CN118001286A

CN118001286A - 人参皂苷Rb3的医药应用

Info

Publication number: CN118001286A
Application number: CN202211402709.5A
Authority: CN
Inventors: 章丹丹; 潘一峰; 涂驭斌; 林超颖
Original assignee: Shanghai Huanghai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Shanghai Huanghai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2022-11-09
Filing date: 2022-11-09
Publication date: 2024-05-10

Abstract

本发明公开了一种人参皂苷Rb3在制备用于防治乳腺癌和/或乳腺癌脏器转移的药品、食品和/或保健品中的用途。本发明的问世是考察人参皂苷类成分影响M2型巨噬细胞表型极化和三阴性乳腺癌细胞迁移的体外筛选模型上发现的：在多个人参皂苷中，人参皂苷Rb3在体外无毒剂量可抑制M2型巨噬细胞的表型极化；同时，呈剂量依赖性抑制三阴性乳腺癌细胞的体外迁移和体内肺转移。

Description

人参皂苷Rb3的医药应用

技术领域

本发明涉及医药保健品领域，具体涉及一种人参皂苷Rb3的医药应用。本发明的人参皂苷Rb3可用于制备用于防治肿瘤的药品、食品和/或保健品。

背景技术

三阴性乳腺癌及复发转移

乳腺癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤之一，并且乳腺癌患者在原位瘤手术后常发生复发转移，包括肺、骨、脑和肝等。三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)占所有乳腺癌病理类型的10％-20％，恶性程度高、侵袭转移性强和预后不良，其雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)及人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)的表达均为阴性，难以从内分泌治疗及靶向治疗中受益，传统化疗又往往引起耐药，尚缺乏有效的治疗手段。

肿瘤相关巨噬细胞

肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAMs)是浸润到肿瘤间质内的巨噬细胞，在大多数恶性肿瘤中其比例能占到肿瘤组织细胞总数的50％以上。TAMs通过分泌多种炎症因子的方式影响肿瘤微环境，在肿瘤的发生、生长、侵袭、转移、肿瘤血管和淋巴管生成等过程中发挥重要的作用，是肿瘤转移的协助者，多呈M2表型，表达精氨酸酶1(Arg-1)等表面标记物，是肿瘤免疫治疗的靶点之一。

人参皂苷Rb3(Ginsenoside-Rb3)是五加科植物人参、西洋参、三七等的主要药理活性成分，主要存在于人参的根、花蕾、茎叶和西洋参的根、茎叶以及三七的茎叶中。人参皂苷Rb3药理作用：1)在神经系统的作用主要体现在对缺血缺氧脑损伤的保护、抗惊厥；2)在心血管系统方面的作用主要是保护缺血时心肌功能、抑制血管平滑肌细胞增生；3)对血液系统的作用集中体现在对血小板的影响上，主要表现在抑制血小板活化聚集，防止血栓的形成；4)人参皂苷Rb3具有抗单纯疱疹病毒Ⅰ型和滤泡性口炎病毒活性；5)对线粒体损伤的保护作用及清除氧自由基、抑制脂质过氧化等抗氧化活性；6)降胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇。

现有技术中未见人参皂苷Rb3防治肿瘤的相关报道。

发明内容

基于此，本发明提供了一种人参皂苷Rb3在制备用于防治乳腺癌和/或乳腺癌脏器转移的药品、食品和/或保健品中的用途。

进一步地，该人参皂苷Rb3作为唯一的活性成分应用于防治乳腺癌和/或乳腺癌脏器转移的药品、食品和/或保健品的制备中。

根据本发明的另一个方面，提供了一种包含人参皂苷Rb3的药物组合物或药物制剂在制备用于防治乳腺癌和/或乳腺癌脏器转移的药品、食品和/或保健品中的用途。

进一步地，该乳腺癌为三阴性乳腺癌。

进一步地，该脏器为肺。

根据本发明的另一个方面，提供了一种人参皂苷Rb3在制备用于肿瘤免疫治疗的药品、食品和/或保健品中的用途。

进一步地，该人参皂苷Rb3作为唯一的活性成分应用于肿瘤免疫治疗的药品、食品和/或保健品的制备中。

根据本发明的另一个方面，提供了一种包含人参皂苷Rb3的药物组合物或药物制剂在制备用于肿瘤免疫治疗的药品、食品和/或保健品中的用途。

根据本发明的另一个方面，提供了一种人参皂苷Rb3在制备用于调节巨噬细胞极化和/或抑制巨噬细胞体外迁移的药品、食品和/或保健品中的用途；

进一步地，该人参皂苷Rb3作为唯一的活性成分应用于调节巨噬细胞极化和/或抑制巨噬细胞体外迁移的药品、食品和/或保健品的制备中。

根据本发明的另一个方面，提供了一种包含人参皂苷Rb3的药物组合物或药物制剂在制备用于调节巨噬细胞极化和/或抑制巨噬细胞体外迁移的药品、食品和/或保健品中的用途。

进一步地，该肿瘤免疫治疗与肿瘤相关巨噬细胞的调节相关。

进一步地，该巨噬细胞为M2型巨噬细胞。

进一步地，该巨噬细胞极化和/或该巨噬细胞体外迁移为细胞因子和/或4T1条件培养基诱导的该巨噬细胞极化和/或该巨噬细胞体外迁移。

进一步地，该细胞因子为IL-4和/或IL-13。

进一步地，该药物制剂包括药学上可接受的药用辅料。

进一步地，该药用辅料选自以下的一种或多种：卵磷脂、硬脂酸铝、离子交换材料、自乳化药物传递系统、表面活化剂、血清蛋白、缓冲物质和电解质。

进一步地，该药物制剂为口服制剂、非肠道给药制剂或局部给药制剂。

进一步地，该口服制剂为胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂或膏剂。

进一步地，该非肠道给药制剂为注射液。

进一步地，该局部给药制剂为霜剂、贴剂、软膏剂或喷雾剂。

本发明的有益效果：

本发明的问世是考察人参皂苷类成分影响M2型巨噬细胞表型极化和三阴性乳腺癌细胞迁移的体外筛选模型上发现的：在多个人参皂苷中，人参皂苷Rb3在体外无毒剂量可抑制M2型巨噬细胞的表型极化；同时，呈剂量依赖性抑制三阴性乳腺癌细胞的体外迁移和体内肺转移。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图，而并不超出本发明要求保护的范围。

图1为人参皂苷Rb3的结构式示意图。

图2为人参皂苷Rb3对巨噬细胞RAW264.7体外增殖影响结果示意图。

图3为人参皂苷Rb3对细胞因子IL-4诱导的M2型巨噬细胞的体外迁移影响结果示意图。A为空白对照组的巨噬细胞迁移图；B为细胞因子IL-4诱导的M2型巨噬细胞迁移加剧图；C为人参皂苷Rb3(25μM)处理的M2型巨噬细胞迁移图；D为人参皂苷Rb3(50μM)处理的M2型巨噬细胞迁移图；E为人参皂苷Rb3处理M2型巨噬细胞迁移实验结果所对应的柱状图。

图4为人参皂苷Rb3对M2型巨噬细胞中精氨酸酶1(Arg-1)、甘露糖受体(MR)、炎症区域1(FIZZ1)和细胞毒性T淋巴细胞相对蛋白4(CTLA-4)mRNA表达的影响结果示意图。A为Arg-1的结果；B为MR的结果；C为FIZZ1的结果；D为CTLA-4的结果。

图5为人参皂苷Rb3对4T1条件培养基(4T1CM)诱导的M2型巨噬细胞的体外迁移影响结果示意图。A为空白对照组的巨噬细胞迁移图；B为受4T1CM诱导的M2型巨噬细胞迁移加剧图；C为人参皂苷Rb3(25μM)处理的4T1CM-M2型巨噬细胞迁移图；D为人参皂苷Rb3(50μM)处理的4T1CM-M2型巨噬细胞迁移图；E为人参皂苷Rb3处理4T1CM诱导M2型巨噬细胞迁移实验结果所对应的柱状图。

图6为人参皂苷Rb3对细胞因子IL-4和IL-13诱导的骨髓来源巨噬细胞M2表型的体外活力影响结果示意图。

图7为人参皂苷Rb3抑制细胞因子IL-4和IL-13诱导的骨髓来源巨噬细胞M2表型中精氨酸酶1(Arg1)的蛋白表达结果示意图。

图8为人参皂苷Rb3对三阴性乳腺癌细胞4T1体外增殖影响结果示意图。

图9为人参皂苷Rb3对三阴性乳腺癌细胞4T1的体外迁移影响结果示意图。A为空白对照组；B为人参皂苷Rb3 50μM剂量组；C为人参皂苷Rb3 100μM剂量组；D为结果对应柱状图。

图10为人参皂苷Rb3抑制乳腺癌肺转移结果示意图。

图11为不同分组的小鼠体重变化结果示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另外说明，本文所用的所有技术和科学术语和缩略语具有本发明领域或该术语应用领域中普通技术人员通常所理解的含义。虽然本发明实施过程中可使用类似于或等价于本文公开的那些的任何方法、条件、物质或材料，但本文描述了优选的方法、条件物质或材料。

本发明有预期地涵盖所有的选择余地、变体和同等物，这些可能如权利要求所定义的那样包含在现有发明领域。所属领域的技术人员将识别许多类似或等同于在此所描述的方法和物质，这些可以应用于本发明的实践中去。本发明绝非限于方法和物质的描述。

在一定程度上，具体实施方式和/或权利要求中使用术语“包含”、“包括(including，includes)”和“具有(having，has，with)”或其变体，这些术语意在包括与术语“包含(comprising)”类似的方式。

正如背景技术部分所描述的，三阴性乳腺癌难以从内分泌治疗及靶向治疗中受益，传统化疗又往往引起耐药，尚缺乏有效的治疗手段的问题。为了解决上述问题，本发明提供了一种人参皂苷Rb3在制备用于防治乳腺癌和/或乳腺癌脏器转移的药品、食品和/或保健品中的用途。

如本发明所用，本发明的化合物人参皂苷Rb3(Ginsenoside-Rb3)为白色无定形粉末，分子量为1079，分子式为C₅₃H₉₀O₂₂，易溶于水、甲醇、乙醇等，与人参皂苷Rb2、Rc互为同分异构体，其结构式如图1所示。

如本领域的普通技术人员所知，本发明的化合物人参皂苷Rb3可通过商业途径购买获得，亦可用本领域的常规方法从五加科植物人参、西洋参、三七等的根、花蕾、茎叶中提取获得。其纯度均符合药用标准。

在本发明中，术语“防治”既包括“治疗”也包括“预防”，除非存在与此相反的具体说明。术语“治疗(的)”和“治疗(地)”应该作相应的理解。

在一种优选的实施方式中，该人参皂苷Rb3作为唯一的活性成分应用于防治乳腺癌和/或乳腺癌脏器转移的药品、食品和/或保健品的制备中。

在一种优选的实施方式中，该乳腺癌为三阴性乳腺癌。

在一种优选的实施方式中，该脏器为肺。

在一种优选的实施方式中，该人参皂苷Rb3作为唯一的活性成分应用于肿瘤免疫治疗的药品、食品和/或保健品的制备中。

在一种优选的实施方式中，该人参皂苷Rb3作为唯一的活性成分应用于调节巨噬细胞极化和/或抑制巨噬细胞体外迁移的药品、食品和/或保健品的制备中。

在一种优选的实施方式中，该肿瘤免疫治疗与肿瘤相关巨噬细胞的调节相关。

在一种优选的实施方式中，该巨噬细胞为M2型巨噬细胞。

在一种优选的实施方式中，该巨噬细胞极化和/或该巨噬细胞体外迁移为细胞因子和/或4T1条件培养基诱导的该巨噬细胞极化和/或该巨噬细胞体外迁移。

在一种优选的实施方式中，该细胞因子为IL-4和/或IL-13。

在一种优选的实施方式中，该药物制剂包括药学上可接受的药用辅料。

在一种优选的实施方式中，该药用辅料选自以下的一种或多种：卵磷脂、硬脂酸铝、离子交换材料、自乳化药物传递系统、表面活化剂、血清蛋白、缓冲物质和电解质。

本发明中对于上述药用辅料的种类没有特别的限制，可以采用本领域中常用的常规药用辅料，而不限于上述所列举的那些。

在一种优选的实施方式中，该药物制剂为口服制剂、非肠道给药制剂或局部给药制剂。

在一种优选的实施方式中，该口服制剂为胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂或膏剂。

在一种优选的实施方式中，该非肠道给药制剂为注射液。

在一种优选的实施方式中，该局部给药制剂为霜剂、贴剂、软膏剂或喷雾剂。

根据本发明的另一个方面，还提供了一种防治乳腺癌和/或乳腺癌脏器转移的方法，该方法包括给予所述患者治疗有效量的上述人参皂苷Rb3或包含人参皂苷Rb3的药物组合物或药物制剂。

根据本发明的另一个方面，还提供了一种对肿瘤进行免疫治疗的方法，该方法包括给予所述患者治疗有效量的上述人参皂苷Rb3或包含人参皂苷Rb3的药物组合物或药物制剂。

根据本发明的另一个方面，还提供了一种调节巨噬细胞极化和/或抑制巨噬细胞体外迁移的方法，该方法包括给予所述患者治疗有效量的上述人参皂苷Rb3或包含人参皂苷Rb3的药物组合物或药物制剂。

根据本发明的另一个方面，还提供了一种人参皂苷Rb3或包含人参皂苷Rb3的药物组合物或药物制剂，用于防治乳腺癌和/或乳腺癌脏器转移。

根据本发明的另一个方面，还提供了一种人参皂苷Rb3或包含人参皂苷Rb3的药物组合物或药物制剂，用于对肿瘤进行免疫治疗。

根据本发明的另一个方面，还提供了一种人参皂苷Rb3或包含人参皂苷Rb3的药物组合物或药物制剂，用于调节巨噬细胞极化和/或抑制巨噬细胞体外迁移。

当然，对于上述治疗用途，用药剂量根据所用化合物、给药方式、所需要的治疗和所适用的疾病而不同。上文定义的人参皂苷Rb3的日剂量可以为0.001mg/kg-100mg/kg。

本发明的人参皂苷Rb3及其药物组合物的给药途径可以为口服、舌下、经皮、经肌肉或皮下、皮肤粘膜、静脉、尿道、阴道等。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例或份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

实施例一人参皂苷成分基于体外M2型巨噬细胞筛选

1 实验材料

1.1 实验细胞与试剂

鼠源巨噬细胞RAW264.7购自ATCC。鼠源IL-4购自美国Peprotech公司；胎牛血清购自美国HyClone公司；RPMI-1640培养基干粉购自美国Gibco公司；噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、Trizol RNA提取试剂、HighCapacity cDNA Reverse Transcription Kits购自美国Life Technologies公司；RealMasterMix SYBR Green试剂盒购自美国罗氏；其他试剂均为分析纯。精氨酸酶1(Arg-1)引物和β-肌动蛋白(β-actin)引物均由上海生物工程服务有限公司合成。

1.2仪器设备

CO₂培养箱(HEPA CLASS100，美国Thermo公司)；生物安全柜(Delta series，Labconco，美国)；低温高速离心机(Eppendorf Centrifuge 5810R，德国)；倒置显微镜(IX71，Olympus，日本)；Spectra MAX190酶标仪(美国MD公司)；QB-9006恒温微孔板快速振荡器(海门市其林贝尔仪器有限公司)；细胞计数仪(Auto T4，Nexcelom，美国)；荧光定量PCR仪(7500Fast System，美国Applied biosystems公司)。

1.3筛选药物

单体购买自上海同田生物技术有限公司。具体如表1所示。

表1本实验所使用的单体情况

药物	英文名	CAS号	货号	纯度
					人参皂苷Rg3	20(S)-Ginsenoside Rg3	14197-60-5	E-0083	≥97.0％
人参皂苷Rg1	Ginsenoside–Rg1	22427-39-0	E-0080	≥98.0％
					人参皂苷Rf	Ginsenoside–Rf	52286-58-5	E-0179	≥96.0％
人参皂苷Rb3	Ginsenoside Rg3	68406-26-8	E-0081	≥98.0％
					石吊兰素	Lysionotin	152743-19-6	E-0498	≥98.0％
三七皂苷R1	Notoginseno-side	80418-24-2	E-0248	≥95.0％

2 实验方法

2.1 细胞培养

RAW264.7细胞株培养于含10％的胎牛血清的RPMI 164培养基中，置于保持饱和湿度、5％CO₂培养箱中，在37℃恒温的条件下培养。待细胞长至7～8成密度进行传代。取10～15代的细胞用于实验。

2.2MTT法考察人参皂苷单体对巨噬细胞细胞活力的影响

巨噬细胞悬液以每孔1×10⁴/100μL接种于96孔板，培养过夜。人参皂苷Rf、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg3、石吊兰素、三七皂苷R1和皂苷Rb3采用12.5、25、50μM剂量处理细胞。刺激维持24h后，加入MTT(用PBS溶解为5g/L)溶液20μL，继续37℃培养4h，加入DMSO后置摇床上使其充分溶解摇匀后，用酶标仪读取490nm光吸收值A，计算各处理组各剂量对细胞活力的影响。各处理组设置3孔重复，独立实验重复3次。各组的细胞活力以空白对照组为100％进行换算。

2.3qRT-PCR考察人参皂苷单体对M2型巨噬细胞中精氨酸酶1(Arg-1)基因表达的影响

RAW264.7细胞培养于30mm细胞培养皿中，待贴壁后无血清处理16h，人参皂苷Rf、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg3、石吊兰素、三七皂苷R1和皂苷Rb3采用50μM预处理1h，与60ng/mL终浓度的IL-4共孵育6h后，收集各组样品提取RNA，根据260nm吸收值计算出RNA水平，加水调整各组样品RNA至0.5μg/μL。所用RNA的A260/A280均在1.8-2.0之间。逆转录合成模板cDNA后，应用7500Fast Real-Time PCR扩增仪进行PCR聚合酶链式反应。PCR反应条件：95℃×10min；50℃×2min；95℃×15s，60℃×60s，40个循环。引物序列如表2所示。

表2引物列表

引物名称	正义序列(5’-3’)	反义序列(5’-3’)
			Arg-1	CAGAAGAATGGAAGAGTCAG	CAGATATGCAGGGAGTCACC
β-actin	GCTACAGCTTCACCACCACAG	GGTCTTTACGGATGTCAACGTC

3实验结果

3.1人参皂苷单体对巨噬细胞体外增殖的影响

从表3的结果可知，与对照组相比，人参皂苷Rf、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg3、石吊兰素、三七皂苷R1和皂苷Rb3在50μM剂量对巨噬细胞RAW264.7的细胞活力无显著性毒性。后期筛选选择人参皂苷成分的50μM剂量进行。

表3人参皂苷单体对巨噬细胞体外增殖的影响

3.2人参皂苷单体对M2型巨噬细胞中精氨酸酶1(Arg-1)的基因表达的影响

从表4结果可知，与对照组相比，M2型巨噬细胞的表型极化标记物精氨酸酶1的基因表达显著提高，而人参皂苷Rb3显著抑制Arg-1的基因表达，抑制率在50％以上，而其他单体则明显促进Arg-1的基因表达。

表4筛选药物对M2型巨噬细胞中Arg-1基因表达的影响

分组	剂量	相对表达量	抑制率(％)
				C	-	1.00
M2	-	10.65	-
				人参皂苷Rg1	50	16.67	-56.48
人参皂苷Rg3	50	15.30	-43.59
				人参皂苷Rf	50	14.88	-39.67
人参皂苷Rb3	50	3.69	65.35
				石吊兰素	50	11.65	-9.36
三七皂苷R1	50	38.51	-261.52

实施例二人参皂苷Rb3抑制M2型巨噬细胞表型极化的研究

1 实验材料

1.1 实验细胞与试剂

鼠源巨噬细胞RAW264.7购自ATCC。鼠源IL-4购自美国Peprotech公司；胎牛血清购自美国HyClone公司；RPMI-1640培养基干粉购自美国Gibco公司；噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、Trizol RNA提取试剂、HighCapacity cDNA Reverse Transcription Kits购自美国Life Technologies公司；RealMasterMix SYBR Green试剂盒购自美国罗氏；其他试剂均为分析纯。精氨酸酶1(Arg-1)、β-肌动蛋白(β-actin)、炎症区域1(FIZZ1)、甘露糖受体(MR)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)引物均由上海生物工程服务有限公司合成。

1.2仪器设备

2 实验方法

2.1 细胞培养

RAW264.7细胞株培养于含10％的胎牛血清的RPMI 1640培养基中，置于保持饱和湿度、5％ CO₂培养箱中，在37℃恒温的条件下培养。待细胞长至7～8成密度进行传代。取10～15代的细胞用于实验。

2.2MTT法考察人参皂苷Rb3对巨噬细胞细胞活力的影响

巨噬细胞悬液以每孔1×10⁴/100μL接种于96孔板，培养过夜。人参皂苷Rb3采用25、50μM剂量处理细胞。刺激维持24h后，加入MTT(用PBS溶解为5g/L)溶液20μL，继续37℃培养4h，加入DMSO后置摇床上使其充分溶解摇匀后，用酶标仪读取490nm光吸收值A，计算人参皂苷Rb3各剂量处理组对细胞活力的影响。各处理组设置3孔重复，独立实验重复3次。各处理组的细胞活力以空白对照组为100％进行换算。

2.3Trans-well小室迁移实验考察M2型巨噬细胞迁移能力变化及人参皂苷Rb3干预的影响

将处于细胞对数期的巨噬细胞，用10％ FBS培养基调整细胞密度为1×10⁶/mL，种于30mm的细胞培养皿中，培养过夜。第2天换无血清培养基，人参皂苷Rb3(25、50μM)预处理1h后，加入终质量浓度为60ng/mL的IL-4造模6h，随后在Trans-well小室上室加入无血清培养基调整的细胞密度为1×10⁶/mL的细胞，体积均为100μL，迁移24h。迁移24h后取出Trans-well小室，用多聚甲醛固定30min，结晶紫染色30min，用水冲洗，用棉签小心擦除上层未迁移细胞。400倍显微镜下随机5个视野观察细胞并计数。独立实验重复3次。

2.4qRT-PCR考察人参皂苷Rb3对M2型巨噬细胞中基因表达的影响RAW264.7细胞培养于30mm细胞培养皿中，待贴壁后无血清处理16h，人参皂苷Rb3(25、50μM)预处理1h，与60ng/mL终质量浓度的IL-4共孵育6h后，收集各组样品提取RNA，根据260nm吸收值计算出RNA水平，加水调整各组样品RNA至0.5μg/μL。所用RNA的A260/A280均在1.8～2.0之间。逆转录合成模板cDNA后，应用7500Fast Real-Time PCR扩增仪进行PCR聚合酶链式反应。PCR反应条件：95℃×10min；50℃×2min；95℃×15s，60℃×60s，40个循环。引物序列如表5所示。独立实验重复3次。

表5引物列表

3实验结果

3.1人参皂苷Rb3在25-50μM对巨噬细胞的体外增殖无影响

图2为人参皂苷Rb3对巨噬细胞RAW264.7的细胞活力影响，与对照组相比，无显著性差异，说明人参皂苷Rb3在25、50μM对巨噬细胞的体外增殖无影响。

3.2人参皂苷Rb3呈剂量依赖性降低细胞因子IL-4诱导的M2型巨噬细胞体外迁移

如图3所示，M2型巨噬细胞体外迁移力提高(P<0.01)。人参皂苷Rb3呈剂量依赖性显著性降低巨噬细胞向M2表型极化而引起的体外迁移力的提升(P<0.05)。

3.3人参皂苷Rb3降低M2型巨噬细胞的标记物基因水平的表达

在静息态M0型巨噬细胞中Arg-1、MR、Fizz1和CTLA-4的基因水平低表达，经IL-4诱导后表达显著上升(P<0.01)，Rb3呈剂量依赖性下调Arg-1、MR、Fizz1和CTLA-4的基因表达(P<0.05)。结果如图4所示。

实施例三人参皂苷Rb3抑制4T1条件培养基(4T1-CM)诱导M2型巨噬细胞表型极化的研究

1 实验材料

1.1 实验细胞与试剂

鼠源巨噬细胞RAW264.7和三阴性乳腺癌4T1细胞均购自ATCC。胎牛血清购自美国HyClone公司；RPMI-1640培养基干粉购自美国Gibco公司。

1.2仪器设备

CO₂培养箱(HEPA CLASS100，美国Thermo公司)；生物安全柜(Delta series，Labconco，美国)；低温高速离心机(Eppendorf Centrifuge 5810R，德国)；倒置显微镜(IX71，Olympus，日本)；细胞计数仪(Auto T4，Nexcelom，美国)。

2 实验方法

2.1 细胞培养

巨噬细胞RAW264.7和乳腺癌4T1细胞株均培养于含10％的胎牛血清的RPMI 1640培养基中，置于保持饱和湿度、5％ CO₂培养箱中，在37℃恒温的条件下培养。

2.2制备4T1条件培养基(4T1CM)

4T1细胞在细胞培养皿中密度达到8成左右，更换为0％胎牛血清的RPMI1640培养液，继续培养24小时，1000rpm离心3分钟，将上清取出收集待用，即为4T1条件培养基。

将细胞对数期的巨噬细胞，用10％ FBS培养基调整细胞密度为1×10⁶/mL，种于30mm细胞培养皿中培养过夜。第2天换无血清培养基，人参皂苷Rb3(25、50μM)预处理1h后，加入25％体积比的4T1条件培养基，继续培养24小时。在Trans-well小室上室加入无血清培养基调整的各组细胞，密度为1×10⁶/mL，体积均为100μL，迁移24h。迁移24h后取出Trans-well小室，用多聚甲醛固定30min，结晶紫染色30min，用水冲洗，用棉签小心擦除上层未迁移细胞。400倍显微镜下随机5个视野观察细胞并计数。独立实验重复3次。

3实验结果

3.1人参皂苷Rb3呈剂量依赖性降低4T1CM诱导的M2型巨噬细胞体外迁移

如图5所示，与空白对照组相比，4T1条件培养基处理后的M2型巨噬细胞体外迁移力提高(P<0.01)。人参皂苷Rb3呈剂量依赖性显著性降低巨噬细胞向4T1CM-M2表型极化而引起的体外迁移力的提升(P<0.05)。

实施例四人参皂苷Rb3对细胞因子IL-4和IL-13诱导的骨髓来源巨噬细胞M2表型中精氨酸酶1蛋白表达的研究

1 实验材料

1.1 实验动物与试剂

B/c雌性小鼠5周龄采购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，胎牛血清FBS购自美国HyClone公司；RPMI-1640培养液购自美国Gibco公司；小鼠细胞因子M-CSF、IL-4和IL-13购自美国PeproTech公司。抗体精氨酸酶1(Arg-1)购自美国Abcam公司、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)购自美国Proteintech公司。

2实验方法

2.1骨髓来源巨噬细胞的制备

用1640培养液冲刷分离得到的小鼠股骨骨髓腔，将获得的细胞悬液1500rpm，5min，4℃离心。弃掉上清，加1xRBC红细胞裂解液，孵育2min，室温每30s轻吹打混匀。用含10％FBS和培养液终止裂解。用细胞过滤器过滤细胞悬液，再次离心。弃掉上清，用含30ng/ml M-CSF、10％FBS和1％双抗的1640培养液吹打混匀，种于175mm大培养瓶中。第4天换新鲜培养液，继续诱导分化骨髓来源巨噬细胞至第7天。

2.2人参皂苷Rb3处理细胞因子IL-4和IL-13诱导的骨髓来源巨噬细胞M2表型

将骨髓来源巨噬细胞种于细胞培养皿和96孔板中，用含10％FBS的1640培养液培养。细胞贴壁过夜后，更换为0％FBS 1640培养液配液及分组处理。分组为空白对照C组、模型M2组(IL-4-20ng/mL和IL-13-20ng/mL)、Rb3-50μM处理组(IL-4-20ng/mL、IL-13-20ng/mL和Rb3-50μM)；Rb3-100μM(IL-4-20ng/mL、IL-13-20ng/mL和Rb3-100μM)。

2.3CCK-8检测人参皂苷Rb3对IL-4和IL-13诱导的骨髓来源巨噬细胞M2表型体外活力的影响

将CCK-8溶液按试剂说明书稀释，加入96孔板各处理细胞中，作用2小时后，于酶标仪450和630nM处读值，按空白对照组为100％，计算各组的相对活力值。

2.4Western blot法检测精氨酸酶-1(Arg-1)的蛋白表达

使用BCA蛋白检测试剂盒测量蛋白含量。每个泳道上样量为10μg蛋白，按照免疫蛋白印记法的流程进行检测Arg-1和GAPDH的蛋白表达，计算Arg-1和GAPDH的比值，并以M组作为1，计算各组Arg-1的相对表达值。

3实验结果

3.1人参皂苷Rb3对细胞因子IL-4和IL-13诱导的骨髓来源巨噬细胞M2表型体外活力的影响

如图6所示，人参皂苷Rb3对细胞因子IL-4和IL-13诱导的骨髓来源巨噬细胞M2表型的体外活力无明显影响(P>0.05)。

3.2人参皂苷Rb3对细胞因子IL-4和IL-13诱导的骨髓来源巨噬细胞M2表型中精氨酸酶1蛋白表达的影响

如图7所示，经细胞因子IL-4和IL-13诱导，M2表型骨髓来源巨噬细胞中精氨酸酶1的蛋白表达显著提高(P<0.05)，人参皂苷Rb3呈剂量依赖性抑制细胞因子IL-4和IL-13诱导的骨髓来源巨噬细胞M2表型中精氨酸酶1的蛋白表达(P<0.05)。

实施例五人参皂苷Rb3抑制三阴性乳腺癌细胞4T1体外迁移的研究

1 实验材料

1.1 实验细胞与试剂

三阴性乳腺癌4T1细胞购自ATCC。胎牛血清购自美国HyClone公司；RPMI-1640培养基干粉购自美国Gibco公司；噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Life Technologies公司。

1.2仪器设备

CO₂培养箱(HEPA CLASS100，美国Thermo公司)；生物安全柜(Delta series，Labconco，美国)；低温高速离心机(Eppendorf Centrifuge 5810R，德国)；倒置显微镜(IX71，Olympus，日本)；Spectra MAX190酶标仪(美国MD公司)；QB-9006恒温微孔板快速振荡器(海门市其林贝尔仪器有限公司)；细胞计数仪(Auto T4，Nexcelom，美国)。

2 实验方法

2.1 细胞培养

乳腺癌4T1细胞株培养于含10％的胎牛血清的RPMI 1640培养基中，置于保持饱和湿度、5％CO₂培养箱中，在37℃恒温的条件下培养。待细胞长至7～8成密度进行传代，PBS清洗2次后，用0.25％的胰酶(含0.02％的EDTA)消化，加入含血清培养基终止消化，吹打并收集细胞悬液，800r/min室温离心3min。加入含血清培养基吹打混匀细胞，按1:3～1:6的比例传代培养。取10～15代的细胞用于实验。

2.2MTT法考察人参皂苷Rb3对乳腺癌细胞的细胞活力的影响

乳腺癌细胞4T1悬液以每孔5×10³/100μL接种于96孔板，培养过夜。人参皂苷Rb3采用25、50、75、100μM剂量处理细胞。刺激维持24h后，加入MTT(用PBS溶解为5g/L)溶液20μL，继续37℃培养4h，加入DMSO后置摇床上使其充分溶解摇匀后，用酶标仪读取490nm光吸收值A，计算人参皂苷Rb3各剂量处理组对细胞活力的影响。各处理组设置3孔重复，独立实验重复3次。各处理组的细胞活力以空白对照组为100％进行换算。

2.3Trans-well小室迁移实验考察人参皂苷Rb3干预4T1迁移能力的影响

收集处于细胞对数期的4T1细胞，分成3组，空白对照组，人参皂苷Rb3(50、100μM)处理组，处理24h后。在Trans-well小室上室加入各组用无血清培养基调整的细胞密度为1×10⁶/mL的4T1细胞，体积均为100μL，迁移24h。迁移24h后取出Trans-well小室，用多聚甲醛固定30min，结晶紫染色30min，用水冲洗，用棉签小心擦除上层未迁移细胞。400倍显微镜下随机5个视野观察细胞并计数。独立实验重复3次。各处理组的细胞迁移力以空白对照组为100％进行换算。

3实验结果

3.1人参皂苷Rb3对巨噬细胞和乳腺癌细胞的体外增殖无影响

如图8所示，人参皂苷Rb3为对乳腺癌细胞4T1的细胞活力无影响，与对照组相比，无显著性差异，说明人参皂苷Rb3在25-100μM对4T1细胞的体外增殖无显著影响(P>0.05)。

3.2人参皂苷Rb3呈剂量依赖性降低三阴性乳腺癌细胞4T1的体外迁移

如图9所示，人参皂苷Rb3呈剂量依赖性降低4T1细胞的体外迁移力(P<0.01)。

实施例六人参皂苷Rb3抑制三阴性乳腺癌肺转移的体内药效学研究

1实验材料

1.1实验细胞与试剂

三阴性乳腺癌4T1-luc细胞，实验室自备。胎牛血清、RPMI-1640培养基、胰酶购自美国Gibco公司。成像底物购买自美国PE公司；人参皂苷Rb3购买自上海同田生物技术有限公司。

1.2实验动物

BALB/c雌性小鼠购买自斯莱克公司，5周龄。

1.3仪器设备

小动物活体成像仪；细胞计数仪。

2实验方法

2.1动物荷瘤、分组给药及终点检测

小鼠适应性饲养1周后，以10⁶个细胞/只进行乳腺癌原位荷瘤，荷瘤后1周手术摘除原位瘤，随机分组和给药如下：模型组(M)6只；Rb3-50mg/kg/d(50)给药组6只；Rb3-100mg/kg/d(100)给药组6只；共给药处理21天；另设空白对照组(C)6只。待小鼠麻醉后，腹腔注射150μL的Luciferin底物溶液，待作用8min后解剖小鼠，取出肺组织进行成像。

3实验结果

3.1人参皂苷Rb3抑制乳腺癌肺转移

如图10所示，与模型组M相比，人参皂苷Rb3-50处理组(50mg/kg/天，21天)有抑制肺转移的趋势，人参皂苷Rb3-100处理组(100mg/kg/天，21天)可显著抑制4T1-luc的肺转移(P<0.05)。

3.2小鼠体重

如图11所示，不同分组的4组小鼠体重无明显差别(P>0.05)。

综上所述，人参皂苷Rb3在100mg/kg剂量处理21天，可显著抑制乳腺癌肺转移，且对小鼠体重影响不大。

以上对本发明实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明仅用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。同时，本领域技术人员依据本发明的思想，基于本发明的具体实施方式及应用范围上做出的改变或变形之处，都属于本发明保护的范围。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims

1.一种人参皂苷Rb3在制备用于防治乳腺癌和/或乳腺癌脏器转移的药品、食品和/或保健品中的用途；

优选地，所述人参皂苷Rb3作为唯一的活性成分应用于防治乳腺癌和/或乳腺癌脏器转移的药品、食品和/或保健品的制备中。

2.一种包含人参皂苷Rb3的药物组合物或药物制剂在制备用于防治乳腺癌和/或乳腺癌脏器转移的药品、食品和/或保健品中的用途。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌；

优选地，所述脏器为肺。

4.一种人参皂苷Rb3在制备用于肿瘤免疫治疗的药品、食品和/或保健品中的用途；

优选地，所述人参皂苷Rb3作为唯一的活性成分应用于肿瘤免疫治疗的药品、食品和/或保健品的制备中。

5.一种包含人参皂苷Rb3的药物组合物或药物制剂在制备用于肿瘤免疫治疗的药品、食品和/或保健品中的用途。

6.一种人参皂苷Rb3在制备用于调节巨噬细胞极化和/或抑制巨噬细胞体外转迁移的药品、食品和/或保健品中的用途；

优选地，所述人参皂苷Rb3作为唯一的活性成分应用于调节巨噬细胞极化和/或抑制巨噬细胞体外迁移的药品、食品和/或保健品的制备中。

7.一种包含人参皂苷Rb3的药物组合物或药物制剂在制备用于调节巨噬细胞极化和/或抑制巨噬细胞体外迁移的药品、食品和/或保健品中的用途。

8.根据权利要求4或5所述的用途，其特征在于，所述肿瘤免疫治疗与肿瘤相关巨噬细胞的调节相关。

9.根据权利要求6至8中任一项所述的用途，其特征在于，所述巨噬细胞为M2型巨噬细胞；

优选地，所述巨噬细胞极化和/或所述巨噬细胞体外迁移为细胞因子和/或4T1条件培养基诱导的所述巨噬细胞极化和/或所述巨噬细胞体外迁移；

更优选地，所述细胞因子为IL-4和/或IL-13。

10.根据权利要求2、5和7中任一项所述的用途，其特征在于，所述药物制剂包括药学上可接受的药用辅料；

优选地，所述药用辅料选自以下的一种或多种：卵磷脂、硬脂酸铝、离子交换材料、自乳化药物传递系统、表面活化剂、血清蛋白、缓冲物质和电解质；

更优选地，所述药物制剂为口服制剂、非肠道给药制剂或局部给药制剂；

又优选地，所述口服制剂为胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂或膏剂；

又优选地，所述非肠道给药制剂为注射液；

又优选地，所述局部给药制剂为霜剂、贴剂、软膏剂或喷雾剂。