.05mM KH2PO4(磷酸调pH3.0):乙腈=65:35,流速1mL/min,柱温30℃,检测波长200nm,出峰时间约2.6min(如图5所示),样品检测时间6min。
需要说明的是,不论天然筛选的菌株还是构建的重组菌株均可用该生物传感器进行筛选。
以上所述的具体实施例,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施例而已,并不用于限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种精氨酸生物传感器,其包括argP基因突变体模块,抗性基因模块和tRNA模块;其中,
所述argP基因突变体模块包括argP基因突变体,所述argP基因突变体是通过将亲本argP基因的一个或多个精氨酸密码子置换为终止密码子而获得的;
所述抗性基因模块包括启动子PargO基因和抗性基因;
所述tRNA模块包括tRNA和tRNA启动子,其中所述tRNA是能够识别并携带精氨酸至翻译位点并且能够通读终止密码子的tRNA。
2.根据权利要求1所述的精氨酸生物传感器,其中,所述终止密码子为TAG;所述argP基因突变体的序列为将SEQ ID NO:1所示的亲本argP基因的第210-213位碱基突变为TAG后的核苷酸序列;或将SEQ ID NO:1所示的亲本argP基因的第358-360位碱基突变为TAG后的核苷酸序列;或将SEQ ID NO:1所示的亲本argP基因的第210-213位碱基和第358-360位碱基同时突变为TAG后的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的精氨酸生物传感器,其中,所述启动子PargO基因的序列如SEQID NO:3所示。
4.根据权利要求1所述的精氨酸生物传感器,其中,所述抗性基因提供对抗生素的抗性或耐受性;任选地,所述抗生素选自潮霉素,卡那霉素,氯霉素,青霉素,利福平,氨苄青霉素,或头孢氨苄等。
5.根据权利要求1所述的精氨酸生物传感器,其中,所述tRNA的序列如SEQ ID NO:5所示,任选地,所述tRNA启动子的序列如SEQ ID NO:6所示。
6.根据权利要求1所述的精氨酸生物传感器,其中,所述argP基因突变体模块,所述抗性基因模块和所述tRNA模块位于相同或不同的质粒中,优选相同的质粒中。
7.根据权利要求6所述的精氨酸生物传感器,其中,所述质粒是能够在底盘菌株中正常复制的质粒,优选pSTV质粒或pTrc质粒。
8.权利要求1-7中任一项所述的精氨酸生物传感器的构建方法,其包括:将所述argP基因突变体模块,所述抗性基因模块和所述tRNA模块分别引入相同或不同的质粒中。
9.权利要求1-7中任一项所述的精氨酸生物传感器在筛选精氨酸高产菌株中的应用。
10.筛选精氨酸高产菌株的方法,其包括将权利要求1-7中任一项所述的精氨酸生物传感器引入待筛选菌株中并在所述抗性基因所对应的抗生素条件下进行培养,选择菌株生长情况相对好的菌株,即为精氨酸生产能力相对强的菌株。
11.根据权利要求10所述的方法,其中,所述待筛选菌株是能够生产精氨酸的野生型或重组型的细菌和真菌,例如大肠杆菌,枯草芽孢杆菌,谷氨酸棒杆菌,蓝细菌,丝状真菌或酵母菌。
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PB01 | Publication | ||
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