CN117965458A - 一种丁香假单胞菌噬菌体及其在防治茶树芽枯病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种丁香假单胞菌噬菌体及其在防治茶树芽枯病中的应用，属于生物防控领域。所述丁香假单胞菌噬菌体(Pseudomonas syringae phage)的保藏编号为CGMCCNo.45789。该丁香假单胞菌噬菌体是从土壤中分离获取的，经实验发现，该丁香假单胞菌噬菌体能够有效抑制病原菌(丁香假单胞菌)的生长，明显减轻茶树芽枯病的病害症状。因此，本发明公开的丁香假单胞菌噬菌体有望应用到工业生产中，制备抑制丁香假单胞菌引起的茶树芽枯病的生物菌剂或者药物。本发明对茶树芽枯病的有效防治提供了新的方法和理论支持。

Description

一种丁香假单胞菌噬菌体及其在防治茶树芽枯病中的应用

技术领域

本发明涉及生物防控领域，特别是涉及一种丁香假单胞菌噬菌体及其在防治茶树芽枯病中的应用。

背景技术

噬菌体(bacteriophage，phage)是一种在细胞内生长繁殖的病毒，早在1896年，Hankin通过研究发现，在印度的恒河和亚穆纳河的河水中，存在一种可以通过磁性滤器的物质，其对霍乱有明显的抗菌作用。随后，Edward Twort和Felixd Herele分别在1915年和1917年各自独立发现一种物质，他们发现这一物质能够特异性裂解宿主细菌，并在双层平板上形成空斑，因此将其命名为噬菌体。自生物进化至今，环境中的噬菌体数量已达到10¹¹。目前，海洋是噬菌体含量最高的地方，平均每毫升海水中的噬菌体的含量可高达9×10⁸个，并且海洋中的70％的细菌都能被噬菌体感染。噬菌体是最为普遍和分布广泛的一种生物，它的传播途径多，有病原菌的地方都可以筛选到噬菌体。噬菌体安全性较高，不会对环境造成污染。噬菌体对真核生物是没有毒性的，噬菌体是一种具有有限自我复制能力的有益的病毒，它们只在有宿主细胞存在的环境中复制，在宿主细胞缺乏时快速降解，一旦离开了宿主细胞，噬菌体既不能生长，也不能复制。噬菌体只能侵染相应的细菌，具有高度的特异性，不会破坏正常的菌群，符合现代倡导的绿色、无污染农业的要求，然而传统的农药防治在杀死致病菌的同时也对土壤中的有益微生物进行了破坏，导致土壤微生物失衡，对环境产生了不良影响。噬菌体的制备简便且绿色环保，且效价较稳定，在4℃条件下保存数月后，效价没有明显降低。因为噬菌体不受农业化学品的抑制，所以噬菌体也可以和多种农用化学品混合在一起使用而且没有明显的效价损失。噬菌体的增殖迅速，呈指数方式进行增殖，Banu等发现T7噬菌体在较短时间内就可以扩增到100倍，只需要使用少量的噬菌体就可以杀灭宿主菌。与含铜杀菌剂和抗生素相比，噬菌体穿透细菌生物膜的能力强。噬菌体还可以与宿主菌发生共进化，从而克服宿主菌的抗性，而传统细菌病害防治方法不具备这样的优点。

丁香假单胞菌(Pseudomonas syringa)是属于假单胞菌科假单胞菌属细菌，是好氧、腐生性较强的革兰氏阴性菌，具有多个致病型，在大气、土壤、水体和植物叶片等环境中普遍分布，具有较强的生态适应能力。丁香假单胞菌侵染寄主植物，通过分泌胞壁降解酶、毒素等物质破坏植物细胞的细胞壁、细胞膜等方式导致植物发病。疫病症状主要表现为溃疡、萎蔫和坏死等，是植物十大病害之首，其寄主植物最为广泛，能够引起女贞细菌性叶斑病、万寿菊细菌性叶斑病、冬青细菌性叶斑病，还可引起番茄叶斑病、菊科向日葵叶斑病、胡麻科胡麻细菌叶斑病等病害、以及茶树芽枯病。

丁香假单胞菌也是引起茶树芽枯病的致病病原菌，茶树芽枯病是威胁茶树生产的一种常见病害。茶树细菌性芽枯病的传播蔓延速度快、传播范围广，且常常流行成灾，是一种世界性病害。茶芽枯病(Tea bud blight)主要危害幼嫩的芽叶。开始时，叶尖或叶缘部位出现黄色或黄褐色斑点，逐步扩展为不规则形病斑，病健交界处不明显。受害叶片卷缩扭曲、叶缘变脆，芽尖呈黑褐色枯焦状，严重时整个叶梢全部枯死。后期病部表面散生小黑点，大部分在叶片正面。丁香假单胞杆菌作为一种植物病原体，在感染的初期，丁香假单胞菌可以定居在叶片组织上，丁香假单胞菌可以在叶子表面存活，也可以在高湿度以及舒适的环境下存活。在有利的环境条件下，例如雨水或植物组织受伤，它会侵入植物质外体并引起疾病。部分研究表明丁香假单胞菌的某些菌株可成功进入以感染的叶子组织为食的蚜虫体内，这表明丁香假单胞菌也可以使用昆虫作为宿主。大自然中的植物不断受到病原微生物如细菌、真菌、昆虫和病毒的攻击。在漫长的进化过程中，植物逐渐形成了通过自身免疫系统来抵抗微生物侵染。微生物通过直接穿透植物表面或自然开口(例如气孔)进入植物实现侵染宿主植物。与真菌病原体不同，细菌没有专门的结构来刺穿植物表皮，它们必须依靠表面擦伤或其他自然开口来进入宿主。茶叶含有多种对人体有益的成分，如茶多酚，具有抗癌、防癌、提神、降压、保健等功效。茶叶作为我国主要的经济作物之一，茶树种植面积与茶叶年产量均居世界第一。由于其主要生长在亚热带和热带地区，生态环境稳定，温暖湿润的气候同时利于各类病菌的滋生与传播，造成茶树的病害种类众多，影响茶树的观赏价值，重则危害到茶叶的生产。

目前，预防茶树芽枯病的主要方法是在生产上主要采取综合防治措施减轻相关病害的发生，如喷洒化学药剂防治、选用优良的抗病品种等措施来减轻病害的发生。植物病害对全球的农业生产造成了巨大的影响，尽管化学农药的使用提高了对植物病害的控制，然而农药残留造成的环境污染，农作物上残留的化合物危害人类的健康已经到了触目惊心的地步。植物致病是一个全球性问题，植物病原菌导致的农作物病害一直是威胁人类粮食安全的重要因素，关于致病菌的致病机理值得人们的重视。早在之前，噬菌体就被看做是一种植物疾病的防控药剂，但由于噬菌体具有宿主特异性、多变的细菌敏感性以及与紫外光之间的相互作用等影响因素，所以并未受到重视。然而，现如今，在噬菌体的帮助下，减少农药的使用并防止细菌耐药性产生的生物防治再次引起了人们的注意，通过噬菌体侵染并裂解病菌的方法，将有效且安全地防止疾病发生，减少经济损失。

目前，噬菌体产品已有用于由黄单胞菌、丁香科假单胞菌引起的番茄和辣椒上的细菌斑点防治。Obradovic等利用噬菌体应用于番茄根部施药，可以明显减少番茄细菌性叶斑病的发生。Civerolo使用噬菌体处理的方法，将桃幼苗上细菌斑点的发病率降低了86％～100％。Tanaka从青枯病菌(Ralstonia solanacearum)中筛选出了两株噬菌体，结果表明它们都可以有效地减少烟草青枯病的发病率。Flaherty等采用噬菌体防治天竺葵的白叶枯病，使天竺葵的发病率下降了70％～85％。在接下来的几年里，噬菌体被用于防治由黄单胞菌(Xanthomonas)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的几种植物病害。目前，噬菌体在茶树芽枯病的防治上在国内外还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种丁香假单胞菌噬菌体及其在防治茶树芽枯病中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过在土壤中分离筛选得到的噬菌体vB_PsS_LDT325能够有效防治丁香假单胞菌引起的茶树芽枯病。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种丁香假单胞菌噬菌体(Pseudomonas syringae phage)，其保藏编号为CGMCC No.45789，保藏时间为2023年11月29日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明还提供所述的丁香假单胞菌噬菌体在如下(1)或(2)中的应用：

(1)在抑制丁香假单胞菌中的应用；

(2)在制备抑制丁香假单胞菌的生物菌剂或者药物中的应用。

本发明还提供所述的丁香假单胞菌噬菌体在如下(1)或(2)中的应用：

(1)在防治丁香假单胞菌引起的细菌性疾病中的应用；

(2)在制备防治丁香假单胞菌引起的细菌性疾病的生物菌剂或者药物中的应用。

优选的是，所述细菌性疾病包括茶树芽枯病。

本发明还提供一种抑制丁香假单胞菌的生物菌剂或者药物，含有所述的丁香假单胞菌噬菌体。

优选的是，所述生物菌剂或者所述药物以所述丁香假单胞菌噬菌体为有效成分，或者以所述丁香假单胞菌噬菌体为唯一的有效成分。

更优选的是，本发明的噬菌体可以单独或混合使用制备成生物制剂或者药物喷洒于植物表面，可特异性、大幅度地抑制植物体中丁香假单胞菌的生存和繁殖，防止植物的进一步病变。

更优选的是，本发明中噬菌体可以和其他的抗菌剂混合使用，在获得抗菌广谱性的同时，对茶树芽枯病菌特异性杀灭，能与该发明中噬菌体联合使用的抗菌剂包括但不限于抗生素和化学抗菌剂。本发明中噬菌体还可应用于工业生产，可由宿主菌茶树芽枯病菌特异性扩增，可应用标准病毒纯化方法高度纯化，单独使用作为植物抗菌剂防止植物中茶树芽枯病菌侵染。

本发明公开了以下技术效果：

本发明中从自然界土壤中分离得到一种烈性噬菌体分离物，该噬菌体分离物包括一种或者多种对茶树芽枯病菌具有裂解作用的噬菌体，经纯化后获取一株对茶树芽枯病菌具有烈性裂解作用的噬菌体单体即噬菌体vB_PsS_LDT325，其对茶树芽枯病菌均有广谱的杀菌能力。经实验，发现该噬菌体对丁香假单胞菌所引起的茶树叶枯病具有很好的防治效果，并且对温度及pH的适用范围广，非常适用于实际生产需要。因此，本发明分离得到的噬菌体经过高度纯化有望开发成生物农药，避免茶树间丁香假单胞菌的传播以及茶树中丁香假单胞菌的生长繁殖，有效防治丁香假单胞菌引起的茶树芽枯病。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中双层平板点滴噬菌体原液进行噬菌斑实验结果；

图2为本发明实施例1中纯化后的噬菌斑；

图3为本发明实施例2中噬菌体电镜图；

图4为本发明实施例3中培养基中丁香假单胞菌与噬菌体共培养及无噬菌体时的生长状态；

图5为本发明实施例4中培养基中丁香假单胞菌与不同温度处理后的噬菌体共培养及无噬菌体时的生长状态；

图6为本发明实施例4中培养基中丁香假单胞菌与不同pH处理后的噬菌体共培养及无噬菌体时的生长状态；

图7为本发明例5中不同处理后活体茶树叶片上病斑直径(mm)的差异。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1噬菌体的筛选和纯化

1、土壤样品的采集

本发明中土壤样品采自山东省聊城市，为花卉基地中的土壤(见表1)。采用五点取样法采集，即每个取样点至少取5处，先将表层土铲去1～2厘米，再取深度5～10厘米的土壤，放入袋中，置于4℃冰箱里保存。

2、土壤样品中针对茶树芽枯病菌的噬菌体的分离

预先扩培好茶树芽枯病菌，将此菌悬液取5mL于锥形瓶内混合，称取5g土样于该锥形瓶内，置于30℃、180r/min的摇床中过夜培养。将摇过夜的土壤悬液离心去土壤颗粒及菌体，取上清液，用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌，得到无菌混合噬菌体悬液。

表1土壤、菌种信息

3、噬菌斑实验测定

茶树芽枯病菌双层平板的制备：高温灭菌LB固体培养基，室温放置冷却至50℃，倾倒至培养皿内，均匀铺于皿底，室温放置15min，使其凝固。将高温灭菌的LB半固体培养基，室温放置冷却至约50℃，取5mL与1mL对数期丁香假单胞菌悬液混匀，倒入上述培养皿内，室温放置凝固。

取上述分离得到的噬菌体悬液的样品5μL点于双层平板上，30℃培养1天，观察有无噬菌斑，有噬菌斑则证明该悬液中存在混合噬菌体样品(见图1)。

4、混合噬菌体样品的纯化

将上述混合噬菌体样品经过连续性的10倍稀释，取200μL稀释后噬菌体悬液，与200μL对数期丁香假单胞菌悬液，再加入5mL LB半固体培养基，混合均匀后倾倒至备好的平板上，使其平铺，室温放置凝固，30℃恒温箱培养1天。选取合适的平板，挑取单个噬菌斑。将挑取出来的噬菌体单克隆，加入5mL对数期丁香假单胞菌悬液中，30℃，180r/min摇床过夜培养，离心、滤膜除菌后获得第一次纯化后噬菌体悬液。重复此纯化步骤5次，得到噬菌体单克隆样品，并将其命名为丁香假单胞菌噬菌体vB_PsS_LDT325(见图2)。

该丁香假单胞菌噬菌体(Pseudomonas syringae phage)vB_PsS_LDT325已于2023年11月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.45789。

实施例2高浓度噬菌体的制备及电镜观察

1、噬菌体的制备

将丁香假单胞菌噬菌体vB_PsS_LDT325加入提前制备好的丁香假单胞菌悬液中，于30℃，180r/min摇床过夜培养，将共培养物12000rpm离心5min，取上清液，用0.22μm滤膜过滤除菌，得到噬菌体悬液，待进一步浓缩。

2、噬菌体计数方法(效价)

将所得到的噬菌体样品按10倍比例稀释，取其中一定稀释比例的样品100μL，铺双层平板，取合适比例计算噬菌斑个数。

3、噬菌体的浓缩

制备30mL vB_PsS_LDT325噬菌体悬液(10¹⁰PFU/mL)，将得到的噬菌体悬液进行超速离心，10000rpm离心2h，弃上清，用100μL 1M醋酸铵溶液悬浮噬菌体，制得的样品用于电镜观察。

4、噬菌体的电镜观察

噬菌体在显微镜下的形态结构特征，是目前噬菌体分类的重要依据，根据其形态特点，可将噬菌体分为有尾噬菌体、纤维状噬菌体。

对vB_PsS_LDT325噬菌体采用负染电镜观察噬菌体粒子的形态结构，该噬菌体头部为六边体，尾部为注射器形状，具有可收缩的尾部，头部与尾部之间具有颈部结构，在尾部末端可见类似基板的膨大结构或长尾丝。通过电镜形态结构观察，该噬菌体属于有尾噬菌体目的长尾噬菌体科，电镜形态见图3。

实施例3培养基中噬菌体对茶树芽枯病菌生长的影响

取九个无菌10mL玻璃管，各加入LB液体5mL。均分为三组，每组三个重复。第1-3组分别加入200μL LB液体培养基、200μL宿主菌菌液(10⁷CFU/mL)、200μL宿主菌菌液(10⁷CFU/mL)与200μL噬菌体裂解液(10⁷PFU/mL)的混合液。置于30℃、180r/min震荡培养，每隔3h取样测量OD₆₀₀值，培养30h。以时间为横坐标，每组OD₆₀₀平均值为做坐标，绘制生长曲线。

结果显示，当无任何噬菌体添加时，丁香假单胞菌生长状态正常，未受到任何抑制。当添加噬菌体悬液后，丁香假单胞菌生长状态受到了一定抑制，生长较为缓慢，丁香假单胞菌出现了一定量的裂解死亡(见图4)。丁香假单胞菌(宿主菌)潜伏期约为3h，在3-6h出现明显的快速增长时期，大约有3h左右的对数期，6h后平稳增长，21h左右进入平台期，24h后缓慢下降。从总体趋势来看，丁香假单胞菌有可见的对数期、稳定期，总体基本呈现稳步增长。如图4所示，与宿主菌相比，在相同时间内，宿主菌和噬菌体的混合液在0-15h内保持稳定，宿主菌和噬菌体的混合液OD₆₀₀平均值小于宿主菌的平均值。15-18h开始缓慢增长，18h后出现明显的快速增长时期。说明噬菌体对抑制丁香假单胞菌有明显的治疗效果。

实施例4培养基中不同温度和PH处理后噬菌体对茶树芽枯病菌的抑制效果

1、培养基中不同温度处理后的噬菌体对茶树芽枯病菌生长的影响

制备噬菌体悬液(10⁷PFU/mL)，将噬菌体悬液经过40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下在SM缓冲液中孵育。在20min、40min、60min时各取样一次，测定其温度稳定性。重复实验三次。

结果显示，噬菌体具有一定的温度稳定性，见图5，在50℃水浴条件下作用1h后仍能保持较高活性，60℃作用20min后效价开始显著下降，70℃作用40min及60min后仍有活性，80℃条件下效价为0。说明40℃、50℃对噬菌体效价的影响不大，噬菌体热稳定性较好，不耐受50℃以上高温，自然环境下可存活，当温度高于50℃时，其活性开始受影响。

2、培养基中不同pH处理后的噬菌体对茶树芽枯病菌生长的影响

使用HCl(1mol/L)和NaOH(1mol/L)将SM缓冲液的pH值分别调整为1-13。取不同pH值的SM缓冲液900μL再加入纯化后的噬菌体100μL(10⁷PFU/ml)。然后混合均匀，37℃作用1h，以确定PH稳定性。采用双层琼脂法测定噬菌体滴度。重复实验三次。

结果显示，噬菌体在碱性条件下具有较好的稳定性，但对强酸或强碱敏感(见图6)。噬菌体耐碱性良好，在pH＝3-11范围内效价未受影响，但是当pH≤2时，对噬菌体活性影响较大，pH＝1时，噬菌体失活，这与多数研究报道的噬菌体耐碱性强于耐酸性相符，噬菌体pH稳定性结果，说明本发明噬菌体耐碱性良好。

实施例5喷洒噬菌体后活体茶树叶片上病斑直径的变化

在生物防治中使用噬菌体治疗必须考虑的是检查它们在植物细菌性病害方面有无治疗效果。为了测试噬菌体在模式植物中是否有效，对茶树植株进行体内接种，研究其是否能够减少植物上的病原菌。首先，施用丁香假单胞菌10⁷CFU/mL和噬菌体10⁷PFU/mL对茶树植株进行体内接种，实验重复3次。然后，接种后0h采集一次叶片，每6h采集一次，连续72h，测量茶树植物病斑直径。具体操作如下：

以茶树易感品种为研究对象，研究了噬菌体对茶树细菌性枯萎病的抑制作用。植物生长在未消毒的酸性土壤中。首先采用75％的酒精进行茶树植株叶片消毒，待干后，分为四组，针刺接种病原菌。本实验以丁香假单胞菌为模式植物病原菌，取丁香假单胞菌宿主菌菌液(10⁷CFU/mL)与噬菌体裂解液(10⁷PFU/mL)各200μL。分别向第1-4组叶片针刺接种处滴加10μL无菌水、10μL宿主菌菌液(10⁷CFU/mL)、10μL宿主菌菌液(10⁷CFU/mL)与10μL噬菌体裂解液(10⁷PFU/mL)、10μL噬菌体裂解液(10⁷PFU/mL)。每组处理10株茶树。每组实验重复3次。在整个实验期间，植物在室温条件下生长。以无菌水为对照，每隔六小时测量植物叶片上病斑直径大小。

结果显示，接种病原菌6h时测量1-4组的茶树叶片病斑直径。只接种病原菌的茶树叶片病斑直径为2.65mm，而采用噬菌体治疗的茶树叶片病斑直径为1.85mm，与对照组相比，采用噬菌体治疗的茶树叶片病斑直径显著减小。在0-12h内，对照组和处理组的病斑直径出现明显的快速增长。12h后，对照组和处理组的病斑直径稳定增长。测量接种细菌36h时1-4组的茶树叶片病斑直径，发现接种病原菌的茶树叶片病斑直径为4.19mm，而采用噬菌体治疗的茶树叶片病斑直径为2.4mm。测量接种细菌72h时1-4组的茶树叶片病斑直径，发现只接种病原菌的茶树叶片病斑直径为5.2mm，而采用噬菌体治疗的茶树叶片病斑直径为2.67mm，表明采用噬菌体治疗的茶树叶片病斑直径比只接种病原菌的茶树叶片病斑直径减少了2倍。说明噬菌体vB_PsS_LDT325对抑制丁香假单胞菌有明显的治疗效果(见图7)。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (6)

1.一种丁香假单胞菌噬菌体(Pseudomonas syringae phage)，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.45789。

2.如权利要求1所述的丁香假单胞菌噬菌体在如下(1)或(2)中的应用：

(1)在抑制丁香假单胞菌中的应用；

(2)在制备抑制丁香假单胞菌的生物菌剂或者药物中的应用。

3.如权利要求1所述的丁香假单胞菌噬菌体在如下(1)或(2)中的应用：

(1)在防治丁香假单胞菌引起的细菌性疾病中的应用；

(2)在制备防治丁香假单胞菌引起的细菌性疾病的生物菌剂或者药物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述细菌性疾病包括茶树芽枯病。

5.一种抑制丁香假单胞菌的生物菌剂或者药物，其特征在于，含有权利要求1所述的丁香假单胞菌噬菌体。

6.如权利要求5所述的抑制丁香假单胞菌的生物菌剂或者药物，其特征在于，所述生物菌剂或者所述药物以所述丁香假单胞菌噬菌体为有效成分，或者以所述丁香假单胞菌噬菌体为唯一的有效成分。