CN117965455A - 一种提高car-t细胞功能的组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞工程技术领域，尤其涉及一种提高CAR‑T细胞功能的组合物及其应用。本发明的组合物包括：培养基、IL‑2、IL‑15、IL‑21、转铁蛋白、γ‑谷甾醇、老鹳草素、宽缨酮、亚油酸。本发明在研究中发现：组合物中的宽缨酮成分能够有效降低CAR‑T细胞的耗竭；老鹳草素成分能够有效提升CAR‑T细胞中TCM细胞占比，本发明的组合物还能够增强CAR‑T的杀伤能力。
Description
技术领域
本发明涉及细胞工程技术领域，尤其涉及一种提高CAR-T细胞功能的组合物及其应用。
背景技术
随着科技的进步，免疫疗法在临床实验中取得了巨大的进步。免疫疗法是当机体处于非正常的免疫状态时，人为干预机体的免疫功能实现治疗疾病目的的治疗方法。其他临床肿瘤治疗方法，如化疗、放疗、靶向治疗等针对的靶标是肿瘤细胞和组织，而免疫疗法则与之完全不同，免疫疗法针对的靶标是患者自身的免疫系统。免疫疗法的应用需要免疫细胞，常用的免疫细胞有T细胞。
临床实验中，研究人员通过基因工程技术能够改造T细胞，将其从“战士”塑造为“超级战士”。所谓改造是利用基因工程技术手段，将含有能够识别肿瘤细胞且能够激活T细胞的嵌合抗原受体的慢病毒转染T细胞，最终得到能够专门识别患者体内肿瘤细胞，并能够通过免疫系统的免疫作用释放多种细胞因子的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）。临床实验数据表明，CAR-T细胞能够高效杀伤肿瘤细胞，实现治疗疾病的目的。临床上为了获得大量CAR-T细胞，通常需要体外培养以及体外扩增，培养中使用的培养基类型、培养过程等均会影响最终获得的CAR-T细胞的性能。目前，常用的CAR-T的培养基存在成分复杂、培养成本高以及细胞易于耗竭，杀伤能力差等问题。基于此，本发明提供了一种新型的提高CAR-T细胞功能的组合物。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种提高CAR-T细胞功能的组合物，该组合物成分简单，且能够有效降低CAR-T的耗竭，提升中央记忆T细胞占比，增强杀伤能力。
本发明的目的之二在于提供一种提高CAR-T细胞功能的组合物的应用。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种提高CAR-T细胞功能的组合物，包括培养基、IL-2、IL-15、IL-21、转铁蛋白、γ-谷甾醇、老鹳草素、宽缨酮、亚油酸。
优选地，所述IL-2、IL-15、IL-21、转铁蛋白、γ-谷甾醇、老鹳草素、宽缨酮、亚油酸在培养基中的浓度为：500~700U/mL IL-2、12~26ng/mL IL-15、3~9ng/mL IL-21、104~150ng/mL转铁蛋白、6~13ng/mL γ-谷甾醇、15.5~28ng/mL老鹳草素、40.5~70.5ng/mL宽缨酮、0.2~0.7μg/mL亚油酸。
更优选地，所述IL-2、IL-15、IL-21、转铁蛋白、γ-谷甾醇、老鹳草素、宽缨酮、亚油酸在培养基中的浓度为：600U/mL IL-2、21ng/mL IL-15、5ng/mL IL-21、128ng/mL转铁蛋白、9ng/mL γ-谷甾醇、24ng/mL老鹳草素、61ng/mL宽缨酮、0.4μg/mL亚油酸。
优选地，所述培养基为无血清RPMI 1640培养基。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
一种提高CAR-T细胞功能的组合物的应用，包括以下步骤：
（1）从外周血中分离T细胞；
（2）采用含有CAR基因表达序列的慢病毒对步骤（1）的T细胞进行转染，获得CAR-T细胞；
（3）将步骤（2）的CAR-T细胞接种于上述组合物中进行培养。
优选地，所述步骤（3）CAR-T细胞在组合物中的接种密度为1×105~8×105个/mL。
优选地，所述步骤（3）培养的时间为12~13d，每2d更换一次组合物。
优选地，所述从外周血中分离T细胞具体是：使用等体积的PBS对收集的外周血进行稀释，加入淋巴细胞分离液，离心后吸取处于血清与淋巴细胞分离液界面的絮状单个核细胞层。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明的组合物包括：培养基、IL-2、IL-15、IL-21、转铁蛋白、γ-谷甾醇、老鹳草素、宽缨酮、亚油酸。本发明在研究中发现：组合物中的宽缨酮成分能够有效降低CAR-T细胞的耗竭；老鹳草素成分能够有效提升CAR-T细胞中TCM细胞占比，本发明的组合物还能够增强CAR-T的杀伤能力。
附图说明
图1为实施例1~3、对比例1~6 CAR-T细胞中PD1阳性细胞占比情况；
图2为实施例1~3、对比例1~6 CAR-T细胞中LAG3阳性细胞占比情况；
图3为实施例1~3、对比例1~6 CAR-T细胞的中央记忆T细胞占比情况。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
（一）实施例
实施例1
本实施例提供一种提高CAR-T细胞功能的组合物，组合物由无血清RPMI 1640培养基、IL-2、IL-15、IL-21、转铁蛋白、γ-谷甾醇、老鹳草素、宽缨酮、亚油酸组成。以上各成分在RPMI 1640培养基中的浓度为：600U/mL IL-2、21ng/mL IL-15、5ng/mL IL-21、128ng/mL转铁蛋白、9ng/mL γ-谷甾醇、24ng/mL老鹳草素、61ng/mL宽缨酮、0.4μg/mL亚油酸。
一种提高CAR-T细胞功能的组合物的应用，详细应用过程为：
（1）从外周血中分离T细胞：使用添加肝素的采血管采集健康志愿者外周血10mL，使用等体积的PBS对收集的外周血进行稀释；取新的离心管，加入5mL ficoll分离液（淋巴细胞分离液），然后使用移液枪加入稀释后的外周血；调整离心机速度为450g，转速上升为4挡，转速下降为0挡，于室温下离心处理25min；离心结束后吸取处于血清与淋巴细胞分离液界面的絮状单个核细胞层，并移入新的离心管中，使用PBS清洗3次；
（2）采用含有CAR基因表达序列的慢病毒对步骤（1）的T细胞进行转染，获得CAR-T细胞：具体制备过程参考现有技术刘蕊《CAR-T细胞治疗中枢神经系统淋巴瘤的有效性及安全性研究》制备得到；
（3）将步骤（2）的CAR-T细胞接种于上述组合物中，CAR-T细胞在组合物中的接种密度为3×105个/mL，于37℃、5%CO2培养箱中培养12d，每2d更换一次组合物。
实施例2
本实施例提供一种提高CAR-T细胞功能的组合物，组合物由无血清RPMI 1640培养基、IL-2、IL-15、IL-21、转铁蛋白、γ-谷甾醇、老鹳草素、宽缨酮、亚油酸组成。以上各成分在RPMI 1640培养基中的浓度为：500U/mL IL-2、12ng/mL IL-15、3ng/mL IL-21、104ng/mL转铁蛋白、6ng/mL γ-谷甾醇、15.5ng/mL老鹳草素、40.5ng/mL宽缨酮、0.2μg/mL亚油酸。
一种提高CAR-T细胞功能的组合物的应用，详细应用过程为：
（1）从外周血中分离T细胞：使用添加肝素的采血管采集健康志愿者外周血10mL，使用等体积的PBS对收集的外周血进行稀释；取新的离心管，加入5mL ficoll分离液（淋巴细胞分离液），然后使用移液枪加入稀释后的外周血；调整离心机速度为450g，转速上升为4挡，转速下降为0挡，于室温下离心处理25min；离心结束后吸取处于血清与淋巴细胞分离液界面的絮状单个核细胞层，并移入新的离心管中，使用PBS清洗3次；
（2）采用含有CAR基因表达序列的慢病毒对步骤（1）的T细胞进行转染，获得CAR-T细胞：具体制备过程参考现有技术刘蕊《CAR-T细胞治疗中枢神经系统淋巴瘤的有效性及安全性研究》制备得到；
（3）将步骤（2）的CAR-T细胞接种于上述组合物中，CAR-T细胞在组合物中的接种密度为1×105个/mL，于37℃、5%CO2培养箱中培养13d，每2d更换一次组合物。
实施例3
本实施例提供一种提高CAR-T细胞功能的组合物，组合物由无血清RPMI 1640培养基、IL-2、IL-15、IL-21、转铁蛋白、γ-谷甾醇、老鹳草素、宽缨酮、亚油酸组成。以上各成分在RPMI 1640培养基中的浓度为：700U/mL IL-2、26ng/mL IL-15、9ng/mL IL-21、150ng/mL转铁蛋白、13ng/mL γ-谷甾醇、28ng/mL老鹳草素、70.5ng/mL宽缨酮、0.7μg/mL亚油酸。
一种提高CAR-T细胞功能的组合物的应用，详细应用过程为：
（1）从外周血中分离T细胞：使用添加肝素的采血管采集健康志愿者外周血10mL，使用等体积的PBS对收集的外周血进行稀释；取新的离心管，加入5mL ficoll分离液（淋巴细胞分离液），然后使用移液枪加入稀释后的外周血；调整离心机速度为450g，转速上升为4挡，转速下降为0挡，于室温下离心处理25min；离心结束后吸取处于血清与淋巴细胞分离液界面的絮状单个核细胞层，并移入新的离心管中，使用PBS清洗3次；
（2）采用含有CAR基因表达序列的慢病毒对步骤（1）的T细胞进行转染，获得CAR-T细胞：具体制备过程参考现有技术刘蕊《CAR-T细胞治疗中枢神经系统淋巴瘤的有效性及安全性研究》制备得到；
（3）将步骤（2）的CAR-T细胞接种于上述组合物中，CAR-T细胞在组合物中的接种密度为8×105个/mL，于37℃、5%CO2培养箱中培养12d，每2d更换一次组合物。
（二）对比例
对比例1
本对比例提供一种提高CAR-T细胞功能的组合物及其应用，与实施例1的不同的之处是：对比例1的组合物中未添加老鹳草素成分。
对比例2
本对比例提供一种提高CAR-T细胞功能的组合物及其应用，与实施例1的不同的之处是：对比例2的组合物中未添加宽缨酮成分。
对比例3
本对比例提供一种提高CAR-T细胞功能的组合物及其应用，与实施例1的不同的之处是：对比例3的组合物中未添加老鹳草素、宽缨酮两种成分。
对比例4
本对比例提供一种提高CAR-T细胞功能的组合物及其应用，与实施例1的不同的之处是：对比例4的组合物中宽缨酮的浓度为90ng/mL。
对比例5
本对比例提供一种提高CAR-T细胞功能的组合物及其应用，与实施例1的不同的之处是：对比例5的组合物中宽缨酮的浓度为20ng/mL。
对比例6
本对比例提供一种提高CAR-T细胞功能的组合物及其应用，与实施例1的不同的之处是：对比例6的组合物中老鹳草素的浓度为50ng/mL。
（三）效果例
效果例1
本效果例就CAR-T细胞的杀伤功能进行检测：
收集实施例1~3、对比例1~6获得的CAR-T细胞（效应细胞），离心后重悬于RPMI1640培养基中（添加200IU/mL IL-2），细胞浓度为1×105个/mL。按照效靶比1:1将靶细胞（被GFP荧光标记的Nalm-6细胞，Nalm-6细胞浓度为1×105个/mL）、效应细胞各50μL接种于96孔板中，每组3个复孔。于37℃，5%CO2的细胞培养箱中培养1d，以350g速度离心8min，使用酶标仪进行检测，结果如表1所示。
表1
表1是实施例1~3、对比例1~6获得的CAR-T细胞的杀伤情况。通过表1不难发现：使用实施例1~3组合物获得的CAR-T细胞的杀伤率明显高于对比例1~6的CAR-T细胞。其中，对比例1的组合物中未添加老鹳草素成分，对比例2的组合物中未添加宽缨酮成分，对比例3的组合物中未添加老鹳草素、宽缨酮两种成分，对比例4~5调整了宽缨酮用量，对比例6调整了老鹳草素用量。因此，组合物中调整老鹳草素、宽缨酮中的任一成分的用量均会影响CAR-T细胞的杀伤能力。
效果例2
本效果例就CAR-T细胞的耗竭指标进行检测：
（1）孵育细胞
收集实施例1~3、对比例1~6的CAR-T细胞，细胞计数后，将细胞置于流式管中（2×104个/管），以350g的速度离心处理5min；弃上清液，采用PBS（1μL）清洗细胞沉淀，以350g的速度离心处理5min；弃上清液，每管加入100μL PBS，再加入1μL anti-human PD-1(APC)、1μL anti-human LAG-3(PE-cy7)抗体，于暗处避光孵育20min；
（2）上机检测
使用PBS（1μL）清洗抗体，以350g的速度离心处理5min；弃上清液，将细胞沉淀重悬于PBS（300μL）中，流式细胞仪上机检测。本效果例中以PD1、LAG3作为耗竭的表型标准，结果如图1-2所示。
图1为实施例1~3、对比例1~6 CAR-T细胞中PD1阳性细胞占比情况，图2为实施例1~3、对比例1~6 CAR-T细胞中LAG3阳性细胞占比情况。通过图1-2不难发现：
实施例1~3 CAR-T细胞中PD1阳性细胞、LAG3阳性细胞占比略低于对比例1、对比例6。实施例1~3 CAR-T细胞中PD1阳性细胞、LAG3阳性细胞占比显著低于对比例2~5；对比例2与对比例3 CAR-T细胞中PD1阳性细胞、LAG3阳性细胞占比无显著差异；对比例4与对比例5CAR-T细胞中PD1阳性细胞、LAG3阳性细胞占比无显著差异。
分析知，对比例2~3的组合物中均未添加宽缨酮，对比例4的组合物增加了宽缨酮的浓度，对比例5的组合物减少了宽缨酮的浓度。由上可知，宽缨酮成分能够影响CAR-T细胞中PD1阳性细胞、LAG3阳性细胞占比情况。即宽缨酮能够有效降低CAR-T细胞的耗竭。
效果例3
本效果例就CAR-T细胞的中央记忆T细胞占比情况进行检测：
（1）孵育细胞
收集实施例1~3、对比例1~6的CAR-T细胞，细胞计数后，将细胞置于流式管中（1×104个/管），以380g的速度离心处理8min；弃上清液，采用PBS（1μL）清洗细胞沉淀，以380g的速度离心处理8min；弃上清液，每管加入100μL PBS，再加入0.5μL anti-human CD62L(PE)、0.5μL anti-human CD45RO(APC)抗体，于暗处避光孵育20min；
（2）上机检测
使用PBS（1μL）清洗抗体，以380g的速度离心处理8min；弃上清液，将细胞沉淀重悬于PBS（300μL）中，上机进行检测。本效果例中以CD62L、CD45RO作为中央记忆T细胞（TCM）的表型标准，结果如图3所示。
图3为实施例1~3、对比例1~ CAR-T细胞的中央记忆T细胞占比情况。通过图3不难发现：
实施例1~3 CAR-T细胞中TCM细胞占比略高于对比例2、对比例4~5。实施例1~3 CAR-T细胞中TCM细胞占比显著高于对比例1、对比例3、对比例6；对比例6 CAR-T细胞中TCM细胞占比略高于对比例1、对比例3。
分析知，对比例1、对比例3的组合物中均未添加老鹳草素，对比例6的组合物增加了老鹳草素的浓度。由上可知，老鹳草素成分能够影响CAR-T细胞中TCM细胞占比情况。即老鹳草素能够有效提升CAR-T细胞中TCM细胞占比。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (5)
1.一种提高CAR-T细胞功能的组合物，其特征在于，包括无血清RPMI 1640培养基、IL-2、IL-15、IL-21、转铁蛋白、γ-谷甾醇、老鹳草素、宽缨酮、亚油酸；所述IL-2、IL-15、IL-21、转铁蛋白、γ-谷甾醇、老鹳草素、宽缨酮、亚油酸在无血清RPMI 1640培养基中的浓度为：500~700U/mL IL-2、12~26ng/mL IL-15、3~9ng/mL IL-21、104~150ng/mL转铁蛋白、6~13ng/mL γ-谷甾醇、15.5~28ng/mL老鹳草素、40.5~70.5ng/mL宽缨酮、0.2~0.7μg/mL亚油酸。
2.根据权利要求1所述组合物在CAR-T细胞培养中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）从外周血中分离T细胞；
（2）采用含有CAR基因表达序列的慢病毒对步骤（1）的T细胞进行转染，获得CAR-T细胞；
（3）将步骤（2）的CAR-T细胞接种于权利要求1~3任一项所述组合物中进行培养。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）CAR-T细胞在组合物中的接种密度为1×105~8×105个/mL。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）培养的时间为12~13d，每2d更换一次组合物。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述从外周血中分离T细胞具体是：使用等体积的PBS对收集的外周血进行稀释，加入淋巴细胞分离液，离心后吸取处于血清与淋巴细胞分离液界面的絮状单个核细胞层。
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN102670636A (zh) * | 2012-03-28 | 2012-09-19 | 中国医学科学院医学实验动物研究所 | 老鹳草素在制备治疗人肠道病毒71型感染引发疾病药物中的应用 |
| CN110974821A (zh) * | 2019-12-24 | 2020-04-10 | 浙江大学 | Eurycomanone及其类似物在制备治疗高脂血症、脂肪肝药物或减肥产品的用途 |
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2024
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Patent Citations (2)
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