CN117982488A - 鸦胆子素A在制备治疗IgA肾病的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及鸦胆子素A在制备治疗IgA肾病的药物中的应用。本发明通过在Thy1大鼠模型体内进行的药效学实验表明，鸦胆子素A可有效降低IgA肾病模型‑抗Thy1大鼠肾炎模型24h尿蛋白及尿蛋白肌酐比，抑制抗Thy1大鼠肾皮质炎症、增殖和纤维化相关基因Cyclin E、α‑SMA、FN、CCL2、NF‑κB、IL‑6的mRNA的表达，进一步改善肾脏病理，在体外细胞模型当中，鸦胆子素A可抑制大鼠系膜细胞的增殖，抑制TGF‑β、Cyclin E、α‑SMA、CCL2、NF‑κB、IL‑6等mRNA的表达，表明鸦胆子素具有显著的抗炎、抗细胞增殖以及抗纤维化的效果。鸦胆子素A具有可观的治疗潜力，为临床预防、治疗IgA肾病的药物提供了一种潜在的新药选择，对于开发安全有效的IgA肾病治疗药物具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及鸦胆子素A在制备治疗IgA肾病的药物中的应用。
背景技术
IgA肾病(IgA nephropathy)是世界上最常见的原发性肾小球疾病。其病因不明，病理机制尚不明确，病理特征主要表现为以IgA1和异常糖基化IgA1聚合形成的免复合物在肾小球系膜区的沉积，IgA肾病的临床表现多种多样，差异较大，多数患者起病隐匿，临床上约40％-45％患者表现为单纯血尿(镜检或肉眼血尿)，35％的患者表现为血尿伴轻、中度蛋白尿，有些患者表现为单纯蛋白尿，世界各地的流行病学研究显示IgA肾病发病率存在极大的地域差异，其中，亚洲地区IgA肾病患者发病率高达60％，欧洲和北美等国家报道的IgA肾病发病率分别为30％和10％，IgA肾病患者约80％为儿童和年轻人(20至30岁)，尽管IgA肾病患者的临床进展有较强的异质性，多数病情呈慢性进行性发展，其中15-20％的患者在首次发病后10年内进展到终末期肾脏疾病(End-stage renal disease，ESRD)，30-40％的患者在发病后20-30年内进展到ESRD，最终导致透析或肾移植，这对个人和全球卫生经济造成了巨大的社会经济压力。
随着近年来对IgA肾病机制的大量研究，目前医学界认为IgA肾病是多种因素引起的自身免疫性疾病，并提出“四重打击”学说：(1)血液循环中低糖基化IgA1(Galactosedeficient IgA1，Gd-IgA1)的合成显著增加；(2)抗Gd-IgA1分子的自身抗体的产生；(3)形成含有致病性Gd-IgA1的循环免疫复合物；(4)复合物在肾球系膜区沉积，导致肾小球系膜细胞活化和肾小球损伤。IgA肾病与糖尿病肾病的区别主要在于：(1)发病因素不同。大多数患者发生IgA肾病主要是因为感染性因素引起的，比如上呼吸道感染、肠道感染，这样就会导致免疫系统紊乱，引起免疫复合物沉积于肾脏。而糖尿病肾病的发病因素和血糖持续性升高、胰岛素抵抗、饮食结构不合理、肾脏微血管病变有密切关系；(2)症状不同。发生糖尿病肾病后，首先会出现血糖升高，其次还会伴随高血压、水肿、大量蛋白尿等。发生IgA肾病后，除了会引起高血压、水肿，患者还会出现肉眼可见血尿、小便泡沫增多、尿量逐渐减少、腰背酸痛、夜尿次数增多；(3)治疗方案不同。治疗IgA肾病一般是选择控制感染以及控制蛋白尿的药物，如果出现高血压时可以服用降压药物。对于糖尿病肾病的治疗方法，主要是通过降糖药物以及降压药物来进行治疗。因此，IgA肾病已被广泛认为是一种多基因多因素参与的复杂性疾病，近年来开展众多全基因组关联分析(Genome-WideAssociation Studies，GWAS)研究提示IgA肾病的易感性与黏膜免疫系统、补体替代途径、抗原处理和呈递途径的某些遗传变异有关，迄今为止，IgAN尚缺乏有效的根治手段，目前临床常用的治疗药物包括激素、环磷酰胺、硫唑嘌呤、抗凝剂等等，在缓解病情、减少蛋白尿和抑制活动性病变等方面具有一定作用，但并不能有效延缓或终止慢性肾脏病(CKD)的进程，且因常常伴有严重不良反应或毒副作用，临床应用受到限制。
发明内容
为了解决上述问题，在现有治疗IgA肾病药物的基础上，本发明提供鸦胆子素A在制备治疗IgA肾病的药物中的应用。
一方面，本发明提供鸦胆子素A在制备治疗IgA肾病的药物中的应用。
进一步地，鸦胆子素A制备的治疗IgA肾病的药物可以抑制肾皮质炎症、增殖以及纤维化相关基因Cyclin E、α-SMA、CCL2、NF-κB、IL-6、FN的mRNA表达。
进一步地，鸦胆子素A制备的治疗IgA肾病的药物可以抑制肾小球系膜细胞的增殖。
进一步地，鸦胆子素A制备的治疗IgA肾病的药物可以降低蛋白尿，改善肾脏病理。
进一步地，鸦胆子素A制备的治疗IgA肾病的药物可以为口服制剂、舌下含化片剂、丸剂或针剂。
进一步地，口服制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、滴剂、果汁剂或糖浆剂。
进一步地，针剂为注射液、粉针剂或冻干粉针剂。
另一方面，本发明还提供一种治疗IgA肾病的药物，包含鸦胆子素A以及药物学上可接受的辅料。
进一步地，药物学上可接受的辅料包括崩解剂、湿润剂、粘合剂、填充剂、吸收促进剂、溶剂、润滑剂、表面活性剂、香味剂、甜味剂、抗氧化剂、防腐剂或色素中的任意一种或几种的组合物。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明通过在Thy1大鼠模型体内进行的药效学实验表明，鸦胆子素A可以有效抑制IgA肾病模型Thy1大鼠的肾皮质炎症、增殖、纤维化等相关基因、Cyclin E、α-SMA、CCL2、NF-κB、IL-6、FN的mRNA表达，降低大鼠24h尿蛋白及尿蛋白肌酐比，改善肾脏病理，在体外细胞模型当中，鸦胆子素A可抑制大鼠系膜细胞的增殖，抑制TGF-β、Cyclin E、α-SMA、CCL2、NF-κB、IL-6)等mRNA的表达，表明鸦胆子素具有显著的抗炎、抗细胞增殖以及抗纤维化的效果。鸦胆子素A治疗IgA肾病的疗效显著，具有可观的治疗潜力，为临床预防、治疗IgA肾病的药物提供了一种潜在的新药选择，对于探索安全有效的IgA肾病治疗药物并进一步探索其内在的肾脏保护作用机制具有重要的启发意义。
2.本发明证实了鸦胆子素A单体在治疗IgA肾病中的确切疗效，相比于包含鸦胆子在内的传统中药组合物复合组方，本发明对于IgA肾病的治疗预防更为明确，也从一定程度上减少了副作用的发生。
附图说明
为了更清楚的说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见的，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它附图。
图1为鸦胆子素A的化学结构式；
图2为本发明实施例1鸦胆子素A对抗Thy1模型大鼠尿蛋白肌酐比、24h尿蛋白及肾脏病理的影响；
图3为本发明实施例1鸦胆子素A对抗Thy1模型大鼠肾皮质CCL2、IL-6、NF-κB、α-SMA、FN、Cyclin E mRNA的影响；
图4为本发明实施例2鸦胆子素A对LPS诱导的系膜细胞增殖的影响；
图5为本发明实施例2鸦胆子素A对LPS诱导的相关系膜细胞增殖及炎症因子TGF-β、α-SMA、Cyclin E、IL-6、CCL2、NF-κB mRNA表达以及细胞周期分布的影响。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通的技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明的保护范围。
本发明中所述鸦胆子素A(BruceineA，BA)是从鸦胆子干燥果实中提取的苦木素类化合物，CAS：25514-31-2，分子式为C26H34O11，分子量为522.53，包含一个含氧杂环，一个内酯环，化学结构式如图1所示。本发明对所述鸦胆子素的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售鸦胆子素A即可。
实施例1鸦胆子素A在体内防治IgA肾病的作用
1.1材料：
6-8周龄雄性Wistar(均为SPF级)购于浙江维通利华实验动物技术有限公司；鸦胆子素A购于南京春秋生物工程有限公司
1.2动物饲养及分组：
实验大鼠于广东省中医院科学研究所实验动物屏障系统内饲养，给予普通饲料，自由饮食、饮水，每天12h交替照明，实验已通过动物实验伦理委员会批准。
36只雄性Wistar大鼠适应性喂养7天后按体重随机分为6组，每组各6只，分别设为健康对照组、模型组、鸦胆子素A低剂量给药组、鸦胆子素A中剂量给药组、鸦胆子素A高剂量给药组、奥美沙坦阳性药物组(Olmesartan，OM)。
1.3给药方案：
对照组和模型组分别腹腔注射相应体积生理盐水，鸦胆子素A低、中、高剂量组分别以腹腔注射0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg鸦胆子素A溶液，每间隔1天给药1次，连续给药7天,奥美沙坦阳性药组给与10mg/kg的奥美沙坦，每天灌胃给药1次，连续给药7天。
1.4检测指标
1.4.1大鼠尿蛋白检测：
使用大鼠代谢笼收集给药第3天及第7天后的24h尿液，大鼠放置代谢笼中24h，禁食不禁水，收集24h尿，记录尿量，使用全自动生物化学仪检测尿蛋白肌酐比值的变化，同时计算24h尿蛋白定量。
1.4.2大鼠肾皮质PCR检测：检测肾脏重要的炎症因子CCL2、NF-κB、IL-6及α-SMA、Cyclin E、FN等mRNA的表达变化。
1.4.3大鼠肾脏病理的检测：采用HE及PAS染色观察大鼠肾脏病理的改善情况。
1.5结果
给药3天后中高剂量的鸦胆子素A即可有效降低尿蛋白肌酐比及24h尿蛋白定量，给药7天后，低中高剂量的鸦胆子素A均能降低大鼠的尿蛋白肌酐比及24h尿蛋白定量结果如图2A-2B所示，病理评估PAS染色发现，模型组部分肾小球肥大，出现明显的系膜细胞增殖和系膜基质的沉积，同时伴有毛细血管袢受压，毛细血管官腔狭窄，个别出现结构破坏，血管消失，出现结节和团块状实性区，呈弥漫性指状分布改变，给药鸦胆子素A后，可有效的改善系膜细胞的增殖及系膜基质的沉积，改善肾脏病理，结果如图2C-2F所示，同时对大鼠肾皮质提取RNA进行PCR实验，发现模型组对比健康对照组CCL2、IL-6、NF-κB及FN、α-SMA、CyclinE等mRNA显著升高，给药鸦胆子素A后，能显著降低其mRNA的表达，结果如图3A所示，以上结果均表明鸦胆子素A可减轻肾脏炎症反应，减少系膜细胞的增殖及系膜基质的沉积，改善肾脏病理，预防肾小球硬化，从而起到防治IgA肾病的作用。
实施例2鸦胆子素A在治疗LPS诱导系膜细胞增殖及炎症模型的作用
2.1材料：
大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1购于中国医学科学院基础医学研究所细胞中心；鸦胆子素A购于南京春秋生物工程有限公司；LPS购于美国Sigma-Aldrich公司；BCA蛋白浓度检测试剂盒购于美国Thermo Scientific公司；Trizol试剂(15596-018)购于美国LifeTechnologies公司，2×EasyTaq PCR SuperMix(AS111)购于北京全式金生物技术有限公司；
2.2.细胞培养、造模、分组及加药处理：
HBZY-1大鼠系膜细胞用含10％(v/v)FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM完全培养基，于37℃，5％CO2无菌恒温培养箱中孵育培养,待细胞贴壁后，以无血清培养基同步细胞24h后，分为对照组、模型组及鸦胆子素A组，阳性药物奥美沙坦组，给与100ng/ml的LPS刺激系膜细胞48h以诱导系膜细胞增殖及炎症模型，后予以不同浓度的鸦胆子素A(30nM、60nM、120nM)刺激系膜细胞24h，进行相关检测
2.2.1qPCR法检测TGF-β、α-SMA、CyclinE、CCL2、NF-κB、IL-6等相关基因mRNA的表达水平，取对数生长期的HBZY-1细胞，以2×105个/孔接种于6孔细胞培养板，待细胞充分贴壁后，以无血清DMEM培养基周期同步化24h，模型组和鸦胆子素A处理组加入100ng/ml的LPS刺激48h，后给与不同浓度的鸦胆子素A(30nM、60nM、120nM)刺激24h，用Trizol法抽提细胞总RNA，使用5×PimeScriptRTmastermix逆转录PCR获得cDNA，然后以大鼠TGF-β、α-SMA、CyclinE、CCL2、NF-κB引物(引物序列见表1)，2×SYBR Green Master为材料，总体系10μl,于反应条件：94℃，5min预变性；94℃，30s变性；60℃，30s退火；72℃，1min延伸，进行40个循环。经由△△CT计算，表达倍数其中△△CT＝(CT(待测样本目的基因)-CT(待测样本内标基因))—(CT(对照样本目的基因)-CT(对照样本内标基因))，得出各组相关基因的mRNA表达水平。
2.2.2克隆形成实验：HBZY-1大鼠系膜细胞以500/每孔的密度接种于6孔板，待细胞贴壁后，分为模型组、对照组、阳性药奥美沙坦组，以及鸦胆子素A组(给与30nM、60nM、120nM的鸦胆子素A)，每3天换1次液，一共观察14天，计算每个培养孔的克隆集落的形成数。
2.2.3EDU细胞增殖实验：HBZY-1大鼠系膜细胞细胞以1万/孔的密度接种于12孔板，待细胞贴壁后，给与无血清培养基同步化24h，分为模型组、对照组、阳性药奥美沙坦组、鸦胆子素A组(30nM、60nM、120nM的鸦胆子素A)，模型组及鸦胆子素A组分别给与100ng/ml的LPS刺激48h,给药后观察24h，检测系膜细胞的增殖情况
2.2.4流式细胞周期实验：HBZY-1大鼠系膜细胞以10万/孔的密度接种于6孔板，待系膜细胞贴壁后给与无血清培养基同步化24h后，分为模型组、对照组、奥美沙坦组、鸦胆子素A组，模型组及鸦胆子素A组分别给与100ng/ml的LPS刺激48h,后给与不同浓度(30nM、60nM、120nM的鸦胆子素A)作用24h后收集细胞，预冷的70％无水乙醇固定细胞过夜，第二天3000g离心10分钟去除无水乙醇，加入碘化丙啶染色液(PI)500ul 37℃避光温浴30min，流式细胞仪上机检测。
2.3结果
CCK8细胞增殖实验提示100ngLPS作用系膜细胞48h即可刺激系膜细胞的增殖，不同浓度的鸦胆子素A均可抑制HBZY-1系膜细胞的增殖，结果如图4A，4B所示，同时可减轻克隆形成的数目，如图4C-4D所示，EDU细胞增殖实验显示不同浓度的BA可抑制系膜细胞的复制，减少系膜细胞的增殖如图4E-4F所示，进一步的细胞流式周期实验提示100ng/ml的LPS刺激下诱导更多的细胞进入S期，同时G0G1期细胞减少，而加入不同浓度的鸦胆子素A后，可以显著增加G0G1期细胞数量，减少S期数量，诱导细胞G0G1期停滞，从而抑制系膜细胞的增殖，提示鸦胆子素抑制系膜细胞的增殖可能与其诱导细胞周期阻滞有关，结果如图5A-5B所示，鸦胆子素A对LPS诱导HBZY-1细胞IL-6、CCL2、NF-κB、TGF-β、α-SMA、CyclinE mRNA的影响，IL-6、CCL2、NF-κB、TGF-β、α-SMA、CyclinE是IgA肾病重要的细胞因子，与IgA肾病疾病的发生进展密切相关，qPCR结果显示，不同剂量的的鸦胆子素A可抑制LPS诱导的IL-6、CCL2、NF-κB、TGF-β、α-SMA、CyclinE mRNA的表达，结果如图5C所示，体外实验表明鸦胆子素A具有显著的抗炎以及抑制系膜细胞增殖的效果，可用于防治IgA肾病。
以上借助具体实施例对本发明做了进一步描述，但是应该理解的是，这里具体的描述，不应理解为对本发明的实质和范围的限定，本领域内的普通技术人员在阅读本说明书后对上述实施例做出的各种修改，都属于本发明所保护的范围。
Claims (9)
1.鸦胆子素A在制备治疗IgA肾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗IgA肾病的药物可以抑制肾皮质炎症、增殖以及纤维化相关基因Cyclin E、α-SMA、CCL2、NF-κB、IL-6、FN的mRNA表达。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述治疗IgA肾病的药物可以抑制肾小球系膜细胞的增殖。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗IgA肾病的药物可以降低蛋白尿，改善肾脏病理。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为口服制剂、舌下含化片剂、丸剂或针剂。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述口服制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、滴剂、果汁剂或糖浆剂。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述针剂为注射液、粉针剂或冻干粉针剂。
8.一种治疗IgA肾病的药物，其特征在于，包含鸦胆子素A以及药物学上可接受的辅料。
9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述药物学上可接受的辅料包括崩解剂、湿润剂、粘合剂、填充剂、吸收促进剂、溶剂、润滑剂、表面活性剂、香味剂、甜味剂、抗氧化剂、防腐剂或色素中的任意一种或几种的组合物。
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