CN117965757A - 斑石鲷遗传性别的分子标记、引物、方法、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学技术，具体的说一种斑石鲷遗传性别的分子标记、引物、方法、试剂盒及应用。分子标记为斑石鲷itih4基因内含子DNA非插入与插入的核苷酸序列，即，SEQ ID NO:1（ChrX1itih4b）和SEQ ID NO:2（ChrYitih4b）所示碱基。本发明分子标记缩短了斑石鲷itih4基因内含子DNA插入变异准确鉴定的时间，提升了检测效率。在斑石鲷基于itih4基因内含子变异开展雌雄性别鉴定、高雄苗种制备和家系选育上具有重要的意义和应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术，具体的说一种检测斑石鲷遗传性别的分子标记、引物、检测方法、试剂盒及其应用。
背景技术
斑石鲷是一种重要的养殖鱼类。它属于鲈形目、石鲷科、石鲷属，主要分布在西太平洋温热带海域。并且我国也成功地实现了斑石鲷的人工繁殖和苗种全人工繁育，将其引入网箱养殖和工业化养殖。目前，斑石鲷的市场价格已经达到每斤200元，其养殖经济效益显著。作为我国本土自然物种，斑石鲷的资源开发和可持续利用在长期将很重要，其养殖前景广阔。斑石鲷具有典型的 X1X1X2X2/X1X2Y 性别决定机制。石鲷科鱼类在养殖过程中，雄鱼和雌鱼在生长速度上存在明显差异，雄鱼的生长速度更快。因此，养殖高比例雄鱼的斑石鲷以及全雄苗种都有利于推动斑石鲷养殖业的质量和效率提升。此外，研发斑石鲷苗种性别鉴定快速技术，将有助于选育斑石鲷优良的雄性品种。
α-胰蛋白酶抑制剂重链4蛋白（Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain4, Itih4），在多细胞生物的炎症反应和免疫应答调节机制中扮演重要角色，itih4基因的正常表达有助于维持细胞间相互作用的平衡，从而保护机体免遭不适当的自身免疫反应。研究表明itih4基因的变异可能与若干慢性炎症性疾病和恶性疾病相关。理解itih4基因在多细胞生物生理调控中的作用，对发展新型治疗手段非常重要。
发明内容
本发明的目的在于克服了现有斑石鲷itih4基因内含子DNA插入变异检测技术不足，提供了一种检测斑石鲷遗传性别分子标记、引物、检测方法、试剂盒及其应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种检测斑石鲷遗传性别的分子标记，分子标记为斑石鲷itih4基因内含子DNA非插入与插入的核苷酸序列，即，SEQ ID NO:1（ChrX1itih4b）和SEQ ID NO:2（ChrYitih4b）所示碱基。
所述SEQ ID NO:1所示碱基为斑石鲷雌、雄鱼X1染色体共有itih4内含子DNA非插入基因的同源片段，为斑石鲷itih4基因内含子碱基插入与非插入个体共有DNA特征标记；且，所述SEQ ID NO:1所示碱基序列第53位点和54位点、第62位点和63位点之间插入序列片段，即为SEQ ID NO:2所示碱基序列，其为斑石鲷itih4内含子发生碱基插入变异基因特有的DNA标记。
一种所述的检测斑石鲷遗传性别的分子标记的应用，所述分子标记在检测斑石鲷遗传性别中的应用。
一种鉴定所述的斑石鲷遗传性别的分子标记的方法，
1）PCR扩增：取待测斑石鲷，提取基因组DNA；以所得基因组DNA为模板，采用特异性引物，进行PCR扩增，并将所得PCR扩增产物与所述的斑石鲷itih4基因内含子发生DNA插入与非插入的核苷酸序列进行对比；
2） 结果判断：从待测斑石鲷的基因组DNA中扩增出333bp（SEQ ID NO:1所示碱基）和532bp（SEQ ID NO:2所示碱基）两个DNA片段，即为判断该待测斑石鲷为itih4基因内含子发生DNA插入变异个体，即为斑石鲷雄鱼（X1X2Y）个体；
3）待测斑石鲷的基因组DNA中仅扩增出333bp（SEQ ID NO:1所示碱基）的单一DNA片段，即为判断该待测斑石鲷为斑石鲷itih4基因内含子未发生DNA插入变异个体，即为斑石鲷雌性（X1X1X2X2）个体。
所述引物为
Chitih4b_F:1 : 5’- CACCTACAAATCCTAACCCAC-3’；
Chitih4b_R:2 : 5’- ATGGATGTGGCCTCTGATGG-3’。
一种检测所述的斑石鲷雌雄遗传性别的特异性标记的遗传性别特异性引物，
Chitih4b_F:1 : 5’- CACCTACAAATCCTAACCCAC-3’；
Chitih4b_R:2 : 5’- ATGGATGTGGCCTCTGATGG-3’。
一种鉴定斑石鲷雌雄遗传性别的试剂盒，所述试剂盒含所述的遗传性别特异性引物。
本发明所具有的优点：
本发明通过斑石鲷雄鱼融合染色体Y上的itih4基因与位于雌鱼同源染色体X上的itih4基因相比较发生了大片段的内含子序列插入，进而高效、快速精准鉴定斑石鲷itih4基因内含子是否发生DNA插入变异，对于揭示斑石鲷的雌、雄病害炎症反应异同和免疫系统调节差异，实现雌、雄遗传性别的快速鉴定，提升斑石鲷遗传育种进程和优质苗种规模化生产具有重要的意义和应用价值。
本发明从斑石鲷全基因组序列中筛选并获得了斑石鲷X和Y染色体itih4基因内含子同源区段且有大片段DNA插入标记序列，进一步建立了斑石鲷itih4基因内含子DNA插入变异快速检测方法，采用该方法可以快速、准确和高效的鉴定待检测斑石鲷itih4基因内含子是否发生DNA插入。该方法利用一对引物在itih4基因内含子DNA插入个体中扩增出532bp和333bp两个相差199bp的条带，在itih4基因内含子为发生DNA插入个体中仅扩增出333bp的单一条带，并可以通过琼脂糖凝胶电泳分辨，缩短了斑石鲷itih4基因内含子变异准确鉴定的时间，提升了检测效率。在斑石鲷基于itih4基因雌、雄病害炎症反应异同和免疫系统调节差异研究及雌雄性别鉴定、高雄苗种制备和家系选育上具有重要的意义和应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例提供的获得X染色体itih4基因与Y染色体itih4基因的核苷酸序列比对图；图中连接线连接的模块代表itih4基因在X与Y染色体上的高度同源区域，其中标注的区域为本发明目标序列ChrX1itih4b和ChrYitih4b所在的位置。
图2为本发明实施例提供的ChrX1itih4b和ChrYitih4b在X与Y染色体上的具体位置信息；333bp代表ChrX1itih4b片段的长度，532bp代表ChrYitih4b的长度；ChrYitih4b中间低位区域代表插入的199bp核苷酸序列，该区域与ChrX1itih4b片段无同源匹配序列。
图3为本发明实施例提供的获得的X染色体ChrX1itih4b与Y染色体ChrYitih4b核苷酸序列比对图，两端引物位置用黑色粗下划线表示；*：代表ChrX1itih4b和ChrYitih4b序列一致性，空白区域表示两者碱基不一致序列；_ _ _ _ ：代表插入缺失序列；黑色下划线代表插入序列所在区域。
图4为本发明实施例提供的X染色体ChrX1itih4b（a）与Y染色体ChrYitih4b（b）核苷酸序列同源插入差异DNA片段模式图；黑色区域代表同源区域，空白区域代表缺失区域及位点信息。
图5为本发明实施例提供的斑石鲷雌雄个体PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳结果图，M：DL 2000 DNA Maker;♂：生理雄鱼；♀：生理雌鱼；图中呈现两条带（532bp和333bp）的个体为itih4基因内含子发生DNA插入个体，也为遗传雄鱼，并且生理性别组织学鉴定为雄鱼，呈现单条带（333bp）的个体为itih4基因内含子未发生DNA插入变异个体，也为遗传雌性，生理性别组织学鉴定为雌性。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
本发明首先通过采用PacBio第三代全基因组测序技术完成了斑石鲷雌、雄全基因组测序及组装，获得了斑石鲷雌、雄染色体水平的高质量基因组；通过比较基因组生物信息学分析方法发现相较于雌鱼X1染色体itih4基因，斑石鲷雄鱼Y染色体上同源itih4基因发生了2处大片段DNA序列插入变异（图1）。并选择雌鱼X1染色体上itih4基因4400bp~4900bp区及雄鱼Y染色体与之同源且存在DNA序列插入的11100bp~11700bp区为研究目标区域（图2）。X1染色体上DNA片段长度为333bp，命名为ChrX1 itih4b，其序列为Xitih4bID No:1；Y染色体上的DNA片段长度为532bp，包含了与X1染色体上itih4基因同源序列序列（不含插入序列），命名为ChrYitih4b，其序列为Yitih4bID No:1；ChrYitih4b与ChrX1 itih4b同源序列比对发现在与ChrX1 itih4b对应的第53位点和54位点之间（115bp）、第62位点和63位点（84bp）之间发现了2个片段DNA序列插入，大小为199bp（图3），雄鱼Y染色体itih4基因在11100bp~11700bp内含子区域比雌鱼X1染色体上itih4同源基因内含子区域插入了199bp大小的DNA序列，这个片段即为检测斑石鲷itih4基因内含子是否发生碱基插入变异的DNA标记；同时由于该标记位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，因此这个片段也为斑石鲷雄鱼Y染色体特有的DNA标记，而ChrX1 itih4b则为斑石鲷雌雄遗传性别共有DNA特征标记。
本发明基于斑石鲷雄鱼Y染色体上itih4基因11100bp~11700bp内含子区域发现的长片段DNA插入序列特征标记来确定斑石鲷itih4基因是否发生内含子DNA插入变异，由此提供一种斑石鲷itih4基因内含子变异快速检测方法，并将该方法应用到了斑石鲷雌、雄遗传性别的快速鉴定；具体检测方法，是确定待检测的斑石鲷是否存在Y itih4bID No:1的核苷酸片段（532bp）；通过PCR引物进行快速鉴定；本发明基于对斑石鲷Y染色体上的itih4基因序列和X1和X2染色体上的同源基因序列进行比较分析，确定了与X1染色体上itih4基因Xitih4bID No:1核苷酸序列同源的Y染色体上Y itih4bID No:1核苷酸序列，利用在上述同源内含子区域itih4基因在斑石鲷Y染色体有大片段DNA插入这一特征，设计了两条引物。采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的方法，快速判断受检斑石鲷itih4基因是否发生内含子DNA插入变异；同时利用该标记位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，应用于斑石鲷遗传性别的精确鉴定，上下游引物序列分别为：
Chitih4b_F:1 : 5’- CACCTACAAATCCTAACCCAC-3’ (Xitih4bID No:2)
Chitih4b_R:2 : 5’- ATGGATGTGGCCTCTGATGG-3’ (X itih4bID No:3)。
使用上述引物鉴定斑石鲷itih4基因内含子插入变异的步骤主要包括：提取高质量的斑石鲷全基因组DNA、扩增Y染色体itih4基因上内含子插入的特异标记DNA片段、琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物DNA；其中在斑石鲷雄鱼（X1X2Y）Y染色体和X1染色体中分别扩增出532bp和333bp两个DNA片段，532bp片段为变异内含子itih4基因特有标记片段；而在斑石鲷雌性（X1X1X2X2）个体中仅扩增出333bp的单一DNA片段。
本发明基于斑石鲷雌雄全基因组测序和雌、雄个体itih4基因定位及DNA序列比对分析，可见斑石鲷雄鱼Y染色体上的itih4基因内含子区发生了DNA长片段的插入变异，进而通过其作为斑石鲷Y染色体上itih4基因内含子插入特有的DNA标记，并利用斑石鲷itih4基因内含子插入变异快速鉴定斑石鲷雌雄，采用该方法可以快速、准确和高效的区分受检斑石鲷是否发生itih4基因内含子插入变异。该方法会在发生itih4基因内含子变异的斑石鲷个体中扩增出532bp和333bp两条带，其中532bp条带为特异性目的条带，而在非变异内含子的itih4基因个体中仅扩增出单一条带（333bp），上述目的条带可以采用琼脂糖凝胶电泳快速准确的分辨带型，实现斑石鲷itih4基因内含子发生变异与否的快速鉴定。同时由于该特异性目的条带（532bp）位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，因此这个片段也为斑石鲷雄鱼Y染色体特有的DNA标记，可以应用于斑石鲷雌、雄遗传性别的快速鉴定。
实施例1斑石鲷itih4基因内含子碱基插入变异特有DNA标记的筛选及验证
斑石鲷X和Y染色体itih4基因同源区段且含大片段插入目标DNA序列的发现：所用的雄鱼异形染色体（neo-Y）DNA序列及雌鱼的X1染色体DNA序列来自中国科学院海洋研究所海水鱼类增养殖与繁育技术研究室李军研究团队，团队委托广州基迪奥生物科技有限公司采用第三代PacBio全基因组测序技术完成了斑石鲷雌、雄全基因组测序及组装，组装结果与已公布的斑石鲷基因组信息基本一致（CNP0001488，Li et al., 2021）。采用比较基因组生物信息学分析斑石鲷雌雄基因组序列可见（参见图1和2），斑石鲷雄鱼异形染色体Y上itih4基因与斑石鲷雌鱼X1染色体itih4基因同源，且存在大片段DNA插入片段，其中X1染色体上itih4基因目标DNA片段长度为333bp，命名为ChrX1 itih4b，其序列为SEQ ID NO:1：
CACCTACAAATCCTAACCCACATCTACAAATTTTGGTACCTGTATTTAAAAATACATATAATAAGTTTTGTTTTCTGCCCTGTATGTTTGTCTCATAGTCAGCACAATATCTCAAAAACTACTTAGAAAGACTTGAAGAAATGTGGTGGAAAGTTTAGGCCAAGGGGTTGAGAAGAAGTCAGTAGTTTTAGGCGGAAATTCAGATCCAGCAGCAGCCCCATGTGGTTATTTATAAAGTAGTTCACATAAATAACTCATTAAACATTAAATGGAAGCAAATTCTTTTTTTCTCTTCAAGATTCATAGAAAAAATCCATCAGAGGCCACATCCAT。
而在雄鱼异形染色体Y上itih4同源基因的目标DNA片段长度为532bp，其包含了与X1同源序列，命名为ChrYitih4b，其序列为SEQ ID NO:2：
CACCTACAAATCCTAACCCACATCTACAAATTTTGGTACcTGTATTTAAAAATGTTCCGTGAAGGAACATCTTATTCATATCAAATCATGTGATTGGCATTTTTAAGTGTAGCCCAAACAAAAATACACAAAATATTTACTGCATGTTTTTGTAGTATTAAAATTTGCATATATAATGTAGACACTACATTTGGATATTTGGGGTAAAAACAAATAAAGTCAGGTCAGGGAAAATGAAATTAGCATTTACCTCTACCAAGGAAGTTTTGTTTTCTGCCCTGTATGTTTGTCTCATAGTCAGCACAATATCTCAAAAACTACTTAGAAAGACTTGAAGAAATGTGGTGGAAAGTTTAGGCCAAGGGGTTGAGAAGAAGTCAGTAGTTTTATGCGGAAATTCAGATCCAACAGCAGCACCATGTGGTTATTTATAAAGTAGTTCACATAAATAACTCATGAAACATGAAATGGAAGCAAATACTTTTTTTCTCTTCAAGATTCATAGAAAAAATCCATCAGAGGCCACATCCAT。
雌雄全基因组扫描和雌、雄个体itih4基因定位及DNA序列比对分析显示，与位于X1染色体itih4基因片段ChrXitih4b同源的ChrYitih4b（Y染色体）发生了2处内含子DNA序列插入，对应ChrX1 itih4b的第53位点和54位点之间（115bp）、第62位点和63位点（84bp）之间，大小为199bp（图3和图4）。Y染色体上itih4基因目标区域（ChrYitih4b）DNA序列比与X1染色体同源DNA区域（ChrX1itih4b）插入了199bp大小的DNA序列，这个片段即为斑石鲷itih4基因内含子插入变异特有的DNA标记，其存在与否可用来鉴别斑石鲷ChrYitih4b基因是否发生内含子插入变异。同时由于该标记位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，因此，ChrYitih4b这个片段也为斑石鲷雄鱼Y染色体特有的DNA标记，而ChrX1itih4b则为斑石鲷雌雄遗传性别共有DNA特征标记，如图3和图4所示。
itih4基因内含子插入变异特有DNA标记的序列验证：基于Y染色体itih4基因的SEQ ID NO:2核苷酸序列与X1染色体上同源基因SEQ ID NO:1核苷酸序列特征，设计两条引物（图3）。选择已知生理性别的雌、雄斑石鲷并提取其高质量DNA，同时使用Chitih4b_F:1、Chitih4b_R:2两条引物进行PCR扩增，反应条件及程序如下：PCR反应体系为20µL，包括10×Buffer 5.8µL、dNTP 4.0µL、rTaq酶（5U/µL）0.2µL、上下游引物（Chitih4b_F:1、Chitih4b_R:2）各0.4µL、DNA模板2.0µL、ddH2O 7.2µL。Touch down PCR扩增程序：94℃ 3mins，60℃（-1℃，3个循环） 1min，72℃ 1min30s，3个循环；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 1min30s，30个循环；72℃ 10min，15℃保存。PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳可以分辨出内含子变异与非变异itih4基因个体存在差异。将内含子变异与非变异itih4基因差异片段产物割胶回收并通过PMD18-T载体转化至感受态细胞中，挑取阳性克隆送至青岛派森诺基因生物技术有限公司测序。测序结果验证了斑石鲷X、Y染色体同源itih4基因含大片段插入目标DNA序列片段，如图1和图2所示。
实施例2斑石鲷itih4基因内含子插入变异鉴定技术的建立与应用
对于来自山东烟台莱州市莱州明波水产有限公司养殖的斑石鲷（其中，12尾表型为雌鱼，12尾表型为雄鱼）进行遗传鉴定。
高质量DNA提取：使用天根海洋动物DNA提取试剂盒提取斑石鲷鳍条DNA，用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定基因组DNA的完整性，采用紫外分光光度计测量DNA上清的OD值，调整使得DNA浓度至70ng/µL，于-20℃冻存备用。
PCR反应体系及PCR扩增鉴定：使用斑石鲷itih4基因内含子插入变异特异的DNA片段引物Chitih4b_F:1和Chitih4b_R:2通过PCR方法检测斑石鲷itih4基因内含子变异与否。PCR反应体系为20µL，包括10×Buffer 5.8µL、dNTP 4.0µL、rTaq酶（5U/µL）0.2µL、上下游引物（Chitih4b_F:1、Chitih4b_R:2）各0.4µL、DNA模板2.0µL、ddH2O 7.2µL。Touch down PCR扩增程序：94℃ 3mins，60℃（-1℃，3个循环） 1min，72℃ 1min30s，3个循环；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 1min30s，30个循环；72℃ 10min，4℃保存。使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，在110V恒压电压下20分钟，凝胶成像可清晰的分别斑石鲷内含子发生DNA插入与非插入itih4基因个体（参见图5）。
由图5可见，在itih4基因内含子发生DNA插入的斑石鲷个体中会扩增出两条目的条带（532bp和333bp），其中532bp条带为itih4基因内含子发生DNA插入变异特异性目的条带ChrYitih4b，而在itih4基因内含子未发生DNA插入变异个体中只能扩增出单一带型ChrX1itih4b（333bp）。由于ChrYitih4b标记位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，因此ChrYitih4b这个片段也为斑石鲷雄鱼Y染色体特有的DNA标记，而ChrX1itih4b则为斑石鲷雌雄遗传性别共有DNA特征标记，进而可将选取的斑石鲷得以区分，采用本发明方法不仅可以快速、准确和高效的鉴定待检测斑石鲷itih4基因是否发生基因内含子插入变异，而且在斑石鲷基于itih4基因雌、雄病害炎症反应异同和免疫系统调节差异研究及雌雄性别鉴定、高雄苗种制备和家系选育上具有重要的意义和应用价值。
Claims (7)
1.一种斑石鲷遗传性别的分子标记，其特征在于：分子标记为斑石鲷itih4基因内含子DNA非插入与插入的核苷酸序列，即，SEQ ID NO:1（ChrX1itih4b）和SEQ ID NO:2（ChrYitih4b）所示碱基。
2.根据权利要求1所述的斑石鲷遗传性别的分子标记，其特征在于：所述SEQ ID NO:1所示碱基为斑石鲷雌、雄鱼X1染色体共有itih4内含子DNA非插入基因的同源片段，为斑石鲷itih4基因内含子碱基插入与非插入个体共有DNA特征标记；且，所述SEQ ID NO:1所示碱基序列第53位点和54位点、第62位点和63位点之间插入序列片段，即为SEQ ID NO:2所示碱基序列，其为斑石鲷itih4内含子发生碱基插入变异基因特有的DNA标记。
3.一种权利要求1所述的斑石鲷遗传性别的分子标记的应用，其特征在于：所述分子标记在检测斑石鲷遗传性别中的应用。
4.一种鉴定权利要求1所述的斑石鲷遗传性别的分子标记的方法，其特征在于，
1）PCR扩增：取待测斑石鲷，提取基因组DNA；以所得基因组DNA为模板，采用特异性引物，进行PCR扩增，并将所得PCR扩增产物与权利要求1所述的斑石鲷itih4基因内含子发生DNA插入与非插入的核苷酸序列进行对比；
2） 结果判断：从待测斑石鲷的基因组DNA中扩增出333bp（SEQ ID NO:1所示碱基）和532bp（SEQ ID NO:2所示碱基）两个DNA片段，即为判断该待测斑石鲷为itih4基因内含子发生DNA插入变异个体，即为斑石鲷雄鱼（X1X2Y）个体；
3）待测斑石鲷的基因组DNA中仅扩增出333bp（SEQ ID NO:1所示碱基）的单一DNA片段，即为判断该待测斑石鲷为斑石鲷itih4基因内含子未发生DNA插入变异个体，即为斑石鲷雌性（X1X1X2X2）个体。
5.根据权利要求4所述的斑石鲷遗传性别的分子标记的方法，其特征在于，引物为
Chitih4b_F:1 : 5’- CACCTACAAATCCTAACCCAC-3’；
Chitih4b_R:2 : 5’- ATGGATGTGGCCTCTGATGG-3’。
6.一种检测权利要求1所述的斑石鲷遗传性别的分子标记的遗传性别特异性引物，其特征在于：
Chitih4b_F:1 : 5’- CACCTACAAATCCTAACCCAC-3’；
Chitih4b_R:2 : 5’- ATGGATGTGGCCTCTGATGG-3’。
7.一种鉴定斑石鲷雌雄遗传性别的试剂盒，其特征在于：试剂盒含权利要求6所述的遗传性别特异性引物。
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| 李明: "斑石鲷基因组学初步研究及性别特异标记发掘与遗传性别鉴定技术的建立", 中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑, no. 03, 15 March 2021 (2021-03-15), pages 052 - 2 * |
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