CN117987462A - 一种抗4种水稻病毒rna干涉载体、构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗4种水稻病毒RNA干涉载体、构建方法及应用，属于生物技术领域。本发明公开针对水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)、南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)、水稻齿叶矮缩病毒(RRSV)、水稻条纹病毒(RSV)基因保守片段的融合序列，如SEQ ID NO.5所示，并基于此融合序列构建了RNA发夹结构。本专利还公开基于该融合发夹的转基因载体pRNAi‑4K及其构建方法。将该载体转化水稻，得到的转基因水稻株系对靶标的4种水稻病毒均产生了极高的抗性，为广谱高效水稻抗性育种提供了成功的实例和一种新的有效方法。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种适合单子叶植物遗传转化的4种水稻病毒RNA干涉载体、构建方法及其在水稻上应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一，同时也是我国最主要的栽培作物之一，但其每年都遭受到严重的病虫害的侵扰，给农业生产带来了巨大的损失。
水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)和南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)属于呼肠孤病毒科，斐济病毒属，分别由灰飞虱(SBPH)和白背飞虱(WPH)传播；水稻齿叶矮缩病毒(RRSV)属于呼肠孤病毒科，水稻病毒属，传播介体为褐飞虱(BPH)；而水稻条纹病毒(RSV)则是属于白纤病毒科，纤细病毒属，传毒介体为灰飞虱。这些病毒侵染水稻后会严重阻碍水稻发育并显著下降其结实率，甚至造成绝收，对亚洲水稻生成造成了严重的威胁。
通过杀虫剂来抑制病毒传播是目前的主要控制策略，但对环境有害并且成本高昂。抗病毒品种的开发是控制病毒病害最经济和最环保的策略。但是，除了RSV以外，其余3中病毒尚无可以用于生产的抗性品种。并且，由于缺乏高而稳定的抗性种质资源，针对RBSDV、SRBSDV和RRSV的抗性育种仍然进展有限。
传统上，水稻抗病毒育种依赖于自然抗性源的筛选，但由于自然抗性源的缺乏，这种方法面临巨大挑战。近年来，RNA干涉(RNAi)技术的发展为水稻抗病毒育种提供了新的解决方案。RNAi是真核细胞中的一种生物学现象，细胞通过产生特定的小RNA(sRNA)，特异性降解或沉默与sRNA序列互补的mRNA，从而抑制特定基因的表达。并且，RNAi也是植物对病毒的一种重要的防御机制。在水稻基因工程中，利用RNAi技术可以特异性地靶向并降解病毒核酸，从而提高水稻对这些病毒的抗性。虽然之前已有通过RNAi技术抗水稻病毒的案例，但往往都是针对1-2种水稻病毒，开发能同时对多种病毒产生抗性的水稻品种仍然是一个挑战。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中难以同时使植物对多种病毒产生抗性的缺陷，并提供一种抗4种水稻病毒RNA干涉载体、构建方法及应用。本发明通过构建一个单一的长发夹RNA(hpRNA)结构，针对RBSDV、SRBSDV、RSV和RRSV的关键基因保守区域，成功开发出了一种同时抗4种水稻病毒RNA干涉载体，可提高水稻等禾本科植物的抗病毒能力，也为未来的抗病毒育种提供了新的方向。
为实现上述发明目的，本发明具体采用的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种抗4种水稻病毒RNA干涉载体，其载体骨架上连接有4种水稻病毒基因保守片段的融合片段，且融合片段的正义链和反义链之间通过内含子片段连接形成RNA发夹结构；所述融合片段的正义链序列和反义链序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
作为上述第一方面的优选，所述内含子片段为拟南芥RTM1基因的内含子片段，序列如SEQ ID NO.7所示。
作为上述第一方面的优选，所述载体骨架为pCAMBIA1300载体，且其中的潮霉素抗性基因被替换为草甘膦抗性基因。其中，包含的草甘膦抗性基因可用于转基因后代筛选。
第二方面，本发明提供了一种如上述第一方面任一方案所述抗4种水稻病毒RNA干涉载体的构建方法，其特征在于，将所述4种水稻病毒基因保守片段的融合片段正义链、反义链以及所述内含子片段，通过同源重组连入所述载体骨架中，形成抗4种水稻病毒RNA干涉载体。
作为上述第二方面的优选，所述4种水稻病毒基因保守片段的融合片段通过将4种病毒基因保守片段通过同源重组酶连入SmaI消化的中间载体pUC18得到；所述4种病毒基因保守片段分别为序列如SEQ ID NO.1所示的RBSDV P10基因片段、如SEQ ID NO.2所示的SRBSDV P9-1基因片段、如SEQ ID NO.3所示的RRSV S9基因片段、如SEQ ID NO.4所示的RSVCP基因片段。
作为上述第二方面的优选，一个优选实施例中抗4种水稻病毒RNA干涉载体pRNAi-4K的构建方法如下：步骤(1)分别得到如序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQID NO.4所示的RBSDV P10、SRBSDV P9-1、RRSV S9、RSV CP基因片段；再将得到的四种基因片段通过同源重组酶连入SmaI消化的中间载体pUC18，得到4种病毒基因保守片段融合片段，序列如SEQ ID NO.5；步骤(2)获取SEQ ID NO.7所示的拟南芥RTM1基因内含子片段，将其与4种病毒基因保守片段融合片段通过同源重组连入潮霉素抗性基因被替换为草甘膦抗性基因且包含有玉米泛素基因Ubi启动子和NOS终止子的pCAMBIA1300载体(记为pCAMBIA1300-GlyR)，得到4种水稻病毒RNA干涉载体pRNAi-4K。
作为上述优选实施例的进一步优选，所述步骤(1)采用如下方式：提取感染RBSDV的水稻组织总RNA，以RBSDV-P10(UC18)-F和RBSDV-P10(SRB_P9-1)-R所示序列为引物对，经RT-PCR扩增得到序列为SEQ ID NO.1的RBSDV P10基因片段；提取感染SRBSDV的水稻组织总RNA，以SRBSDV-P9-1(RB_P10)-F和SRBSDV-P9-1(RRSV_S9)-R所示序列为引物对，经RT-PCR扩增得到序列为SEQ ID NO.2的SRBSDV P9-1基因片段；提取感染RRSV的水稻组织总RNA，以RRSV_S9(SRB_P9-1)-F和RRSV-S9(RSV-CP)-R所示序列为引物对，经RT-PCR扩增得到序列为SEQ ID NO.3的RRSV S9基因片段；提取感染RSV的水稻组织总RNA，以RSV-CP(RRSV-S9)-F和RSV-CP(UC18)-R所示序列为引物对，经RT-PCR扩增得到序列为SEQ ID NO.4的RSV CP基因片段。上述用到的引物如下：
将pUC18载体用SmaI限制性内切酶消化，将RT-PCR得到的片段通过同源重组试剂盒，重组到切开的pUC18载体，筛选得到成功重组的克隆获得pUC18-4K载体。
作为上述优选实施例的进一步优选，所述步骤(2)采用如下方式：分别使用RBSDV-P10(Ubi)-F、RSV-CP(intron)-R和RSV-CP(intron)-F、RBSDV-P10(NOS)-R引物，以pUC18-4K为模板，PCR扩增4种病毒基因保守片段融合片段的正义链和反义链。使用RTM1-Intron-F和RTM1-Intron-R引物，以拟南芥基因组DNA为模板，PCR扩增拟南芥RTM1基因内含子片段。上述用到的引物如下：
将4种病毒基因保守片段融合片段的正义链和反义链片段，以及RTM1内含子片段通过同源重组连入KpnI和PstI消化的pCAMBIA1300-GlyR载体，得到4种水稻病毒RNA干涉载体pRNAi-4K。
第四方面，本发明提供了一种如上述第一方面任一方案所述抗4种水稻病毒RNA干涉载体的应用，其特征在于，利用所述4种水稻病毒RNA干涉载体转化受体植物，使之对水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)、南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)、水稻齿叶矮缩病毒(RRSV)、水稻条纹病毒(RSV)产生抗性。
作为上述第三方面的优选，所述转化的方法为农杆菌介导法。
作为上述第三方面的优选，所述农杆菌为根癌农杆菌菌株EHA105。
作为上述第三方面的优选，所述受体植物为禾本科植物。
作为上述第三方面的优选，所述受体植物为水稻。
根癌农杆菌介导的植物遗传转化方法是目前应用最为广泛的转化方法之一，已成功的应用于单、双子叶植物的转基因研究中。利用根癌农杆菌EHA105将本发明最终构建的干涉载体pRNAi-4K导入水稻。所得到的转基因植株可以使入侵的病毒基因发生RNA沉默现象，使病毒不能复制或积累，从而使植物具备对病毒的抗病性。
本发明已得到武育粳3号水稻品种为受体的T4代转基因植株，编号为ZJU-4K，PCR检测结果见图2。通过人工接种的方法，对T4代ZJU-4K植株进行RBSDV、SRBSDV、RRSV、RSV四种水稻病毒抗性鉴定，每种病毒野生型武育粳3号水稻以及ZJU-4K水稻各接种3组重复，每个重复30株水稻。RBSDV接种后，野生型武育粳3号水稻每组发病率分别为22.22％、11.76％、32.35％，ZJU-4K水稻每组发病率分别为6.06％、0％、0％；SRBSDV接种后，野生型武育粳3号水稻每组发病率分别为34.38％、34.48％、28.57％，ZJU-4K水稻每组发病率均为0％；RRSV接种后，野生型武育粳3号水稻每组发病率分别为53.57％、58.62％、39.29％，ZJU-4K水稻每组发病率均为0％；RSV接种后，野生型武育粳3号水稻每组发病率分别为59.09％、55.56％、72.41％，ZJU-4K水稻每组发病率分别为0％、0％、3.57％。这说明转基因水稻植株较受体，对这4中水稻病毒的抗性大幅提升(图3)。
综上，本发明构建了一种抗4种水稻病毒RNA干涉载体，将该载体转化水稻，得到的转基因水稻株系对靶标的4种水稻病毒均产生了极高的抗性，为广谱高效水稻抗性育种提供了成功的实例和一种新的有效方法。
附图说明
图1为抗4种水稻病毒RNA干涉载体pRNAi-4K的图谱示意图。
图2为T4代ZJU-4K水稻PCR检测结果。提取野生型武育粳3号和T4代ZJU-4K水稻基因组RNA，通过融合序列特异性引物进行PCR检测并琼脂糖电泳分析。其中，WYJ3代指武育粳3号水稻；CK代指加入双蒸水的阴性对照；分子量标注在最右侧。
图3为人工接种鉴定野生型武育粳3号和ZJU-4K水稻植株对RBSDV、SRBSDV、RRSV、RSV抗性水平。其中A、B、C、D依次分别是接种RBSDV、SRBSDV、RRSV、RSV后水稻植株发病率以及发病症状。武育粳3号和ZJU-4K水稻植株发病率间使用t-检验确认是否存在显著性差异分析，*代指p值小于0.05；***代指p值小于0.001；****代指p值小于0.0001。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。本发明所用的pCAMBIA1300-GlyR载体为潮霉素抗性基因被替换为草甘膦抗性基因且包含有玉米泛素基因Ubi启动子和NOS终止子的pCAMBIA1300载体，由pCAMBIA1300(农杆菌介导法转化水稻的常用载体)载体改造而来，其潮霉素抗性基因替换为了草甘膦抗性基因，多克隆位点插入了玉米泛素基因Ubi启动子；pUC18为常见的分子克隆中间载体，以上载体保存于浙江大学农业与生物技术学院生物技术研究所植物病毒实验室。下述实施例中所用的其他试验材料，如无特殊说明，均为采用常规生化试剂。
实施例1、抗4种水稻病毒RNA干涉载体的构建
步骤1、RBSDV P10、SRBSDV P9-1、RRSV S9、RSV CP基因片段的获得。
提取感染RBSDV的水稻组织总RNA，以RBSDV-P10(UC18)-F和RBSDV-P10(SRB_P9-1)-R所示序列为引物对，经RT-PCR扩增得到序列为SEQ ID NO1.的RBSDV P10基因片段；提取感染SRBSDV的水稻组织总RNA，以SRBSDV-P9-1(RB_P10)-F和SRBSDV-P9-1(RRSV_S9)-R所示序列为引物对，经RT-PCR扩增得到序列为SEQ ID NO.2的SRBSDV P9-1基因片段；提取感染RRSV的水稻组织总RNA，以RRSV_S9(SRB_P9-1)-F和RRSV-S9(RSV-CP)-R所示序列为引物对，经RT-PCR扩增得到序列为SEQ ID NO.3的RRSV S9基因片段；提取感染RSV的水稻组织总RNA，以RSV-CP(RRSV-S9)-F和RSV-CP(UC18)-R所示序列为引物对，经RT-PCR扩增得到序列为SEQ ID NO.4的RSV CP基因片段。
本步骤用到的引物如下：
本步骤中用到的PCR反应体系均为：10×buffer 10.0μL，2.5mM dNTPs 8.0μL,Primer STAR Taq酶(Takara)1.0μL，模板cDNA4.0μL，正反向引物各5.0μL(引物浓度10μM)，加水至100μL。PCR扩增程序为：98℃预变性3min；98℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1kb/1min，循环34次；72℃再延伸5min；12℃保温。在1％琼脂糖凝胶上对PCR扩增产物进行核酸电泳分离，核酸染料染色后在紫外灯下拍照，记录结果，并切胶回收PCR产物。用Axygen胶回收Kit对电泳条带进行回收。
步骤2、构建RBSDV P10、SRBSDV P9-1、RRSV S9、RSV CP基因片段的融合序列。
将回收的PCR产物，利用通用生物生产的同源重组酶连接到SmaI酶切的pUC18载体上，得到RBSDV P10、SRBSDV P9-1、RRSV S9、RSV CP基因片段的融合序列的重组载体。将重组载体，转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，PCR筛选获得阳性菌落。
步骤3、将融合序列发夹结构连入pCAMBIA1300-GlyR载体。
分别使用RBSDV-P10(Ubi)-F、RSV-CP(intron)-R和RSV-CP(intron)-F、RBSDV-P10(NOS)-R引物，以pUC18-4K为模板，PCR扩增4种病毒基因保守片段融合片段的正义链和反义链(其中正义链采用RBSDV-P10(Ubi)-F和RSV-CP(intron)-R作为引物进行扩增，反义链采用RSV-CP(intron)-F和RBSDV-P10(NOS)-R作为引物进行扩增)，得到的正义链和反义链序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。使用RTM1intro(RSV-CP)-F和RTM1intro(RB-P10)-F引物，以拟南芥基因组DNA(SEQ ID NO.7所示)为模板，PCR扩增拟南芥RTM1基因内含子片段。在1％琼脂糖凝胶上对PCR扩增产物进行核酸电泳分离，用Axygen胶回收Kit对电泳条带进行回收。
本步骤中用到的PCR反应体系均为：10×buffer 10.0μL，2.5mM dNTPs 8.0μL,Primer STAR Taq酶(Takara)1.0μL，模板cDNA4.0μL，正反向引物各5.0μL(引物浓度10μM)，加水至100μL。PCR扩增程序为：98℃预变性3min；98℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1kb/1min，循环34次；72℃再延伸5min；12℃保温。
本步骤用到的引物如下：
将回收的PCR产物，利用通用生物生产的同源重组酶连接KpnI和PstI消化pCAMBIA1300-GlyR载体上，得到抗4种水稻病毒RNA干涉载体pRNAi-4K。将重组载体，转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，PCR筛选获得阳性菌落。抗4种水稻病毒RNA干涉载体pRNAi-4K的图谱如图1所示。
实施例2、抗4种水稻病毒RNA干涉载体pRNAi-4K转化武育粳3号水稻
步骤1、pRNAi-4K载体电击转化农杆菌菌株EHA105.
将10ng质粒(即前述实施例1中得到的抗4种水稻病毒RNA干涉载体pRNAi-4K)、150μL农杆菌EHA105感受态混匀，加入到灭菌后的电击杯中，于2.5KV电压下进行电击转化。然后加800μL液体培养基冲洗电击杯并转入EP管，28℃,220rpm摇培2h后，取100μL培养液涂于YEP固体培养基上(Kana：50μg/mL；利福平25μg/mL)，28℃培养约18小时。经PCR鉴定单菌落后，挑取单菌落于5mL YEP液体培养基(Kana：50μg/mL；利福平25μg/mL)，28℃，220rpm，培养18h，得到重组农杆菌。
步骤2、农杆菌侵染水稻愈伤与再生水稻苗的筛选获得
利用上述步骤1得到的重组农杆菌转化武育粳3号水稻品种，愈伤农杆菌侵染筛选后，诱导分化，得到再生水稻植株。提取分化水稻植株基因组DNA，使用RBSDV-P10(Ubi)-F和RSV-CP(intron)-R引物通过PCR检测确定阳性转基因植株，并加代繁种，下面通过实施例3说明相关试验结果。
实施例3、转基因植株对水稻条纹病毒的抗性
本发明通过人工接种的方法，在温室对T4代ZJU-4K水稻(即实施例2中以武育粳3号水稻品种为受体的T4代转基因植株，编号为ZJU-4K)进行了RBSDV、SRBSDV、RRSV和RSV的抗性鉴定。T4代ZJU-4K水稻PCR检测结果见图2。灰飞虱来自实验室保存的成虫群体，在RBSDV阳性水稻植株上饲养7天，然后将灰飞虱转移到健康的水稻品种上继续饲养8天，使RBSDV在灰飞虱中完成循回。用斑点酶联免疫吸附试验(dot-ELISA)测定灰飞虱群体的RBSDV带毒率。白背飞虱来自实验室保存的成虫群体，在SRBSDV阳性水稻植株上饲养7天，然后将白背飞虱转移到健康的水稻品种上继续饲养8天，使SRBSDV在白背飞虱中完成循回。用斑点酶联免疫吸附试验(dot-ELISA)测定白背飞虱群体的SRBSDV带毒率。褐飞虱来自实验室保存的成虫群体，在RRSV阳性水稻植株上饲养7天，然后将褐飞虱转移到健康的水稻品种上继续饲养8天，使RRSV在褐飞虱中完成循回。用斑点酶联免疫吸附试验(dot-ELISA)测定褐飞虱群体的RRSV带毒率。由于RSV可以通过带毒灰飞虱经卵传播给后代，故无需经历灰飞虱获毒步骤。RSV带毒灰飞虱来源于实验室饲养的带毒群体，群体带毒率在90％-100％之间。
将带毒飞虱赶到健康水稻上，按照如下强度进行接种：RBSDV，单株有效从虫数2，接种时间48h；SRBSDV，单株有效从虫数2，接种时间48h；RRSV，单株有效从虫数1.5，接种时间48h；RSV，单株有效从虫数1.5，接种时间48h。接种完成后，扫出飞虱并将其杀灭。
接种完成后将水稻苗移栽，30-40天后统计发病率。每种病毒野生型武育粳3号水稻以及ZJU-4K水稻各接种3组重复，每个重复30株水稻。RBSDV接种后，野生型武育粳3号水稻每组发病率分别为22.22％、11.76％、32.35％，ZJU-4K水稻每组发病率分别为6.06％、0％、0％；SRBSDV接种后，野生型武育粳3号水稻每组发病率分别为34.38％、34.48％、28.57％，ZJU-4K水稻每组发病率均为0％；RRSV接种后，野生型武育粳3号水稻每组发病率分别为53.57％、58.62％、39.29％，ZJU-4K水稻每组发病率均为0％；RSV接种后，野生型武育粳3号水稻每组发病率分别为59.09％、55.56％、72.41％，ZJU-4K水稻每组发病率分别为0％、0％、3.57％。这说明转基因水稻植株较受体，对这4中水稻病毒的抗性大幅提升。ZJU-4K对4种水稻病毒抗性水平鉴定的结果见图3。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。相关领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种抗4种水稻病毒RNA干涉载体，其特征在于，载体骨架上连接有4种水稻病毒基因保守片段的融合片段，且融合片段的正义链和反义链之间通过内含子片段连接形成RNA发夹结构；所述融合片段的正义链序列和反义链序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
2.如权利要求1所述的抗4种水稻病毒RNA干涉载体，其特征在于，所述内含子片段为拟南芥RTM1基因的内含子片段，序列如SEQ ID NO.7所示。
3.如权利要求1所述的抗4种水稻病毒RNA干涉载体，其特征在于，所述载体骨架为pCAMBIA1300载体，且其中的潮霉素抗性基因被替换为草甘膦抗性基因。
4.一种如权利要求1～3任一所述抗4种水稻病毒RNA干涉载体的构建方法，其特征在于，将所述4种水稻病毒基因保守片段的融合片段正义链、反义链以及所述内含子片段，通过同源重组连入所述载体骨架中，形成抗4种水稻病毒RNA干涉载体。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述4种水稻病毒基因保守片段的融合片段通过将4种病毒基因保守片段通过同源重组酶连入SmaI消化的中间载体pUC18得到；所述4种病毒基因保守片段分别为序列如SEQ ID NO.1所示的RBSDV P10基因片段、如SEQ IDNO.2所示的SRBSDV P9-1基因片段、如SEQ ID NO.3所示的RRSV S9基因片段、如SEQ IDNO.4所示的RSV CP基因片段。
6.一种如权利要求1～3任一所述抗4种水稻病毒RNA干涉载体的应用，其特征在于，利用所述4种水稻病毒RNA干涉载体转化受体植物，使之对水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)、南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)、水稻齿叶矮缩病毒(RRSV)、水稻条纹病毒(RSV)产生抗性。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述转化的方法为农杆菌介导法。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述农杆菌为根癌农杆菌菌株EHA105。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述受体植物为禾本科植物。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述受体植物为水稻。
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