CN117987574A - 一种大肠杆菌总rna残留检测试剂盒及其检测方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大肠杆菌总RNA残留检测试剂盒及其检测方法和应用，通过设计前处理体系，对质粒样本进行消化后可直接用于RT‑qPCR定量检测大肠杆菌总RNA残留。该检测方法通过设置消化质控品排除酶消化过程对检测结果的影响，确保整个检测结果的准确性，且具有优秀的专属性、准确度、灵敏度和精密度。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体地说涉及一种大肠杆菌总RNA残留检测试剂盒及其检测方法和应用。
背景技术
天然质粒是细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体(或拟核)以外的DNA分子，存在于细胞质中，具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒本身可以携带外源目的基因用于质粒DNA基因治疗药物的开发，也是CAR-T、mRNA等细胞与基因治疗药物的基本原料，而且随科学技术的发展，质粒在医药、农业和环保、食品等领域都有了广泛应用，特别是在细胞基因治疗、mRNA疫苗等先进疗法药物技术中。质粒可以作为DNA疫苗产品或产品的主要成分之一，同时也可作为病毒载体或DNA载体基因疗法的重要原料，病毒载体或非病毒载体细胞免疫疗法的重要原料。这些DNA产品的RNA残留可能影响其生物学活性(如干扰质粒的转染、表达效率)或造成风险(如外源RNA可激活细胞干扰素通路引发免疫反应)，因此需建立DNA产品的RNA残留定量检测方法。
质粒的工业化生产是通过大肠杆菌发酵、碱裂解、纯化获得质粒产品，碱裂解时大肠杆菌中大量的RNA也会同时释放出来并随机断裂形成大小不一的RNA碎片。目前针对质粒样本中总RNA残留检测有多种方法，如紫外分光光度法、琼脂糖凝胶电泳法和RT-qPCR法。使用紫外分光光度法检测质粒DNA产品溶液的OD260与OD280之比可粗略检测是否存在RNA残留，但该方法受蛋白残留、RNA碎片大小等因素的影响，因此实际应用中该方法对RNA残留的灵敏度与准确性较差。目前常用的检测方法是琼脂糖凝胶电泳(AGE)和逆转录荧光定量PCR(RT-qPCR)。
AGE法仅仅可进行定性检测，常用的AGE核酸染料对RNA的灵敏性远低于DNA，样品中DNA成分会严重影响RNA曝光成像，而且实际RNA残留为RNA降解碎片而非完整的RNA，这些进一步降低了AGE法的灵敏性和准确性。
相比AGE法，逆转录荧光定量PCR(RT-qPCR)法的灵敏度和准确度都是提升一个量级。一般的RT-qPCR法，实验流程复杂，包括样本处理、逆转录、PCR反应等。且样本处理等较复杂，对检测结果的影响比较大。因此，本细分领域亟需研发一种准确、简便的质粒DNA产品中RNA残留检测方法或者检测试剂盒用于医药质量监控。基于RT-qPCR法检测质粒RNA含量的不可控因素在于质粒样本处理环节，一般经过酶消化DNA后再进行检测。但是由于提取RNA步骤繁琐，会导致RNA提取回收率不可控，严重影响了检测的准确性。常规的酶消化过程中由于酶的用量、酶的特性、酶反应时间均对最终检测结果的回收率造成影响。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种以大肠杆菌16sRNA基因为标签建立的用于检测大肠杆菌总RNA残留的试剂盒；本发明还有一个目的是提供所述试剂盒在定量检测大肠杆菌总RNA残留上的应用；本发明还有一个目的是提供一种经消化处理后直接对质粒样本进行RT-qPCR检测以确定大肠杆菌总RNA残留的方法。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明的一种大肠杆菌总RNA残留检测试剂盒，包括如SEQ ID NO:1所示的上游引物、如SEQ ID NO:2所示的下游引物、如SEQ ID NO:3所示的引物探针、稀释液、逆转录酶、Enzyme Mix和RNA定量参考品。
其中，所述Enzyme Mix为PCR反应用DNA聚合酶混合物，包括Tag DNA聚合酶和dNTPs。
进一步地，所述RNA定量参考品来源于大肠杆菌总RNA提取物。
进一步地，所述大肠杆菌总RNA残留检测试剂盒还包括前处理体系，所述前处理体系包括DNA酶和质控品，所述质控品包含大肠杆菌DNA、大肠杆菌RNA和质粒DNA。
本发明基于RT-qPCR技术，以16sRNA基因为标签建立直接进行RT-qPCR检测的方法；特别是利用前处理体系的酶消化体系，结合RT-PCR法检测质粒样本RNA残留，具有较好的方法学性能。
其中，所述上游引物、下游引物、引物探针、逆转录酶，以及必要的逆转录buffer可预混合装入一个独立容器中作为Probe Mix。也可必要地将该Probe Mix通过冷冻干燥工艺制成相应产品，以提高产品稳定性并延长产品保质期。
优选地，所述试剂盒还包括消化反应液，所述消化反应液包括RNA酶抑制剂和反应buffer。
优选地，所述DNA酶为DNaseI。所述DNA酶优选使用不含有或极少含有残留蛋白酶产品。
进一步地，为保证DNA酶消化彻底做质控对照，所述质控品中的大肠杆菌DNA含量为0.1-1wt％；为保障酶消化过程中对RNA样品额外的痕量损失做质控对照，所述大肠杆菌RNA的含量为5-20pg/μL，优选的含量为20pg/μL；为模拟真实样本提供高浓度核酸背景做质控对照，所述质粒DNA的含量为0.5-1mg/mL，优选的含量为1mg/mL。
前述的大肠杆菌总RNA残留检测试剂盒可用于包括但不限于生物医药行业中用于生产的质粒样本中大肠杆菌总RNA残留的检测。前述的前处理试剂可独立成为一个产品，也可包含在大肠杆菌总RNA残留检测试剂盒中。
本发明还提供了基于前述试剂盒检测大肠杆菌总RNA残留的方法，该方法包括如下步骤：
(1)分别对质粒样本和质控品进行消化处理；
(2)消化后直接将消化处理获得的混合物进行RT-qPCR检测。
其中，所述消化处理是向质粒样本中加入2-8U/μgDNA的DNA酶，依次在37℃反应15-25min，在90℃反应8-15min，并保存在2-8℃下备用。
进一步地，以所述质控品的回收率在70-130％之间内作为质控标准。相较于美国药典第509号通则(USP<509>)发布的关于qPCR检测准确性回收率50-150％的参考标准而言，本发明提供的质控标准严于美国药典。而本发明提供的试剂盒及其前处理体系使得该标准的实现具有可行性。
有益效果：(1)本发明提供的前处理体系及相应的检测方法，在做样本消化的同时增加酶消化质控，通过消化质控品控制消化的过程，排除酶消化过程对检测结果的影响；同时对不同引物表现出更好的兼容性。(2)本发明基于前处理和特定的引物探针和反应体系，对大肠杆菌总RNA残留的检测经验证具有优秀的专属性、准确度、灵敏度和精密度。
附图说明
图1为实施例1大肠杆菌总RNA残留检测试剂盒的扩增曲线；
图2为实施例1大肠杆菌总RNA残留检测试剂盒的标准曲线；
图3为实施例4大肠杆菌残留RNA专属性数据线性图；
图4为实施例4大肠杆菌残留RNA专属性数据扩增曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1
本实施例提供了一种大肠杆菌总RNA残留检测试剂盒，其包含内容物如表1所示：
表1大肠杆菌总RNA残留检测试剂盒
其中，Enzyme Mix为PCR反应用DNA聚合酶混合物，包括Tag DNA聚合酶和dNTPs。Probe Mix试剂中包含上游引物、下游引物、引物探针、逆转录酶和逆转录buffer。其中，上游引物、下游引物和探针所对应的核苷酸序列如表2所示(由上海生工生物合成)；逆转录酶购于Vazyme。稀释液为0.02mg/ml BSA(1×TE,PH 8.0)。RNA定量参考品为20ng/μl大肠杆菌总RNA。
表2引物和探针序列
| 引物探针名称 | 序列信息(5’-3’) | SEQ ID NO. |
| F1 | AGATGAGAATGTGCCTTCGG | 1 |
| R1 | ATTTCACAACACGAGCTGAC | 2 |
| O1 | ACCGTGAGACAGGTGCTGCATGGC | 3 |
本实施例提供的试剂盒扩增曲线如图1所示，扩增效率E＝100.2％，R2＝1.000，线性范围2-200000fg/μL，线性良好。用于定量的标准曲线如图2所示。
实施例2
本实施例提供了一种包含前处理体系的大肠杆菌总RNA残留检测试剂盒：
表3大肠杆菌总RNA残留检测试剂盒
其中，DNA酶为DnaseI(Takara)，2×消化反应液中包含10×DnaseI buffer：40mMTris-HCl，PH 7.5(8mM Mg2+,5mM DTT)、Rnase抑制剂(Sigma)；水为无核酸酶水(购于Thermo)；质控品包括1wt％大肠杆菌DNA(购于中检院)、20pg/μL大肠杆菌RNA(购于Thermo)和1mg/mL质粒DNA(实验室提取制备)；其余物料来源请参见表1。
实施例3
本实施例提供利用实施例2所述试剂盒检测大肠杆菌总RNA残留的方法，包括如下步骤：
(1)配制消化反应液
在生物安全柜中，参照表4所示的前处理消化体系，分别对质控品和质粒样品配制消化反应液于PCR反应管中；
表4前处理体系(每1μg质粒)
| DnaseI | 4U |
| 10x DnaseI buffer | 4μL |
| Rnase抑制剂 | 1μL |
| 水 | 30μL |
| 质粒样本/质控品 | 1μL(1μg) |
(2)消化反应
将反应管放入热循环仪中37℃20min；90℃10min；完成消化反应；
(3)检测质控品的回收率
回收率R％＝(质控品检测值/质控品标识值)*100％
判断质控品回收率是否符合质控标准：
A.质控品回收率为70-130％，样品测试值有效；
B.质控品回收率>130％时，表明样本消化不完全，消化效率不达标，样品测试无效；
C.质控品回收率<70％时，表明样本消化不完全，消化效率不达标，样品测试无效。
(5)配制RT-qPCR反应体系
表5 RT-qPCR反应体系
| 试剂 | 单孔反应/μL |
| Probe mix | 10 |
| Enzyme mix | 1 |
| 引物(10μM) | 0.8 |
| 探针(10μM) | 0.2 |
| 10mg/mL BSA | 1 |
| Dnase/Rnase free water | 2 |
(6)直接进行RT-qPCR反应
表6 RT-qPCR反应程序
实施例4专属性实验
本实施例分别考察HEK293基因组DNA及PBMC基因组DNA对大肠杆菌RNA残留检测方法标准曲线的影响。
使用0.02mg/ml BSA(TE buffer)作为RNA参考品稀释液，分别制备三组标准曲线，标准曲线最高浓度点分别为：①200pg/μL的大肠杆菌总RNA参考品；②200pg/μL的大肠杆菌总RNA参考品及200pg/μL的HEK293基因组DNA混合物(实验室提取制备)；③200pg/μL的大肠杆菌总RNA参考品及200pg/μL的PBMC基因组DNA混合物(实验室提取制备)。以这三个点分别作为三组标准曲线的最高点，依次再进行5次连续的10倍比稀释组成标准曲线的6个点，考察HEK293基因组DNA及PBMC基因组DNA对大肠杆菌RNA残留检测标准曲线扩增效率、各浓度CT值的影响。实验方法和试剂如实施例3所示，不涉及酶消化处理。实施例结果表明相关干扰物HEK239基因组和PBMC基因组对检测无影响(表7、图3和图4)。
表7大肠杆菌残留RNA专属性数据
| 样本 | 基因组DNA浓度(ng/μl) | 检测浓度均值(fg/μl) |
| HEK293 gDNA | 2.11 | 1.94E-3(＜LOD) |
| PBMC gDNA | 1.15 | 4.54E-5(＜LOD) |
实施例5准确度实验
因质粒样本中大肠杆菌宿主残留DNA的质量标准一般为不超过1％，且大肠杆菌宿主残留DNA对RNA的检测存在干扰，所以模拟制备含1％HCD的质粒样本，进行DnaseI消化，并在消化前同时加标高、中、低终浓度分别为20pg/μL，2pg/μL，0.2pg/μL的大肠杆菌RNA参考品，考察经消化后RNA的回收率用于评价方法的准确度，每次实验做3重复孔。本实施例结果(表8)表明本专利所述方法或试剂盒在消化前加标回收率满足80-120％，检测结果可靠。
表8大肠杆菌残留RNA准确度数据
实施例6灵敏度实验
将大肠杆菌总RNA参考品稀释至8fg/μL、4fg/μL，2fg/μL，1fg/μL，每个浓度做6重复孔，考察各浓度RNA参考品的回收率及CV，以回收率满足70％-130％，CV＜20％的最低浓度却认为LOQ浓度。以0.02mg/ml BSA(TE Buffer)作为样品稀释液，重复6孔，以样品稀释液检测浓度的均值+3SD对应的浓度确认为方法LOD浓度。本实施例结果(表9和表10)表明本专利所述方法或试剂盒LOQ为1fg/μL，LOD为0.025fg/μL。
表9大肠杆菌残留RNA LOD数据
表10大肠杆菌残留RNA LOQ数据
实施例7精密度实验
向质粒样本中添加1％的HCD来制备含1％ HCD的质粒样本，进行DnaseI消化，并在消化前同时加标高、中、低终浓度分别为20pg/μL，2pg/μL，0.2pg/μL的大肠杆菌RNA参考品，考察经消化后各浓度样品的CV用于评价方法的重复性，每次实验做6重复孔。中间精密度每次实验做3重复孔，由两名分析员在至少2天共进行3次实验，考察实验间的CV。本实施例结果(表11和表12)表明本专利所述方法或试剂盒重复性和精密度均小于20％。
表11大肠杆菌残留RNA重复性数据
表12大肠杆菌残留RNA中间精密度数据
实施例7不同引物下前处理体系的兼容性
制备1mg/ml的加标质粒样本(含1％ E.coli HCD、终浓度20pg/μL RNA)，同时制备1mg/ml的未加标对照质粒样本，按照表13所示的三种不同前处理体系配制消化反应液进行DnaseI消化，反应管放入热循环仪中37℃20min，90℃10min完成消化反应。使用表14所列的不同引物对检测体系检测三种消化体系后的两种样品。
本发明实施结果参见表15-17所示，针对3对不同的检测引物，三种不同的前处理体系检测效率表现不同。其中C体系针对三对引物都表现出很好的回收率，都在70-130％的范围内。而AB两种体系，对于引物对P3表现出较差的回收率，分别为24.70％和31.17％。其中B组前处理体系对于P2和P3引物对都表现出较差的回收率，整体上兼容最差。相比之下C前处理体对于不同引物对表现出较好兼容性，可针对不同质量引物表现出高的耐受性。
表13三种不同的前处理消化体系
表13
表15前处理体系A的回收率数据
| 引物对 | P1 | P2 | P3 |
| 未加标对照(fg/μl) | 0.01 | 0.59 | 0.07 |
| 加标检测(fg/μl) | 17700.00 | 14100.00 | 4940.00 |
| 加标量fg | 20000.00 | 20000.00 | 20000.00 |
| 回收率(％) | 88.50 | 70.50 | 24.70 |
表16前处理体系B的回收率数据
| 引物对 | P1 | P2 | P3 |
| 未加标对照(fg/μl) | 16.80 | 12.80 | 6.88 |
| 加标检测(fg/μl) | 17600.00 | 11500.00 | 6240.00 |
| 加标量fg | 20000.00 | 20000.00 | 20000.00 |
| 回收率(％) | 87.92 | 57.44 | 31.17 |
表17前处理体系C的回收率数据
| 引物对 | P1 | P2 | P3 |
| 未加标对照(fg/μl) | 0.12 | 0.69 | 0.91 |
| 加标检测(fg/μl) | 24200.00 | 14000.00 | 22400.00 |
| 加标量fg | 20000.00 | 20000.00 | 20000.00 |
| 回收率(％) | 121.00 | 70.00 | 112 |
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种大肠杆菌总RNA残留检测试剂盒，其特征在于：包括如SEQ ID NO:1所示的上游引物、如SEQ ID NO:2所示的下游引物、如SEQ ID NO:3所示的引物探针、稀释液、逆转录酶、Enzyme Mix和RNA定量参考品。
2.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌总RNA残留检测试剂盒，其特征在于：所述RNA定量参考品来源于大肠杆菌总RNA提取物。
3.根据权利要求1或2所述的一种大肠杆菌总RNA残留检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒还包括前处理体系，所述前处理体系包括DNA酶和质控品，所述质控品包含大肠杆菌DNA、大肠杆菌RNA和质粒DNA。
4.根据权利要求3所述的一种大肠杆菌总RNA残留检测试剂盒，其特征在于：所述前处理体系还包括消化反应液，所述消化反应液包括RNA酶抑制剂和反应buffer。
5.根据权利要求4所述的一种大肠杆菌总RNA残留检测试剂盒，其特征在于：所述DNA酶为DNaseI。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于：所述质控品中的大肠杆菌DNA含量为0.1-1wt％，大肠杆菌RNA含量为5-20pg/μL，质粒DNA含量为0.5-1mg/mL。
7.如权利要求1-6任意一项所述的试剂盒在定量检测大肠杆菌总RNA残留上的应用。
8.利用权利要求1所述试剂盒检测大肠杆菌总RNA残留的方法，其特征在于：
(1)分别对质粒样本和质控品同时进行消化处理；
(2)消化后直接将消化处理获得的混合物进行RT-qPCR检测。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述消化处理是向质粒样本中加入2-8U/μgDNA的DNA酶，依次在37℃反应15-25min，在90℃反应8-15min。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：以所述质控品的回收率在70-130％之间内作为质控标准。
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