CN118006546A - 促进脐带间充质干细胞分泌生产外泌体的方法、外泌体制剂和应用方法 - Google Patents
促进脐带间充质干细胞分泌生产外泌体的方法、外泌体制剂和应用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了促进脐带间充质干细胞分泌生产外泌体的方法、外泌体制剂和应用方法，包括从鲜脐带中分离和提取脐带间充质干细胞、对收集而来的脐带间充质干细胞进行预处理、将预处理完成的脐带间充质干细胞进行三维培养、收集脐带间充质干细胞分泌的外泌体。通过预处理脐带间充质干细胞样本，先对其脐带间充质干细胞样本进行预先判断，筛选出高活性的脐带间充质干细胞，使得分泌外泌体的脐带间充质干细胞均为高活性，筛选出高活性的脐带间充质干细胞可以减少对资源和耗材的使用量，从而节省实验成本，高活性的细胞往往具有更好的增殖能力和多向分化潜能，可以在体外实验中更快更有效地进行细胞扩增和分化。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域，特别涉及促进脐带间充质干细胞分泌生产外泌体的方法、外泌体制剂和应用方法。
背景技术
生物医学是研究生物学、医学和健康科学之间相互作用的学科领域。在生物医学领域中，研究人员探索和开发利用生物学原理和技术来理解疾病的发生机制、开发新的治疗方法和技术，提高人类健康和生活质量，其中外泌体是一种通过细胞间通信传递信息的方式。脐带间充质干细胞外泌体通过释放包含生物活性分子的囊泡，可以在细胞间传递脱离细胞的信号物质，从而调节目标细胞的功能和代谢，这种细胞间通信机制可以影响炎症反应、组织修复和再生等生理过程；
现有的促进脐带间充质干细胞分泌生产外泌体的方法是直接通过特定的培养条件和诱导剂进行促进分泌，但是由于不同细胞之间的生物活性不同，而现有的方法直接对不同生物活性的脐带间充质干细胞进行诱导分泌外泌体，因此会导致低活性的细胞因无法承受诱导剂而死亡，因此不仅使得实验资源的浪费，同时还需要额外增加人力资源去清理死亡的细胞，因此使得其人力成本的增加，还有现有的培养条件是直接将细胞放置在合适条件的培养基中，但是此方式的培养条件无法有效的模拟细胞在脐带间的生产环境，因此无法最大程度的加快脐带间充质干细胞分泌生产外泌体的速率。
发明内容
本发明的主要目的在于提供促进脐带间充质干细胞分泌生产外泌体的方法、外泌体制剂和应用方法，可以有效解决背景技术中的技术问题。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
促进脐带间充质干细胞分泌生产外泌体的外泌体制剂，该所述促进脐带间充质干细胞分泌生产外泌体的外泌体制剂由以下成分比材料构成：
外泌体膜蛋白30％—60％
表面标识物10％—20％
核酸成分5％—10％
脂质成分5％—10％。
促进脐带间充质干细胞分泌生产外泌体的方法，该方法具体包括如下步骤：
S1、从鲜脐带中分离和提取脐带间充质干细胞；
S2、对收集而来的脐带间充质干细胞进行预处理；
S3、将预处理完成的脐带间充质干细胞进行三维培养；
S4、收集脐带间充质干细胞分泌的外泌体。
进一步的，所述从鲜脐带中分离和提取脐带间充质干细胞，具体过程如下：
S11、将脐带置于无菌的容器中，使用无菌剪刀和镊子将脐带剥离外膜和血管；
S12、将脱离外膜和血管的脐带切成小片或将其切碎；
S13、将脐带组织置于含有消化酶的培养基中，适当温度下进行消化；
S14、将消化后的细胞悬液通过滤网或离心筛进行筛选，使得去除残留的组织碎片和大型细胞，剩余的即为脐带间充质干细胞；
S15、将脐带间充质干细胞分为多个样本培养。
需说明的是，样本培养所需要的细胞培养基内部需要放置细胞生长的基础物质以外，还需要添加额外的物质，该物质包括但不局限于血清、生长因子、抗生素和抗菌剂以及缓冲剂。
进一步的，所述对收集而来的脐带间充质干细胞进行预处理，具体过程如下：
S21、将细胞进行检测筛选，然后将低活性的细胞样本去除，保留高活性的细胞样本；
S211、通过计算脐带间充质干细胞的特定时间内的增殖速率，以此区分不同样本的脐带间充质干细胞的活性
S22、对高活性的细胞样本进行缺氧处理，激发细胞的应激反应，以此加快细胞分泌外泌体；
所述通过计算脐带间充质干细胞的特定时间内的增殖速率，获取特定时间内的增殖速率的方法为：
RGR＝[(Nt-N0)/N0]*(1/t)
其中，RGR为脐带间充质干细胞的特定时间内的增殖速率，Nt为脐带间充质干细胞样本培养结束后细胞数量，N0为脐带细胞充质干细胞样本培养开始时细胞数量，t为脐带间充质干细胞样本培养的时间，Nt-N0为脐带细胞充质干细胞变化量。
进一步的，所述将预处理完成的脐带间充质干细胞进行三维培养的具体流程如下：
所述将预处理完成的脐带间充质干细胞进行三维培养，具体过程如下：
S31、在培养过程中，采用三维培养系统，模拟生物组织的三维结构和细胞相互作用环境，以此提供更逼真的外泌体产生环境，并按照外泌体蛋白60％、表面标识物20、核酸成分10％、脂质成分10％成分比组成外泌体制剂，并将外泌体制剂注入三维培养系统中；
S32、通过使用得出脐带间充质干细胞分泌外泌体的增值率，其中，/>为脐带间充质干细胞分泌外泌体的增值率，α为脐带间充质干细胞分泌外泌体初始量，β为脐带间充质干细胞分泌外泌体最终量，η为时间因子，α*η/β*100％为脐带间充质干细胞分泌外泌体的初始增值率，η*100％为脐带间充质干细胞分泌外泌体的最终增值率；
S33、根据增值率的大小，来调整三维培养系统的参数以及调整外泌体制剂中各个成分的占比；
需说明的是三维培养系统指的是通过提供更接近于生物组织的三维结构和细胞相互作用环境，来模拟更真实的细胞生长环境。传统的细胞培养通常是在平板上进行的，而三维培养系统则提供了更接近于体内组织的三维结构，以模拟细胞在体内的环境，这种系统可以包括特定的培养基、细胞载体或支架，以及细胞与细胞之间的细胞相互作用；
调节参数的方法包括但不局限于改变培养基成分、细胞密度、培养基液体流动速度、支架形状和孔隙度等等，通过这些方法，可以根据不同的脐带间充质干细胞样本进行单独调整细胞在三维培养系统中的生长环境，使得不同的脐带间充质干细胞样本可以因材施教，以此使得不同的脐带间充质干细胞样本均可以达到分泌外泌体的最大速率。
所述收集脐带间充质干细胞分泌的外泌体，具体过程如下：
S41、将脐带间充质干细胞所分泌外泌体通过使用密度离心法将外泌体进行分离，然后进行收集处理；
需说明的密度离心法是基于不同组分的密度差异，利用离心的力将外泌体从细胞碎片和其他细胞器等杂质中分离出来，以此确保得到高质量和纯度的外泌体样品。
促进脐带间充质干细胞分泌生产外泌体在制备药品中的应用。
本发明的有益效果如下：
通过预处理脐带间充质干细胞样本，先对其脐带间充质干细胞样本进行预先判断，筛选出高活性的脐带间充质干细胞，使得分泌外泌体的脐带间充质干细胞均为高活性，筛选出高活性的脐带间充质干细胞可以减少对资源和耗材的使用量，从而节省实验成本，高活性的细胞往往具有更好的增殖能力和多向分化潜能，可以在体外实验中更快更有效地进行细胞扩增和分化；
采用三维培养系统来进行脐带间充质干细胞的培养，这种系统能够模拟类似于生物组织的三维结构和细胞相互作用环境，提供更逼真的外泌体产生环境，有助于更有效地促进外泌体的产生和分泌；
通过根据增值率的大小，来调整三维培养系统的参数，使得可以根据不同的脐带间充质干细胞样本，对其进行单独的调整三维培养系统，使得不同的脐带间充质干细胞样本均可以达到最快分泌外泌体效率；
附图说明
图1为本发明促进脐带间充质干细胞分泌生产外泌体的方法流程图；
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
如图1所示，促进脐带间充质干细胞分泌生产外泌体的外泌体制剂，该促进脐带间充质干细胞分泌生产外泌体的外泌体制剂由以下成分比材料构成：
外泌体膜蛋白30％—60％
表面标识物10％—20％
核酸成分5％—10％
脂质成分5％—10％；
需要说明的是可以通过以下方法对其促进脐带间充质干细胞分泌生产外泌体的外泌体制剂的成分配比进行调节，
细胞培养条件优化：通过优化脐带间充质干细胞的培养条件、培养基配方和培养时间等，可以影响外泌体的成分和产量，调整培养条件可以间接调节外泌体膜蛋白、表面标识物、核酸和脂质等成分的含量；
根据需要，可以尝试添加外源的成分或添加剂来补充或调整外泌体制剂的成分比例；
通过以上方法可以改变其促进脐带间充质干细胞分泌生产外泌体的成分配比，进而改变促进脐带间充质干细胞分泌生产外泌体的使用效果，以此满足不同脐带间充质干细胞分泌生产外泌体的效率。
促进脐带间充质干细胞分泌生产外泌体的方法，该方法具体包括如下步骤：
S1、从鲜脐带中分离和提取脐带间充质干细胞；
S2、对收集而来的脐带间充质干细胞进行预处理；
S3、将预处理完成的脐带间充质干细胞进行三维培养；
S4、收集脐带间充质干细胞分泌的外泌体。
进一步的，从鲜脐带中分离和提取脐带间充质干细胞，具体过程如下：
S11、将脐带置于无菌的容器中，使用无菌剪刀和镊子将脐带剥离外膜和血管；
S12、将脱离外膜和血管的脐带切成小片或将其切碎；
S13、将脐带组织置于含有消化酶的培养基中，适当温度下进行消化；
S14、将消化后的细胞悬液通过滤网或离心筛进行筛选，使得去除残留的组织碎片和大型细胞，剩余的即为脐带间充质干细胞；
S15、将脐带间充质干细胞分为多个样本培养。
需说明的是，样本培养所需要的细胞培养基内部需要放置细胞生长的基础物质以外，还需要添加额外的物质，该物质包括但不局限于血清、生长因子、抗生素和抗菌剂以及缓冲剂。
进一步的，对收集而来的脐带间充质干细胞进行预处理，具体过程如下：
S21、将细胞进行检测筛选，然后将低活性的细胞样本去除，保留高活性的细胞样本；
S211、通过计算脐带间充质干细胞的特定时间内的增殖速率，以此区分不同样本的脐带间充质干细胞的活性；
S22、对高活性的细胞样本进行缺氧处理，激发细胞的应激反应，以此加快细胞分泌外泌体；
需说明的是通过计算脐带间充质干细胞的特定时间内的增殖速率，获取特定时间内的增殖速率的方法为：
RGR＝[(Nt-N0)/N0]*(1/t)
其中，RGR为脐带间充质干细胞的特定时间内的增殖速率，Nt为脐带间充质干细胞样本培养结束后细胞数量，N0为脐带细胞充质干细胞样本培养开始时细胞数量，t为脐带间充质干细胞样本培养的时间，Nt-N0为脐带细胞充质干细胞变化量。
进一步的，将预处理完成的脐带间充质干细胞进行三维培养，具体过程如下：
S31、在培养过程中，采用三维培养系统，模拟生物组织的三维结构和细胞相互作用环境，以此提供更逼真的外泌体产生环境，并按照外泌体蛋白60％、表面标识物20、核酸成分10％、脂质成分10％成分比组成外泌体制剂，并将外泌体制剂注入三维培养系统中；
S32、通过使用得出脐带间充质干细胞分泌外泌体的增值率，其中，/>为脐带间充质干细胞分泌外泌体的增值率，α为脐带间充质干细胞分泌外泌体初始量，β为脐带间充质干细胞分泌外泌体最终量，η为时间因子，α*η/β*100％为脐带间充质干细胞分泌外泌体的初始增值率，η*100％为脐带间充质干细胞分泌外泌体的最终增值率；
S33、根据增值率的大小，来调整三维培养系统的参数以及调整外泌体制剂中各个成分的占比；
需说明的是三维培养系统指的是通过提供更接近于生物组织的三维结构和细胞相互作用环境，来模拟更真实的细胞生长环境。传统的细胞培养通常是在平板上进行的，而三维培养系统则提供了更接近于体内组织的三维结构，以模拟细胞在体内的环境，这种系统可以包括特定的培养基、细胞载体或支架，以及细胞与细胞之间的细胞相互作用；
调节参数的方法包括但不局限于改变培养基成分、细胞密度、培养基液体流动速度、支架形状和孔隙度等等，通过这些方法，可以根据不同的脐带间充质干细胞样本进行单独调整细胞在三维培养系统中的生长环境，使得不同的脐带间充质干细胞样本可以因材施教，以此使得不同的脐带间充质干细胞样本均可以达到分泌外泌体的最大速率。
收集脐带间充质干细胞分泌的外泌体，具体过程如下：
S41、将脐带间充质干细胞所分泌外泌体通过使用密度离心法将外泌体进行分离，然后进行收集处理；
需说明的密度离心法是基于不同组分的密度差异，利用离心的力将外泌体从细胞碎片和其他细胞器等杂质中分离出来，以此确保得到高质量和纯度的外泌体样品。
促进脐带间充质干细胞分泌生产外泌体在制备药品中的应用。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (9)
1.促进脐带间充质干细胞分泌生产外泌体的外泌体制剂，其特征在于：该所述促进脐带间充质干细胞分泌生产外泌体的外泌体制剂由以下成分比材料构成：
外泌体膜蛋白30％—60％
表面标识物10％—20％
核酸成分5％—10％
脂质成分5％—10％。
2.促进脐带间充质干细胞分泌生产外泌体的方法，其特征在于：该方法具体包括如下步骤：
S1、从鲜脐带中分离和提取脐带间充质干细胞；
S2、对收集而来的脐带间充质干细胞进行预处理；
S3、将预处理完成的脐带间充质干细胞进行三维培养；
S4、收集脐带间充质干细胞分泌的外泌体。
3.根据权利要求2所述的促进脐带间充质干细胞分泌生产外泌体的方法，其特征在于：所述从鲜脐带中分离和提取脐带间充质干细胞，具体过程如下：
S11、将脐带置于无菌的容器中，使用无菌剪刀和镊子将脐带剥离外膜和血管；
S12、将脱离外膜和血管的脐带切成小片或将其切碎；
S13、将脐带组织置于含有消化酶的培养基中，适当温度下进行消化；
S14、将消化后的细胞悬液通过滤网或离心筛进行筛选，使得去除残留的组织碎片和大型细胞，剩余的即为脐带间充质干细胞；
S15、将脐带间充质干细胞分为多个样本培养。
4.根据权利要求2所述的促进脐带间充质干细胞分泌生产外泌体的方法，其特征在于：所述对收集而来的脐带间充质干细胞进行预处理，具体过程如下：
S21、将细胞进行检测筛选，然后将低活性的细胞样本去除，保留高活性的细胞样本；
S22、对高活性的细胞样本进行缺氧处理，激发细胞的应激反应，以此加快细胞分泌外泌体。
5.根据权利要求4所述的促进脐带间充质干细胞分泌生产外泌体的方法，其特征在于：所述将细胞进行检测筛选，然后将低活性的细胞样本去除，保留高活性的细胞样本，具体过程如下：
S211、通过计算脐带间充质干细胞的特定时间内的增殖速率，以此区分不同样本的脐带间充质干细胞的活性。
6.根据权利要求5所述的促进脐带间充质干细胞分泌生产外泌体的方法，其特征在于：所述通过计算脐带间充质干细胞的特定时间内的增殖速率，获取特定时间内的增殖速率的方法为：
RGR＝[(Nt-N0)/N0]*(1/t)
其中，RGR为脐带间充质干细胞的特定时间内的增殖速率，Nt为脐带间充质干细胞样本培养结束后细胞数量，N0为脐带细胞充质干细胞样本培养开始时细胞数量，t为脐带间充质干细胞样本培养的时间，Nt-N0为脐带细胞充质干细胞变化量。
7.根据权利要求2所述的促进脐带间充质干细胞分泌生产外泌体的方法，其特征在于：所述将预处理完成的脐带间充质干细胞进行三维培养，具体过程如下：
S31、在培养过程中，采用三维培养系统，模拟生物组织的三维结构和细胞相互作用环境，以此提供更逼真的外泌体产生环境，并按照外泌体蛋白60％、表面标识物20、核酸成分10％、脂质成分10％成分比组成外泌体制剂，并将外泌体制剂注入三维培养系统中；
S32、通过使用得出脐带间充质干细胞分泌外泌体的增值率，其中，/>为脐带间充质干细胞分泌外泌体的增值率，α为脐带间充质干细胞分泌外泌体初始量，β为脐带间充质干细胞分泌外泌体最终量，η为时间因子，α*η/β*100％为脐带间充质干细胞分泌外泌体的初始增值率，η*100％为脐带间充质干细胞分泌外泌体的最终增值率；
S33、根据增值率的大小，来调整三维培养系统的参数以及调整外泌体制剂中各个成分的占比。
8.根据权利要求1所述的促进脐带间充质干细胞分泌生产外泌体的方法，其特征在于：所述收集脐带间充质干细胞分泌的外泌体，具体过程如下：
S41、将脐带间充质干细胞所分泌外泌体通过使用密度离心法将外泌体进行分离，然后进行收集处理。
9.权利要求1至8中任一项所述的促进脐带间充质干细胞分泌生产外泌体在制备药品中的应用。
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| CN202311647118.9A CN118006546A (zh) | 2023-12-04 | 2023-12-04 | 促进脐带间充质干细胞分泌生产外泌体的方法、外泌体制剂和应用方法 |
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