CN113209196A - 一种与动脉粥样硬化斑块稳定性相关的中药组合物及应用 - Google Patents

一种与动脉粥样硬化斑块稳定性相关的中药组合物及应用 Download PDF

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Abstract

一种与动脉粥样硬化斑块稳定性相关的中药组合物及应用。制备中草药紫花地丁和食用白醋的药物浸膏，并稀释成不同浓度，检测不同浓度药液对小鼠腹腔巨噬细胞中IL‑6表达的影响。本发明提供了一种新的中药组合物在体外对巨噬细胞功能的干预作用，验证了中草药紫花地丁与食用白醋所得组合物的新的药用价值，为以后在动脉粥样硬化斑块稳定性相关的预防与治疗中提供理论依据，并为临床对于动脉粥样硬化相关血管疾病提供用药指导。

Description

一种与动脉粥样硬化斑块稳定性相关的中药组合物及应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，特别涉及一种与动脉粥样硬化斑块稳定性相关的中药组合物 及应用。
背景技术
冠状动脉粥样硬化性心脏病是指冠状动脉粥样硬化使管腔狭窄或堵塞，导致 心肌缺血、缺氧而引起的心脏相关疾病。冠心病不仅可引起患者胸痛，活动耐量 降低等症状，造成患者生活质量的下降，还可因心肌长期缺血而引起心力衰竭、 心律失常等疾病。更重要的在于因为冠状动脉粥样硬化斑块的破裂导致急性心血 管事件，造成严重后果。目前，心血管疾病发病趋势日益年青化，其较高的致残 率及高昂的医药费给患者本人、家庭及社会带来了沉重的经济负担。因此，了解 动脉粥样硬化的发病机制并寻找行之有效的治疗方式是每一个科研人员及临床 医生亟待解决的问题。
冠状动脉粥样硬化斑块破裂是急性心血管事件发生的根本原因。斑块的破裂与否取决与 斑块的稳定性。斑块稳定性则与纤维帽的厚度及脂质含量密切相关。而纤维帽的厚度及脂质 含量则与冠心病的炎症反应联系在一起。血管壁的炎症最初是对血管损伤的保护机制，通过 炎性细胞如单核细胞、巨噬细胞增生保持机体内环境的稳定。但如果炎症未能及时消除则会 对组织造成破坏，引起炎性纤维增生反应及脂质的沉积，形成动脉粥样斑块。在AS初始形 成过程中，血管内皮受到损伤后，黏附分子表达增加，调节白细胞的黏附及穿越内皮的游移(以 单核细胞为主)，单核细胞到血管内皮下，摄取氧化修饰的低密度脂蛋白(ox-LDL)，变为激活 的巨噬细胞，这些激活的巨噬细胞可分泌IL-6。IL-6通过细胞信号转导激活核因子-kB(nuclear factor,NF-kB)，使炎症介质和细胞因子的基因转录增强，进一步促使中膜的平滑肌细胞向内膜 下迁移、增殖并发生表型转化，还导致更多的炎症介质释放，促使更多的单核细胞聚集、浸 润，最终导致AS病变的发生发展。由此可见，AS病变是一个缓慢而复杂的炎症反应过程， IL-6则是炎症反应瀑布的源头，发挥着极其重要的介导作用。
紫花地丁出自《本草纲目》，为堇菜科堇菜属植物紫花地丁的全草，别名堇 堇菜、箭头草、地丁、犁头草等。性味：苦、辛、寒，归经：归心、肝经。具有清热解毒、 凉血消肿、消痈散结之功效。常用于疔疫痈疽，丹毒，肠痈，瘰疬，湿热宵铜，黄疸，目赤 肿毒，蛇毒咬伤。紫花地丁的主要化学成分为黄酮和香豆素类化合。紫花地丁的提取物已被 证明具有广谱的抗菌活性。临床在治疗炎症及自身免疫相关性疾病中有广泛报道。而紫花地 丁及食用白醋新的组合物对于动脉粥样硬化斑块稳定性相关研究暂无报道，而动脉粥样硬化 的中医病因病机中痰浊、血瘀、湿热是主要的致病机理，与中草药紫花地丁的治病机理吻合， 因此，研究中草药紫花地丁对于动脉粥样硬化的治疗具有广阔前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与动脉粥样硬化斑块稳定性相关的中药组合物及其应用，此 中药组合物由中草药紫花地丁全草和食用白醋按一定比例制备所得。并验证所得中药组合物 在Hcy致小鼠腹腔巨噬细胞损伤过程中的预防及治疗作用，明确其发挥作用的合适浓度范围， 为临床动脉粥样硬化的治疗提供理论依据，为临床用药提供指导。
本发明的技术方案为：
一种与动脉粥样硬化斑块稳定性相关的中药组合物及应用。制备中草药紫花地丁和食用 白醋的药物浸膏，并稀释成不同浓度，检测不同浓度药液对小鼠腹腔巨噬细胞中IL-6表达的 影响。
具体操作流程为：
(1)中药组合物100μmol/l Hcy干预小鼠腹腔巨噬细胞建立巨噬细胞损伤模型，并且RT-qPCR检测该浓度Hcy可以致内皮细胞损伤，为后续实验奠定基础。
(2)中草药紫花地丁和食用白醋组合物，其稀释为不同浓度梯度药液(0μg/ml、10μg/ml、 50μg/ml、100μg/ml、250μg/ml、500μg/ml、1mg/ml、10mg/ml)，干预细胞24h后，CCK-8检 测细胞存活率，验证药物对细胞的增殖作用。
(3)同时将中药药液与Hcy干预细胞或者先将Hcy干预细胞后再加入中药药液以此筛 选合适药物浓度对IL-6表达的影响，明确药物对动脉粥样硬化斑块的抑制作用，对动脉粥样 硬化的治疗作用。
(4)将中药药液按不同浓度先干预小鼠腹腔巨噬细胞，再将Hcy干预细胞，筛选合适 浓度药液对IL-6表达的影响，明确药物有利于动脉粥样硬化斑块的稳定性，对动脉粥样硬化 具有保护作用。
进一步，所述中草药紫花地丁采于湖南省为最佳。
进一步，所述中草药组合物试剂包括引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列如 SEQ:ID:NO:1所示，逆转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒由Takara公司提供。
进一步，验证中草药组合物对于小鼠腹腔巨噬细胞损伤的预防和治疗作用，其步骤包括： ①首先建立Hcy致小鼠腹腔巨噬细胞损伤的细胞模型；②筛选药物对细胞具有保护作用的浓 度范围、时间范围；③验证中药组合物对细胞的预防作用，先加中药组合物干预细胞，后Hcy 作用于小鼠腹腔巨噬细胞，RT-qPCR检测IL-6mRNA表达；④验证中药组合物对细胞的治疗 作用，先Hcy作用于小鼠腹腔巨噬细胞，后加中药组合物干预细胞，RT-qPCR检测IL-6mRNA 表达。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)本发明提供了一种新的中药组合物在体外对巨噬细胞功能的干预作用，即中草药紫 花地丁与食用白醋组合物。
(2)本发明验证了中草药紫花地丁与食用白醋所得组合物的新的药用价值。
(3)本发明明确了在Hcy致小鼠腹腔巨噬细胞损伤模型中，中药组合物在适当浓度及 适当干预时间上对小鼠腹腔巨噬细胞有一定的预防及保护作用。
(4)本发明所涉及的中草药紫花地丁及食用白醋组合物在小鼠腹腔巨噬细胞损伤中具有 重要作用，为以后在动脉粥样硬化斑块稳定性相关的预防与治疗中提供理论依据，并为临床 对于动脉粥样硬化相关血管疾病提供用药指导。
(5)本发明所涉及的药物提取方法及验证方法均简单易行，操作方便，价格低廉，容易 被广大群众所接受。
附图说明
图1为本发明中药组合物100μmol/l Hcy干预小鼠腹腔巨噬细胞后，RT-qPCR检测0组 (对照组)和Hcy组(实验组)IL-6mRNA表达。
图2为中药组合物不同浓度干预小鼠腹腔巨噬细胞，CCK-8检测细胞存活率。
图3为将中药组合物与Hcy共同干预细胞，24h后RT-qPCR检测Hcy组和加药组 (50μg/ml、100μg/ml、500μg/ml、1mg/ml)IL-6mRNA表达。与Hcy组相比，*P＜0.05
图4为先将各中药按不同浓度干预细胞24h后，弃去培养基，再Hcy干预小鼠腹腔巨噬 细胞24h，RT-qPCR检测Hcy组和加药组(50μg/ml、100μg/ml、500μg/ml、1mg/ml)IL-6mRNA表达。与Hcy组相比，**P＜0.01，*P＜0.05
图5为先将Hcy干预小鼠腹腔巨噬细胞24h，弃去培养基，再各浓度中药组合物药液干 预细胞24h，RT-qPCR检测Hcy组和加药组(50μg/ml、100μg/ml、500μg/ml、1mg/ml)IL-6mRNA 表达。与Hcy组相比，*P＜0.05
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
本发明的技术方案为：一种与动脉粥样硬化斑块稳定性相关的中药组合物及应用。具体 操作流程为：
(1)采用中药组合物100μmol/l Hcy干预小鼠腹腔巨噬细胞建立巨噬细胞损伤模型，并 且RT-qPCR检测该浓度Hcy可以致内皮细胞损伤，为后续实验奠定基础。
(2)中草药紫花地丁和食用白醋组合物，稀释中药组合物为不同浓度梯度药液(0μg/ml、 10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、250μg/ml、500μg/ml、1mg/ml、10mg/ml)，干预细胞24h后， CCK-8检测细胞存活率，验证药物对细胞的增殖作用。
(3)同时将中药药液与Hcy干预细胞或者先将Hcy干预细胞后再加入中药药液以此筛 选合适药物浓度对IL-6表达的影响，明确药物对动脉粥样硬化斑块的抑制作用，对动脉粥样 硬化的治疗作用。
(4)将中药药液按不同浓度先干预小鼠腹腔巨噬细胞，再将Hcy干预细胞，筛选合适 浓度药液对IL-6表达的影响，明确药物有利于动脉粥样硬化斑块的稳定性，对动脉粥样硬化 具有保护作用。
本发明所述的中药紫花地丁与食用白醋组合物对动脉粥样硬化斑块发挥稳定作用，进一 步验证其发挥作用的方式。
1、实验对象
细胞株
小鼠腹腔巨噬细胞(RAW264.7)
2、仪器设备及实验试剂
2.1主要仪器
超净工作台(苏州，安泰)；CO2培养箱(德国，Heraeus)；5415D型微量台式离心机(德 国，Eppendorf)；Heratherm通用型烘箱(美国，Thermo Fisher)；蒸馏提纯旋转蒸发仪(中 国，郑州市创瑞仪器有限公司)；超微量分光光度计(美国，SimpliNano)；梯度RCR仪(德国，Biometra Tone)；荧光定量PCR仪(上海，枫岭)；酶标仪Epoch(美国，Bio Tek)。
2.2主要试剂
白醋(中国，湖南长康实业有限责任公司)；同型半胱氨酸(美国，Sigma公司)；胎牛血清、RPMI 1640培养基(澳大利亚，Gibco公司)；青链霉素、胰蛋白酶消化液(中国，碧 云天生物技术研究所)、cDNA试剂盒、RT-qPCR试剂盒(日本，Takara公司)；CCK-8细胞毒 性/增殖检测试剂盒(美国，Ape×Bio公司)；引物由上海生物工程有限公司合成。
3方法
3.1中草药紫花地丁白醋浸膏制备
在紫花地丁采收期采集其全草，除去杂质，洗净，晾干，再于50℃烤箱中彻底烘干后， 将其打成粗粉，加入药材重量10-12倍的水，搅拌15-30分钟，浸泡1小时，武火煎煮0.5h， 文火煎煮1.5小时，过无菌纱布，收集煎液，后再加10-12倍的水，用同样的方法煎煮第二次， 合并两次煎液，加入煎液一半量的白醋，搅拌均匀，静置沉淀，过夜，取上清液，放入旋蒸 仪，浓缩至浸膏(1g浸膏相当于2-5g的草药)，4℃保存。
将浸膏稀释成初浓度为250mg/ml的药物溶液，即称取5g浸膏于50ml离心管，加入从 高压蒸汽锅中拿出的热水，振荡，充分混匀药液，过100目的尼龙网，滤过的液体分装到15ml 离心管中，再4000转，10分钟离心。取上清液与另一5ml离心管中，再将药液拿入细胞间， 过0.22mm的无菌滤器，得到无菌纯药液，-4℃保存，备用。
3.2细胞培养
用含10％胎牛血清RPMI 1640培养基培养RAW264.7，置于37℃、5％CO2培养箱中，待细胞密度达70％左右时，用终浓度0μmol/L Hcy(0组)、100μmol/L Hcy(Hcy组)干 预细胞24h后，收集细胞用于后续实验。
3.3 CCK-8检测细胞存活率
收集处于生长对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μl细胞悬液，细胞密度 约为8000每孔，5％CO2，37℃孵育24小时，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)；取出96孔板，小心弃去孔内培养基，按分组加入不同浓度梯度的中草药药液，每孔100μl，5％CO2，37℃孵育24～48小时，每孔加入10μL CCK-8溶液，继续培养箱孵育2h。通过酶联免疫检测仪(450nm波长)检测各实验组细胞孔的吸光值；设置空白孔(无细胞、无培养液、无CCK-8 溶液)，设置对照孔(细胞、相同药物的溶解介质、CCK-8溶液)，每组设3个复孔，保存结 果，进行计算：细胞存活率(％)＝[(加药孔OD值)-(空白孔OD值)]÷[(对照孔OD 值)-(空白孔OD值)]×100％。实验重复三次，记录平均值。
3.4荧光定量PCR(RT-qPCR)检测IL-6的表达
3.4.1小鼠腹腔巨噬总RNA提取
按照试剂盒说明书提取小鼠腹腔巨噬细胞总RNA，整个操作在超净台(经紫外照射杀毒 30min)内进行，在6孔板中加入裂解液RZ裂解细胞，每孔加1ml RZ。用取样器抽打若干次至溶液透明。将透明溶液在室温放置5min，使得核酸复合物完全分离。4℃，12000rpm离心5min，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中。加入200μl氯仿，盖好瓶盖，涡旋振 荡15sec，室温放置3min。4℃，12000rpm离心10min，样品会分为三层：黄色的有机相， 中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，水相的体积约为500μl。把水相转移到新管中， 缓慢加入250μl无水乙醇，混匀，将得到的溶液转入吸附柱CR3中，4℃，12000rpm离心1min， 弃掉收集管中的废液。向吸附柱CR3中加入500μl去蛋白液RD，4℃，12000rpm离心1min， 弃废液，将CR3放入收集管中。向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW，室温静置2min，4 ℃，12000rpm离心1min，弃废液，再次重复加入500μl漂洗液RW，室温静置2min，4℃， 12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱CR3放入2ml收集管中，4℃，12000rpm离心2min， 去除残余液体，将吸附柱CR3在室温放置5min，以充分晾干。将吸附柱CR3转入一个新的 1.5ml离心管中，加60μl RNase-Free ddH2O，室温放置2min，4℃，12000rpm离心2min， 分光光度计测RNA浓度。为防止RNA降解，将其立即放入-80℃保存。
3.4.2 IL-6的逆转录
此步骤在紫外灯照射30min的超净台中进行，操作过程中均使用无RNase的枪头，依次 分别加入以下表1中的试剂，整个过程在冰上操作：
表1：逆转录体系
Figure BDA0002978677560000081
以上体系混匀后，瞬时离心，进行逆转录反应，反应条件如下：
表2：逆转录条件
Figure BDA0002978677560000082
产物短期保存与-20℃，长期保存于-80℃，切忌反复冻融。
3.4.3 RT-qPCR检测IL-6的表达
将以下表3中试剂依次分别加到200μl无RNase离心管中：
表3：RT-qPCR反应体系
Figure BDA0002978677560000083
所有样品加样完成后，涡旋振荡混匀，瞬时离心后去除气泡将样品放到荧光定量PCR仪 进行反应，反应体系为95℃30sec，95℃5sec，55.8℃34sec，70℃10sec，反应进行40个循 环，将GAPDH作为内参对照。根据目的基因的相对量＝2-△△CT计算结果，IL-6由上海生物工 程有限公司设计合成。
4统计学方法
本研究实验结果均为计量资料，用Prism7.0统计软件进行统计学分析，结果以
Figure DA00029786775651361999
±s表示， 两组间比较采用t检验，多样本均数间比较采用One-way ANOVA检验，组间两两比较用 Student-Newman-Keuls检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。
5结果
5.1小鼠腹腔巨噬细胞中IL-6的表达
RT-qPCR检测小鼠腹腔巨噬细胞中IL-6mRNA的表达，结果显示，与0组相比，Hcy组IL-6mRNA表达增加，差异有统计学意义。
5.2 CCK-8筛选药物合适浓度及时间
CCK-8筛选药物合适浓度及时间，结果显示：与0组相比，不同药物浓度(0μg/ml、10μg/ml、 50μg/ml、100μg/ml、250μg/ml、500μg/ml、1mg/ml、10mg/ml)干预细胞24h，随浓度增加， 细胞存活率增加，且增长幅度较大。
5.3中药药液和Hcy同时干预细胞后，IL-6mRNA的表达
为了检测中药组合物对损伤细胞的治疗作用，将中药药液按浓度(50μg/ml、100μg/ml、 500μg/ml、1mg/ml)和Hcy同时干预小鼠腹腔巨噬细胞24h后，RT-qPCR检测小鼠腹腔巨噬 细胞中IL-6mRNA的表达，结果显示，与Hcy组相比，50μg/ml组IL-6mRNA表达降低， 差异有统计学意义。
5.4先加Hcy再加中药药液后，IL-6mRNA的表达
为了更加明确中药组合物对损伤细胞的治疗作用，先将Hcy干预细胞后，造成细胞损伤 后，再按浓度(50μg/ml、100μg/ml、500μg/ml、1mg/ml)将中药药液加入细胞干预24h，RT-qPCR 检测小鼠腹腔巨噬细胞中IL-6mRNA的表达，结果显示，与Hcy组相比，50μg/ml和500μg/ml 组IL-6mRNA表达降低，但50μg/ml组意义更显著，差异有统计学意义。
5.5先加中药药液再加Hcy后，IL-6mRNA的表达
为了检测中药组合物对细胞的损伤的预防作用，先将中药药液按浓度(50μg/ml、100μg/ml、500μg/ml、1mg/ml)干预小鼠腹腔巨噬细胞24h后，再将Hcy干预细胞24h，RT-qPCR检测小鼠腹腔巨噬细胞中IL-6mRNA的表达，结果显示，与Hcy组相比，1mg/ml组IL-6 mRNA表达降低，差异有统计学意义。
6结论
本发明通过中草药紫花地丁全草与食用白醋按一定比例混合，水提，旋蒸得到混合物浸 膏，通过稀释不同浓度药液干预小鼠腹腔巨噬细胞，观察到其可以预防并治疗Hcy诱导的小 鼠腹腔巨噬细胞中IL-6表达的增加，为动脉粥样硬化斑块脱落而造成的并发症提供新的理论 基础，为临床预防与治疗提供新的方向。
以上所述，仅为本发明较佳的、较具体的实施方法，本发明的保护范围不限于此，任何 熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，对技术方案的简单变化或等效替换 均落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 宁夏医科大学
<120> 一种与动脉粥样硬化斑块稳定性相关的中药组合物及应用
<130> 20210316
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 白介素-6(上游引物)
<400> 3
ctgcaagaga cttccatcca g 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 白介素-6(下游引物)
<400> 3
agtggtatag acaggtctgt tgg 23

Claims (4)

1.一种与动脉粥样硬化斑块稳定性相关的中药组合物及应用，其特征在于，制备中草药紫花地丁和食用白醋的药物浸膏，并稀释成不同浓度，检测不同浓度药液对小鼠腹腔巨噬细胞中IL-6表达的影响。
2.根据权利要求1所述的一种与动脉粥样硬化斑块稳定性相关的中药组合物及应用，其特征在于，具体操作流程为：
（1）中药组合物100 μmol/l Hcy干预小鼠腹腔巨噬细胞建立巨噬细胞损伤模型，并且RT-qPCR检测该浓度Hcy可以致内皮细胞损伤，为后续实验奠定基础；
（2）中草药紫花地丁和食用白醋组合物，其稀释为不同浓度梯度药液（0μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、250μg/ml、500μg/ml、1mg/ml、10mg/ml），干预细胞24h后，CCK-8检测细胞存活率，验证药物对细胞的增殖作用；
（3）同时将中药药液与Hcy干预细胞或者先将Hcy干预细胞后再加入中药药液以此筛选合适药物浓度对IL-6表达的影响，明确药物对动脉粥样硬化斑块形成的抑制作用，对动脉粥样硬化的治疗作用；
（4）将中药药液按不同浓度先干预小鼠腹腔巨噬细胞，再将Hcy干预细胞，筛选合适浓度药液对IL-6表达的影响，明确药物有利于动脉粥样硬化斑块的稳定性，对动脉粥样硬化具有保护作用。
3.根据权利要求1或2所述的一种与动脉粥样硬化斑块稳定性相关的中药组合物及应用，其特征在于，验证中草药组合物对于小鼠腹腔巨噬细胞损伤的预防和治疗作用，其步骤包括：①首先建立Hcy致小鼠腹腔巨噬细胞损伤的细胞模型；②筛选药物对细胞具有保护作用的浓度范围、时间范围；③验证中药组合物对细胞的预防作用，先加中药组合物干预细胞，后Hcy作用于小鼠腹腔巨噬细胞，RT-qPCR检测IL-6 mRNA表达；④验证中药组合物对细胞的治疗作用，先Hcy作用于小鼠腹腔巨噬细胞，后加中药组合物干预细胞，RT-qPCR检测IL-6 mRNA表达。
4.根据权利要求1或2所述的一种与动脉粥样硬化斑块稳定性相关的中药组合物及应用，其特征在于，所述制备中草药紫花地丁和食用白醋的药物浸膏的制备方法为：在紫花地丁采收期采集其全草，除去杂质，洗净，晾干，再于50℃烤箱中彻底烘干后，将其打成粗粉，加入药材重量10-12倍的水，搅拌15-30分钟，浸泡1小时，武火煎煮0.5h，文火煎煮1.5小时，过无菌纱布，收集煎液，后再加10-12倍的水，用同样的方法煎煮第二次，合并两次煎液，加入煎液一半量的白醋，搅拌均匀，静置沉淀，过夜，取上清液，放入旋蒸仪，浓缩至浸膏，4℃保存；将浸膏稀释成初浓度为250mg/ml的药物溶液，即称取5g浸膏于50ml离心管，加入从高压蒸汽锅中拿出的热水，振荡，充分混匀药液，过100目的尼龙网，滤过的液体分装到15ml离心管中，再4000转，10分钟离心；取上清液与另一15ml离心管中，再将药液拿入细胞间，过0.22mm的无菌滤器，得到无菌纯药液，-4℃保存，备用。
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